Επιδράσεις του υπερφθοροοκτανοϊκού οξέος στη μικροχλωρίδα του εντέρου και στους μικροβιακούς μεταβολίτες σε ποντίκια C57BL/6JⅡ

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Των ζώων

Αρσενικά ποντίκια C57BL/6J, ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων, χωρίς παθογόνο, αγοράστηκαν από το Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ, ΗΠΑ). Τα ποντίκια κατανάλωναν πόσιμο νερό κατά βούληση. Η εγκατάσταση των ζώων στο Πανεπιστήμιο της Τζόρτζια διατηρήθηκε στους 22 ◦C και 40−70% υγρασία, σε κύκλο φωτός: σκοτάδι 12:12 ωρών. Πριν από το πείραμα έκθεσης στο PFOA, πέντε ποντίκια στεγάστηκαν σε ένα κλουβί και τα ποντίκια άλλαξαν κλουβιά τυχαία μία φορά την εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες. Η έκθεση στο PFOA ξεκίνησε όταν τα ποντίκια ήταν οκτώ εβδομάδων και η περίοδος έκθεσης διήρκεσε τέσσερις εβδομάδες. Στην αρχή του πειράματος, τα ποντίκια κατατάχθηκαν στην ομάδα έκθεσης PFOA ή στην ομάδα ελέγχου τυχαία (n=10 ποντίκια σε κάθε ομάδα), με ένα ποντίκι σε ένα κλουβί. Το PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) χορηγήθηκε σε ποντίκια μέσω πόσιμου νερού. Η τελική συγκέντρωση του PFOA στο πόσιμο νερό ήταν 1 μέρος ανά εκατομμύριο (ppm). Η δόση επιλέχθηκε με βάση την προηγούμενη μελέτη μας [24]. Τα ποντίκια ελέγχου κατανάλωναν πόσιμο νερό χωρίς την προσθήκη PFOA. Το πρωτόκολλο για τα ζώα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων, Πανεπιστήμιο της Γεωργίας (κωδικός πρωτοκόλλου: A2014 10-014-Y2-A1).

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΣΤΙΣ οικιακές θεραπείες για τη δυσκοιλιότητα

2.2. Εκχύλιση Μεταβολίτη

Η εκχύλιση των μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, 20 μL από κάθε δείγμα ορού εκχυλίστηκαν με 225 μL μεθανόλης. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν για 10 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, 750 μL μεθυλτριτ-βουτυλ αιθέρα (MTBE) και 188 μL νερού προστέθηκαν στα παραπάνω δείγματα για να προκληθεί διαχωρισμός φάσεων. Τα δείγματα ανακινήθηκαν στους 4 ◦C για 6 λεπτά, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στους 14,000× g για 2 λεπτά. Ο διαλύτης εκχύλισης απαερώθηκε και προψύχθηκε στους -20 ◦C. Η ανώτερη μη πολική φάση (350 μL) συλλέχθηκε και εξατμίστηκε μέχρι να στεγνώσει πλήρως χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή ψυχρής παγίδας Labconco Centrivap (Labconco, Κάνσας, ΜΟ, ΗΠΑ). Για δείγματα ήπατος και κοπράνων, προστέθηκαν 225 μL μεθανόλης και 750 μLMTBE σε 10 mg κάθε δείγματος. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) σε ταχύτητα 1500 rpm για 30 άμμο, στη συνέχεια στροβιλίστηκαν και ανακινήθηκαν στους 4 ◦C για 6 λεπτά. Στη συνέχεια, 188 μL νερού προστέθηκαν στα δείγματα, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στους 14,000× g για 2 λεπτά. Η ανώτερη μη πολική φάση (350 μL) συλλέχθηκε και εξατμίστηκε μέχρι να στεγνώσει πλήρως. Στη συνέχεια, τα ξηρά δείγματα επαναιωρήθηκαν σε 60 μL ακετονιτριλίου 4:1 και νερό (ν/ν) με εσωτερικά πρότυπα. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν, ακολουθούμενη από υπερήχηση για 5 λεπτά και φυγοκέντρηση στους 14°C, 000× g για 2 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε για ανάλυση LC-MS.

2.3. Μη στοχευμένη προφίλ μεταβολισμού

Το μη στοχευμένο προφίλ μεταβολισμού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Το σύστημα UHPLC Vanquish (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε για διαχωρισμό μεταβολιτών με μια στήλη Acquity UPLC BEH Amide (150 mm × 2,1 mm × 1,7 μm), η οποία συζεύχθηκε με ένα Acquity VanGuard BEH Amide pre- στήλη (5 mm χ 2,1 mm χ 1,7 μm, Waters, Milford, ΜΑ, ΗΠΑ). Νερό βαθμού LC-MS (100%) με 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο και 0.125% μυρμηκικό οξύ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση Α. Εν τω μεταξύ, ακετονιτρίλιο 95:5: νερό (v/v) που περιείχε 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο και 0,125% μυρμηκικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση Β. Η βαθμίδα άρχισε με 100% Β στο 0- 2 λεπτά, 70% Bat 7,7 λεπτά, 40% Β στα 9,5 λεπτά και 30% Β στα 10,25 λεπτά, ακολουθούμενο από 100% Β στα 12,75-16,75 λεπτά. Ο ρυθμός ροής διατηρήθηκε στα 0,4 mL/min. Τα φάσματα συλλέχθηκαν σε θετικό τρόπο ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) χρησιμοποιώντας Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Το εύρος μάζας ορίστηκε από m/z 60 έως 900 με μια λειτουργία που εξαρτάται από δεδομένα για την απόκτηση φασμάτων MS/MS. Τα μη στοχευμένα ακατέργαστα δεδομένα μεταβολομικής μετατράπηκαν για πρώτη φορά σε αρχεία ABF χρησιμοποιώντας τον μετατροπέα ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (πρόσβαση στις 6 Ιουλίου 2022)). Η έκδοση MSDIAL 5.1.0.1 χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση και την ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών [26]. Το Mass Spectral Feature List Optimizer (MS-FLO) χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση της ποιότητας των λιστών χαρακτηριστικών επισημάνοντας χαρακτηριστικά για περαιτέρω επεξεργασία δεδομένων [27]. Βιβλιοθήκες m/z χρόνου διατήρησηςκαι οι βάσεις δεδομένων φασμάτων Fiehn HILIC MS/MS στη MassBank της Βόρειας Αμερικής χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση των μεταβολιτών.

2.4. 16S rRNA Γονιδιακή Αλληλουχία

Το συνολικό DNA εξήχθη από δείγματα κοπράνων χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης DNA PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές 515F και 806R χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση της περιοχής V4 του γονιδίου 16S rRNA. με κανονικοποίηση και γραμμωτό κώδικα. Η αλληλουχία του DNA έγινε στο κιτ IlluminaMiSeq v2 με 500 κύκλους. Τα δεδομένα αλληλουχίας του γονιδίου 16S rRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) II [28]. Εν συντομία, τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας διαγράφηκαν μέσω του DADA2, ακολουθούμενη από επιλογή λειτουργικής ταξινομικής μονάδας (OTU). Το SILVA (έκδοση 138), που εκπαιδεύτηκε από τον ταξινομητή που βασίζεται στο scikit-learn Naïve-Bayes, χρησιμοποιήθηκε ως βάση δεδομένων.

2.5. Στατιστική ανάλυση

Το μέγεθος του αποτελέσματος της γραμμικής διάκρισης ανάλυσης (LEfSe) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των βακτηριακών γενών που ήταν πιο πιθανό να εξηγήσουν τις διαφορές μεταξύ του PFOA και των ομάδων ελέγχου [29]. Για τη σύγκριση των μεταβολιτών, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή Mann−Whitney U για τον υπολογισμό των τιμών p μεταξύ των ομάδων PFOA και ελέγχου. Το ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση των πολλαπλών συγκρίσεων. Μεταβολίτες με τιμή p < 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικοί. Η ανάλυση μερικής διάκρισης ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA) και η ανάλυση εμπλουτισμού διαδρομής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το MetaboAnalyst 5.0 [30]. Το MixOmics χρησιμοποιήθηκε για την ολοκληρωμένη ανάλυση της μικροχλωρίδας του εντέρου και των μεταβολιτών των κοπράνων — αυτό είναι ένα ολοκληρωμένο πλαίσιο για την πολυπαραγοντική ανάλυση των δεδομένων omics [31].

Φυσικό Βοτανικό Φάρμακο για την Ανακούφιση από τη Δυσκοιλιότητα-Σκιστάνο

Το Cistanche είναι ένα γένος παρασιτικών φυτών που ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae. Αυτά τα φυτά είναι γνωστά για τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες και χρησιμοποιούνται στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM) εδώ και αιώνες. Τα είδη Cistanche απαντώνται κυρίως σε άνυδρες και ερημικές περιοχές της Κίνας, της Μογγολίας και σε άλλα μέρη της Κεντρικής Ασίας. Τα φυτά Cistanche χαρακτηρίζονται από τους σαρκώδεις, κιτρινωπούς μίσχους τους και εκτιμώνται ιδιαίτερα για τα πιθανά οφέλη για την υγεία τους. Στο TCM, το Cistanche πιστεύεται ότι έχει τονωτικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται συνήθως για τη θρέψη των νεφρών, την ενίσχυση της ζωτικότητας και την υποστήριξη της σεξουαλικής λειτουργίας. Χρησιμοποιείται επίσης για την αντιμετώπιση ζητημάτων που σχετίζονται με τη γήρανση, την κούραση και τη γενική ευεξία. Ενώ το Cistanche έχει μακρά ιστορία χρήσης στην παραδοσιακή ιατρική, η επιστημονική έρευνα για την αποτελεσματικότητα και την ασφάλειά του είναι συνεχής και περιορισμένη. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι περιέχει διάφορες βιοδραστικές ενώσεις όπως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ιριδοειδή, λιγνάνες και πολυσακχαρίτες, οι οποίες μπορεί να συμβάλλουν στις φαρμακευτικές του επιδράσεις.

Wecistanche'sσκόνη cistanche, δισκία cistanche, κάψουλες cistanche, και άλλα προϊόντα αναπτύσσονται χρησιμοποιώνταςέρημοςκιστανάκιως πρώτες ύλες, που όλες έχουν καλή επίδραση στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός είναι ο εξής: Το Cistanche πιστεύεται ότι έχει πιθανά οφέλη για την ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα με βάση την παραδοσιακή χρήση του και ορισμένες ενώσεις που περιέχει. Ενώ η επιστημονική έρευνα ειδικά για την επίδραση του Cistanche στη δυσκοιλιότητα είναι περιορισμένη, πιστεύεται ότι έχει πολλαπλούς μηχανισμούς που μπορεί να συμβάλλουν στη δυνατότητά του να ανακουφίσει τη δυσκοιλιότητα. Υπακτικό αποτέλεσμα:Cistancheέχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική ως θεραπεία για τη δυσκοιλιότητα. Πιστεύεται ότι έχει ένα ήπιο καθαρτικό αποτέλεσμα, το οποίο μπορεί να βοηθήσει στην προώθηση των κινήσεων του εντέρου και να προκαλέσει δυσκοιλιότητα. Αυτή η επίδραση μπορεί να αποδοθεί σε διάφορες ενώσεις του Cistanche, όπως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες και πολυσακχαρίτες. Ενυδάτωση των εντέρων: Με βάση την παραδοσιακή χρήση, το Cistanche θεωρείται ότι έχει ενυδατικές ιδιότητες, στοχεύοντας συγκεκριμένα στα έντερα. Η προώθηση της ενυδάτωσης και της λίπανσης των εντέρων μπορεί να βοηθήσει να μαλακώσουν τα εργαλεία και να διευκολύνουν το πέρασμα, ανακουφίζοντας έτσι τη δυσκοιλιότητα. Αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα: Η δυσκοιλιότητα μπορεί μερικές φορές να σχετίζεται με φλεγμονή στο πεπτικό σύστημα. Το Cistanche περιέχει ορισμένες ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και των λιγνάνων, που πιστεύεται ότι έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Μειώνοντας τη φλεγμονή στα έντερα, μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της κανονικότητας των κινήσεων του εντέρου και στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα.