Εξέταση Ημερήσιας Παραλλαγής και Διαφορών Φύλου στη Νευροφυσιολογία του Ιπποκάμπου και στη Χωρική Μνήμη Μέρος 2

Εγγραφές μπαλωμάτων-σφιγκτήρα ολόκληρων κυττάρων

Όλα τα δεδομένα συλλέχθηκαν από φέτες στεφανιαίου ιππόκαμπου κατά τη διάρκεια ZT 2-6 (ημέρα) ή ZT 13-17 (νύχτα) στους 32 βαθμούς σε τυπικό ACSF που περιέχει τα ακόλουθα (σε mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 Na2PO4, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHC03 και 25 γλυκόζη, με φυσαλίδες με 95% O2/5% CO2.

Ο στεφανιαίος ιππόκαμπος είναι μια σημαντική περιοχή του εγκεφάλου που παίζει βασικό ρόλο στη διαδικασία της ανθρώπινης μνήμης.

Η έρευνα δείχνει ότι ο στεφανιαίος ιππόκαμπος είναι κρίσιμος για την αποθήκευση και την ανάκτηση μακροπρόθεσμων αναμνήσεων. Είναι αυτό που οι άνθρωποι αποκαλούν «ταξιδιώτη στο χρόνο» που μπορεί να οδηγήσει τους ανθρώπους πίσω σε προηγούμενες εμπειρίες και εμπειρίες. Ο στεφανιαίος ιππόκαμπος παίζει σημαντικό ρόλο στην ταυτότητά μας, τον συναισθηματικό έλεγχο, την αυτοκατανόηση και τις διαπροσωπικές μας σχέσεις.

Η μνήμη μας επιδεινώνεται με την πάροδο του χρόνου, αλλά υπάρχουν μερικά πράγματα που μπορούμε να κάνουμε για να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Πρώτα απ 'όλα, είναι σημαντικό να διατηρήσετε μια θετική στάση καθώς αυτό μπορεί να μειώσει το άγχος και να βελτιώσει τη μνήμη. Δεύτερον, περισσότερη άσκηση και δίαιτα μπορούν να βοηθήσουν στην προώθηση της λειτουργίας του στεφανιαίου ιππόκαμπου και να είναι ευεργετικά για τη σωματική υγεία. Τέλος, η εκπαίδευση μνήμης και η χρήση εργαλείων όπως τα σημειωματάρια μπορούν επίσης να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης.

Συνολικά, ο στεφανιαίος ιππόκαμπος παίζει αναντικατάστατο ρόλο στην ανθρώπινη μνήμη και στη γνωστική απόδοση. Επομένως, θα πρέπει να προσέχουμε τον ρόλο του και να το διατηρήσουμε σε υγιή κατάσταση όσο το δυνατόν περισσότερο. Λαμβάνοντας προληπτικά βήματα, μπορούμε να βελτιώσουμε τη μνήμη μας και να επιβραδύνουμε τη φθορά της, ώστε να μπορούμε να συνεχίσουμε να σκεφτόμαστε καθαρά και να ζούμε ζωές με νόημα. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το κρέας μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Οι εγγραφές με σφιγκτήρα με επιθέματα κυττάρου πυραμιδικών νευρώνων CA1 ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την τεχνική του τυφλού επιθέματος. Εν συντομία, τοποθετήθηκαν μπαλωματές είτε στο μεσαίο είτε στο πλάγιο άκρο της περιοχής CA1 (ανάλογα με το αν μια φέτα ήταν από το αριστερό δεξί ημισφαίριο) σε βάθος 50–150 mM, εφαρμόστηκε θετική πίεση καθώς η πιπέτα προχωρούσε αργά, είτε μεσαία είτε πλευρικά. το στρώμα πυραμιδικού κυττάρου έως ότου μια ταχεία αύξηση στην αντίσταση της πιπέτας έδειξε επαφή με έναν νευρώνα, οπότε απελευθερώθηκε η θετική πίεση, ελήφθη μια σφιχτή σφράγιση (0,1 GX) και εφαρμόστηκε ελαφρά αρνητική πίεση για να επιτευχθεί διαμόρφωση επιθέματος ολόκληρου του κυττάρου.

Τα δεδομένα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας έναν ενισχυτή Multiclamp700B, τον ψηφιοποιητή Axon Digidata 1440A και 1550B και το λογισμικό pClamp10/11 (Molecular Devices). )σε αντίσταση μεταξύ 2,5 και 5 MV. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση για 5 λεπτά πριν από τις πειραματικές καταγραφές. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση είχαν αντίσταση πρόσβασης, 30 MV που δεν αυξήθηκε κατά 0,20% για τη διάρκεια κάθε {{14}λεπτού πειράματος.

Για πειράματα σφιγκτήρα τάσης, όλα τα κελιά διατηρήθηκαν στα 70 mV και τα σήματα φιλτραρίστηκαν στα 5 kHz και ψηφιοποιήθηκαν στο 10 kHz. Τα πειράματα IPSC χρησιμοποίησαν ένα διάλυμα σιφώνου που περιείχε (σε mM): 140 CsCl, 10 EGTA, 5 MgCl2, 2 NaATP, 0,3 Na-GTP, 10 HEPES, 0,2% βιοκυτίνη (pH 7,3, 290 mm) και 5 QX (ανταγωνιστής διαύλων νατρίου) προστέθηκε τη στιγμή της χρήσης. Τα IPSC απομονώθηκαν φαρμακολογικά με έγχυση λουτρού 10 mM NBQX (ανταγωνιστής AMPAR, HelloBio) και 5 mM CPP (ανταγωνιστής NDMAR, Hello Bio).

Τα πειράματα EPSC χρησιμοποίησαν ένα διάλυμα σιφώνου που περιέχει (inmM): 100 CsOH, 100 γλυκονικό οξύ (50%), 0,6 EGTA, 5MgCl2, 2 Na- ATP*3H2O, 0,3 Na-GTP, 40 HEPES, 7 φωσφοκρεατίνη, βιοκυτίνη (0,2%) και 5 QX-314 προστέθηκαν τη στιγμή της χρήσης. Τα EPSC απομονώθηκαν φαρμακολογικά με έγχυση λουτρού 10 mM γκαβαζίνης (ανταγωνιστής GABAAR, Hello Bio). Ξεχωριστά πειράματα για τη μέτρηση μικροσκοπικών IPSC και μικροσκοπικών EPSCs (mIPSCs/mEPSCs) καταγράφηκαν όπως παραπάνω με την προσθήκη 0,5 mM τετροδοτοξίνης αναστολέας, Tocris).

Για πειράματα με σφιγκτήρα ρεύματος, τα σήματα φιλτράρονταν στο 10 kHz και ψηφιοποιήθηκαν στα 20 kHz. Περιεχόμενο διάλυμα πιπέτας με επικάλυψη (σε mM): 135 K-γλυκονικό, 2 MgCl2, 0.1 EGTA, 10 HEPES, 4 KCl, 2 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 10 φωσφοκρεατίνη και βιοκυτίνη (0,2%· pH 7,3, 310 mOsm και 2-4 MV). Η νευρωνική διεγερσιμότητα εκτιμήθηκε με έγχυση προοδευτικών βημάτων εκπολωτικού ρεύματος από ηρεμία (0–500 pA, D 20 pA) και μετρώντας τον αριθμό των δυναμικών δράσης που εκτοξεύτηκαν κατά τη διάρκεια κάθε 1000 ms τρέχον βήμα.

Η κλίση απόκρισης λήφθηκε με τον υπολογισμό της γραμμικής σχέσης μεταξύ της συχνότητας πυροδότησης και του εγχυόμενου ρεύματος μεταξύ {{0}} έως 400-pAsteps. Μετρήθηκαν επίσης η συχνότητα πυροδότησης μέγιστου δυναμικού δράσης (AP) (max) και το ρεύμα στο οποίο συνέβη το μέγιστο (Imax). Η πτώση μετρήθηκε ως το πλάτος (mV) της μέγιστης τάσης από μια έγχυση υπερπολωτικού ρεύματος που πέτυχε δυναμικό μεμβράνης σταθερής κατάστασης 90–93 mV. Η αντίσταση εισόδου (MX) μετρήθηκε ως η κλίση της απόκρισης ρεύματος σε μια σειρά υπερπολωτικού ρεύματος ενέσεις (150 έως 0 pA, D 50 pA).

Η Rheobase ορίστηκε ως το ελάχιστο ρεύμα που απαιτείται για την πρόκληση ενός μόνο AP. Χρησιμοποιήθηκαν μεμονωμένα AP που προκλήθηκαν από τη ρεόβαση για την ανάλυση των ιδιοτήτων του δυναμικού δράσης (Πίνακες 1, 2). Το πλάτος AP ορίστηκε ως η διαφορά τάσης μεταξύ του ορίου AP και της κορυφής του. Το όριο ορίστηκε ως η τάση (mV) στην οποία η πρώτη παράγωγος AP (dV/dt) υπερέβη τα 20 mV/s. Ο χρόνος αύξησης του AP ήταν ο χρόνος (ms) για να φτάσει ένα AP στο 90% του πλάτους αιχμής του από το 10% του μέγιστου του. Ο χρόνος διάσπασης ήταν ο χρόνος μεταξύ 90% και 10% του πλάτους κορυφής AP. Το μισό πλάτος ήταν ο χρόνος (ms) μεταξύ του μισού πλάτη της ανόδου και της αποσύνθεσης της κυματομορφής AP. Η μετα-υπερπόλωση (AHP) ήταν η διαφορά μεταξύ της βασικής γραμμής και του πιο υπερπολωμένου σημείου που εμφανιζόταν εντός 3 ms μετά το όριο AP για fast-AHP(fAHP) και 10–50 ms μετά το όριο AP για μεσαίο AHP(mAHP).

Η ανύψωση και η πτώση κορυφής AP ορίστηκαν ως η μέγιστη κλίση (DmV/Dms) για την άνοδο και την αποσύνθεση AP, αντίστοιχα. Το δυναμικό της μεμβράνης γραμμής βάσης υπολογίστηκε ως η μέση τάση στη σάρωση 1400-ms κατά τη διάρκεια του βήματος 0-pA. Τα αρχικά πειράματα έγιναν απουσία συναπτικών αποκλειστών για να προσδιοριστεί πώς το φύλο και η ώρα της ημέρας συμβάλλουν στη διεγερσιμότητα του πυραμιδικού νευρώνα CA1 στο άθικτο κύκλωμα. Για να αρχίσει να αξιολογείται η επίδραση της συναπτικής μετάδοσης στην ενισχυμένη διεγερσιμότητα τη νύχτα, διεξήχθη ένα ξεχωριστό πείραμα παρακολούθησης παρουσία του ανταγωνιστή GABAA, γκαβαζίνης (10 mM) και των γλουταμινεργικών ανταγωνιστών, NBQX (10 mM) και CPP (5 mM) .

Ανοσοϊστοχημεία

Για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα που καταγράφηκαν για τη μέτρηση των μετασυναπτικών ρευμάτων ήταν πυραμιδικά κύτταρα CA1, όλα τα κύτταρα γεμίστηκαν με βιοκυτίνη για τουλάχιστον 20 λεπτά. Οι φέτες που περιείχαν γεμάτα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για τουλάχιστον 24 ώρες, στη συνέχεια πλύθηκαν για 3 10 λεπτά σε PBS και επωάστηκαν για 2-3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα TBS που περιείχε 10% NDS, 3% BSA, 1% γλυκίνη, 0,4 % Triton X-100 και στρεπταβιδίνη-488(1:1000).

Οι φέτες στη συνέχεια πλύθηκαν για 3 και 10 λεπτά σε PBS και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και καλυπτρίδες με μέσα στερέωσης ProLongGold Antifade που περιέχουν DAPI. Οι διαφάνειες οπτικοποιήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού BZ-X700 (Keyence). Οποιαδήποτε κύτταρα δεν μπορούσαν να ταξινομηθούν ως CA1 πυραμιδικά κύτταρα με βάση τη θέση και τη μορφολογία εξαιρέθηκαν από την ανάλυση.

Ανάλυση και στατιστική
Τα δεδομένα αναλύθηκαν και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS (έκδοση 27/28) και λογισμικό Prism-GraphPad. Οι υποθέσεις των παραμετρικών δοκιμών, συμπεριλαμβανομένης της κανονικότητας και της ομοιογένειας της διακύμανσης αξιολογήθηκαν, και εάν παραβιάζονταν, τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν ή χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές δοκιμές. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, η σημασία αποδόθηκε στο p, 0.05. Μια σύνοψη όλων των στατιστικών δοκιμών παρέχεται στον Πίνακα ExtendedData 1-1.

Μνήμη θέσης αντικειμένου

Τα δεδομένα OLM αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανεξάρτητη αμφίδρομη ANOVA με την ώρα της ημέρας και το φύλο ως ανεξάρτητες μεταβλητές και τον δείκτη διάκρισης ως εξαρτημένη μεταβλητή (Εικ. 1D). Χρησιμοποιήθηκε μια συσχέτιση Pearson για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ του συνολικού χρόνου εξερεύνησης και των βαθμολογιών του δείκτη διάκρισης και μια ανάλυση έκτακτης ανάγκης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κατανομής των υψηλών έναντι των χαμηλών χρόνων εξερεύνησης μεταξύ του φύλου και της ώρας της ημέρας (ExtendedData Σχήμα 1-1B) .

Καταγραφές πεδίου

Τα δεδομένα εισόδου-εξόδου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό μικτό μοντέλο με κλίση fEPSP ως συνάρτηση της ώρας της ημέρας, του φύλου και της έντασης διέγερσης. Για τα πειράματα LTP, οι κλίσεις του fEPSP κανονικοποιήθηκαν στις βασικές αποκρίσεις και οι αποκρίσεις που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 λεπτών της περιόδου καταγραφής 40-λεπτού μετά το HFS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια τριμερή ANOVA με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (RM-ANOVA).

Ηλεκτροφυσιολογία εμπλάστρου-σφιγκτήρα ολόκληρου κυττάρου

Τα μετασυναπτικά ρεύματα (ανασταλτικά και διεγερτικά) ανιχνεύθηκαν αυτόματα από μια εγγραφή 5-λεπτών χρησιμοποιώντας την αναζήτηση προτύπου συμβάντων του pClamp και, στη συνέχεια, επιθεωρήθηκαν χειροκίνητα για ανίχνευση ψευδών συμβάντων. Τα πλάτη και το ενδιάμεσο διάστημα (IEI) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια γενικευμένη εξίσωση εκτίμησης (GEE) που επέτρεψε εκτιμήσεις παραμέτρων με μοντέλα με μέσο όρο πληθυσμού, ενώ έλαβε υπόψη τους συσχετισμούς μεταξύ επαναλαμβανόμενων μετρήσεων εντός των υποκειμένων (Reed and Kaas, 2010· Cook et al., 2016).

Το μοντέλο GEE προσδιόρισε μια μη δομημένη δομή συσχέτισης εργασίας, μια επίδραση υποκειμένου του κυττάρου και μια επίδραση εντός υποκειμένου μετασυναπτικών γεγονότων. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα είχαν μια σημαντική θετική λοξή με ακραίες τιμές και, επομένως, περικόπηκαν από τα ανώτερα και κατώτερα ακραία σημεία (10%) ακολουθούμενα από έναν μετασχηματισμό καταγραφής στην περίπτωση των δεδομένων πλάτους ή έναν μετασχηματισμό log 1 1 στην περίπτωση των δεδομένων IEI , να πληρούνται οι υποθέσεις των κανονικών κατανομών πριν από την ανάλυση.

Όλα τα δεδομένα του σφιγκτήρα ρεύματος αναλύθηκαν με το EasyElectrophysiology (Easy Electrophysiology, RRID: SCR_021190), ένα πακέτο λογισμικού που χρησιμοποιεί το Neo (Garcia etal., 2014). Τα δυναμικά ενεργειών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μονάδα Action Potential Counting με τον προεπιλεγμένο αλγόριθμο AutoThreshold Spike. Χρησιμοποιήθηκε ένα RM-ANOVA για την ανάλυση των δυνατοτήτων δράσης στα τρέχοντα βήματα στα οποία τα δεδομένα δεν παραβίαζαν τις παραδοχές γραμμικότητας και κανονικότητας: 160–400 pA. Όλες οι άλλες ιδιότητες της μεμβράνης (Πίνακες 1, 2) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ANOVA με ανεξάρτητες μεταβλητές ώρας της ημέρας και φύλου. Όλα τα δεδομένα του σφιγκτήρα ρεύματος στρωματοποιήθηκαν με βάση τη θέση κατά μήκος του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα πριν από την τελική στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

Οι διαφορές ημέρας-νύχτας στην απόδοση του OLM εξαρτώνται από το φύλο

Για να εξετάσουμε την επίδραση του σεξ στους κιρκαδικούς ρυθμούς μάθησης και μνήμης, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία μνήμης θέσης αντικειμένων (OLM), η οποία βασίζεται στην τάση ενός ποντικιού να εξερευνά αντικείμενα σε νέες τοποθεσίες, για να αξιολογήσει την ιπποκαμπική χωρική μνήμη (Barker and Warburton, 2011, Takahashiet al ., 2013· Chao et al., 2016). Αν και έχουν αναφερθεί κιρκαδικές και ημερήσιες διαφορές στην απόδοση στο OLM (Takahashi et al., 2013; Snider et al., 2016), η επίδραση του φύλου στην ημερήσια διακύμανση στην απόδοση του OLM παραμένει ελάχιστα κατανοητή.

Βρήκαμε ότι η απόδοση του OLM ποικίλλει ανάλογα με την ώρα της ημέρας. Ωστόσο, το μοτίβο της ημερήσιας διαφοράς στην απόδοση διέφερε μεταξύ των φύλων (ρ=0.023, αμφίδρομη αλληλεπίδραση ANOVA).

Ενώ τα αρσενικά είχαν καλύτερες επιδόσεις τη νύχτα σε σύγκριση με την ημέρα, όπως αναμενόταν (p {{{0}}.028, απλά κύρια εφέ που συγκρίνουν τη νύχτα σε αρσενικά· Εικ. 1D), τα θηλυκά ποντίκια είχαν καλύτερες επιδόσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας σε σύγκριση με τη νύχτα (p=0.004, απλά κύρια εφέ που συγκρίνουν την ημέρα με τη νύχτα στις γυναίκες· Εικ. 1D). Δεν υπήρξε καμία επίδραση της ώρας της ημέρας ή του φύλου στον συνολικό χρόνο εξερεύνησης (p=0.926 και 0.936, αμφίδρομα κύρια εφέ ANOVA· Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 1-1Α). Δεν υπήρχε σχέση μεταξύ της συνολικής εξερεύνησης και των DIscores (r(52)=0.053, ns p=0.704, συσχέτιση Pearson· Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 1-1B).

Το μέγεθος LTP τη νύχτα είναι μεγαλύτερο από την ημέρα, ανεξάρτητα από το φύλο
Η μακροπρόθεσμη ενίσχυση (LTP) θεωρείται κυτταρικός συσχετισμός μάθησης και μνήμης. Το LTP στις συνάψεις CA3-CA1 είναι υψηλότερο τη νύχτα σε σύγκριση με την ημέρα στην κακοήθεια (Chaudhury et al., 2005; Besing et al., 2017; Davis etal., 2020), αλλά από ό,τι γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν δημοσιευμένες αναφορές των επιπτώσεων της ώρας της ημέρας σε μέγεθος LTP σε ενήλικα θηλυκά ποντίκια. Δεδομένου του ευρήματός μας ότι οι ημερήσιες διαφορές στην απόδοση σε μια δοκιμασία μνήμης εξαρτώμενης από τον ιππόκαμπο εξαρτώνται από το φύλο, στη συνέχεια προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν το φύλο επηρεάζει τις ημερήσιες διαφορές στο LTP.

Πρώτον, για να αξιολογήσουμε την ισχύ της βασικής συναπτικής μετάδοσης στις συνάψεις CA{{0}}CA1, δημιουργήσαμε καμπύλες εισόδου/εξόδου μετρώντας την κλίση fEPSP από την αδράνεια ακτινοβολίας στρώματος CA1 στην παράπλευρη διέγερση Schaffer σε μια σειρά αυξανόμενων εντάσεων διέγερσης ( 0.2–200 mA, D 10 mA) κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια (Εικ. 2A,B). Ενώ ούτε το φύλο ούτε η ώρα της ημέρας είχαν σημαντική επίδραση στη βασική συναπτική μετάδοση στο εύρος ερεθισμάτων που δοκιμάστηκε (ρ=0.552 και 0,981, αντίστοιχα, LMM κύρια επίδραση), υπήρξε σημαντική αλληλεπίδραση έντασης φύλου προς διέγερση ( ρ, 0,001, LMM· Εικ. 2Α, Β).

Τα αρσενικά είχαν μεγαλύτερες κλίσεις fEPSP σε σύγκριση με τα θηλυκά μόνο στα 180, 190 και 200 ​​mA, ανεξάρτητα από την ώρα της ημέρας (p =0.041, 0.043 και 0.035, αντίστοιχα. απλά κύρια εφέ συγκρίνοντας αρσενικά και θηλυκά σε όλες τις εντάσεις διέγερσης· Εικ. 2Α). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ώρα της ημέρας δεν επηρεάζει τη βασική συναπτική μετάδοση και ότι το σεξ επηρεάζει τις αποκρίσεις μόνο στις υψηλότερες εντάσεις διέγερσης.

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τη συναπτική πλαστικότητα στη σύναψη CA3-CA1 μετρώντας το LTP ως απόκριση σε μια σύντομη διέγερση υψηλής συχνότητας (HFS; Εικ. 2C, D). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το μέγεθος του LTP ήταν μεγαλύτερο τη νύχτα σε σύγκριση με την ημέρα τόσο στα αρσενικά όσο και στα θηλυκά ποντίκια (ρ =0.003, τριμερής RM-ANOVA; Εικ. 2C, D). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική επίδραση ή αλληλεπίδραση με το σεξ. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η ώρα της ημέρας επηρεάζει τη συναπτική πλαστικότητα σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια, χωρίς να επηρεάζει τη βασική συναπτική ισχύ.

Η συναπτική αναστολή στα πυραμιδικά κύτταρα CA1 κατά τη διάρκεια της ημέρας είναι μεγαλύτερη από τη νύχτα, ανεξάρτητα από το φύλο

Οι αλλαγές στο LTP μπορούν να αποδοθούν σε συναπτικούς μηχανισμούς ή/και εγγενείς αλλαγές στη διεγερσιμότητα. Επομένως, αρχικά προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν η ώρα της ημέρας και το σεξ επηρεάζουν την ανασταλτική και διεγερτική συναπτική μετάδοση στους πυραμιδικούς νευρώνες του CA1. Για να εξετάσουμε τη συναπτική αναστολή σε πυραμιδικά κύτταρα CA1, μετρήσαμε το πλάτος και τη συχνότητα των αυθόρμητων IPSC (sIPSCs) χρησιμοποιώντας σφιγκτήρα τάσης ολόκληρων κυττάρων σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας (Εικ. 3Α). Βρήκαμε ότι το διάστημα παρεμβάσεων sIPSC (IEI) κατά τη διάρκεια της ημέρας ήταν μικρότερο από ό,τι τη νύχτα, ανεξάρτητα από το φύλο (ώρα της ημέρας: p=0).033, GEE; Εικ. 3A, C), υποδεικνύοντας μεγαλύτερη συχνότητα ανασταλτικών συμβάντων κατά τη διάρκεια της ημέρας.

Το πλάτος των sIPSC κατά τη διάρκεια της ημέρας ήταν μεγαλύτερο από ό,τι τη νύχτα τόσο στα αρσενικά όσο και στα θηλυκά (time-of-day:p=0.008, GEE; Εικ. 3A, E). Αυτή η αυξημένη συχνότητα ημέρας και το εύρος των sIPSC υποδηλώνουν ισχυρότερη αναστολή των πυραμιδικών νευρώνων CA1 κατά τη διάρκεια της ημέρας σε σύγκριση με τη νύχτα.

Η ισχυρότερη συναπτική αναστολή κατά τη διάρκεια της ημέρας θα μπορούσε να προκύψει από την αύξηση της προσυναπτικής απελευθέρωσης GABA ή από την αυξημένη μετασυναπτική λειτουργία GABAAR. Για να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των δυνατοτήτων, μετρήσαμε μικροσκοπικά IPSCS (mIPSCs) παρουσία της τετροδοτοξίνης αναστολέα διαύλων νατρίου (TTX) με περιορισμένη τάση, τόσο σε αρσενικά όσο και σε θηλυκά ποντίκια κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας (Εικ. 4Α). Ενώ διαπιστώσαμε ότι ούτε το φύλο (p=0.392,GEE) ούτε η ώρα της ημέρας (ρ=0.760, GEE) είχαν στατιστικά σημαντική επίδραση στο mIPSC IEI, τα συμβάντα από τους άνδρες έτειναν να εμφανίζουν διαφορά ημέρας-νύχτας (ρ= 0.068, αλληλεπίδραση μεταξύ του φύλου, ώρα της ημέρας, GEE; Εικ. 3Γ).

Η έλλειψη διαφορών ημέρας-νύχτας στα θηλυκά δείχνει ότι οι επιπτώσεις της ώρας της ημέρας στα sIPSC πιθανότατα οφείλονται στην τοπική πυροδότηση του δυναμικού δράσης μεταξύ των νευρώνων. Στους άντρες, οι μέσες τιμές μεταξύ ημέρας και νύχτας διέφεραν κατά;12 ms (μέσος όρος και SEM: ημέρα ανδρών, 98.24 61.05 ms, νύχτα για άνδρες, 85.78 6 1.04 ms), υποδηλώνοντας αυτή την ενέργεια. Η ανεξάρτητη από το δυναμικό ανασταλτική απελευθέρωση κυστιδίων μπορεί να είναι πιο συχνή τη νύχτα (Εικ. 3C). Όταν εξετάσαμε το πλάτος του mIPSC, βρήκαμε απροσδόκητα μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ της ώρας της ημέρας και του φύλου (p=0.038,GEE), με τα πλάτη στις γυναίκες να είναι μεγαλύτερα από τα αρσενικά κατά τη διάρκεια της ημέρας (p {{16} }.006, Wald x2 συγκρίσεις ανά ζεύγη· Εικ. 4Ε); Ωστόσο, αυτή; .

Συνολικά, αυτά τα αυθόρμητα και μικροσκοπικά δεδομένα IPSC υποδηλώνουν ότι η αναστολή που εξαρτάται από το δυναμικό δράσης, αλλά όχι η αυθόρμητη σύντηξη κυστιδίων, στα πυραμιδικά κύτταρα CA1 είναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια της ημέρας σε σύγκριση με τη νύχτα τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες.

Η συναπτική διέγερση στα πυραμιδικά κύτταρα CA1 εξαρτάται από το φύλο

Στη συνέχεια θέλαμε να προσδιορίσουμε εάν η αυθόρμητη διεγερτική συναπτική είσοδος στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 επηρεάστηκε από το φύλο και την ώρα της ημέρας. Αρχικά, μετρήσαμε τα αυθόρμητα EPSCs (sEPSCs) χρησιμοποιώντας εγγραφές με σφιγκτήρα τάσης ολόκληρων κυψελών (Εικ. 5Α). Αν και δεν υπήρχε σημαντική κύρια επίδραση της ώρας της ημέρας στο πλάτος του sEPSC (Εικ. 5Ε), ανεξάρτητα από το φύλο (p=0.371, GEE), η στατιστική τάση για μια σημαντική κύρια επίδραση του χρόνου ημέρα έδειξε ότι το sEPSC IEI που καταγράφηκε κατά τη διάρκεια της ημέρας μπορεί να είναι μεγαλύτερο από εκείνο που καταγράφηκε τη νύχτα (p=0.052,GEE), υποδηλώνοντας μεγαλύτερη συχνότητα διεγερτικών γεγονότων τη νύχτα (Εικ. 5C). Συνολικά, διαπιστώσαμε ότι τα θηλυκά είχαν περισσότερη διεγερτική συναπτική είσοδο, με μεγαλύτερα sEPSC πλάτος και μικρότερο IEI σε σύγκριση με τα αρσενικά (p=0.022 και 0.020, αντίστοιχα, κύρια επίδραση του φύλου,GEE; Εικ. 5C, E).

Στη συνέχεια, επαναλάβαμε αυτά τα πειράματα παρουσία της τετροδοτοξίνης αποκλειστή διαύλων νατρίου (TTX) και μετρήσαμε μικροσκοπικά αυθόρμητα διεγερτικά συναπτικά ρεύματα (mEPSCs) σε πυραμιδικούς νευρώνες CA1 (Εικ. 6Α). Το πλάτος των mEPSC δεν διέφερε ανάλογα με το φύλο ή το χρόνο of-day(p= 0.227 and p= 0.150, κύρια επίδραση του φύλου και της ώρας της ημέρας, αντίστοιχα, GEE; Εικ. 6E); Ωστόσο, οι παραλλαγές ημέρας-νύχτας inmEPSC IEI εξαρτιόνταν από το φύλο (ρ= 0.021, αλληλεπίδραση φύλου κατά τη διάρκεια της ημέρας, GEE· Εικ. 6C). Στα αρσενικά, το mEPSC IEI ήταν μικρότερο τη νύχτα από ό,τι κατά τη διάρκεια της ημέρας (p= 0.002, Wald x2 συγκρίσεις ανά ζεύγη), υποδεικνύοντας μεγαλύτερη συχνότητα διεγερτικών συμβάντων τη νύχτα σε αρσενικά ποντίκια και επομένως μια πιθανή αύξηση στην πιθανότητα προσυναπτικής απελευθέρωσης. Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά ημέρας-νύχτας στα θηλυκά (ρ= 0.765,Wald x2 συγκρίσεις ανά ζεύγη· Εικ. 6C).

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η τάση προς αυξημένη συχνότητα sEPSC κατά τη διάρκεια της νύχτας (ειδικά στις γυναίκες) εξαρτάται από το δυναμικό δράσης. Ωστόσο, στα αρσενικά, ο αποκλεισμός των δυνατοτήτων δράσης αποκαλύπτει αύξηση της συχνότητας κατά τη διάρκεια της νύχτας που δεν παρατηρήθηκε σε αυτά τα EPSC.

Οι πυραμιδικοί νευρώνες CA1 είναι πιο διεγερτικοί τη νύχτα

Γενικά, οι παρατηρήσεις μας υποδηλώνουν ότι η συναπτική αναστολή είναι μεγαλύτερη τη νύχτα και η συναπτική διέγερση είναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια της ημέρας. Έτσι, στη συνέχεια θέλαμε να προσδιορίσουμε εάν αυτή η αντίθετη ημερήσια διακύμανση στη συναπτική διεγερτική και ανασταλτική είσοδο οδηγεί σε ημερήσια διακύμανση στη διεγερσιμότητα του πυραμιδικού νευρώνα CA1. Για το σκοπό αυτό, επιδιορθώσαμε τα πυραμιδικά κύτταρα CA1 σε λειτουργία σύσφιξης ρεύματος με το κύκλωμα άθικτο (δηλ. απουσία συναπτικών ανταγωνιστών) και χωρίς δυναμικό μεμβράνης σύσφιξης. Εγχύαμε αυξανόμενες ποσότητες ρεύματος εκπόλωσης (0–500 pA, D 20 pA, 1000-ms διάρκεια) σε πυραμιδικούς νευρώνες και μετρήσαμε τον αριθμό των δυναμικών δράσης που προκλήθηκαν.

Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από νευρώνες σε όλο τον πρόσθιο-οπίσθιο άξονα του ιππόκαμπου. Προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες βρήκαν ηλεκτροφυσιολογική ποικιλομορφία στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 που εξαρτώνται από τη θέση κατά μήκος των αξόνων (Spruston, 2008; Marcelin et al., 2012; Dougherty et al., 2012, 2013; Hönigsperger et al., 2015, Johns; Malik et al., 2016· Milior et al., 2016); Επομένως, επιλέξαμε να λάβουμε υπόψη αυτόν τον παράγοντα ταξινομώντας όλους τους νευρώνες είτε ως "πρόσθιους" ή "οπίσθιους" με βάση την ανατομία της στεφανιαίας τομής (Allen Reference Atlas από https://atlas.brain-map.org/; Εικ. 7Α).

Όταν συμπεριλάβαμε τον πρόσθιο-οπίσθιο άξονα έναν παράγοντα στο αρχικό μας μοντέλο ANOVA που αξιολογεί πολλά δυναμικά δράσης ανά τρέχον βήμα, διαπιστώσαμε ότι ο μεγαλύτερος παράγοντας που συνέβαλε ήταν η περιοχή (p= 0.005, κύριο αποτέλεσμα, τετραδρομική RM-ANOVA). Επιπλέον, βρέθηκαν σημαντικές περιφερειακές διαφορές για την αντίσταση εισόδου (A: 64.27 6 1.95 MX, P:75.90 6 2.47 MX, p, 0.001, ANOVA τριών κατευθύνσεων), ρεόβαση (A : 146.69 6 7.50 pA, P: 112.32 6 6.10 pA, p, 0,001, ANOVA τριών κατευθύνσεων) και Imax ή ρεύμα στο οποίο οι νευρώνες εκπέμπουν τη μέγιστη συχνότητα (A: 417.{ {23}}.29 pA. P: 386.90 610.82 pA, p= 0.047, ANOVA τριών κατευθύνσεων).

Αυτές οι διαφορές μεταξύ πρόσθιων και οπίσθιων νευρώνων ευθυγραμμίζονται με προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες που βρήκαν ποικιλομορφία μεταξύ των ραχιαίων και κοιλιακών πυραμιδικών νευρώνων CA1. Ενώ η προετοιμασία της στεφανιαίας τομής δεν μας επέτρεψε να απομονώσουμε πλήρως το κοιλιακό CA1, οι οπίσθιες τομές είναι πιο πιθανό να περιλαμβάνουν μερικούς κοιλιακούς νευρώνες CA1. διαπίστωσε ότι οι οπίσθιοι νευρώνες είχαν ιδιότητες σύμφωνες με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα στους πυραμιδικούς νευρώνες του κοιλιακού CA1, ενώ οι πρόσθιοι νευρώνες ήταν παρόμοιοι με τους ραχιαίους πυραμιδικούς νευρώνες (Dougherty et al., 2012; Malik et al., 2016).

For more information:1950477648nn@gmail.com