Επιδράσεις των γλυκοζιτών του Cistanche στη μάθηση της γνώσης και της συναπτικής πλαστικότητας σε αρουραίους μοντέλου στέρησης ύπνου

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Σκοπός:Για να διερευνήσει εάν οι γλυκοσίδες του cistanche μπορούν να βελτιώσουν τη μαθησιακή και γνωστική λειτουργία των αρουραίων μοντέλου στέρησης ύπνου ρυθμίζοντας τη συναπτική πλαστικότητα.

Μέθοδοι: Πενήντα αρσενικοί αρουραίοι Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε μια κενή ομάδα ελέγχου (Έλεγχος), ομάδα ελέγχου πλατφόρμας (PC), ομάδα μοντέλου (Μοντέλο),γλυκοσίδες της ομάδας κιστάνχης (GCs)και ομάδα εσταζολάμης (Est). Το μοντέλο στέρησης ύπνου των αρουραίων παρασκευάστηκε με μια τροποποιημένη μέθοδο υδατικού περιβάλλοντος πολλαπλών πλατφορμών. Ο υδάτινος λαβύρινθος Morris και η δοκιμή ανοιχτού πεδίου χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της χωρικής γνωστικής λειτουργίας και των συναισθηματικών αλλαγών των αρουραίων. Η χρώση Nissl χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση των αλλαγών στη μορφολογία και την ποσότητα των νευρικών κυττάρων στοπεριοχή CAl του ιππόκαμπου αρουραίων. Western blot και R'T - PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης της συναπτοφυσίνης (SY'N), της πυκνής ουσίας 95 μετασυναπτικής μεμβράνης (PSD -95) καινευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF). 

Αποτελέσματα;Τα αποτελέσματα του υδάτινου λαβύρινθου Morris έδειξαν ότι σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τομαθησιακή και γνωστική ικανότητα των αρουραίωνστην ομάδα Μοντέλο μειώθηκε σημαντικά (Π<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasβελτιωμένη θεραπεία GCs ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the επίπεδα πρωτεΐνης και γονιδιακής έκφρασης του BDNF, SYN και PSD -95στην ομάδα Mlodel μειώθηκαν σημαντικά (Σ<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΓΙΑΒΕΛΤΙΩΣΗ ΜΑΘΗΣΗΣ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑΓλυκοζίτες του κιστάνιου; Ιππόκαμπος; Στέρηση ύπνου? Μάθηση και μνήμη. Ανησυχία; Συναπτική πλαστικότητα

Διαταραχή ύπνου (SD)είναι αλειτουργική διαταραχή μη φυσιολογικού ύπνουπου προκαλείται από μια σειρά σύνθετων παραγόντων όπωςαϋπνία, ονειροπόληση, καιεύκολο ξύπνημα. Τα τελευταία χρόνια,η επίπτωση της ΣΔαυξανόταν σταδιακά. Σχετικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η ΣΔ μπορεί να προκαλέσεικαρδιαγγειακές παθήσεις,μεταβολική δυσλειτουργία,ασθένειες του ανοσοποιητικού, καικεντρικό νευρικό σύστημαεκφυλιστικές ασθένειες όπως η νόσος Αλτσχάιμερ [1]. Η ΣΔ μπορεί να προκαλέσει οξειδωτική βλάβη στους νευρώνες του ιππόκαμπου, να προκαλέσει γνωστική δυσλειτουργία και να προκαλέσει αλλαγές στη διάθεση, όπως άγχος και κατάθλιψη [2]. Το Cistanche deserticola είναι ένα πολύτιμο φαρμακευτικό υλικό που μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο ως φάρμακο όσο και ως τρόφιμο στην Κίνα. Έχει τα αποτελέσματα της τόνωσης των νεφρών και της αναπλήρωσης του τσι, ενυδάτωσης των εντέρων προάγοντας τις κινήσεις του εντέρου και ενισχύοντας το yang. Το κύριο εκχύλισμα Cistanche deserticola, οι γλυκοσίδες του cistanche (GCs), έχει αντιοξειδωτικές, αντι-αποπτωτικές, ηπατοπροστατευτικές και νευροπροστατευτικές επιδράσεις [3]. Η προηγούμενη έρευνά μας βρήκε ότι τα GCs μπορούν να βελτιώσουν τη μαθησιακή και γνωστική λειτουργία των ποντικών SAMP8 παίζοντας έναν αντιοξειδωτικό και αντι-αποπτωτικό ρόλο [4].

Σχετικές μελέτες έχουν δείξει ότι η γνωστική δυσλειτουργία που προκαλείται από ΣΔ σχετίζεται στενά με τη συναπτική πλαστικότητα [5]. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες αναφορές σχετικά με τον μηχανισμό με τον οποίο τα GC ρυθμίζουν τη συναπτική πλαστικότητα και βελτιώνουν τη μάθηση και τη μνήμη και τη γνωστική έκπτωση σε αρουραίους που προκαλείται από στέρηση ύπνου. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη στοχεύει να διερευνήσει εάν τα GC επηρεάζουν τη συναπτική πλαστικότητα ρυθμίζοντας την έκφραση δεικτών που σχετίζονται με συναπτικά, βελτιώνοντας έτσι τη μαθησιακή και γνωστική λειτουργία των αρουραίων με μοντέλα στέρησης ύπνου και να παρέχει νέες ιδέες και σχέδια θεραπείας για τα GC για τη θεραπεία της μάθησης και της γνωστικής βλάβη που προκαλείται από διαταραχές ύπνου.

1 Υλικά και μέθοδοι

1.1 Πειραματόζωα

Αρσενικοί αρουραίοι Wistar ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων, με βάρος 280 έως 300 g, αγοράστηκαν από το Beijing Sibeifu, με άδεια ζωικής παραγωγής [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν στο Κέντρο Πειραμάτων Ζώων του Ιατρικού Κολλεγίου Baotou υπό τις ακόλουθες συνθήκες: θερμοκρασία (24 ± 1) βαθμοί, υγρασία 50% έως 55%, 12 ώρες φως και 12 ώρες σκοτάδι και χωρίς περιορισμούς σε τροφή και νερό. Αυτό το πείραμα εγκρίθηκε από την επιτροπή σχολικής ηθικής [Baoyi Lunshen 2022 Αρ. (63)].

1. 2 Κύρια αντιδραστήρια και όργανα

Οι συνολικές γλυκοσίδες του Cistanche deserticola αγοράστηκαν από την Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (αριθμός παρτίδας: KSM20220609011). Τα δισκία εσταζολάμη αγοράστηκαν από την CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (αριθμός παρτίδας: 044220343). Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης πρωτεΐνης (Ρ1015), ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (R0010), διάλυμα χημειοφωταύγειας (ΡΕ0010), κ.λπ. αγοράστηκαν όλα από την Beijing Solebao. Η ουσία μετασυναπτικής πυκνότητας σε αντίσωμα 95 (PSD-95) (AB192757) και αντίσωμα συναπτοφυσίνης (SYN) (ab32127) αγοράστηκαν από την Abcam, USA Company. Ο νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF) (48503-2) και η -ακτίνη (52901) αγοράστηκαν από την SAB Company, ΗΠΑ. Το δευτερεύον αντίσωμα IgG κατσίκας κατά κουνελιού (SA00001-20) αγοράστηκε από την Proteintech Company, ΗΠΑ. Η μελατονίνη αρουραίου (MT) και το κιτ επιστημονικής έρευνας ELISA (MM-0657R1) αγοράστηκαν από την Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Παραφίνη τεμαχιστή (Leica, Γερμανία). οπτικό μικροσκόπιο (Leica, Γερμανία);

Λαβύρινθος νερού Morris, κιβώτιο δοκιμής ανοιχτού πεδίου (Shanghai Xinruan). συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης (Beijing Liuyi Company); σέικερ αποχρωματισμού (Beijing Liuyi Company); Σύστημα ανάλυσης απεικόνισης πρωτεϊνών (Τεχνολογία Shanghai Tanon); όργανο ποσοτικής PCR φθορισμού (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Πειραματικές μέθοδοι

1.3.1 Ομαδοποίηση ζώων και χορήγηση φαρμάκων

50 αρσενικοί αρουραίοι Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε κενή ομάδα ελέγχου (ομάδα ελέγχου), ομάδα ελέγχου πλατφόρμας (πλατφόρμα ελέγχου, ομάδα PC), ομάδα μοντέλου (ομάδα μοντέλου), ολικές γλυκοσίδες της ομάδας Cistanche deserticola (ομάδα GCs , 50 mg/kg) και ομάδα εσταζολίνης (ομάδα Est, 0,54 mg/kg), με 10 αρουραίους σε κάθε ομάδα. Η ομάδα ελέγχου και η ομάδα PC έλαβαν 0,9% αλατούχο διάλυμα με καθετήρα. Όλες οι ομάδες υποβλήθηκαν σε καθετήρα στις 7 π.μ. κάθε μέρα μετά την έναρξη της μοντελοποίησης, και ο καθετήρας διήρκεσε για 21 ημέρες.

1.3. 2. Προετοιμασία ζωικού μοντέλου στέρησης ύπνου

Το μοντέλο στέρησης ύπνου καθιερώθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο τροποποιημένου υδάτινου περιβάλλοντος πολλαπλών πλατφορμών [6]. Ο πειραματικός εξοπλισμός ήταν ένα ορθογώνιο δοχείο νερού από ρητίνη πολυαιθυλενίου 130 cm × 50 cm × 45 cm. Στη δεξαμενή νερού τοποθετήθηκε μια μικρή πλατφόρμα με διάμετρο 5 cm και ύψος 20 cm. Η πλατφόρμα της ομάδας PC είχε διάμετρο 10 cm και ύψος 20 cm. Η δεξαμενή νερού γεμίστηκε με νερό σε βάθος περίπου 18 cm και η θερμοκρασία του νερού διατηρήθηκε στους (20 ± 1) βαθμούς. Μία εβδομάδα πριν από την έναρξη του πειράματος, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν στο κουτί στέρησης ύπνου κάθε μέρα για 60 λεπτά για να εξοικειωθούν με το περιβάλλον. Μετά την καθιέρωση του μοντέλου, εκτός από την ομάδα ελέγχου, οι αρουραίοι κάθε ομάδας τοποθετήθηκαν στη μικρή πλατφόρμα εγκαίρως από τις 8 το πρωί έως τις 8 το βράδυ κάθε μέρα για στέρηση ύπνου για 21 συνεχόμενες ημέρες.

Όλοι οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και κινούνταν ελεύθερα στην πλατφόρμα. Ο κύκλος φωτός και σκότους ήταν 12 ώρες κάθε μέρα.

1. 3. 3 Πείραμα υδάτινου λαβύρινθου Morris

Ο υδάτινος λαβύρινθος Morris χωρίστηκε σε 4 περιοχές, γεμίστηκε με νερό και η πλατφόρμα τοποθετήθηκε στο 4ο τεταρτημόριο. Η επιφάνεια του νερού ήταν περίπου 2 cm πάνω από την πλατφόρμα. Στο νερό προστέθηκε βρώσιμη μελανίνη ποιότητας τροφίμων και η θερμοκρασία του νερού διατηρήθηκε στους (25 ± 1) βαθμούς. (1) Πείραμα πλοήγησης τοποθέτησης: Επιλέχθηκε το κέντρο κάθε περιοχής και οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν απαλά στο νερό. Τους επιτρεπόταν να εξερευνήσουν ελεύθερα. Ο χρόνος που χρειάστηκε για να βρουν οι αρουραίοι την πλατφόρμα στόχο μέσα σε 60 δευτερόλεπτα καταγράφηκε. Οι αρουραίοι που δεν βρήκαν την πλατφόρμα οδηγήθηκαν στην πλατφόρμα και παρέμειναν για 20 δευτερόλεπτα. Η εκπαίδευση συνεχίστηκε για 5 ημέρες. (2) Δοκιμή χωρικής εξερεύνησης: Την 6η ημέρα, η πλατφόρμα αφαιρέθηκε και οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν στο νερό από το κέντρο του 2ου τεταρτημορίου στον τοίχο. Καταγράφηκε ο αριθμός των φορών που οι αρουραίοι πέρασαν την πλατφόρμα μέσα σε 120 δευτερόλεπτα και ο χρόνος που παρέμειναν στο 4ο τεταρτημόριο.

1. 3. 4 Πείραμα ανοιχτού πεδίου

Χρησιμοποιήθηκε ένα πειραματικό κουτί 100 cm × 100 cm × 50 cm και ο πυθμένας του κουτιού χωρίστηκε σε 9 πλέγματα. Κάθε ομάδα αρουραίων τοποθετήθηκε εκ των προτέρων στο ανοιχτό πειραματικό δωμάτιο για να προσαρμοστεί στο εσωτερικό περιβάλλον για 60 λεπτά. Στην αρχή του πειράματος, οι δοκιμαστικοί αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε σταθερές γωνίες του πειραματικού κουτιού ανοιχτού πεδίου με τη σειρά τους και ο αριθμός των χρόνων παραμονής, η απόσταση κίνησης και ο στατικός χρόνος των αρουραίων εντός 5 λεπτών καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης συμπεριφοράς. Το περιβάλλον απαιτήθηκε να είναι ήσυχο κατά τη διάρκεια του πειράματος και η πειραματική συσκευή σκουπίστηκε με νερό και αλκοόλ αντίστοιχα μεταξύ δύο πειραμάτων για να αποτραπεί η επίδραση της μυρωδιάς του πρώτου αρουραίου στη συμπεριφορά του επόμενου αρουραίου.

1. 3. 5 Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA)

Ανίχνευση των επιπέδων ΜΤ στον ορό σε αρουραίους Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση και συλλέχθηκαν 5 mL αίματος από την κοιλιακή αορτή. Μετά από αναμονή για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, το αίμα φυγοκεντρήθηκε για να ληφθεί ορός. 40 μL αραιωτικού δείγματος προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και στη συνέχεια προστέθηκαν 10 μL του προς δοκιμή δείγματος. Μετά τη σφράγιση με μια μεμβράνη σφράγισης, η πλάκα επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Πλύθηκε 5 φορές, προστέθηκαν 50 μL διαλύματος σήμανσης ενζύμου και η πλάκα σφραγίστηκε με στεγανοποιητικό φιλμ και επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Πλύθηκαν 5 φορές, και στη συνέχεια το διάλυμα ανάπτυξης χρώματος και το διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης προστέθηκαν με τη σειρά. Η τιμή OD κάθε φρεατίου μετρήθηκε με έναν ενζυμικό σημαντήρα σε μήκος κύματος 450 nm.

1. 3. 6 Χρώση Nissl

Τρεις επίμυες επιλέχθηκαν από κάθε ομάδα και ο εγκεφαλικός ιστός αφαιρέθηκε με αποκεφαλισμό και σταθεροποιήθηκε με διάλυμα πολυοξυαιθυλενίου 4%. Ο ιστός αφυδατώθηκε, βυθίστηκε σε διάλυμα κεριού, ενσωματώθηκε και κόπηκε σε φέτες με συμβατικές μεθόδους. Οι φέτες διατηρήθηκαν με πάχος 5 μm, ξεπλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με 0.1% μπλε τολουιδίνης για 0.5 ώρες, διαφοροποιήθηκαν με 95% αλκοόλ, αφυδατώθηκαν με 100% αλκοόλ, διαφανή με ξυλόλιο, και σφραγισμένο με ουδέτερο κόμμι. Οι αλλαγές στη μορφολογία και τον αριθμό των νευρώνων στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου του αρουραίου παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο και συλλέχθηκαν εικόνες.

1. 3. 7 Πείραμα Western blot

Επιλέχθηκαν τέσσερις αρουραίοι από κάθε ομάδα και ο ιππόκαμπος απομονώθηκε με αποκεφαλισμό. Ο ιστός του ιππόκαμπου αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIP A σε περιβάλλον λουτρού πάγου και ο ιστός φυγοκεντρήθηκε για να ληφθεί το υπερκείμενο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο BCA. Προστέθηκαν 20 μg πρωτεΐνης με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης πρωτεΐνης για ηλεκτροφόρηση. Αφού ολοκληρώθηκε η ηλεκτροφόρηση πρωτεΐνης, η μεμβράνη μεταφέρθηκε σε σταθερή ροή 300 mA, μπλοκαρίστηκε με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη, το πρωτογενές αντίσωμα επωάστηκε στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα και το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Αφού χρησιμοποιήθηκε το διάλυμα ανάπτυξης χρώματος, οι ζώνες πρωτεΐνης αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης απεικόνισης χημειοφωταύγειας.

1. 3. 8 πείραμα RT-PCR

Τρεις επίμυες επιλέχθηκαν από κάθε ομάδα για την παρασκευή ομογενοποιήματος ιστού ιππόκαμπου. Το συνολικό RNA στο υγρό ιστού εκχυλίστηκε με τη μέθοδο Trizol και μετρήθηκε η συγκέντρωση. Ένα κιτ σύνθεσης cDNA fastking χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή και μια αντίδραση ποσοτικής ενίσχυσης φθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ποσοτικού φθορισμού για την ανίχνευση του σχετικού επιπέδου έκφρασης του mRNA πρωτεΐνης που σχετίζεται με συναπτικά. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 2-ΔΔCt. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1.

Πίνακας 1 Αλληλουχίες εκκινητών RT-PCR

1.4 Στατιστικές μέθοδοι

Τα αποτελέσματα των δεδομένων που συμμορφώθηκαν με την κανονική κατανομή εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (x ± s) και η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 9.5. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ πολλαπλών δειγμάτων και το P < 0.05 έδειξε ότι η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική.