Ενίσχυση Top-Down Proteomics του εγκεφαλικού ιστού με FAIMS Μέρος 4

Προσδιορίσαμε επίσης πολλά θραύσματα που προέρχονται από μη κανονικές ισομορφές ματίσματος ταυπρωτεΐνης που είναι γνωστό ότι εκφράζονται στον ανθρώπινο εγκέφαλο.83 Συνοπτικά, οι ισομορφές tau ορίζονται από τον αριθμό των Ν-τερματικών ενθέτων λόγω εναλλακτικού ματίσματος του εξονίου 2 και/ή 3 (αναφέρεται ως0N, 1N και 2N) και τον αριθμό των επαναλήψεων δέσμευσης μικροσωληνίσκων λόγω εναλλακτικού ματίσματος του εξονίου 10 (αναφέρεται ως 3R ή 4R).84

Η πρωτεΐνη Tau είναι μια σημαντική πρωτεΐνη στα νευρωνικά κύτταρα, η οποία παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής δομής και λειτουργίας των νευρωνικών κυττάρων. Μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη tau σχετίζεται στενά με τη μνήμη και η μη φυσιολογική έκφρασή της μπορεί να οδηγήσει σε γνωστική έκπτωση και ακόμη και γνωστική εξασθένηση.

Οι επιστήμονες έχουν κάνει πολλή έρευνα για τη σχέση μεταξύ της πρωτεΐνης tau και της μνήμης. Σύμφωνα με έρευνα, η πρωτεΐνη tau μπορεί να βοηθήσει στη ρύθμιση της σταθερότητας των νευρικών ινών, προάγοντας έτσι τη μετάδοση πληροφοριών και το σχηματισμό μνήμης μεταξύ των νευρωνικών κυττάρων. Ωστόσο, από τη στιγμή που η πρωτεΐνη tau είναι μη φυσιολογική, όπως η συσσώρευση πρωτεΐνης, θα οδηγήσει σε σπάσιμο των νευρικών ινών και θάνατο μεγάλου αριθμού νευρωνικών κυττάρων, γεγονός που θα επηρεάσει το σχηματισμό και τη διατήρηση της μνήμης και θα οδηγήσει ακόμη και σε εξασθένηση της μνήμης. Επομένως, η διατήρηση της φυσιολογικής έκφρασης και λειτουργίας της πρωτεΐνης tau είναι πολύ σημαντική για τη διατήρηση της υγείας της μνήμης.

Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης βρει ότι τα θρεπτικά συστατικά που περιέχονται σε ορισμένα τρόφιμα και ποτά είναι επίσης ευεργετικά για τη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας της πρωτεΐνης tau. Για παράδειγμα, τα αντιοξειδωτικά, τα ωμέγα-3 λιπαρά οξέα και τα πλούσια σε καφεΐνη λαχανικά και φρούτα μπορούν να βοηθήσουν στη ρύθμιση της έκφρασης και της λειτουργίας της πρωτεΐνης tau, η οποία συμβάλλει στη βελτίωση της μνήμης και της γνωστικής λειτουργίας.

Επομένως, θα πρέπει να προσέχουμε τη διατήρηση καλών συνηθειών ζωής, τον έλεγχο της διατροφής, τη μείωση του στρες κ.λπ., για τη διατήρηση της φυσιολογικής έκφρασης και λειτουργίας της πρωτεΐνης ταυ. Ταυτόχρονα, η διατήρηση καλών συνηθειών μελέτης και η μέτρια άσκηση μπορούν επίσης να βοηθήσουν στην προώθηση της μετάδοσης πληροφοριών και του σχηματισμού μνήμης μεταξύ των νευρωνικών κυττάρων. Πιστεύω ότι όσο προσέχουμε τη διατήρηση ενός υγιεινού τρόπου ζωής, μπορούμε να έχουμε υγιή μνήμη και να απολαμβάνουμε τη ζωή καλύτερα. Αυτό δείχνει ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι τα ενδογενή θραύσματα του ταυ είναι ένα κοινό εύρημα στον ανθρώπινο εγκεφαλικό ιστό και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ο διαφορικός κατακερματισμός του ταυ μπορεί να παίζει ρόλο στην εξέλιξη της AD.85,86

Παρατηρήσαμε αρκετά θραύσματα που μπορούσαν ξεκάθαρα να διακρίνουν τα {{0}}N και 1N tau (Εικόνες 10A, S7 και S8). Το γεγονός ότι παρατηρούμε υψηλές φασματικές μετρήσεις για 0N (86 PrSMs) και 1N (91 PrSMs), αλλά δεν παρατηρούμε κανένα PrSM για 2N, ευθυγραμμίζεται με την προηγούμενη ποσοτική ανοσοστύπωση που βρέθηκε0N και 1N ως οι κυρίαρχες μορφές και κάνει ~ Το 91% του συνολικού ταυ ενώ το 2Ν αποτελεί μόνο το ~9%.87

Σχετικά με τη σαφή αντιστοίχιση των επαναλήψεων δέσμευσης μικροσωληνίσκων, παρατηρήσαμε φάσματα που θα μπορούσαν να αποδοθούν και στο 3R (Εικόνες 10A και S9) και στο 4R tau (Εικόνες 10Α και S10).

Το φειδωλό συμπέρασμα μας επέτρεψε να συμπεράνουμε ότι το braintau αντιπροσωπεύεται κυρίως από το μείγμα του 1N3R (Tau-B) ακολουθούμενο από τις συνδυαστικές μεταβλητές 0N4R (Tau-D), το οποίο συμφωνεί με προηγούμενες παρατηρήσεις.87,88

Ενώ άλλες ισομορφές ματίσματος είχαν επίσης μοναδικά θραύσματα, ο χαμηλός αριθμός φασματικών αντιστοιχιών (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Παραδόξως, τα Ν-άκρα των θραυσμάτων που περιέχουν την κυρίαρχη περιοχή R είναι συνέχεια από τα C-άκρα των θραυσμάτων που περιέχουν την κυρίαρχη περιοχή Ν, ή με άλλα λόγια, φαίνεται ότι είναι συνδεδεμένα θραύσματα που παράγονται από ένα πιθανό συμβάν πρωτεολυτικής διάσπασης (αναφέρεται ως τοποθεσία #1 στο Σχήμα 10Α). Επιπλέον, τα C-άκρα των πρωτεομορφών που περιέχουν την περιοχή 3Rand 4R μοιράζονται την ίδια θέση διάσπασης (αναφέρεται ως θέση #2 στο Σχήμα 10Α), παρόλο που οι ίδιες οι αλληλουχίες είναι διαφορετικές λόγω της παραλλαγής ματίσματος του εξονίου 10.

Ακόμη πιο εκπληκτικό είναι ότι όλες αυτές οι θέσεις διάσπασης βρίσκονται μέσα σε τρία καλά περιγραφόμενα μοτίβα δεξαπεπτιδίου.89–95 Το Σχήμα 10Β δείχνει όλα τα μοναδικά θραύσματα που αναγνωρίσαμε από τα σύνολα δεδομένων μας που θα μπορούσαν να χαρτογραφηθούν στην ισόμορφη tau 1N3R, καθώς και τη θέση της διάσπασης τοποθεσίες.

Η θέση διάσπασης #1 βρίσκεται μέσα στη δεύτερη πλούσια σε προλίνη περιοχή του tau, η οποία διαιρεί την εξαπεπτιδική αλληλουχία KVAVVR και παρέχει μία από τις ισχυρότερες θέσεις δέσμευσης για μικροσωληνίσκους (Εικόνα 10Β). και VQIINK, τα οποία έχουν αποδειχθεί ότι προκαλούν συσσωμάτωση του ταυ (Εικόνα 10Β).92–95

Είναι ενδιαφέρον ότι πολλά από τα θραύσματα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 10Β, ξεκινούν ή τελειώνουν στην εγγύτητα αυτών των δύο θέσεων διάσπασης. Κάθε ένα από αυτά τα εξαπεπτιδικά μοτίβα είναι γνωστό ότι σχηματίζει μια δομή, συχνά με τη μορφή φουρκέτας, η οποία βρίσκεται κάτω από τη συσσώρευση που εμπλέκεται σε διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. ικανό να διαταράξει τις περιοχές συσσώρευσης-σποράς τους.25,85,86

Τέλος, βρήκαμε πολυάριθμες φασματικές αντιστοιχίσεις για το Α που μπορούσαν να παρατηρηθούν αποκλειστικά με τη χρήση FAIMS.

Αυτές οι πρωτεομορφές Α, οι οποίες τυπικά απαιτούν ειδικές τεχνικές κλασμάτωσης ή χειρισμού για τη βελτίωση της ανάκτησης λόγω των υδρόφοβων και επιρρεπών στη συσσώρευση ιδιοτήτων τους, 9,16,97,98 παρατηρήθηκαν ανέπαφα χρησιμοποιώντας FAIMS εντός του εύρους −40 έως −50 CV.

Αυτό περιλαμβάνει τα κανονικά A 1–42 και A 1–40 (Εικόνα 11A, B, αντίστοιχα), καθώς και αρκετές N-τερματικές κολοβωμένες μορφές (συγκεκριμένα A 2–42 και A 4–42, Εικόνα 11C, D).

Αξίζει να σημειωθεί ότι οι πρωτεομορφές Α με διάφορες Ν- και C-τερματικές διασπάσεις είναι εξαιρετικά δύσκολο να αναγνωριστούν σε αναλύσεις από κάτω προς τα πάνω λόγω της ακραίας υδροφοβικότητας των θρυπτικών προϊόντων, γεγονός που υπογραμμίζει το πλεονέκτημα της ανάλυσης ανέπαφων πρωτεϊνών.

Πιστεύουμε ότι η μεθοδολογία FAIMS-TDP προσφέρει έναν ισχυρό τρόπο για την επίτευξη άθικτης ταυτοποίησης αυτών των πρωτεομορφών Α, επιτρέποντας τον εύκολο προσδιορισμό των διαφορετικών συνδυασμών Ν και C-τερματικών προϊόντων διάσπασης που υπάρχουν.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Περιγράψαμε πώς ο διαχωρισμός αντίστροφης φάσης νανο-LC ενός εξαιρετικά πολύπλοκου δείγματος που περιέχει πρωτεΐνες, σε μεγάλο εύρος μάζας, μπορεί να ωφεληθεί από την εφαρμογή της κλασματοποίησης της αέριας φάσης μέσω FAIMS στο πλαίσιο της φασματομετρίας μάζας από πάνω προς τα κάτω.

Το FAIMS αποδείχθηκε ότι επηρεάζει τη μετάδοση των πρωτεομορφών κατά μέγεθος και/ή φορτίο, μειώνοντας την πολυπλοκότητα του MS1 και επιτρέποντας μεγαλύτερο βάθος κάλυψης του πρωτεώματος.

Το FAIMS σε ένα μόνο CV (−50) επέτρεψε την αναγνώριση 1833 ± 17 μοναδικών πρωτεομορφών κατά μέσο όρο, υπερδιπλάσιο σε σύγκριση με χωρίς FAIMS (754 ± 35). Η προσθήκη του FAIMS δεν οδήγησε σε επιδείνωση της αναπαραγωγιμότητας ποσοτικοποίησης και παρέμεινε κοντά στο 20% RSD, το οποίο είναι συγκρίσιμο με τις προσεγγίσεις από κάτω προς τα πάνω χωρίς ετικέτα.

Η μείωση του CV του FAIMS σημειώθηκε για την αύξηση της μοριακής μάζας των ειδών ιόντων που μεταδίδονται στο όργανο (διάμεσος MWof ~5 kDa σε -50 CV έναντι ~15 kDa σε -20 CV) και παρατηρήθηκε επίσης τροποποίηση του CV για να επηρεάσει τη μετάδοση του κέλυφος κατάστασης φόρτισης πρωτεομορφής διαφορικά.

Ορίσαμε επίσης τους βέλτιστους συνδυασμούς βιογραφικών που θα μπορούσαν να παράγουν το μεγαλύτερο θεωρητικό μέγιστο κάλυψης πρωτεομορφών/γονιδίων ή αλληλουχίας πρωτεϊνών. Σε σύγκριση με τα τρία σύνολα δεδομένων "No FAIMS", το εξωτερικό CV στα −50, −40 και −30 V θα μπορούσε να υπερδιπλασιάσει τον αριθμό των μοναδικών πρωτεομορφών, των μοναδικών γονιδίων και της κάλυψης αλληλουχίας πρωτεώματος.

Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η εργασία μας διερεύνησε μόνο ένα σχετικά μικρό εύρος βιογραφικών το οποίο θεωρήσαμε ότι ταιριάζει καλύτερα στην προσέγγιση TDP μας χρησιμοποιώντας ένα σύνθετο δείγμα. Δεδομένου ότι το FAIMS μπορεί εύκολα να προσαρμοστεί σε άλλες μεθόδους, οι αναλύσεις MS1 χαμηλής ανάλυσης με αναλυτές Orbitrap ενδέχεται να είναι σε θέση να βελτιώσουν την αναγνώριση μεγαλύτερων πρωτεομορφών εντός του εύρους CV που δοκιμάσαμε, καθώς και πέραν των −20 V όπου πιθανώς να παρατηρηθούν μεγαλύτερες πρωτεομορφές.

Μπορεί επίσης να οραματιστεί ότι τα μελλοντικά όργανα αναλυτών μάζας που βελτιώνουν την απόκτηση μεγαλύτερων πρωτεομορφών και είναι συμβατά με το FAIMS μπορεί να ωφεληθούν από την εξερεύνηση CV κάτω από −20, επεκτείνοντας το εύρος θετικής τάσης.

Η ροή εργασίας TDP μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε και να χαρακτηρίσουμε μοναδικές πρωτεομορφές που προέρχονται από γονίδια με γνωστούς ρόλους σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες.

Αυτό περιελάμβανε τον προσδιορισμό της σύνθεσης μιας άγνωστης μετατόπισης μάζας που υπάρχει κοντά στην περιοχή δέσμευσης σιδήρου της -συνουκλεΐνης, η οποία χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό των θέσεων των πιθανών περιοχών δέσμευσης σιδήρου στο - και της συνουκλεΐνης επίσης. Το PARK7 βρέθηκε επίσης ότι τροποποιήθηκε με μια ομάδα ηλεκτρυλίου στο υπόλειμμα Cys της ενεργού θέσης του.

Μπορέσαμε να διακρίνουμε ξεκάθαρα τα θραύσματα tau που αντιστοιχούν σε ισομορφές παραλλαγής ματίσματος 0N, 1N, 3R και 4R μεμονωμένα και να περιγράψουμε νέες πρωτεολυτικές θέσεις διάσπασης που βρίσκονται εντός ή κοντά σε πολλές επαναλήψεις εξαπεπτιδίου συσσωμάτωσης.

Τέλος, το FAIMS επέτρεψε την αναγνώριση αρκετών ανέπαφων πρωτεομορφών Α, συμπεριλαμβανομένου του επιρρεπούς σε συσσωμάτωση A 1–42, χωρίς την ανάγκη σύνθετων τεχνικών κλασμάτωσης ή καθαρισμού.

Συνοπτικά, πιστεύουμε ότι η προσθήκη του FAIMS για την ανακάλυψη του TDP θα παρέχει μια ισχυρή και αναπαραγώγιμη μέθοδο για την αύξηση του πρωτεώματος που είναι διαθέσιμο για ανίχνευση και χαρακτηρισμό.

Συμπληρωματικό Υλικό

Ανατρέξτε στην έκδοση Web στο PubMed Central για συμπληρωματικό υλικό.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τον Tao Liu και τον Richard Smith για τις συμβουλές και τις χρήσιμες συζητήσεις τους.

Αυτή η εργασία υποστηρίχτηκε από τις U01 AG061356 (PLDJ) και R01 AG015819 (DAB). Ένα μέρος της έρευνας διεξήχθη χρησιμοποιώντας το EMSL (grid.436923.9), ένα DOE Office of Science User Facility που χρηματοδοτείται από το πρόγραμμα Biological and Environmental Research. Τα στοιχεία περίληψης γραφικών και εικόνας στο Σχήμα 1 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το Biorender.com.

ΑΝΑΦΟΡΕΣ

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Volset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Ξυλουργός DO; Carvalho F; Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE; Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hay SI; Irvani SSN; Jha RP;Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T;Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanapostani M; Mokdad AH; Mondello S;Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR;Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Pond CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A;Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Ροστάμι Α; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Σεπανλού Σ.Γ. ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketasubramanian N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Παγκόσμια, περιφερειακή και εθνική επιβάρυνση της νόσου του Αλτσχάιμερ και άλλων άνοιων, 1990–2016: μια συστηματική ανάλυση για τη μελέτη του παγκόσμιου φορτίου της νόσου 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Κατακτά την πρόδρομη πρωτεΐνη CL αμυλοειδούς (APP) και το βήτα Α4 αμυλοειδές στην αιτιολογία της νόσου του Αλτσχάιμερ: σχέσεις προδρόμου-προϊόντος στη διαταραχή της νευρωνικής λειτουργίας. Παθόλη εγκεφάλου. 1991, 1, 241-251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Η πρωτεΐνη Goedert M. Tau και η νευροϊνιδιακή παθολογία της νόσου του Alzheimer. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Το Gong CX Tau και η νευροεκφυλιστική νόσος: η ιστορία μέχρι στιγμής. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Τρεις διαστάσεις της υπόθεσης του αμυλοειδούς: χρόνος, χώρος και «φτερά άτομα». Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Takeda S. Tau Propagation as a Diagnostic and Therapeutic Target for Dementia: Potentials and Unanswered Questions. Εμπρός. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Πρωτεομική από πάνω προς τα κάτω στην υγεία και την ασθένεια: προκλήσεις και ευκαιρίες. Proteomics 2014, 14, 1195-1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει ανταγωνιστικό οικονομικό συμφέρον. ΜΙ; Popov IA; Nikolaev EN Ανάλυση φασματομετρίας μάζας της ποικιλότητας των πεπτιδίων Abeta: δυσκολίες και μελλοντικές προοπτικές για την ανακάλυψη βιοδεικτών AD. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Η φασματομετρία μάζας είναι ένα πολύπλευρο όπλο που χρησιμοποιείται στη μάχη κατά της νόσου του Alzheimer: Αμυλοειδές βήτα πεπτίδια και όχι μόνο. Φάσμα Μάζας. Αναθ. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev VP; Petyuk VA; Brewer HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Στρατόπεδο Δ; Smith RD;Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Ποσοτική LC-MSproteomics για τη νόσο του Alzheimer και κανονικά γηρασμένο ανθρώπινο εγκέφαλο χωρίς ετικέτα. J. Proteome Res. 2012, 11.3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Γρανάζια M; Wang PG; Πηγούνι LS; Li L. Η ολοκληρωμένη πρωτεομική και η ανάλυση δικτύου εντοπίζουν πρωτεϊνικούς κόμβους και αλλαγές δικτύου στη νόσο του Αλτσχάιμερ. ActaNeuropathol. Commun. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com