Επίδραση του εμβολιασμού πουλετών στην ανάπτυξη και τη μακροζωία της ανοσίας Μέρος 1

Αφηρημένη:

Η αναπνευστική νόσος των πτηνών προκαλεί σημαντικές οικονομικές απώλειες στα εμπορικά πουλερικά. Λόγω της ανάγκης προστασίας των μακρόβιων πουλερικών από παθογόνα της αναπνευστικής οδού από νεαρή ηλικία, τα προγράμματα εμβολιασμού για πουλερικά συνήθως περιλαμβάνουν σειριακή χορήγηση μιας ποικιλίας εμβολίων, συμπεριλαμβανομένου του ιού της λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV), του ιού της νόσου του Newcastle (NDV) και των λοιμωδών ιός λαρυγγοτραχειίτιδας (ILTV). Συχνά το διάστημα μεταξύ των εμβολιασμών είναι μόνο θέμα εβδομάδων, ωστόσο είναι άγνωστο εάν η ανάπτυξη ανοσίας και προστασίας έναντι πρόκλησης όταν τα εμβόλια χορηγούνται σε σύντομη διαδοχή συμβαίνει σε αυτά τα πτηνά, κάτι που είναι γνωστό ως ιογενής παρεμβολή. Ο στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε εάν τα σειριακά χορηγούμενα, ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια κατά του IBV, NDV και ILTV επηρεάζουν την ανάπτυξη και τη μακροζωία της ανοσίας και την προστασία έναντι των προκλήσεων σε μακρόβια πτηνά.

Με βάση ένα τυπικό πρόγραμμα εμβολιασμού πουλιών, σε λευκά leghorns απαλλαγμένα από συγκεκριμένα παθογόνα χορηγήθηκαν πολλαπλά ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια κατά του IBV, NDV και ILTV μέχρι την ηλικία των 16 εβδομάδων (WOA), μετά την οποία ορισμένες ομάδες προκλήθηκαν με IBV, NDV ή ILTV στα 20, 24, 28, 32 και 36 WOA. Πέντε ημέρες μετά την πρόκληση, το ιικό φορτίο, τα κλινικά σημεία, η κρυόσταση, η ιστοπαθολογία της τραχείας και οι τίτλοι αντισωμάτων στον ορό και τα δάκρυα αξιολογήθηκαν. Αποδεικνύουμε ότι τα πουλερικά που χορηγήθηκαν σειριακά ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια κατά IBV, NDV και ILTV προστατεύτηκαν από ομόλογη πρόκληση με IBV, NDV ή ILTV για τουλάχιστον 36 εβδομάδες και συμπεραίνουμε ότι το διάστημα μεταξύ των εμβολιασμών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (τουλάχιστον 2 εβδομάδες ) δεν παρενέβη στην προστασία. Αυτές οι πληροφορίες είναι σημαντικές επειδή δείχνουν ότι ένα τυπικό πρόγραμμα εμβολιασμού πουλιών που αποτελείται από σειριακά χορηγούμενα ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια κατά πολλαπλών παθογόνων του αναπνευστικού μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη προστατευτικής ανοσίας έναντι κάθε παράγοντα ασθένειας.

Μιλώντας για ανοσία, το ανθρώπινο σώμα έχει επίσης πολλά πράγματα που μπορούν να βελτιώσουν την ανοσία, όπως το Cistanche, το οποίο είναι επίσης πλούσιο σε βιολογικά δραστικές ουσίες, όπως πεπτίδια, τερπένια, φαινολικά οξέα κ.λπ., τα οποία μπορούν να διεγείρουν την ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού και βελτίωση των κυττάρων του ανοσοποιητικού. λειτουργούν και ενισχύουν την ανοσία του οργανισμού. Αυτές οι βιολογικά δραστικές ουσίες μπορούν επίσης να ρυθμίσουν και να ενεργοποιήσουν την αυτοάνοση λειτουργία του οργανισμού, βελτιώνοντας περαιτέρω την ανθρώπινη ανοσία.

Κάντε κλικ στο πότε για να πάρετε το cistanche

Λέξεις-κλειδιά:

Ιός λοιμώδους βρογχίτιδας; Ιός της νόσου Newcastle; ιός λοιμώδους λαρυγγοτραχειίτιδας. πρόγραμμα εμβολιασμού? ασυλία, ανοσία; ασθένεια του αναπνευστικού; κρυόσταση? απόκριση αντισωμάτων.

1. Εισαγωγή

Ο εμβολιασμός κατά της ιογενούς νόσου του αναπνευστικού είναι συνήθης πρακτική στις εμπορικές επιχειρήσεις πουλερικών. Τόσο τα ζωντανά όσο και τα νεκρά εμβόλια χορηγούνται στα πουλερικά και τα ζωντανά εμβόλια χρησιμοποιούνται συνήθως για μια ποικιλία παθογόνων, επειδή είναι αποτελεσματικά όταν εφαρμόζονται μαζικά και είναι σχετικά οικονομικά [1]. Γενικά, τα ζωντανά εμβόλια επάγουν τοπική και κυτταρομεσολαβούμενη ανοσία και παρέχουν ευρύτερη προστατευτική απόκριση από τα νεκρά εμβόλια, ενώ τα νεκρά εμβόλια προκαλούν κυρίως χυμική ανοσία και τείνουν να είναι ειδικά για αντιγόνο. Η διάρκεια της ανοσίας που επιτυγχάνεται μετά τη χορήγηση ζωντανού εμβολίου εξαρτάται από την ηλικία και τον τύπο του πτηνού, τα επίπεδα μητρικής ανοσίας, την ασθένεια που στοχεύει το εμβόλιο, την ανοσογονικότητα του εμβολίου, τη μέθοδο εφαρμογής του εμβολίου, τον αριθμό και το διάστημα μεταξύ των ενισχυτών, τη λοιμογόνο δύναμη και την ομοιότητα του ιού πρόκλησης πεδίου, το διάστημα μεταξύ εμβολιασμού και πρόκλησης, και ανοσοικανότητα του ξενιστή [1-3].

Ο ιός της λοιμώδους βρογχίτιδας από κορωνοϊό των πτηνών (IBV) είναι ένα ιικό παθογόνο της ανώτερης αναπνευστικής οδού των πουλερικών και οδηγεί σε μειωμένη αύξηση βάρους και αποτελεσματικότητα της τροφής, πτώση στην παραγωγή αυγών και την ποιότητα των αυγών, καθυστέρηση στην ανάπτυξη και δευτερογενή βακτηριακή λοίμωξη με αποτέλεσμα αεροσακουλίτιδα [4]. Ο ιός αναπαράγεται αρχικά στην ανώτερη αναπνευστική οδό, ακολουθούμενος από συστηματικό πολλαπλασιασμό στην αναπαραγωγική οδό και ορισμένα στελέχη μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στο νεφρό [4]. Τα μολυσμένα πτηνά μπορεί να εμφανίσουν ρινικές εκκρίσεις, βήχα, φτέρνισμα και τραχειακές ραγάδες [4]. Η ασθένεια προλαμβάνεται με εμβολιασμό και τα ζωντανά εμβόλια χρησιμοποιούνται συνήθως για την πρόκληση τοπικής ανοσίας και προστασίας. Τα ζωντανά εμβόλια χορηγούνται γενικά σε νεαρά πτηνά για την επίτευξη έγκαιρης προστασίας και τα στρώματα και οι εκτροφείς ενισχύονται επίσης με ζωντανά ή αδρανοποιημένα εμβόλια, τα οποία ποικίλλουν ανάλογα με την ομοιότητά τους με τους ιούς του κυκλοφορούντος αγρού [2].

Η νόσος του Newcastle (ND) προκαλείται από λοιμώδη στελέχη του παραμυξοϊού των πτηνών τύπου 1, ο οποίος πρόσφατα αναταξινομήθηκε ως ιός αυλακίου πτηνών 1 (AAvV-1) [5]. Ανάλογα με το στέλεχος του ιού, τα κλινικά σημεία της λοίμωξης από ND μπορεί να απουσιάζουν ή μπορεί να περιλαμβάνουν κατάθλιψη, ανορεξία, αναπνευστικά σημεία (ρινική έκκριση, φτέρνισμα, βήχας), μειωμένη παραγωγή και ποιότητα ωαρίων και νευρολογικά σημεία (ταρτικόλλης, κυκλική κυκλοφορία, παράλυση ) [3]. Τα στελέχη του ιού της νόσου των Newcastle (NDV) χαρακτηρίζονται ως λεντογόνα, μεσογόνα και βλαστικά, ανάλογα με τον μέσο χρόνο θανάτου τους στα έμβρυα [6]. Τα Lentogenic στελέχη είναι χαμηλής παθογονικότητας προκαλώντας ήπιες αναπνευστικές ή εντερικές λοιμώξεις, ακολουθούμενα από μεσογόνα στελέχη, ενώ τα velogenic στελέχη είναι εξαιρετικά παθογόνα προκαλώντας συχνά νευρολογικά σημεία και θνησιμότητα [3]. Τα σχήματα εμβολιασμού κατά του NDV ποικίλλουν και μπορεί να χρησιμοποιούν έναν συνδυασμό ζωντανών, αδρανοποιημένων και εμβολίων με ιό [7]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα παραδοσιακά στελέχη εμβολίων περιλαμβάνουν λεντογενή Β1 (ή κλώνους ιού του στελέχους Β1) και στελέχη LaSota [3].

Η λοιμώδης λαρυγγοτραχειίτιδα (ILT) είναι μια αναπνευστική νόσος των πουλερικών που προκαλείται από τον χολόχολο αλφαερπητοϊό Ι και είναι οικονομικά σημαντική παγκοσμίως [8]. Οι κλινικές εκδηλώσεις της ILT περιλαμβάνουν αυξημένη θνησιμότητα, μειωμένη παραγωγή ωαρίων, μειωμένη αύξηση σωματικού βάρους, επιπεφυκίτιδα, τραχειίτιδα με απόχρεμψη αιματηρής βλέννας σε σοβαρές περιπτώσεις, κατάθλιψη, σοβαρή δύσπνοια και ευαισθησία σε άλλα παθογόνα του αναπνευστικού. Τα ζωντανά εμβόλια κατά του ιού ILT (ILTV) μπορεί να είναι προέλευσης εμβρύου κοτόπουλου (CEO) ή προέλευσης ιστοκαλλιέργειας (TCO), στα οποία διοχετεύονται πολλές φορές σε αυγά ή ιστοκαλλιέργεια, αντίστοιχα. Αν και τα ανασυνδυασμένα εμβόλια για ILT είναι εμπορικά διαθέσιμα, το εμβόλιο CEO είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο εμβόλιο κατά του ILTV παγκοσμίως.

Λόγω της ανάγκης προστασίας των κοτόπουλων από διαφορετικά ιικά παθογόνα από νεαρή ηλικία, τα προγράμματα εμβολιασμού περιλαμβάνουν συνήθως πολλαπλά εμβόλια κατά μιας ποικιλίας παθογόνων. Δείγματα εμβολιασμών σε διαφορετικούς τομείς πουλερικών αναθεωρούνται στο Κτηνιατρικό Εγχειρίδιο Merck, στο οποίο το διάστημα μεταξύ των εμβολιασμών είναι συχνά μόνο θέμα εβδομάδων.

Ωστόσο, υπάρχουν λίγες πληροφορίες που δείχνουν ότι τα μεσοδιαστήματα μεταξύ των εμβολιασμών είναι επαρκή ώστε τα πτηνά να αναπτύξουν επαρκή ανοσολογική προστασία έναντι των προκλήσεων κάθε ιού. Η βιβλιογραφία δείχνει ότι οι διαδοχικές ιογενείς λοιμώξεις μπορεί να οδηγήσουν σε ιογενή παρεμβολή, κατά την οποία ένας ιός μπλοκάρει την επακόλουθη μόλυνση ή/και την αναπαραγωγή ενός άλλου ιού στον ξενιστή [9,10], αλλά μέχρι τώρα είναι άγνωστο εάν αυτό το φαινόμενο οδηγεί σε μειωμένη προστασία από σειριακά χορηγούμενα εξασθενημένα ζωντανά εμβόλια σε κοτόπουλα. Είναι ενδιαφέρον ότι έχει αναφερθεί ότι η ταυτόχρονη χορήγηση ιών σε κοτόπουλα ή γαλοπούλες δεν οδηγεί σε ιογενή παρεμβολή [11]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε πώς ένα τυπικό εμπορικό πρόγραμμα εμβολιασμού που αποτελείται από έναν συνδυασμό σειριακά χορηγούμενων, ζωντανών εξασθενημένων ιικών αναπνευστικών εμβολίων επηρεάζει την ανάπτυξη και τη μακροζωία της ανοσίας και την προστασία από ομόλογες προκλήσεις.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Ιούς

Ένα εμπορικό εμβόλιο IBV MILDVAC-GA-98® (Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Το εμβόλιο αραιώθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ο ιός πρόκλησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν IBV GA98/CWL0474/98 και παρασκευάστηκε σε μια μέση μολυσματική δόση εμβρύου (EID50) 103,19. Οι τίτλοι του ιού υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Reed and Muench [12]. Ένα εμπορικό εμβόλιο NDV Β1 (NEWHATCH-C2, Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε τόσο για εμβολιασμό όσο και για πρόκληση και ανασυστάθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Δεδομένου ότι τα μεσογόνα και τα βελογονικά στελέχη του NDV απαιτούν επίπεδο βιοασφάλειας πάνω από το BSL2, το οποίο δεν είναι διαθέσιμο στο εργαστήριό μας, το πειραματικό μας μοντέλο προστασίας έναντι του NDV περιλαμβάνει σημαντικά μειωμένους τίτλους ιού ή στείρα ανοσία έναντι δεύτερης έκθεσης (πρόκληση) με τον ιό του εμβολίου. Ένα εμπορικό εμβόλιο ILTV CEO (Trachivax® Merck Animal Health, Summit, NJ, USA) και το παθογόνο στέλεχος κρεατοπαραγωγής ILTV Georgia 63140 [13] χρησιμοποιήθηκαν για εμβολιασμό και πρόκληση, αντίστοιχα. Το στέλεχος 63140 πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα νεφρού κοτόπουλου που ελήφθησαν από 3- σε κοτόπουλα 4-εβδομάδων χωρίς ειδικά παθογόνα (SPF) [14]. Το εμβόλιο του CEO παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Μετά τον ενοφθαλμισμό, η μέση μολυσματική δόση ιστοκαλλιέργειας (TCID50) επιβεβαιώθηκε με τιτλοδότηση και των δύο ιών σε κύτταρα νεφρού κοτόπουλου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

2.2. Πειραματικό σχέδιο

Αυγά απαλλαγμένα από συγκεκριμένα παθογόνα ελήφθησαν στις 18 ημέρες επώασης και εκκολάφθηκαν στο Διαγνωστικό και Ερευνητικό Κέντρο Πουλερικών, Αθήνα, GA. Οι νεοσσοί τοποθετήθηκαν σε φρέσκα ροκανίδια πεύκου σε σπίτια αποικιών και μαντριά. Οι νεοσσοί εμβολιάστηκαν με τη συνιστώμενη από τους κατασκευαστές δόση σε 100 µL μέσω της οφθαλμικής οδού σύμφωνα με το ακόλουθο πρόγραμμα. IBV σε 1 DOA, NDV σε ηλικία 2 εβδομάδων (WOA), IBV σε 4 WOA, ILTV σε 8 WOA, NDV σε 12 WOA και ILTV σε 16 WOA.

Επιπλέον, μια ομάδα ελέγχου δεν εμβολιάστηκε. Διεξήχθησαν ομόλογες προκλήσεις στις 20, 24, 28, 32 και 36 WOA και οι νεκροψίες πραγματοποιήθηκαν πέντε ημέρες μετά την πρόκληση (dpc). Στην πρόκληση, τα πουλιά έλαβαν μία από τις τέσσερις θεραπείες: IBV GA98, NDV B1, ILTV 63140 ή καμία πρόκληση. Οι ομάδες θεραπείας για κάθε ιό πρόκλησης ανά χρονικό σημείο ήταν οι εξής: μη εμβολιασμένοι, μη προκληθέντες (n=9–10); εμβολιασμένος, χωρίς πρόκληση (n=9–10); εμβολιάστηκε, προκλήθηκε (n=17–19); μη εμβολιασμένος, αμφισβητούμενος (n=9–10). Όλα τα πουλιά με πρόκληση IBV έλαβαν EID50 1 × 103,2 ανά πουλί σε 100 μL ενδορινικά. Όλα τα πουλιά με πρόκληση NDV έλαβαν το εμβόλιο NDV B1 σε 100 µL ενδορινικά, ανασυσταθέν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα πουλιά που προκλήθηκαν με ILTV έλαβαν το 63140 παθογόνο στέλεχος σε δόση 1 × 103,5 TCID50 ανά πουλί σε 100 µL μοιρασμένα εξίσου μεταξύ της σταγόνας και της ενδορινικής οδού. Για τις προκλήσεις IBV και NDV, τα πουλιά παρατηρήθηκαν σε 5 dpc για αναπνευστικά σημεία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]: 0=απουσία; 1=ήπια; 2=μέτρια; 3=σοβαρή. Για τις προκλήσεις ILTV, τα πουλιά παρατηρήθηκαν σε 3 και 5 dpc για δύσπνοια, επιπεφυκίτιδα, κατάθλιψη και θνησιμότητα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Η χονδροειδής σχισμή (πτηνά με πρόκληση IBV και NDV και πουλιά ελέγχου στα 5 dpc) ή η τραχεία (πτηνά με πρόκληση ILTV και μάρτυρες στα 3 και 5 dpc) υποβλήθηκαν σε μπατονέτες για ανίχνευση ιού και τα επιχρίσματα αποθηκεύτηκαν σε PBS στους -80 ◦C. Στα 28, 32 και 36 WOA, 50 μL δακρύων συλλέχθηκαν με προσθήκη κοκκοποιημένου NaCl στο μάτι. Το αίμα συλλέχθηκε με φτερό ή καρδιακή παρακέντηση και προστέθηκε σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης για τη συλλογή ορού για ανίχνευση αντισωμάτων. Τα πουλιά υπέστησαν ευθανασία και το βλέφαρο, ο Harderian αδένας (HG), ο θύμος, το συκώτι, ο σπλήνας, οι αμυγδαλές του τυφλού και ο θύλακας του Fabricius συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για ανίχνευση ιού και σε 10 τοις εκατό ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Η τραχεία αφαιρέθηκε, ένα τμήμα τοποθετήθηκε σε φορμαλίνη με ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα 10 τοις εκατό και το υπόλοιπο τμήμα της τραχείας βυθίστηκε σε μέσα καλλιέργειας ιστών για τη δοκιμασία εικονοστασίου που περιγράφεται παρακάτω. Οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Τζόρτζια (AUP #: A2015 05-001-R2).

2.3. Δοκιμασία χιλιοστάσεως

Η δοκιμή τέμπλου πραγματοποιήθηκε σε συγκομιδές τραχείας που συλλέχθηκαν σε μέσα κυτταροκαλλιέργειας (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) στους 37 ◦C. Για κάθε τραχεία, κόπηκαν πέντε τραχειακοί δακτύλιοι με πάχος περίπου 1 mm και αντιπροσώπευαν το εγγύς, το μεσαίο και το άπω τμήμα [17,18]. Παρατηρήθηκε η δραστηριότητα των βλεφαρίδων χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Center Valley, PA, ΗΠΑ). Το σύστημα βαθμολόγησης ακολουθεί 0=όλες τις βλεφαρίδες. 1=75 τοις εκατό του χτυπήματος των βλεφαρίδων. 2=50 τοις εκατό χτυπήματα βλεφαρίδων. 3=25 τοις εκατό του χτυπήματος των βλεφαρίδων. 4=δεν χτυπά βλεφαρίδες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η μέγιστη δυνατή βαθμολογία για κάθε τραχεία είναι 20. Κάθε τραχειακός δακτύλιος βαθμολογήθηκε από τρία άτομα και υπολογίστηκε η μέση συνολική βαθμολογία για κάθε τραχεία. Η βαθμολογία προστασίας τέμπλου για κάθε ομάδα προσδιορίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: 100 − [(σύνολο των ατομικών βαθμολογιών για την ομάδα)/(ο αριθμός των ατόμων στην ομάδα × 20) × 100] και βαθμολογία μεγαλύτερη ή ίση έως 50 θεωρήθηκε προστατευόμενος.

2.4. Ιστοπαθολογία Τραχείας

Ένα τμήμα κάθε τραχείας στερεώθηκε σε 10 τοις εκατό ουδέτερη φορμαλίνη με ρυθμιστικό διάλυμα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία και ενσωματώθηκε σε παραφίνη, και τμήματα 5-μm κόπηκαν για χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Για τις βλάβες του IBV, η υπερπλασία του επιθηλίου, η διήθηση λεμφοκυττάρων και η επιθηλιακή εξασθένηση βαθμολογήθηκαν για κάθε τραχεία. Οι βαθμολογίες καθορίστηκαν ως εξής: 1=κανονικό, 2=εστιακό, 3=πολυεστιακό και 4=διάχυτο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Για τις βλάβες NDV, πραγματοποιήθηκε περιγραφική ανάλυση. Για τις βλάβες ILTV, οι μικροσκοπικές βλάβες βαθμολογήθηκαν σε κλίμακα 0-5 (φυσιολογική έως πολύ σοβαρή), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

2.5. Εκχύλιση RNA και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (qRT-PCR)

Για την ανίχνευση IBV και NDV, η εξαγωγή ιικού RNA από 50 µL του PBS από κάθε στειλεό πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης ιών 5× MagMAX-96 (Thermo Fisher, Waltham, MA, ΗΠΑ) σε MagMAX™ Express{{ 3}} Επεξεργαστής Magnetic Particle Processor Deep Well (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με το κιτ AgPath-IDTM One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Waltham, MA, ΗΠΑ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε μίγμα αντίδρασης 25-μL περιείχε 12,5 μL ρυθμιστικού διαλύματος 2× RT-PCR, 10 μΜ από κάθε εκκινητή, 4 μΜ του ανιχνευτή, 1 μL ενζυμικού μίγματος 25× RT-PCR και 5 μL ιικού RNA. Οι αντιδράσεις qRT-PCR εκτελέστηκαν στο σύστημα Applied Biosystems® 7500 Fast Realtime PCR (Life Technologies Ltd., Carlsbad, CA, USA) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένας κύκλος 50 ◦C για 30 λεπτά και 95 ◦C για 15 λεπτά , ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 94 ◦C για 1 s και 60 ◦C για 60 s. Οι εκκινητές και ο ανιχνευτής για το IBV qRT-PCR είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως [21] και αποτελούνται από έναν εμπρόσθιο εκκινητή IBV50GU391 (50 -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-30 ), έναν αντίστροφο εκκινητή IBV50GL533 ({ {38}}GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT G-30 ), and a Taqman® dual-labeled probe IBV50G probe (50 -FAM-CAC CAC CAG AAC CTG TCA CCT C-BHQ{{45 }} ). Οι εκκινητές και ο ανιχνευτής για το NDV qRT-PCR περιγράφηκαν προηγουμένως [22] και αποτελούνται από έναν εμπρόσθιο εκκινητή NDV M συν 4100 (5'-AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC-3'), έναν αντίστροφο εκκινητή NDV M -4220 (5'-CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA-3'), και ένα Taqman® dual-labeled probe NDV M plus 4169 (5'-FAM-TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC -BHQ1-3').

Οι εκκινητές ελήφθησαν από την Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ, ΗΠΑ) και ο ανιχνευτής Taqman συντέθηκε από την BioSearch Technologies (Novato, CA, USA). Τα στοιχεία RT-PCR σε πραγματικό χρόνο και οι παράμετροι του θερμοκυκλωτή περιγράφηκαν προηγουμένως [21]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή κατωφλίου κύκλου (CT) για όλα τα δείγματα σε κάθε ομάδα, με θετικές τιμές CT με βάση το όριο ανίχνευσης για αυτό το τεστ που σχετίζεται με την ανίχνευση ιού στα αυγά [23].

Κάθε πλάκα αντίδρασης qRT-PCR περιελάμβανε μια τυπική καμπύλη ως έλεγχο εκχύλισης RNA και ως θετικό έλεγχο. Το GA98 IBV που απομονώθηκε από αλλαντοϊκό υγρό χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την τυπική καμπύλη. Αρνητικοί έλεγχοι συμπεριλήφθηκαν επίσης σε κάθε πλάκα και αποτελούνταν από αντιδραστήρια PCR χωρίς RNA.

2.6. Εξαγωγή DNA

Για το ILTV, το συνολικό DNA εξήχθη από τα επιχρίσματα τραχείας χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής miniprep 96-φρεάτιου MegaZorb® DNA (Promega, Madison, WI, ΗΠΑ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

2.7. qPCR

Πραγματοποιήθηκε μια διπλή δοκιμασία PCR σε πραγματικό χρόνο που ενισχύει ένα θραύσμα του ιικού γονιδίου UL44 στο ILTV και ένα θραύσμα του γονιδίου άλφα 2-κολλαγόνου κοτόπουλου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

2.8. Ειδικοί τίτλοι αντισωμάτων IgG για τον ιό της λοιμώδους βρογχίτιδας ορού (IBV).

Οι ειδικοί για τον IBV τίτλοι IgG ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμής αντισωμάτων IBV ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού (ELISA) του εμπορίου (IDEXX, Westbrook, ΜΕ, ΗΠΑ). Εν συντομία, τα δείγματα ορού (αποθηκευμένα στους -20 ◦C) αραιώθηκαν 1:500 και η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

2.9. Τίτλοι αντισωμάτων IgA Ειδικοί για τον IBV που εκκρίνονται με δάκρυα

Η ειδική για το δάκρυ IBV IgA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ δοκιμής αντισωμάτων IgG ELISA IBV (IDEXX, Westbrook, ΜΕ, ΗΠΑ). Εν συντομία, τα δάκρυα αραιώθηκαν σειριακά δύο φορές σε PBS και επωάστηκαν σε διπλά φρεάτια όλη τη νύχτα στους 4 ◦C. Όλα τα βήματα πλύσης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PBS-Tween 20 (0,05 τοις εκατό Tween 20). Οι πλάκες επωάστηκαν στους 23 ◦C για 2 ώρες σε μονοκλωνικό IgA-BIOT αντι-κοτόπουλου ποντικού (1:1000, κλώνος Α-1, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), ακολουθούμενο από 1 ώρα σε Streptavidin-HRP ( 1:4000, Southern Biotech, Birmingham, AL, ΗΠΑ). Τα τελικά βήματα ανίχνευσης αντισωμάτων ολοκληρώθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τίτλοι τελικού σημείου προσδιορίστηκαν αναφέροντας τη χαμηλότερη αραίωση στην οποία η οπτική πυκνότητα (OD), που καταγράφηκε σε μήκος κύματος 650 nm, ήταν τουλάχιστον τρεις τυπικές αποκλίσεις πάνω από το μέσο όρο 12 φρεατίων ελέγχου που επωάστηκαν χωρίς δείγματα δακρύων. Τα δεδομένα από φρεάτια με ακριβή αλλαγή χρώματος λόγω του υπολειμματικού υποστρώματος ή των φυσαλίδων αέρα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως log2 του τίτλου τελικού σημείου.

2.10. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism v.6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Για τα δεδομένα ιικού φορτίου, χρησιμοποιήθηκε μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με τη δοκιμή Dunnet's posttest για τη σύγκριση των ομάδων θεραπείας σε κάθε περίοδο συλλογής. Όλα τα άλλα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή Kruskal–Wallis με τη δοκιμή Dunn's posttest για σύγκριση των ομάδων θεραπείας σε κάθε περίοδο συλλογής. Σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν στο p < 0.05.

3. Αποτελέσματα

3.1. Ιός λοιμώδους βρογχίτιδας

Στις 5 ημέρες μετά την πρόκληση με IBV GA98, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πουλιά είχαν σημαντικά χαμηλότερα φορτία RNA σε σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες σε όλους τους χρόνους συλλογής και σε όλα τα δείγματα ιστού, εκτός από την αμυγδαλή του τυφλού στα 24 WOA (Πίνακας 1). Σε εμβολιασμένους μάρτυρες, κανένα IBV RNA δεν έχει ανιχνευθεί σε όλους τους χρόνους συλλογής εκτός από τις αμυγδαλές του τυφλού στο 20 και 24 WOA και τη σχισμή του χοίρου στο 20 WOA. Τα φορτία IBV σε αρνητικούς μάρτυρες σε όλους τους ιστούς ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης χρησιμοποιώντας την τιμή CT μεγαλύτερη ή ίση με 36,17 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23], σε όλους τους χρόνους συλλογής εκτός από τους 24 αρνητικούς μάρτυρες WOA HG.

Τα κλινικά σημάδια της λοίμωξης από IBV που μετρήθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση μειώθηκαν σημαντικά σε εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά σε σύγκριση με θετικούς μάρτυρες όλες τις εβδομάδες εκτός από 28 WOA, αλλά οι τάσεις στις βαθμολογίες κλινικών συμπτωμάτων ήταν αριθμητικά χαμηλότερες μεταξύ των εμβολιασμένων/προκληθέντων πτηνών (Πίνακας 2). . Τα κλινικά σημεία απουσίαζαν σε αρνητικά και εμβολιασμένα πτηνά μάρτυρες και τα σημάδια στα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά δεν διέφεραν σημαντικά από τα σημεία σε μη προκληθέντα πτηνά ελέγχου.

Πίνακας 1. Μέσες τιμές κατωφλίου κύκλου (CT) ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR) για τον ιό της λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV) που συλλέχθηκε από τη σχισμή του χοίρου, τον σκληρό αδένα, τον επιπεφυκότα και την αμυγδαλή του τυφλού 5 ημέρες μετά την πρόκληση με IBV GA98 σε ηλικία 20, 24, 28, 32 και 36 εβδομάδων. Τα γράμματα (a–d) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίου και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05).

Πίνακας 2. Τα κλινικά σημεία και οι μικροσκοπικές βλάβες μετρήθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση IBV GA98. Τα γράμματα (a–b) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0.05).

Η ιστοπαθολογική εξέταση των τραχείων από όλες τις ομάδες κυμαινόταν από εντός των φυσιολογικών ορίων έως εστιακή έως πολυεστιακή ελάχιστη έως μέτρια λεμφοκυτταρική τραχειίτιδα. Ωστόσο, μέτρια λεμφοκυτταρική διήθηση παρατηρήθηκε συχνότερα σε θετικούς μάρτυρες. Σε όλες τις εβδομάδες, το ποσοστό των εμβολιασμένων/προκληθέντων πτηνών με εξασθένιση ή οξεία νέκρωση της τραχείας ήταν σημαντικά μειωμένο σε σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες και δεν διέφερε από τους αρνητικούς και τους εμβολιασμένους μάρτυρες (Πίνακας 2).

Ciliostasis, defined as the cessation of tracheal ciliary movement, was measured at 5 DPC, and the number of birds positive for cryostasis and cryostasis protection scores was calculated for each group (Figure 1). At all collection times, vaccinated/challenged birds were protected from cryostasis (scores were >50), και οι θετικοί έλεγχοι δεν προστατεύτηκαν (οι βαθμολογίες ήταν<50). The non-challenged negative controls and vaccinated controls were protected (scores were >50) σε όλους τους χρόνους συλλογής.

Figure 1. Ciliostasis protection scores among tracheas were collected 5 days post-challenge with IBV GA98 for different groups of birds challenged at 20, 24, 28, 32, and 36 weeks of age (WOA). Groups with a protection score >Προστατεύονται 50 (οριζόντια γραμμή) και ομάδες με βαθμολογία προστασίας<50 are not protected. Fractions above each bar represent the proportion of birds positive for cryostasis for the respective group. −/− = non-vaccinated/non-challenged, +/− = vaccinated/non-challenged, +/+ = vaccinated/challenged, −/+ = non-vaccinated/challenged.

Οι ειδικοί για τον IBV τίτλοι IgG μετρήθηκαν σε ορό που συλλέχθηκε σε 5 DPC. Σε κάθε περίπτωση, εκτός από το 32 WOA, τα εμβολιασμένα πτηνά τόσο από ομάδες χωρίς πρόκληση όσο και από ομάδες που προκλήθηκαν εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερους τίτλους σε σύγκριση με μη εμβολιασμένα πτηνά τόσο από ομάδες χωρίς πρόκληση όσο και από ομάδες (Εικόνα 2). Σε 32 WOA, οι τίτλοι στα εμβολιασμένα πτηνά, ανεξάρτητα από την κατάσταση πρόκλησης, ήταν σημαντικά υψηλότεροι σε σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες. Οι τίτλοι στα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά δεν διέφεραν σημαντικά από τους τίτλους στους εμβολιασμένους μάρτυρες μέχρι το 36 WOA, όταν τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πουλιά είχαν σημαντικά υψηλότερους τίτλους. Σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά είχαν σημαντικά υψηλότερους τίτλους ανά πάσα στιγμή.

Οι ειδικοί για τον IBV τίτλοι IgA μετρήθηκαν σε δάκρυα που συλλέχθηκαν σε 5 DPC στα 28, 32 και 36 WOA. Στο 28 WOA, οι τίτλοι σε εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά ήταν σημαντικά υψηλότεροι σε σύγκριση με τους τίτλους σε μη αμφισβητούμενους αρνητικούς μάρτυρες (Εικόνα 3). Στο 32 WOA, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά έδειξαν σημαντικά χαμηλότερους τίτλους σε σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες. Επιπλέον, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά είχαν σημαντικά υψηλότερους τίτλους από την ομάδα των εμβολιασμένων/μη αμφισβητούμενων στο 28 WOA. Δεν εντοπίστηκαν άλλες σημαντικές διαφορές. Ιοί 2019.

Εικόνα 2. Οι ειδικοί για τον IBV τίτλοι IgG στον ορό συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση με IBV GA98 για διαφορετικές ομάδες πουλιών που προκλήθηκαν στα 20, 24, 28, 32 και 36 WOA. Τα γράμματα (a–c) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05). −/−=μη εμβολιασμένος/μη πρόκληση, συν /−=εμβολιασμένος/μη αμφισβητούμενος, συν / συν=εμβολιασμένος/προκληθείς, −/ συν=μη εμβολιασμένοι/προκληθέντες.

Σχήμα 3. Σχίστε τον ειδικό για τον IBV τίτλο IgA στα δάκρυα που συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση με το IBV GA98 για διαφορετικές ομάδες πουλιών που προκλήθηκαν στα 20, 24, 28, 32 και 36 WOA. Τα γράμματα (a–c) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05). −/−=μη εμβολιασμένος/μη πρόκληση, συν /−=εμβολιασμένος/μη αμφισβητούμενος, συν / συν=εμβολιασμένος/προκληθείς, −/ συν=μη εμβολιασμένοι/προκληθέντες.

3.2. Ιός της νόσου του Newcastle (NDV)

Σε 5 dpc με NDV B1, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά είτε είχαν μη ανιχνεύσιμα φορτία RNA ή σημαντικά χαμηλότερα φορτία σε σύγκριση με τους τίτλους θετικού ελέγχου σε όλους τους χρόνους συλλογής και σε όλους τους ιστούς που ελήφθησαν δείγμα (Πίνακας 3). Οι μη αμφισβητούμενοι αρνητικοί μάρτυρες και οι εμβολιασμένοι μάρτυρες ήταν αρνητικοί για τον ιό RNA χρησιμοποιώντας την τιμή CT μεγαλύτερη ή ίση με 35.0 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22].

Πίνακας 3. Μέσες τιμές qRT-PCR CT για NDV RNA που συλλέχθηκαν από τη σχισμή του χούφτου, τον σκληρό αδένα και τον επιπεφυκότα 5 ημέρες μετά την πρόκληση με το εμβόλιο NDV B1. Τα γράμματα (a–c) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0.05).

Τα κλινικά σημεία που μετρήθηκαν σε 5 dpc ήταν σημαντικά σε 20 WOA στους θετικούς μάρτυρες, μετά τα οποία τα κλινικά σημεία στους θετικούς μάρτυρες δεν ήταν διαφορετικά από καμία από τις άλλες ομάδες θεραπείας (Πίνακας 4). Δεν υπήρξαν σημαντικές διαφορές στα κλινικά σημεία μεταξύ των εμβολιασμένων/προκληθέντων πτηνών και των μη προκληθέντων μαρτύρων ανά πάσα στιγμή. Όλες τις εβδομάδες, η ιστοπαθολογική εξέταση των τραχείων ήταν εντός φυσιολογικών ορίων ή αποκάλυψε εστιακή έως πολυεστιακή ελάχιστη έως ήπια λεμφοκυτταρική τραχειίτιδα και δεν υπήρχαν διαφορές που να σχετίζονται με την ομάδα.

Οι τραχεία αξιολογήθηκαν επίσης για κρυόσταση και καμία ομάδα δεν εμφάνισε κρυόσταση.

Οι ειδικοί για το NDV τίτλοι IgG ορού σε εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά και σε εμβολιασμένους μάρτυρες ήταν σημαντικά υψηλότεροι από τους τίτλους τόσο στους θετικούς όσο και στους αρνητικούς μάρτυρες σε όλους τους χρόνους συλλογής (Εικόνα 4). Δεν υπήρξε καμία σημαντική διαφορά στους τίτλους μεταξύ των εμβολιασμένων/προκληθέντων πτηνών και των εμβολιασμένων μαρτύρων ανά πάσα στιγμή. Ομοίως, δεν ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά στους τίτλους μεταξύ μη εμβολιασμένων/προκληθέντων και αρνητικών μαρτύρων, εκτός από το 28 WOA όπου οι τίτλοι από μη εμβολιασμένους/προκληθέντες μάρτυρες ήταν σημαντικά υψηλότεροι.

Πίνακας 4. Τα κλινικά σημεία μετρήθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση NDV Β1. Τα γράμματα (a–b) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0.05).

Εικόνα 4. Οι ειδικοί για τον NDV τίτλοι IgG στον ορό συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση με εμβόλιο NDV B1 για διαφορετικές ομάδες πουλιών που προκλήθηκαν στα 20, 24, 28, 32 και 36 WOA. Τα γράμματα (a–c) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05). −/−=μη εμβολιασμένος/μη πρόκληση, συν /−=εμβολιασμένος/μη αμφισβητούμενος, συν / συν=εμβολιασμένος/προκληθείς, −/ συν=μη εμβολιασμένοι/προκληθέντες.

3.3. Ιός λοιμώδους λαρυγγοτραχειίτιδας (ILTV)

Σε 5 dpc με στέλεχος ILTV 63140, τα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά είχαν σημαντικά χαμηλότερα φορτία ιικού DNA από τους θετικούς μάρτυρες σε όλους τους χρόνους συλλογής και σε όλους τους ιστούς (Πίνακας 5). Τα φορτία DNA στην τραχεία και το HG ήταν μη ανιχνεύσιμα ή χαμηλά και δεν διέφεραν σημαντικά από τα φορτία DNA σε μη αμφισβητούμενους αρνητικούς και εμβολιασμένους μάρτυρες, οι οποίοι ήταν αρνητικοί χρησιμοποιώντας την τιμή CT μεγαλύτερη ή ίση με 38,0 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [26]. Στον επιπεφυκότα, τα φορτία DNA σε εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα φορτία DNA τόσο από αρνητικούς όσο και από εμβολιασμένους μάρτυρες, εκτός από το 28 WOA στο οποίο δεν ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ εμβολιασμένων/προκληθέντων πτηνών και εμβολιασμένων μαρτύρων.

Πίνακας 5. Μέσες τιμές qPCR CT για ILTV DNA που συλλέγεται από την τραχεία, τον σκληρό αδένα και τον επιπεφυκότα 5 ημέρες μετά την πρόκληση με παθογόνο στέλεχος ILTV 63140. Τα γράμματα (a–c) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίων και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05).

Κλινικά σημεία και ιικό DNA ανιχνεύθηκαν σε προσβεβλημένα πτηνά σε 3 DPC, αλλά τα σημάδια στους θετικούς μάρτυρες είχαν γίνει πιο σοβαρά κατά 5 dpc καθώς αυξήθηκε το ιικό φορτίο της τραχείας (Πίνακας 6). Οι βαθμολογίες κλινικών συμπτωμάτων που μετρήθηκαν σε 5 dpc ήταν σημαντικά μειωμένες στα εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά σε σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες, σε όλα τα σημεία συλλογής εκτός από 36 WOA όταν οι βαθμολογίες κλινικών συμπτωμάτων μειώθηκαν αριθμητικά. Όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες και οι εμβολιασμένοι μάρτυρες δεν είχαν κλινικά σημεία και τα κλινικά σημεία σε εμβολιασμένα/προκληθέντα πτηνά δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά σε σύγκριση με αυτούς τους μάρτυρες, εκτός από το 36 WOA όπου οι βαθμολογίες κλινικών συμπτωμάτων ήταν σημαντικά υψηλότερες.

Πίνακας 6. Τα κλινικά σημεία μετρήθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση ILTV 63140. Τα γράμματα (a–b) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίου και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05).

Η ιστολογική εξέταση της τραχείας ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων ή αποκάλυψε εστιακή έως διάχυτη ελάχιστη έως ήπια λεμφοκυτταρική τραχειίτιδα σε τραχεία από όλες τις ομάδες. Για τους θετικούς μάρτυρες, 3/9 και 1/10 στις εβδομάδες 20 και 28, αντίστοιχα, είχαν οξεία εστιακή νεκρωτική τραχειίτιδα με συγκυτία και ενδοπυρηνικά εγκλείσματα (Εικόνα 5).

Εικόνα 5. Οι μικροσκοπικές βλάβες της τραχείας είναι σύμφωνες με τη μόλυνση από λοιμώδη λαρυγγοτραχειίτιδα στην ηλικία των 20 εβδομάδων. (Α) Πολυάριθμα συγκυτία με ενδοπυρηνικά εγκλείσματα (βέλος). (Β) Μια άλλη τραχεία από την ίδια ομάδα έδειξε συγκυτία με ενδοπυρηνικά εγκλείσματα (βέλος).

Δεν παρατηρήθηκε εικονοστάσι στις τραχειές πτηνών από καμία από τις ομάδες.

Οι ειδικοί για το ILTV τίτλοι IgG στον ορό που συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση ήταν σημαντικά υψηλότεροι σε εμβολιασμένα πτηνά τόσο από τις ομάδες που είχαν προσβληθεί όσο και από τις μη προκληθείσες ομάδες, σε σύγκριση με τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες (Εικόνα 6).

Εικόνα 6. Οι ειδικοί για το ILTV τίτλοι IgG στον ορό συλλέχθηκαν 5 ημέρες μετά την πρόκληση με το στέλεχος ILTV 63140 για διαφορετικές ομάδες πουλιών που προκλήθηκαν στα 20, 24, 28, 32 και 36 WOA. Τα γράμματα (a–b) υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων εμβολίου και πρόκλησης για κάθε εβδομάδα (p < 0,05). −/−=μη εμβολιασμένος/μη πρόκληση, συν /−=εμβολιασμένος/μη αμφισβητούμενος, συν / συν=εμβολιασμένος/προκληθείς, −/ συν=μη εμβολιασμένοι/προκληθέντες.

For more information:1950477648nn@gmail.com