Επίδραση της θεραπείας με πρωτόνια στη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων και στο ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον για το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα

Αφηρημένη: Η ακτινοθεραπεία με θεραπεία πρωτονίων (PT) έχει δοσιμετρικά πλεονεκτήματα έναντι της θεραπείας με φωτόνια, η οποία βοηθά στη διεύρυνση του θεραπευτικού παραθύρου της ακτινοθεραπείας για το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Αξιολογήσαμε την απόκριση του HCC στο PT και εξετάσαμε τους υποκείμενους μηχανισμούς. Οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του ήπατος HepG2 και HuH7 και η κυτταρική σειρά καρκίνου ήπατος ποντικού Hepa1-6 επιλέχθηκαν για πειράματα σε κύτταρα και ζώα για να εξεταστεί η απόκριση που προκλήθηκε από ακτινοβολία ΡΤ. Εξετάστηκαν οι βιολογικές αλλαγές και η ανοσολογική απόκριση μετά από ακτινοβολία ΡΤ. Τα πειράματα in vitro δεν έδειξαν σημαντική διαφορά στην επιβίωση των κυττάρων μετά από PT σε σύγκριση με την ακτινοθεραπεία με φωτόνια. Σε ένα μοντέλο όγκου ποντικού, οι όγκοι ήταν μικρότεροι σε μέγεθος 12 ημέρες μετά την ακτινοβολία ΡΤ. Οι υποκείμενες αλλαγές περιελάμβαναν αυξημένη βλάβη στο DNA, αυξημένα επίπεδα IL-6 και ρυθμισμένο ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον όγκου. Η ανάλυση πρωτεΐνης in vitro και in vivo έδειξε ότι η ΡΤ αύξησε το επίπεδο του συνδέτη προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-L1) που εκφράζεται σε κύτταρα όγκου και στρατολόγησε κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελοειδή (MDSCs). Η αύξηση του PD-L1 συσχετίστηκε θετικά με τη δόση ακτινοβολίας. Στα συγγενικά μοντέλα ποντικών Hepa1-6, ο συνδυασμός του PT με το anti-PD-L1 αύξησε την καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με το PT μόνο, η οποία συσχετίστηκε με αυξημένα Τ κύτταρα διείσδυσης όγκου και εξασθενημένη στρατολόγηση MDSC στο μικροπεριβάλλον. Επιπλέον, όταν το ΡΤ εφαρμόστηκε στον πρωτοπαθή όγκο HCC, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αντίσωμα αντι-PD-L1 εμφάνισαν μικρότερους σύγχρονους μη ακτινοβολημένους όγκους. Συμπερασματικά, η απόκριση του HCC στο ΡΤ προσδιορίστηκε από τη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων και την ανοσολογική απόκριση στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Ο συνδυασμός με το αντίσωμα αντι-PD-L1 για την ενίσχυση της αντινεοπλασματικής ανοσίας ήταν υπεύθυνος για τη θεραπευτική συνεργία για HCC που υποβλήθηκε σε θεραπεία με PT. Με βάση τα αποτελέσματά μας, προτείνουμε ότι το PT σε συνδυασμό με το anti-PD-L1 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική πολιτική για HCC.

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

Λέξεις-κλειδιά: HCC; θεραπεία πρωτονίων; PD-L1; απρόσβλητος

1. Εισαγωγή

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένας παγκόσμιος καρκίνος με σχετικά υψηλή επίπτωση στη νοτιοανατολική Ασία [1]. Η πλειοψηφία των ασθενών έχει κακή πρόγνωση λόγω προχωρημένων όγκων και/ή κακής ηπατικής λειτουργίας. Παραδοσιακά, η ακτινοθεραπεία (RT) με καθορισμένη δόση για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος έχει συσχετιστεί με υψηλό κίνδυνο ηπατίτιδας που προκαλείται από ακτινοβολία. Οι βελτιώσεις στις τεχνικές παροχής ακτινοθεραπείας έχουν βοηθήσει στη διεύρυνση του θεραπευτικού παραθύρου RT για το HCC. Η ανάπτυξη της RT με θεραπεία πρωτονίων (PT) έχει φέρει τη χρήση της RT για HCC στο προσκήνιο [2,3]. Το PT έχει δοσιμετρικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη συμβατική θεραπεία με φωτόνια για τη θεραπεία του καρκίνου, ειδικά για το HCC, τον καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και τον καρκίνο του μαστού. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι μπορεί να υπάρχουν διαφορές στις βιολογικές αλλαγές που προκαλούνται από RT, συμπεριλαμβανομένης της πρόκλησης βλάβης στο DNA, του οξειδωτικού στρες και της ρύθμισης των κυττάρων του ανοσοποιητικού, μεταξύ PT και φωτονίων σε ισοδύναμες δόσεις σχετικής βιολογικής αποτελεσματικότητας [4-7]. Περαιτέρω διερεύνηση της ραδιοβιολογικής επίδρασης του PT θα διευκολύνει την ευκαιρία να παρασχεθεί η ανάπτυξη πολλά υποσχόμενων στρατηγικών PT για τη θεραπεία του καρκίνου. Ο συνδυασμός RT και ανοσοθεραπείας σε κλινικά περιβάλλοντα είναι πολλά υποσχόμενος για πολλές ενδείξεις [8,9]. Καθώς η χρόνια φλεγμονή οδηγεί σε προδιάθεση για ανάπτυξη HCC, το HCC είναι ένας πιθανός στόχος για ανοσοθεραπεία [10]. Η RT έχει τόσο προανοσογονικές όσο και ανοσοκατασταλτικές επιδράσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου [9]. Αν και η RT έχει αποδειχθεί ότι πυροδοτεί ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο και ενισχύει τη διήθηση των αντικαρκινικών ανοσοκυττάρων [11,12], αρκετές μελέτες έδειξαν ότι η RT μπορεί να επάγει κυτοκίνες και ανοσορυθμιστικά κύτταρα, με αποτέλεσμα ένα πιο ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον όγκου. Ο συνδυασμός ανοσοθεραπείας και RT αποδείχθηκε ότι ενισχύει την απόκριση του όγκου σε σύγκριση με οποιαδήποτε από τις δύο μεθόδους και μόνο και ότι καταργεί τα επαγόμενα από την RT ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα [13,14]. Αρκετές προκλινικές και κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία με φωτόνια RT και ανοσοθεραπεία έχει θετική επίδραση στον έλεγχο του όγκου στο HCC [15,16]. Από όσο γνωρίζουμε, σχεδόν όλες οι αναφορές σχετικά με τις ραδιοεπαγόμενες ανοσολογικές αποκρίσεις έχουν ληφθεί με ακτινοβολία βασισμένη σε φωτόνια. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για την απόκριση στην PT θα μπορούσε να οδηγήσει σε πιο ισχυρές θεραπευτικές προσεγγίσεις για το HCC. Οι βιολογικές επιδράσεις του PT που είναι υπεύθυνος για τον έλεγχο του όγκου και την ανοσολογική απόκριση χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. Ως εκ τούτου, στοχεύσαμε να αξιολογήσουμε το αποτέλεσμα ακτινοβολίας με PT και την ανοσοαπόκριση στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Ερευνήσαμε επίσης εάν ο συνδυασμός PT και ο αποκλεισμός του PD-L1 έχει συνεργιστική επίδραση στον έλεγχο του όγκου HCC

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Κυτταρικής καλλιέργειας 

Η κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου ήπατος HepG2 και η κυτταρική σειρά καρκίνου ήπατος ποντικού Hepa1-6 ελήφθησαν από το Κέντρο συλλογής και έρευνας Bioresource. Επιπλέον, τα κύτταρα HuH7, μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου ηπατώματος, παρασχέθηκαν ευγενικά από τον Δρ. Yen-Hao, Chen (Νοσοκομείο Kaohsiung Chang Gung Memorial, Ταϊβάν). Η χρήση των κυτταρικών σειρών εγκρίθηκε από τη θεσμική μας επιτροπή δεοντολογίας της έρευνας (αρ. 00464-2021120952922). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). Επιπλέον, ανθρώπινα μονοκυτταρικά κύτταρα ΤΗΡ-1 διατηρήθηκαν στο μέσο καλλιέργειας RPMI 1640. Τα μονοκύτταρα THP-1 μπορούν να διαφοροποιηθούν σε μακροφάγα Μ1 ή Μ2 όταν επωάζονται σε ρυθμισμένο μέσο [17,18]. Για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις της ΡΤ στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επάγουν τη διαφοροποίηση των μακροφάγων Μ2, κύτταρα HuH7 με ή χωρίς ακτινοβολία ΡΤ σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων 24 ώρες πριν από το τέλος της πόλωσης των μακροφάγων Μ2. Μετά από 24 ώρες συγκαλλιέργειας, η έκφραση του CD163, ενός δείκτη μακροφάγου Μ2, αναλύθηκε με μακροφάγους. Η πολύχρωμη ανάλυση ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής διαμετρήματος FACS (BD Biosciences) σε εναιωρήματα μονοκυττάρων που παρασκευάστηκαν από τα διαφοροποιημένα μακροφάγα και η ανοσοχρώση για το CD163 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα επισημασμένο με φθορισμό μονοκλωνικό αντίσωμα. Τα πειράματα in vitro πραγματοποιήθηκαν στο Συνδυαστικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου Chang Gung Memorial, το οποίο παρείχε τις πλατφόρμες υπηρεσιών, συμπεριλαμβανομένου του διαλογέα κυττάρων, του πολύχρωμου αναλυτή κυττάρων και της ομοεστιακής μικροσκοπίας.

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

2.2. Ακτινοβολία

Η σχετική βιολογική αποτελεσματικότητα των πρωτονίων ορίστηκε στο 1,1 και η δόση σχετικής βιολογικής αποτελεσματικότητας (RBE) υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας τη δόση του πρωτονίου με αυτήν την τιμή [19]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τη δόση RBE για να αξιολογήσουμε το αποτέλεσμα που προκαλείται από την RT. Η δοσολογία στην ακτινοθεραπεία πρωτονίων συνταγογραφείται ως Gy (RBE) με κλιμάκωση της φυσικής δόσης κατά 10%, δηλαδή, η δόση του πρωτονίου RBE=η δόση του φυσικού πρωτονίου × 1,1. Τα κύτταρα και τα ποντίκια έλαβαν τοπική RT είτε με ακτινοβολία φωτονίων είτε με PT με τη δόση RBE. Πραγματοποιήθηκε ακτινοβόληση φωτονίων με χρήση σχεδιασμού θεραπείας Varian 21EX και Eclipse. In vitro, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με απλές δόσεις 0, 3, 6 και 9 Gy χρησιμοποιώντας δέσμη 6 MV για ανάλυση ακτινοβολίας φωτονίων. Για την PT, η ακτινοβολία με σάρωση δέσμης μολυβιού (PBS) πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικές δόσεις πρωτονίων (0, 3, 6, 9 και 12 Gy (RBE)), με ενέργεια που αντιστοιχεί σε 93,6–109,2 MeV και 72–143,2 MeV για τα κύτταρα και ποντίκια, αντίστοιχα. Οι ακτινοβολίες κυττάρου και ποντικού διεξήχθησαν τοποθετώντας τα κύτταρα στο μέσο της εξάπλωσης κορυφής Bragg (SOBP, πλάτος 1 cm για PT κυττάρων, 6 cm πλάτος για ακτινοβολία PT ποντικού) για προσομοίωση κλινικών συνθηκών (Εικόνα 1a,b). Η ακτινοβολία πρωτονίων παραδόθηκε από το κυκλοτρόνιο που χρησιμοποιείται στο νοσοκομείο μας (Sumitomo Heavy Industries, Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία), το οποίο παράγει μια συνεχή και υψηλής έντασης δέσμη πρωτονίων. Το μέγεθος πεδίου RT ήταν 20 × 10 cm2 για να εξεταστεί το αποτέλεσμα της κοιλιακής κοιλότητας, 20 × 15 cm2 για να εξεταστεί η ογκοκτόνος δράση του PT in vivo ή 20 × 20 cm2 για να εξεταστεί η επίδραση του PT in vitro. Το Ray Station ήταν το σύστημα σχεδιασμού θεραπείας που χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της δόσης RT (έκδοση 8.1, Ray Search Laboratories, Στοκχόλμη, Σουηδία).

Εικόνα 1. Προκλινικό μοντέλο για PT. Τα πειραματικά σχέδια δέσμης πρωτονίων για μοντέλα in vitro (α) και ζωικών όγκων (πεδίο RT για ακτινοβόληση όγκων ήπατος, μπλε γραμμή, πεδίο RT για εξέταση του αποσκοπικού φαινομένου, κόκκινη γραμμή) (β).

2.3. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού Τ-κυττάρων

Για να εξετάσουμε εάν το PT ήταν σε θέση να ρυθμίσει την επίδραση των καρκινικών κυττάρων και των κατασταλτικών κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή (MDSCs) στον πολλαπλασιασμό των CD8+ Τ-κυττάρων, μετρήσαμε τον πολλαπλασιασμό των CD8+ Τ κυττάρων μετά τη διέγερση. Τα CD{4}} Τ κύτταρα που απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια αντι-CD8 επισημάνθηκαν με ηλεκτριμιδυλεστέρα καρβοξυφθοροσκεΐνης (CFSE) και σπάρθηκαν σε 96-πλάκες με κύτταρα CD11b+ παρουσία ή απουσία καρκινικών κυττάρων 48 ώρες μετά την PT. Ο πολλαπλασιασμός των CD8+ Τ κυττάρων διεγέρθηκε από σφαιρίδια αντι-CD3/CD28 (Invitrogen, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η φθορίζουσα χρώση CFSE αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής 3 ημέρες μετά τη διέγερση.

2.4. Επαγωγή CD14+HLA-DR-από μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs)

Εντοπίστηκε ένα νέο υποσύνολο MDSC με βάση την παρουσία έκφρασης CD14 αλλά την απουσία έκφρασης ανθρώπινου αντιγόνου λευκοκυττάρου (HLA)-DR (CD14+HLA-DR-) στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο. Η μη φυσιολογική συσσώρευση κυττάρων CD14+HLA-DR- στα PBMC σύμφωνα με αναφορές συμβάλλει στην ανοσοδιαφυγή του όγκου και συσχετίζεται με την πρόγνωση του καρκίνου [20-22]. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ακτινοβολίας PT στην επαγωγή των MDSCs, το ποσοστό των CD14+HLA-DR-μυελοειδών κυττάρων αξιολογήθηκε από PBMC που επωάστηκαν με καρκινικά κύτταρα ακτινοβολημένα με PT για 24 ώρες. Η αναλογία των μυελοειδών κυττάρων CD14+HLA-DR- και το επίπεδο έκφρασης του PD-L1 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

2.5. Clonogenic Assay

Χρησιμοποιήθηκαν κλωνογονικές δοκιμασίες για να εξεταστεί η επίδραση της RT (PT έναντι φωτονίου RT) στην απώλεια της επιβίωσης των αναπαραγωγικών κυττάρων. Οι κυτταρικές καλλιέργειες ακτινοβολήθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ◦C για σχηματισμό αποικίας. Μετά από 10 ημέρες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για μέτρηση αποικιών. Οι αποικίες βαθμολογήθηκαν για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα επιμετάλλωσης και τα επιζώντα κλάσματα σε μια δεδομένη δόση RBE. Το κλάσμα επιβίωσης είναι ο αριθμός των αποικιών μετά την έκθεση σε RT, με διόρθωση για την αποτελεσματικότητα της επιμετάλλωσης.

2.6. Συγγενετικά (έκτοπα και ορθότοπα) μοντέλα όγκων

Όλες οι μελέτες σε ζώα συμμορφώθηκαν με όλους τους σχετικούς κανόνες δεοντολογίας για την έρευνα σε ζώα και εγκρίθηκαν από την επιτροπή πειραματόζωων του νοσοκομείου μας. Τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων του Νοσοκομείου Chang Gung Memorial, στο οποίο χορηγείται πλήρης διαπίστευση από το Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Χρησιμοποιήσαμε ποντίκια C57BL/6J ως μοντέλο εμφύτευσης όγκου ήπατος. Στο μοντέλο έκτοπου και ορθοτοπικού όγκου, κύτταρα όγκου (Hepa 1–6 1 × 106 κύτταρα) εμφυτεύθηκαν υποδόρια στην περιοχή του δεξιού μηρού και/ή διεγχειρητικά εμφυτεύθηκαν στην περιοχή του θόλου του ήπατος. Για να εξεταστεί η απόκριση των ηπατικών όγκων στην PT in vivo, δόθηκε τοπική ακτινοβολία PT για 12 Gy (RBE) σε όγκους 14 ημέρες μετά την εμφύτευση με καρκινικά κύτταρα Hepa1-6 (Εικόνα 1β). Τα ποντίκια ελέγχου υποβλήθηκαν σε ψευδή ακτινοβολία. Για να αντιμετωπίσουμε την αποκοιλιακή επίδραση του PT σε ξενιστές που φέρουν όγκους, εμφυτεύσαμε ταυτόχρονα καρκινικά κύτταρα Hepa1-6 στον δεξιό μηρό (πρωτοπαθής όγκος) και στο άνω μέρος της πλάτης (δευτερογενής σύγχρονος όγκος). Δεκατέσσερις ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου, PT με 12 Gy (RBE) χορηγήθηκε στον πρωτοπαθή όγκο αλλά όχι στον δευτερογενή σύγχρονο όγκο. Στη συνέχεια, παρατηρήσαμε την ανάπτυξη του όγκου (συμπεριλαμβανομένων των πρωτογενών ακτινοβολημένων και των σύγχρονων μη ακτινοβολημένων όγκων) στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Για τη διερεύνηση των επιδράσεων του αντι-PD-L1 στον τοπικό έλεγχο του όγκου με τη μεσολάβηση ΡΤ και την αποσκοπική επίδραση, σε ποντίκια που έφεραν όγκους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκή δόση 250 μg αντισώματος antiPD-L1 αμέσως μετά την ακτινοβόληση με ΡΤ και κάθε 2 ημέρες μέχρι το τέλος της τα πειράματα. Το αντίσωμα αντι-ποντικού PD-L1 (B7-H1, 10F.9G2) ελήφθη από την Bio X Cell (Λίβανος, ΝΗ, ΗΠΑ).

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. MDSC κυτταρομετρικές αναλύσεις ροής In Vivo

Τα MDSC χαρακτηρίζονται από συνέκφραση των αντιγόνων διαφοροποίησης της γενεαλογίας μυελοειδών κυττάρων Gr1 και CD11b. Επομένως, χρησιμοποιήσαμε ένα συγκεκριμένο αντίσωμα anti-Gr1, το οποίο αντιδρά με έναν κοινό επίτοπο στο Ly{-6G και το Ly-6C, και ένα αντίσωμα ειδικό για το CD11b (BD Pharmingen) για να ορίσουμε τα MDSC ποντικού ως CD11b + Gr1+ [23]. Επιπλέον, το μυελοειδές αντιγόνο διαφοροποίησης Gr{-1 αποτελείται από δύο επίτοπους που αναγνωρίζονται από αντισώματα αντι-Ly{-6G και αντι-Ly6C. Ο πληθυσμός των CD11b+Gr-1+ MDSC αποτελούνταν από δύο κύρια υποσύνολα: κύτταρα με κοκκιοκυτταρικό φαινότυπο που εκφράζει Ly{-6G και κύτταρα με μονοκυτταρικό φαινότυπο που εκφράζει Ly6C. Ένα νέο υποσύνολο MDSC ταυτοποιήθηκε ως μονοκυτταρικά MDSC, που ορίστηκαν ως CD11b+Ly6G- σε ποντικούς. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις FACS και ανοσοφθορισμού για να εξετάσουμε την επίδραση της ακτινοβολίας στη στρατολόγηση MDSC μετά την ακτινοβόληση σε ποντίκια. Το FACS διεξήχθη σε εναιωρήματα μονοκυττάρου που παρασκευάστηκαν από ολόκληρους όγκους και σπλήνα μετά από πέψη και ανοσοχρώση για CD11b, Gr1 και LY6G με μονοκλωνικά αντισώματα επισημασμένα με φθορισμό (BD PharMingen). Το ποσοστό του MDSC μετρήθηκε μέσω πολύχρωμης κυτταρομετρίας ροής με τα προαναφερθέντα μονοκλωνικά αντισώματα. Τα ειδικά για ισότυπο αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες στο FACS.

2.8. Στατιστική ανάλυση

Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SD). Όλα τα κυτταρικά πειράματα περιελάμβαναν τρία βιολογικά αντίγραφα ανά συνθήκη [24] και πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα. Για τα πειράματα in vivo, χρησιμοποιήθηκαν έξι ζώα ανά ομάδα και πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Ένα επίπεδο πιθανότητας p < 0.05 λήφθηκε για να υποδείξει τη στατιστική σημαντικότητα εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.

3. Αποτελέσματα:

3.1. Απόκριση HCC σε PT Απάντηση HCC

Ανθρώπινα και καρκινικά κύτταρα ποντικού εκτέθηκαν σε μία δόση PT των 0, 3, 6 ή 9 Gy (RBE) και ο κυτταρικός θάνατος στις 48 ώρες και το κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων που σχηματίζουν αποικία εξετάστηκαν και συγκρίθηκαν με φωτόνιο-RT. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κυτταρική επιβίωση σε ισοδύναμο RBE μεταξύ PT και φωτονίου-RT (Εικόνα 2a,b). Ο σχηματισμός του p-H2AX είναι μια κυτταρική απόκριση σε θραύσματα διπλού κλώνου DNA και η παρουσία έκθεσης σε καλρετικουλίνη και ομάδας υψηλής κινητικότητας Box 1 (HMGB1) χρησιμεύουν ως τα χαρακτηριστικά του κυτταρικού θανάτου ανοσογονικότητας που προκαλείται από RT [25-27]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2γ, η ΡΤ ενίσχυσε την έκφραση καλρετικουλίνης και HMGB1 που σχετίζεται με αυξημένη βλάβη του DNA 24 ώρες μετά την RT. Μια προηγούμενη μελέτη [28] ανέφερε ότι το photon-RT ρυθμίζει προς τα πάνω την IL-6, η οποία σχετίζεται με την αντίσταση του HCC στην RT. Τα δεδομένα (Εικόνα 2γ,δ) αποκαλύπτουν ότι η PT ρύθμισε προς τα πάνω το επίπεδο της IL-6 σε καρκινικά κύτταρα ήπατος που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας IF και RT PCR σε πραγματικό χρόνο στις 24 και 48 ώρες μετά την PT. Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω εάν η αύξηση της IL-6 από την PT συνδέθηκε με τη δραστηριότητα του προαγωγέα IL6, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς δραστηριότητας λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2 και HuH7 σταθερά διαμολυνθέντα με ένα φορέα που εκφράζει κατασκευές προαγωγέα IL-6 (Εικόνα 2e) . Τα ποσοτικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι το PT αύξησε τη δραστηριότητα του προαγωγέα IL-6 στις 48 ώρες μετά από 6 Gy (RBE) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

3.2. Απόκριση στη θεραπεία PT στον ανοσοεπαρκή ξενιστή

In vivo, τα μοντέλα ζωικών όγκων είναι απαραίτητα εργαλεία για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας νέων αντικαρκινικών στρατηγικών. Χρησιμοποιήσαμε συγγενικά μοντέλα όγκων ποντικού για να διερευνήσουμε τις επιδράσεις του PT στον έλεγχο του όγκου HCC. Με βάση την παρατήρηση της δραστηριότητας του όγκου μέσω της δοκιμασίας μοριακής τομογραφίας φθορισμού (FMT) in situ και της μέτρησης του μεγέθους του όγκου, βρήκαμε ότι υπήρχε σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα πρόσληψης γλυκόζης του όγκου και μικρότεροι όγκοι 12 ημέρες μετά την PT σε σύγκριση με το εικονικό RT (Εικόνα 3a, σι). Για να εξετάσουμε περαιτέρω τον μηχανισμό που είναι υπεύθυνος για την απόκριση στην PT, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις FACS και ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας όγκους 3 ημέρες μετά την PT ή την ψευδή ακτινοβολία. Έχει αναφερθεί ότι η έκθεση στην καλρετικουλίνη είναι ένας ανοσογονικός δείκτης της απόπτωσης που προκαλείται από χαμηλότερη δόση RT και το HMGB1 συνδέεται με τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από υψηλότερη δόση [29]. Επιπλέον, η IL-6 έχει αναφερθεί ότι παίζει ρόλο στην επαγόμενη από RT ανοσοτροποποίηση [30]. Προηγουμένως αναφέραμε ότι η έκφραση της IL-6 ρυθμίστηκε προς τα πάνω από την RT φωτονίων και ότι η αύξηση της IL6 συσχετίστηκε με την απόκριση ακτινοβολίας των όγκων του ήπατος [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3c,d, το PT αύξησε τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων που σχετίζεται με αυξημένη βλάβη του DNA και την έκφραση IL6 και HMGB1 σε σύγκριση με ψευδή ακτινοβολία.

3.3. Οι ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις που προκαλούνται από την PT

Η επαγωγή της πόλωσης του μακροφάγου Μ2 έχει αναφερθεί ότι είναι το βασικό ανοσοκατασταλτικό συστατικό στο ακτινοβολημένο μικροπεριβάλλον του όγκου [17,18]. Για να ελέγξουμε εάν το PT ενίσχυσε τη διαφοροποίηση μονοκυττάρων σε κύτταρα Μ2, επωάσαμε μονοκύτταρα THP-1 στο στάδιο ηρεμίας (Μ0) στο ρυθμισμένο μέσο για 72 ώρες για πόλωση Μ2. Στη συνέχεια αναλύσαμε τα επίπεδα του δείκτη Μ2 σε μακροφάγα από μονοκύτταρα με συγκαλλιέργεια σε υπερκείμενο καλλιέργειας με ή χωρίς ακτινοβολημένα με ΡΤ κύτταρα HuH7 24 ώρες πριν από το τέλος της πόλωσης των μακροφάγων Μ2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4α, η προσθήκη καρκινικών κυττάρων που ακτινοβολήθηκαν με ΡΤ στην καλλιέργεια μακροφάγων αύξησε την έκφραση του δείκτη Μ2 CD163 σε μακροφάγους in vitro. Ερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο του PT στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επάγουν MDSC από μονοκύτταρα στο περιφερικό αίμα των δοτών μέσω συγκαλλιέργειας με καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς PT για 48 ώρες. Ένα νέο υποσύνολο MDSC ταυτοποιήθηκε από κύτταρα CD14+HLA-DR-στο PBMC. Το Σχήμα 4β αποκαλύπτει ότι η ακτινοβολία PT συσχετίστηκε με υψηλότερη συχνότητα CD14+ HLA-DR-μυελοειδών κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο. Επιπλέον, υπήρχε υψηλότερη έκφραση του iNOS, ενός λειτουργικού δείκτη ανοσοκαταστολής που προκαλείται από MDSC, στην υποομάδα κυττάρων που συγκαλλιεργήθηκαν με καρκινικά κύτταρα ακτινοβολημένα με ΡΤ (Εικόνα 4γ). Επιπλέον, το CD163 έχει επιβεβαιωθεί ότι είναι ένας φαινοτυπικός δείκτης των μακροφάγων Μ2 που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση των μακροφάγων Μ2 και Μ1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4d,e, το PT οδήγησε στην αύξηση των CD163+ κυττάρων σε όγκους που ακτινοβολήθηκαν με ΡΤ που σχετίζονται με την επαγωγή μονοκυτταρικών MDSC σε ποντικούς που φέρουν όγκο. Η RT έχει αναφερθεί ότι πυροδοτεί ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο και ενισχύει τη διήθηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Για να ελεγχθεί περαιτέρω ο ρόλος του PT στις λειτουργικές συνέπειες των καρκινικών κυττάρων στην καταστολή των Τ-κυττάρων με τη μεσολάβηση MDSC, εκτιμήθηκε ο πολλαπλασιασμός ταξινομημένων CD{37}} Τ κυττάρων παρουσία καρκινικών κυττάρων με ή χωρίς 6 Gy (RBE ) Ακτινοβολία PT. Τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι τα κύτταρα MDSC-CD11b+ μείωσαν τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων και η επώαση με κύτταρα όγκου που ακτινοβολήθηκαν με ΡΤ ανέστρεψε τον πολλαπλασιασμό των CD{44}} Τ κυττάρων μετά τη διέγερση (Εικόνα 4στ).

Σχήμα 2. Απόκριση HCC σε ΡΤ in vitro. Επιδράσεις της θεραπείας με ΡΤ στον κυτταρικό θάνατο των κυττάρων HuH7. (α) Διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένη με φθορισμό με ιωδιούχο προπίδιο και χρώση αννεξίνης V 48 ώρες μετά την PT για την υποδεικνυόμενη δόση (RBE) και (β) κλάσματα επιβίωσης κυττάρων με κλωνογονικές δοκιμασίες που παρουσιάζονται με την αναλογία κανονικοποιημένη από το κλάσμα επιβίωσης υπό συνθήκες ελέγχου. Οι αριθμοί κελιών επιμετάλλωσης για 0, 3, 6 και 9 Gy (RBE) ήταν 500, 1000, 1500 και 3000 ανά φρεάτιο, αντίστοιχα. (γ) Ανοσοφθορισμός για βλάβη DNA που προκαλείται από ΡΤ και δείκτες για κυτταρικό θάνατο ανοσογονικότητας φαίνεται από αντιπροσωπευτικές διαφάνειες και ποσοτικά δεδομένα (DAPI, μπλε, ρΗ 2AX και καλρετικουλίνη, πράσινο, HMGB1 και IL6, κόκκινο). Ο άξονας y αντιπροσωπεύει τις σχετικές αναδιπλούμενες αλλαγές στις εκφράσεις πρωτεΐνης στόχου. (δ) Τα επίπεδα της IL-6 εξετάστηκαν μέσω RT–PCR σε πραγματικό χρόνο 48 ώρες μετά την PT. (ε) Σταθερή επιμόλυνση των κυττάρων HepG2 και HuH7 με πλασμίδια που περιέχουν κατασκευάσματα υποκινητή-αναφορέα IL-6. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται ως πολλαπλάσια ενεργοποίηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης του πλασμιδίου αναφοράς στην υποδεικνυόμενη κατάσταση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. * p < 0,05

Εικόνα 3. Απόκριση στη θεραπεία με ΡΤ σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς. Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικά δεδομένα προσδιορίστηκαν μέσω ανάλυσης FMT της πρόσληψης γλυκόζης στις 0, 3 ή 12 ημέρες με ή χωρίς ακτινοβολία PT (α). Ο άξονας y αντιπροσωπεύει την αναλογία που κανονικοποιείται από την τιμή του όγκου σε 0 ημέρες με ψευδή ακτινοβολία. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικά δεδομένα εικόνων όγκων (β) από ποντικούς που φέρουν καρκινικούς όγκους 12 ημέρες μετά από 12 Gy (RBE) PT ή εικονική ακτινοβολία. Ο άξονας y αντιπροσωπεύει τη σχετική αλλαγή στο μέγεθος του όγκου στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά την PT. Η βλάβη του DNA από το IF (c) και ο κυτταρικός θάνατος από το FACS (d) αξιολογήθηκαν σε 3 ημέρες μετά την PT. Ο άξονας y είναι η σχετική αναδίπλωση στις εκφράσεις πρωτεΐνης στόχου και ο ρυθμός κυτταρικού θανάτου στις 3 ημέρες μετά την PT. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. * p < 0.05

3.4. Ο ρόλος του PT στην έκφραση του συνδέτη προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-L1)

Το PD-L1 είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της ισορροπίας στο μικροπεριβάλλον του ανοσοποιητικού όγκου [31]. Το PT αύξησε την έκφραση του PD-L1 σε κύτταρα όγκου ήπατος και το επίπεδο έκφρασης συσχετίστηκε θετικά με τη δόση RBE του PT in vitro (Εικόνα 5a,b). Για περαιτέρω επικύρωση των επιδράσεων του PT στο PD-L1 in vivo, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης του PD-L1 σε όγκους HCC ποντικού χρησιμοποιώντας IF και FACS. Τα δεδομένα στο Σχήμα 5c,d αποκαλύπτουν σημαντικά αυξημένη έκφραση PD-L1 σε όγκους 3 ημέρες μετά την PT. Εξετάσαμε επίσης εάν το PT ρύθμιζε την έκφραση του PD-L1 σε MDSC χρησιμοποιώντας ταξινομημένα μυελοειδή κύτταρα CD11b+ από όγκους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΡΤ αύξησε την έκφραση PD-L1 στα ταξινομημένα κύτταρα CD11b+ (Εικόνα 5e,f).

3.5. Επίδραση του PD-L1 στην Απόκριση του HCC στο PT In Vivo

Για να προσδιοριστεί εάν το PD-L1 παίζει ρόλο στη ραδιοευαισθησία των όγκων του ήπατος σε PT σε ανοσοεπαρκείς ξενιστές, χορηγήθηκε τοπική RT με PT 12 Gy (RBE) σε υποδορίως εμφυτευμένους όγκους σε ποντικούς με ή χωρίς θεραπεία αντι-PD-L1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6a–c, το anti-PD-L1 αύξησε το αποτέλεσμα αναστολής του όγκου που προκαλείται από PT που σχετίζεται με μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αυξημένο κυτταρικό θάνατο μετά την ακτινοβόληση. Επιπλέον, για την επικύρωση των ρυθμιστικών επιδράσεων του anti-PD-L1 στο μικροπεριβάλλον του ανοσοποιητικού όγκου μετά από PT, εξετάσαμε την ανοσοαπόκριση χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ορθοτοπικού όγκου HCC ποντικού. Τα δεδομένα δείχνουν ότι το anti-PD-L1 μείωσε τη στρατολόγηση MDSC και αύξησε τα CD{15}} TIL που σχετίζονται με μικρότερους όγκους σε σύγκριση με το PT μόνο (Εικόνα 6d–f)

3.6. Ο αποκλεισμός του PD-L1 ενισχύει την επίδραση της κοιλιακής κοιλότητας στον καρκίνο του ήπατος μετά από PT

Η ακτινοβολία έχει αναφερθεί ότι προκαλεί επιδράσεις στο κοιλιακό τμήμα σε απομακρυσμένες, μη θεραπευμένες θέσεις καρκίνου που ενισχύονται με τη χρήση ανοσοτροποποιητικών φαρμάκων [32-34]. Αντίστοιχα, εξετάσαμε περαιτέρω το αποκοιλιακό αποτέλεσμα που προκαλείται από την PT στους όγκους του ήπατος και την επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με το αντίσωμα αντι-PD-L1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7a,b και στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1, η εφαρμογή του τοπικού ΡΤ στον όγκο μόνο προκάλεσε μικρότερους όγκους με χαμηλότερο μεταβολισμό γλυκόζης σε ακτινοβολημένους όγκους πάνω από τον δεξιό μηρό, αλλά δεν έδειξε σημαντική αναστολή όγκου στους δευτερογενείς μη ακτινοβολημένους όγκους στο άνω μέρος της πλάτης , σε σύγκριση με την ομάδα ψευδο-RT. Η συνδυασμένη θεραπεία με το αντίσωμα αντι-PD-L1 αμέσως μετά την PT ενίσχυσε το ογκοκτόνο αποτέλεσμα στο πεδίο που ακτινοβολήθηκε με ΡΤ και είχε ως αποτέλεσμα την υποχώρηση των δευτερογενών όγκων εκτός του ακτινοβολούμενου πεδίου. Η ανάλυση των κυττάρων του ανοσοποιητικού που διεισδύουν στον όγκο έδειξε ότι το anti-PD-L1 εξασθένησε τη στρατολόγηση MDSC, αύξησε τα CD{16}} TIL και μείωσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε μη ακτινοβολημένους όγκους (Εικόνα 7γ, δ) ποντικών που έλαβαν τοπική PT σε πρωτογενείς όγκους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το anti-PD-L1 ενίσχυσε την αντικαρκινική ανοσοαπόκριση και αύξησε το αποκοιλιακό αποτέλεσμα σε ανοσοεπαρκείς ξενιστές μετά από τοπική ακτινοβολία ΡΤ

Εικόνα 4. Ανοσολογική απόκριση που σχετίζεται με PT. Η έκφραση του δείκτη CD163 στα κύτταρα στο τέλος της πόλωσης των μακροφάγων Μ2 αναλύθηκε μέσω FACS (a) (I: έλεγχος· II: + υπερκείμενο καλλιέργειας καρκινικών κυττάρων· III: + καρκινικά κύτταρα· IV: +6 Gy (RBE) υπερκείμενο ακτινοβολημένο με PT καρκινικά κύτταρα, V: +6 Gy (RBE) ακτινοβολημένα με PT καρκινικά κύτταρα). Το ποσοστό των κυττάρων CD14+HLA-DR− από PBMCs που επωάστηκαν με ή χωρίς κύτταρα HuH7 που ακτινοβολήθηκαν με 0, 3 ή 6 Gy (RBE) για 48 ώρες αναλύθηκε (b) και η έκφραση του iNOS στα ταξινομημένα κύτταρα CD14+HLA-DR− αναλύθηκε μέσω IF (DAPI, μπλε, iNOS, κόκκινο) (c). Η έκταση των κυττάρων CD163+ σε ακτινοβολημένους όγκους 12 ημέρες μετά την εξέταση του PT μέσω IF (DAPI, μπλε, CD163, κόκκινο) (d) και η επίδραση της ακτινοβολίας PT στη στρατολόγηση μονοκυτταρικών-MDSC αξιολογήθηκε μέσω FACS ( μι). Επιπλέον, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των Τ-κυττάρων εξετάστηκε μέσω FACS με ή χωρίς επώαση με ακτινοβολημένα με ΡΤ καρκινικά κύτταρα. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικά δεδομένα (f). Η θεραπεία έδειξε CD8+ Τ κύτταρα με σφαιρίδια διέγερσης αντι-CD3/CD28 παρουσία MDSC σε συνδυασμό με καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς ακτινοβολία ΡΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. * p < 0.05.

Σχήμα 5. Επίδραση της ΡΤ στην έκφραση PD-L1. Τα επίπεδα του PD-L1 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας (α) IF (DAPI, μπλε, PD-L1, πράσινο), (β) χρώση FACS για καρκινικά κύτταρα ήπατος ανθρώπου και ποντικού σε 48 ώρες μετά την PT in vitro και (γ) FACS, και (δ) IF για όγκους ήπατος ποντικού στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την PT για 12 Gy (RBE) in vivo. Ο άξονας y είναι η σχετική αλλαγή πτυχής στην έκφραση PD-L1 στις υποδεικνυόμενες συνθήκες μετά την PT. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. * p < 0.05. Επιπλέον, η έκφραση του PD-L1 σε κύτταρα CD11b+ ποντικού μετά από ακτινοβολία ΡΤ αξιολογήθηκε μέσω (ε) ανάλυσης IF και (στ) FACS (κύτταρα CD11b+, μπλε κηλίδες)

Σχήμα 6. Επίδραση του PD-L1 στην απόκριση του HCC σε ΡΤ in vivo. (α) Η επίδραση της θεραπείας με αντι-PD-L1 στην καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου. Ο άξονας y είναι η σχετική αλλαγή πτυχής στο μέγεθος του υποδόριου όγκου που προκαλείται από το anti-PD-L1 μετά από PT. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των πειραμάτων, * p < {{10}}.05. (β) Οι in vivo επιδράσεις της απόπτωσης που προκαλείται από τη θεραπεία, όπως αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας FACS με χρώση Annexin V-PI. Ο άξονας y είναι η σχετική αλλαγή στο ποσοστό κυτταρικού θανάτου μετά από PT. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα του μέσου όρου. * p < 0,05. (γ) Ανοσοϊστοχημεία για βλάβη DNA που προκαλείται από RT και Ki-67 σε όγκους στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την PT για 12 Gy (RBE). (δ) Η επίδραση της θεραπείας με αντι-PD-L1 στην αναστολή του όγκου αξιολογήθηκε σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο όγκου. Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικά δεδομένα εμφανίζονται 12 ημέρες μετά την τοπική ακτινοβολία PT ή την εικονική ακτινοβολία. Ο άξονας y είναι η σχετική αλλαγή στο μέγεθος του όγκου του ήπατος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των πειραμάτων, * p < 0,05. (ε) Η έκταση των κυττάρων ki{67+, CD{3+TIL και CD11b+ σε ακτινοβολημένους όγκους 12 ημέρες μετά την PT εξετάστηκε χρησιμοποιώντας IF (DAPI, μπλε· ki-67 και CD3, πράσινο CD11b, κόκκινο). (στ) Η επίδραση του αντι-PD-L1 σε συνδυασμό με ακτινοβολία PT στη στρατολόγηση MDSC αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας FACS

Εικόνα 7. Η επίδραση της κοιλιακής κοιλότητας στον καρκίνο του ήπατος μετά από PT. Η ανάπτυξη των μη ακτινοβολημένων όγκων στο άνω μέρος της πλάτης προσδιορίστηκε μέσω ανάλυσης FMT της πρόσληψης γλυκόζης (α) και εικόνων όγκου (β) σε ενδεικνυόμενους χρόνους από ποντίκια που έλαβαν PT για 12 Gy (RBE) στον πρωτοπαθή όγκο μόνο στον δεξιό μηρό ( PT (+): τα ποντίκια έλαβαν 12 Gy (RBE) στον πρωτοπαθή όγκο στον δεξιό μηρό, αλλά όχι στον δευτερεύοντα όγκο στο άνω μέρος της πλάτης). Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικά δεδομένα μη ακτινοβολημένων όγκων εμφανίζονται στις 0, 3 και 12 ημέρες μετά την ακτινοβολία PT με ή χωρίς θεραπεία με αντι-PD-L1. Ο άξονας y αντιπροσωπεύει τη σχετική αλλαγή πτυχής στην τιμή του FMT και του μεγέθους του όγκου στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά την PT. Επιπλέον, εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες του επιπέδου του ki-67 και της διήθησης των κυττάρων CD11b+ και των κυττάρων CD3+ σε δευτερογενείς μη ακτινοβολημένους όγκους 12 ημέρες μετά την τοπική PT χρησιμοποιώντας IF (DAPI, μπλε, ki{{16 }} και CD3, πράσινο, CD11b, κόκκινο) (γ). Η συσσώρευση MDSC (δ) στον δευτερογενή μη ακτινοβολημένο όγκο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Ο άξονας y είναι η σχετική αλλαγή πτυχής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των πειραμάτων, * p < 0.05

4. Συζήτηση

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η απώλεια κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες που προκαλείται από το PT είναι δοσοεξαρτώμενη και παρόμοια με αυτή που προκαλείται από την ακτινοβολία φωτονίων. Το επίπεδο της μη επισκευασμένης βλάβης του DNA που προκαλείται από την ακτινοβολία είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ειδικής για τον ιστό απόκρισης ακτινοβολίας. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι ο κυτταρικός θάνατος που προκαλείται από PT συσχετίζεται με την αύξηση των επιπέδων των δεικτών βλάβης του DNA. Αρκετές κυτοκίνες που σχετίζονται με όγκους αναφέρεται ότι ρυθμίζονται με ακτινοβολία και είναι σε θέση να στρατολογούν και να πολώνουν ανοσολογικά υποσύνολα στο μικροπεριβάλλον του όγκου [35,36]. Προηγουμένως αναφέραμε ότι η έκφραση της IL-6 ρυθμίστηκε προς τα πάνω από το φωτόνιο RT και ότι η αύξηση της IL6 συσχετίστηκε με την απόκριση ακτινοβολίας των όγκων του ήπατος [28]. Προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει διαφορική ρύθμιση των φλεγμονωδών παραγόντων μετά από PT έναντι ακτινοβολίας φωτονίων, συμπεριλαμβανομένης της IL-6 [6,7,37]. Δείχνουμε χρησιμοποιώντας κυτταρικά πειράματα ότι η ακτινοβολία PT ρύθμισε επίσης προς τα πάνω το επίπεδο έκφρασης της IL-6 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Η ανταπόκριση του όγκου στη θεραπεία επηρεάζεται από τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και το μικροπεριβάλλον του όγκου. Η χρήση μοντέλων ποντικιών είναι μια βέλτιστη στρατηγική για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Από όσο γνωρίζουμε, λίγες προκλινικές σειρές έχουν παρουσιάσει την ανταπόκριση των όγκων του ήπατος στην PT μέχρι τώρα. Τα in vivo δεδομένα του θανάτου των καρκινικών κυττάρων και της καθυστέρησης της ανάπτυξης του όγκου που προκαλείται από την PT σε ποντικούς που φέρουν όγκο ήπατος επιδείχθηκαν στην παρούσα μελέτη. Εκτός από την εγγενή κυτταρική ραδιοευαισθησία, η αναγέννηση του όγκου μετά από ακτινοθεραπεία in vivo μπορεί να επηρεαστεί ουσιαστικά από αρκετούς φλεγμονώδεις και στρωματικούς παράγοντες [38,39]. Μια ποικιλία επιδράσεων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό κατάντη επάγονται από την RT, συμπεριλαμβανομένων των ανοσοδιεγερτικών και ανοσοκατασταλτικών επιδράσεων. Η RT διεγείρει την αντικαρκινική ανοσία μέσω επαγωγής ανοσογονικού κυτταρικού θανάτου, απελευθερώνοντας νέα αντιγόνα στα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος, οδηγώντας στη συνέχεια σε βελτιωμένη εκκίνηση και ενεργοποίηση των τελεστών Τ κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, η RT οδηγεί σε ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα, όπως η στρατολόγηση MDSC στο ακτινοβολημένο μικροπεριβάλλον [39,40]. Η στρατολόγηση των MDSCs είναι ένας καθοριστικός παράγοντας του ανοσοκατασταλτικού μικροπεριβάλλοντος όγκου μετά από RT. Τα MDSC έχουν αναδειχθεί ως κύριοι ρυθμιστές των ανοσολογικών αποκρίσεων στον καρκίνο και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις. Τα στοιχεία υποστηρίζουν τη βασική συμβολή του MDSC στην εξέλιξη του όγκου. Προηγουμένως αναφέραμε ότι η αύξηση του MDSC θα μπορούσε να προκληθεί από την RT και ότι η αύξηση συσχετίστηκε με την αντίσταση στην RT σε ένα ζωικό μοντέλο HCC [28]. Η παρουσιαζόμενη μελέτη έδειξε ότι η PT οδηγεί στην ενεργοποίηση της στρατολόγησης MDSC που σχετίζεται με την επαγωγή μονοκυτταρικών MDSC σε ποντικούς που φέρουν όγκο. Ένα νέο υποσύνολο MDSC που προσδιορίζεται ως μονοκύτταρα MDSC ορίζεται ως μονοκύτταρα CD14+HLA-DR- από το περιφερικό αίμα ασθενών και CD11b+Ly6G- σε ποντίκια [20,23,41]. Η έκφραση του iNOS ως λειτουργικού δείκτη της αναστολής των Τ-κυττάρων είναι το χρυσό πρότυπο για την αξιολόγηση της λειτουργίας MDSC [42]. Πειράματα χρησιμοποιώντας επώαση PBMC με καρκινικά κύτταρα έδειξαν ότι το PT ενίσχυσε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επάγουν MDSC στα μονοκύτταρα και αύξησε την έκφραση του iNOS στην υποομάδα των κυττάρων. Επιπλέον, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι η συγκαλλιέργεια με κύτταρα CD11b+ μείωσε τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων και ο ακτινοβολούμενος με ΡΤ καρκίνος εξασθένησε την κατασταλτική ικανότητα των κυττάρων CD11b+ στον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων σε πειράματα συγκαλλιέργειας.

Η γενεαλογία των μυελοειδών κυττάρων αναφέρεται ότι αποτελεί ένα δίκτυο ανοσοκατασταλτικών κυττάρων που υπάρχουν στους περισσότερους καρκινοπαθείς και που αναστέλλουν βαθιά τη δημιουργία αντινεοπλασματικής ανοσίας. Τα μακροφάγα, τα άφθονα κύτταρα του ανοσοποιητικού στο μικροπεριβάλλον του όγκου, είναι σημαντικοί ρυθμιστές της χρόνιας φλεγμονής. Έχει προταθεί ότι τα μακροφάγα μπορούν να πολωθούν προς τον φαινότυπο Μ2, ο οποίος συμβάλλει στο ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον [43]. Τα μονοπύρηνα κύτταρα σε όγκους πιθανώς υπάρχουν σε διάφορες φάσεις διαφοροποίησης από μονοκύτταρα/μονοκυτταρικά-MDSCs σε μακροφάγους M2 που σχετίζονται με όγκους. Αυτό το δίκτυο μεταξύ MDSC και μακροφάγων M2 που σχετίζονται με όγκους αποκαλύπτει ότι το M2 μπορεί να διακριθεί από τα μονοκυτταρικά MDSC. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η RT παίζει ρυθμιστικό ρόλο στα μακροφάγα με πόλωση Μ1/Μ2 για τη ρύθμιση της ανοσοαπόκρισης [44,45]. Δείξαμε ότι η συγκαλλιέργεια με κύτταρα ακτινοβολημένα με ΡΤ είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση δεικτών Μ2 in vitro και όγκους ακτινοβολημένους με ΡΤ in vivo. Η ενεργοποίηση των αντικαρκινικών ανοσολογικών αποκρίσεων είναι κρίσιμη για την αποτελεσματικότητα της RT.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Πολλαπλοί ανοσοποιητικοί μηχανισμοί είναι σημαντικοί στην ανάπτυξη και εξέλιξη του HCC και συσχετίζονται με την πρόγνωση. Οι αναστολείς σημείων ελέγχου που στοχεύουν τα PD1 και PDL1 είναι ενεργοί, ανεκτοί και κλινικά ωφέλιμοι έναντι του προχωρημένου HCC [46]. Το PD-L1, ένας κύριος κυτταρικός βιοδείκτης, παίζει ρόλο στην ανοσολογική διαφυγή, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της ανοσολογικής επιτήρησης που προκαλείται από Τ-κύτταρα και της ρύθμισης της πόλωσης του μακροφάγου Μ2 [13,31,47]. Παρατηρήθηκε ανοδική ρύθμιση του άξονα PD-1/PD-L1 για την καταστολή της κυτταροτοξικής δράσης των Τ-λεμφοκυττάρων, η οποία μπορεί να είναι η αιτία των ανοσοαποκρίσεων του ξενιστή που διαφεύγει του όγκου και της ατελούς θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων μετά από ακτινοβόληση. Το PD-L1 εντοπίστηκε ευρέως σε αιμοποιητικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων Τ κυττάρων, μακροφάγων και κυττάρων όγκου. Το PD-1/PD-L1 είναι ένα αξιοσημείωτο σημείο ελέγχου του ανοσοποιητικού που οδηγεί σε ανεργία των Τ-κυττάρων. Τα αντισώματα στο PD-L1, ένα ανοσοποιητικό σημείο ελέγχου, έχουν εγκριθεί για επικουρική θεραπεία ορισμένων καρκίνων και ως πολλά υποσχόμενη ανοσοθεραπεία για προχωρημένους ασθενείς με HCC [48,49]. Οι αναστολείς PDL1 είναι ένας από τους βασικούς άξονες των συστημικών θεραπειών στην κλινική πρακτική ή υπό ανάπτυξη για HCC. Επιπλέον, τα επαγόμενα από την RT ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα αποκαλύπτουν τη δυνατότητα επιτυχούς συνδυασμού ακτινοβολίας με διάφορες μορφές ανοσοθεραπείας για την κατάργηση αυτών των ανοσοκατασταλτικών επιδράσεων. Τα MDSC μπορούν να συμβάλουν στην αντίσταση του ασθενούς στην αναστολή του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου. Δείξαμε ότι το PT ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση του PD-L1 σε όγκους και MDSC με δοσοεξαρτώμενο τρόπο in vitro και in vivo. Τα επαγόμενα από την RT ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα αποκαλύπτουν τη δυνατότητα επιτυχούς συνδυασμού ακτινοβολίας με διάφορες μορφές ανοσοθεραπείας για την κατάργηση αυτών των ανοσοκατασταλτικών επιδράσεων. Η προκλινική έρευνα έχει δείξει ότι ο συνδυασμός RT φωτονίων και ανοσοθεραπείας επιδεικνύει θεραπευτική συνεργία για τη βελτίωση του ελέγχου του όγκου [15]. Όπως γνωρίζουμε, ο συνδυασμός RT και ανοσοθεραπείας βρίσκεται ακόμα στα προκαταρκτικά του στάδια και δεν υπάρχουν βέλτιστες προδιαγραφές δόσης RT, τύπων RT ή αλληλουχίας για RT και ανοσοθεραπεία. Για να διευκρινιστεί αυτό το ζήτημα της ακτινοβολίας PT σε συνδυασμό με την ανοσοθεραπεία, συνδυάσαμε τη θεραπεία αντι-PD-L1 με την ακτινοβολία PT όγκων του ήπατος σε μοντέλα συγγενών όγκων. Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός με αντίσωμα αντι-PD-L1 ευαισθητοποίησε τον καρκίνο του ήπατος στην ακτινοβολία PT, όπως αποδεικνύεται από έναν μικρότερο όγκο που σχετίζεται με αυξημένο θάνατο καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η θεραπεία με αντι-PD-L1 ανέστειλε τη στρατολόγηση MDSC και αύξησε τη διήθηση των CD{41}} Τ κυττάρων σε όγκους που ακτινοβολήθηκαν με PT.

Η RT θεωρείται κλασικά ως τοπική θεραπεία, που σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα μέσω ενδογενούς βλάβης του DNA στο πεδίο ακτινοβολίας. Επιπλέον, η απόκριση του κοιλιακού στην ακτινοβολία είναι ένα καλά εδραιωμένο φαινόμενο όπου όγκοι εκτός πεδίου ακτινοβολίας ανταποκρίνονται επίσης στη θεραπεία. Το αποκοιλιακό αποτέλεσμα θεωρείται ότι προκαλείται από το ανοσοποιητικό. Ένα μέρος των καρκινικών κυττάρων μέσα σε έναν όγκο θα πεθάνει μέσω ανοσογονικού κυτταρικού θανάτου όταν χρησιμοποιείται ακτινοβολία σε θεραπευτικές δόσεις. Ο επαγόμενος από RT θάνατος των καρκινικών κυττάρων σχετίζεται με τη δημιουργία ειδικών μοριακών σημάτων και περισσότερων αντιγόνων που παρουσιάζονται στα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος. Έχει αναφερθεί ότι η RT μπορεί να πυροδοτήσει ένα σχετιζόμενο με το ανοσοποιητικό αποκοιλιακό αποτέλεσμα, το οποίο υποδηλώνει ότι η RT όχι μόνο έχει ογκοκτόνο αποτέλεσμα στον όγκο στόχο αλλά έχει επίσης αντικαρκινική δράση σε απομακρυσμένες, μη θεραπευμένες θέσεις καρκίνου [32,50,51]. Μεταξύ των παραγόντων που προκαλούνται από την RT, η ικανότητα της ακτινοβολίας να προάγει την αναγνώριση καρκινικών κυττάρων από τα Τ κύτταρα είναι πιθανώς ιδιαίτερης σημασίας για το αποκοιλιακό αποτέλεσμα. Αυτό το αποτέλεσμα σχετίζεται με τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων για την τόνωση της αντικαρκινικής ανοσίας που μπορεί να ενισχυθεί με τη χρήση ανοσοτροποποιητικών παραγόντων. Επιπλέον, το pembrolizumab προκαλεί ποσοστό 15–20% αντικειμενικών υφέσεων που σχετίζονται με παρατεταμένη επιβίωση στο HCC [46]. Ένα κρίσιμο σημείο σχετικά με τους αναστολείς σημείων ελέγχου είναι η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά τους. Είναι σαφές ότι η ανοσοθεραπεία δεν παρέχει οφέλη για όλους τους ασθενείς. Το πώς να ξεπεραστεί η αντίσταση του όγκου στην ανοσοθεραπεία είναι ένα σημαντικό ζήτημα. Οι πιθανές αιτίες της αντίστασης του όγκου περιλαμβάνουν την εγγενή αντίσταση και την ανάπτυξη αντισωμάτων κατά των φαρμάκων που εξουδετερώνουν τη δραστηριότητα της ανοσοθεραπείας. Για να επιτευχθεί ισχυρή ανοσολογική διέγερση, διαφορετικές τοπικές θεραπείες μπορούν να συνδυαστούν διαδοχικά ή ταυτόχρονα με συστηματική ανοσοθεραπεία. Η ανοσοθεραπεία είναι πιθανό να συνέργει με τοπικές παρεμβάσεις στο HCC. Το HCC είναι συχνά πολυεστιακό με πιθανές προκαρκινικές περιοχές να αναπτύσσονται ως μεταχρόνιες σε όλη την έκταση. Εδώ, εξετάσαμε περαιτέρω εάν ο συνδυασμός του PT με το anti-PD-L1 ενισχύει την αποσκοπική επίδραση του PT για την αύξηση του ελέγχου των μεταχρόνιων όγκων του ήπατος. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι ο συνδυασμός του PT με το anti-PD-L1 προκάλεσε μικρότερα μεγέθη όγκων στους δευτερογενείς μη ακτινοβολημένους όγκους σε σύγκριση με αυτούς που προκαλούνται είτε από PT είτε από anti-PD-L1 μόνο. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι ο συνδυασμός με αντι-PD-L1 σχετίστηκε με αυξημένα TIL και εξασθενημένη στρατολόγηση MDSC σε μακρινούς μη ακτινοβολημένους όγκους ποντικών που έλαβαν τοπικό PT. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το anti-PD-L1 αύξησε την αντικαρκινική ανοσία, η οποία μεσολάβησε στις αυξημένες δραστηριότητες εξόντωσης του πρωτογενούς όγκου και στο αποκοιλιακό αποτέλεσμα σε ποντίκια που φέρουν όγκο και έλαβαν τοπική ακτινοβολία ΡΤ.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

5. Συμπεράσματα

Το σκεπτικό για το συνδυασμό ακτινοθεραπείας και ανοσοθεραπείας είναι ότι η ακτινοβολία θα μπορούσε να παράγει συνεργιστική αντικαρκινική ανοσία και ότι η ανοσοθεραπεία υπερνικά τις αποκρίσεις ανοσοκαταστολής στο ακτινοβολημένο μικροπεριβάλλον του όγκου. Συνοπτικά, προτείνουμε ότι εκτός από τη βιολογική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα, το PT έχει επίσης μια επίδραση ανοσοτροποποίησης στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ότι το anti-PD-L1 προκάλεσε αντικαρκινική ανοσία και στη συνέχεια αύξησε την απόκριση πρωτογενών και απομακρυσμένων όγκων στην ακτινοβολία PT. Η εφαρμογή anti-PD-L1 σε συνδυασμό με PT θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του HCC.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Bray, F.; Ferlay, J.; Soerjomataram, Ι.; Siegel, R.-L.; Torre, L.-A.; Jemal, A. Παγκόσμιες στατιστικές καρκίνου 2018: Εκτιμήσεις της GLOBOCAN για επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως για 36 καρκίνους σε 185 χώρες. CA Cancer J. Clin. 2018, 68, 394–424. [CrossRef]

2. Chuong, Μ.; Kaiser, Α.; Molitoris, J.; Mendez Romero, Α.; Apisarnthanarax, S. Θεραπεία με δέσμη πρωτονίων για καρκίνους του ήπατος. J. Gastrointest. Oncol. 2020, 11, 157–165. [CrossRef]

3. Yoo, G.-S.; Yu, J.-I.; Park, H.-C. Θεραπεία πρωτονίων για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα: Τρέχουσα γνώση και μελλοντικές προοπτικές. World J. Gastroenterol. 2018, 24, 3090–3100. [CrossRef]

4. Yuan, T.-Z.; Zhan, Z.-J.; Qian, C.-N. Νέα σύνορα στη θεραπεία πρωτονίων: Εφαρμογές σε καρκίνους. Cancer Commun. 2019, 39, 61. [CrossRef] [PubMed]

5. Deycmar, S.; Faccin, Ε.; Kazimova, Τ.; Knobel, Ρ.-Α.; Telarovic, I.; Tschanz, F.; Waller, V.; Winkler, R.; Yong, C.; Zingariello, D. Η σχετική βιολογική αποτελεσματικότητα της ακτινοβολίας πρωτονίων στην εξάρτηση της επιδιόρθωσης βλάβης του DNA. Br. J. Radiol. 2020, 93, 20190494. [CrossRef] [PubMed]

6. Luhr, Α.; von Neubeck, C.; Krause, Μ.; Troost, EGC Σχετική βιολογική αποτελεσματικότητα στη θεραπεία δέσμης πρωτονίων-Τρέχουσα γνώση και μελλοντικές προκλήσεις. Clin. Μετάφρ. Ακτινοβολία. Oncol. 2018, 9, 35–41. [CrossRef]

7. Girdhani, S.; Sachs, R.; Hlatky, L. Βιολογικές επιδράσεις της ακτινοβολίας πρωτονίων: Τι γνωρίζουμε και τι δεν γνωρίζουμε. Ακτινοβολία. Res. 2013, 179, 257–272. [CrossRef]

8. Van Limbergen, E.-J.; De Ruysscher, D.-K.; Olivo Pimentel, V.; Marcus, D.; Berbee, Μ.; Hoeben, Α.; Rekers, Ν.; Theys, J.; Yaromina, Α.; Dubois, L.-J.; et al. Συνδυασμός ακτινοθεραπείας με ανοσοθεραπεία: Το παρελθόν, το παρόν και το μέλλον. Br. J. Radiol. 2017, 90, 20170157. [CrossRef]

9. Shabason, J.-E.; Minn, A.-J. Αποκλεισμός σημείων ελέγχου ακτινοβολίας και ανοσοποιητικού: Από τον πάγκο στην κλινική. Σεμιν. Ακτινοβολία. Oncol. 2017, 27, 289–298. [CrossRef] [PubMed]

10. Lu, C.; Rong, D.; Zhang, Β.; Zheng, W.; Wang, X.; Chen, Ζ.; Tang, W. Τρέχουσες προοπτικές για το ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον όγκου στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα: Προκλήσεις και ευκαιρίες. ΜοΙ. Cancer 2019, 18, 130. [CrossRef]

11. Baird, J.-R.; Monjazeb, Α.-Μ.; Shah, Ο.; McGee, Η.; Murphy, W.-J.; Crittenden, M.-R.; Gough, M.-J. Διέγερση της έμφυτης ανοσίας για την ενίσχυση του ελέγχου του όγκου που προκαλείται από την ακτινοθεραπεία. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2017, 99, 362–373. [CrossRef]

12. Bernstein, Μ.-Β.; Krishnan, S.; Hodge, J.-W.; Chang, J.-Y. Ανοσοθεραπεία και στερεοτακτική αφαιρετική ακτινοθεραπεία (ISABR): Θεραπευτική προσέγγιση; Nat. Κλιν. Oncol. 2016, 13, 516–524. [CrossRef] [PubMed]

13. Pilones, K.-A.; Vanpouille-Box, C.; Demaria, S. Συνδυασμός ακτινοθεραπείας και αναστολέων σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού. Σεμιν. Ακτινοβολία. Oncol. 2015, 25, 28–33. [CrossRef] [PubMed]

14. Ishihara, D.; Pop, L.; Takeshima, Τ.; Iyengar, Ρ.; Hannan, R. Σκεπτικό και στοιχεία για το συνδυασμό ακτινοθεραπείας και ανοσοθεραπείας για τη θεραπεία του καρκίνου. Cancer Immunol. Άλλο ανοσοποιητικό. 2017, 66, 281–298. [CrossRef]

15. Lee, Υ.-Η.; Tai, D.; Yip, C.; Choo, S.-P.; Chew, V. Συνδυαστική Ανοσοθεραπεία για Ηπατοκυτταρικό Καρκίνωμα: Ακτινοθεραπεία, Αποκλεισμός Σημείων Ανοσοποίησης και Πέρα από αυτό. Εμπρός. Immunol. 2020, 11, 568759. [CrossRef] [PubMed]

16. Choi, C.; Yoo, G.-S.; Cho, W.-K.; Park, H.-C. Βελτιστοποίηση ακτινοθεραπείας με αποκλεισμό του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. World J. Gastroenterol. 2019, 25, 2416–2429. [CrossRef]

17. Genin, Μ.; Clement, F.; Fattaccioli, Α.; Raes, Μ.; Τα μακροφάγα Michiels, C. M1 και M2 που προέρχονται από κύτταρα THP-1 ρυθμίζουν διαφορικά την απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην ετοποσίδη. BMC Cancer 2015, 15, 577. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, F.; Feng, Y.-C.; Zhao, G.; Zhang, R.; Cheng, Ζ.-Ζ.; Kong, W.-N.; Wu, Η.-L.; Xu, Β.; Lv, Χ.; Η διήθηση μακροφάγου M2 CD163(+) M2 που σχετίζεται με όγκο Ma, XM σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την έκφραση PD-L1 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Cancer Manag. Res. 2020, 12, 5831–5843. [CrossRef]

19. Cassetta, L.; Noy, R.; Swierczak, Α.; Sugano, G.; Smith, Η.; Wiechmann, L.; Pollard, J.-W. Απομόνωση μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους ποντικού και ανθρώπου. Adv. Exp. Med. Biol. 2016, 899, 211–229.

20. Chikamatsu, Κ.; Sakakura, Κ.; Toyoda, Μ.; Takahashi, Κ.; Yamamoto, Τ.; Masuyama, K. Ανοσοκατασταλτική δραστηριότητα των CD14+ HLA-DR- κυττάρων σε ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου. Cancer Sci. 2012, 103, 976–983. [CrossRef]

21. Chen, M.-F.; Kuan, F.-C.; Yen, T.-C.; Lu, M.-S.; Lin, Ρ.-Υ.; Chung, Υ.-Η.; Chen, W.-C.; Lee, K.-D. Τα διεγερμένα από IL-6-CD11b+ CD14+ κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από το μυελοειδές HLA-DR σχετίζονται με εξέλιξη και κακή πρόγνωση στο πλακώδες καρκίνωμα του οισοφάγου. Oncotarget 2014, 5, 8716–8728. [CrossRef]

22. Paganetti, H. Τιμές σχετικής βιολογικής αποτελεσματικότητας (RBE) για θεραπεία δέσμης πρωτονίων. Παραλλαγές ως συνάρτηση του βιολογικού καταληκτικού σημείου, της δόσης και της γραμμικής μεταφοράς ενέργειας. Phys. Med. Biol. 2014, 59, R419–R472. [CrossRef] [PubMed]

23. Bronte, V.; Brandau, S.; Chen, S.-H.; Colombo, Μ.-Ρ.; Frey, Α.-Β.; Greten, T.-F.; Mandruzato, S.; Murray, P.-J.; Ochoa, Α.; Ostrand Rosenberg, S.; et al. Συστάσεις για ονοματολογία και πρότυπα χαρακτηρισμού κατασταλτικών κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή. Nat. Commun. 2016, 7, 12150. [CrossRef]

24. Curtis, M.-J.; Bond, R.-A.; Spina, D.; Ahluwalia, Α.; Alexander, SPA; Giembycz, Μ.-Α.; Gilchrist, Α.; Hoyer, D.; Insel, Ρ.-Α.; Izzo, Α.-Α. Πειραματικός σχεδιασμός και ανάλυση και η αναφορά τους: Νέα καθοδήγηση για δημοσίευση στο BJP. Br. J. Pharmacol. 2015, 172, 3461–3471. [CrossRef]

25. Haikerwal, S.-J.; Hagekyriakou, J.; MacManus, Μ.; Martin, Ο.-Α.; Haynes, Ν.-Μ. Χτίζοντας ανοσία στον καρκίνο με ακτινοθεραπεία. Cancer Lett. 2015, 368, 198–208. [CrossRef] [PubMed]

26. Yuan, S.; Liu, Ζ.; Xu, Ζ.; Liu, J.; Zhang, J. Κουτί 1 ομάδας υψηλής κινητικότητας (HMGB1): Ένας βασικός ρυθμιστής αιμοποιητικών κακοηθειών. J. Hematol. Oncol. 2020, 13, 91. [CrossRef] [PubMed]

27. Suzuki, Υ.; Mimura, Κ.; Yoshimoto, Υ.; Watanabe, Μ.; Ohkubo, Υ.; Izawa, S.; Murata, Κ.; Fujii, Η.; Nakano, Τ.; Kono, K. Ανοσογόνος κυτταρικός θάνατος όγκου που προκαλείται από χημειοακτινοθεραπεία σε ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα οισοφάγου. Καρκίνος. Res. 2012, 72, 3967–3976. [CrossRef]

28. Chen, M.-F.; Hsieh, C.-C.; Chen, W.-C.; Lai, C.-H. Ο ρόλος της ιντερλευκίνης-6 στην απόκριση ακτινοβολίας των όγκων του ήπατος. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2012, 84, e621–e630. [CrossRef] [PubMed]

29. Liao, Υ.; Liu, S.; Fu, S.; Wu, J. HMGB1 in Radiotherapy: A Two-Headed Signal Regulating Tumor Radiosensitivity and Immunity. Oncol. Στόχοι Θερ. 2020, 13, 6859–6871. [CrossRef]

30. Guo, Υ.; Xu, F.; Lu, Τ.; Duan, Ζ.; Zhang, Z. Interleukin-6 σηματοδοτικό μονοπάτι στη στοχευμένη θεραπεία για τον καρκίνο. Αντικαρκινική θεραπεία. Αναθ. 2012, 38, 904–910. [CrossRef]

31. Afreen, S.; Dermime, S. Το ανοσοανασταλτικό μόριο Β7-Η1 ως πιθανός στόχος στον καρκίνο: Θανάτωση πολλών πτηνών με μια πέτρα. Αιματόλη. Oncol. Στέλεχος. Κύτταρο. Εκεί. 2014, 7, 1–17. [CrossRef]

32. Formenti, S.-C.; Demaria, S. Ακτινοθεραπεία για τη μετατροπή του όγκου σε in situ εμβόλιο. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2012, 84, 879–880. [CrossRef]

33. Rodriguez-Ruiz, M.-E.; Vitale, Ι.; Harrington, K.-J.; Melero, Ι.; Galluzzi, L. Ανοσολογική επίδραση της σηματοδότησης κυτταρικού θανάτου που οδηγείται από ακτινοβολία στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Nat. Immunol. 2020, 21, 120–134. [CrossRef]

34. Liu, Υ.; Dong, Υ.; Kong, L.; Shi, F.; Zhu, Η.; Yu, J. Abscopal αποτέλεσμα της ακτινοθεραπείας σε συνδυασμό με αναστολείς του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου. J. Hematol. Oncol. 2018, 11, 104. [CrossRef] [PubMed] 35. Hill, R.-P. Το μεταβαλλόμενο παράδειγμα της απόκρισης του όγκου στην ακτινοβολία. Br. J. Radiol. 2017, 90, 20160474. [CrossRef]

36. Mukherjee, S.; Chakraborty, Α. Φαινόμενο παρευρισκόμενου που προκαλείται από ακτινοβολία: Ενόραση και επιπτώσεις στην ακτινοθεραπεία. Int. J. Radiat. Biol. 2019, 95, 243–263. [CrossRef] [PubMed]

37. Gameiro, S.-R.; Μάλαμας, Α.-Σ.; Bernstein, Μ.-Β.; Tsang, Κ.-Υ.; Vassantachart, Α.; Sahoo, Ν.; Tailor, R.; Πηδικίτη, R.; Guha, C.-P.; Hahn, S.-M.; et al. Τα καρκινικά κύτταρα που επιβιώνουν από έκθεση σε ακτινοβολία πρωτονίων ή φωτονίων μοιράζονται μια κοινή υπογραφή ανοσογονικής διαμόρφωσης, καθιστώντας τα πιο ευαίσθητα στη θανάτωση που προκαλείται από κύτταρα Τ. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2016, 95, 120–130. [CrossRef]

38. Sun, Υ.; Nelson, P.-S. Μοριακές οδοί: Συμπεριλαμβάνουν αντιδράσεις βλάβης μικροπεριβάλλοντος στην αντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου. Clin. Cancer Res. 2012, 18, 4019–4025. [CrossRef] [PubMed]

39. Kozin, S.-V.; Kamoun, W.-S.; Huang, Υ.; Dawson, M.-R.; Jain, R.-K.; Ντούντα, Δ.-Γ. Η στρατολόγηση μυελοειδών αλλά όχι ενδοθηλιακών πρόδρομων κυττάρων διευκολύνει την εκ νέου ανάπτυξη του όγκου μετά από τοπική ακτινοβόληση. Cancer Res. 2010, 70, 5679–5685. [CrossRef] [PubMed]

40. Kao, J.; Ko, E.-C.; Eisenstein, S.; Sikora, A.-G.; Fu, S.; Chen, S.-H. Στόχευση ανοσοκατασταλτικών κατασταλτικών κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή στην ογκολογία. Κριτ. Rev. Oncol. Αιματόλη. 2011, 77, 12–19. [CrossRef]

41. Hoechst, Β.; Ormandy, LA; Ballmaier, Μ.; Lehner, F.; Krüger, C.; Manns, βουλευτής; Greten, TF; Korangy, F. Ένας νέος πληθυσμός κατασταλτικών κυττάρων που προέρχονται από μυελοειδή σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα επάγει CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) Τ κύτταρα. Γαστρεντερολογία 2008, 135, 234-243. [CrossRef] [PubMed]

42. Hsu, C.-Y.; Lin, Y.-C.; Chang, L.-Y.; Huang, S.-K.; Huang, C.-H.; Yang, C.-K.; Huang, C.-T.; Lin, C.-Y. Θεραπευτικός ρόλος της επαγώγιμης συνθετάσης μονοξειδίου του αζώτου που εκφράζει κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από μυελοειδή σε ηπατική ανεπάρκεια ποντικού που προκαλείται από ακεταμινοφαίνη. Εμπρός. Immunol. 2020, 11, 574839. [CrossRef]

43. Pollard, J.-W. Τα μακροφάγα που εκπαιδεύονται στον όγκο προάγουν την εξέλιξη και τη μετάσταση του όγκου. Nat. Rev. Cancer 2004, 4, 71-78. [CrossRef] [PubMed]

44. Wang, L.-X.; Zhang, S.-X.; Wu, Η.-J.; Rong, X.-L.; Guo, J. M2b πόλωση μακροφάγων και οι ρόλοι της σε ασθένειες. J. Leukoc. Biol. 2019, 106, 345–358. [CrossRef] [PubMed]

45. Chiang, C.-S.; Fu, S.-Y.; Wang, S.-C.; Yu, C.-F.; Chen, F.-H.; Lin, C.-M.; Hong, J.-H. Η ακτινοβόληση προάγει έναν φαινότυπο μακροφάγου m2 στην υποξία του όγκου. Εμπρός. Oncol. 2012, 2, 89. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Sangro, Β.; Sarobe, Ρ.; Hervás-Stubbs, S.; Melero, I. Προόδους στην ανοσοθεραπεία για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2021, 18, 525–543. [CrossRef]

47. Lu, D.; Νί, Ζ.; Liu, Χ.; Feng, S.; Dong, Χ.; Shi, Χ.; Zhai, J.; Mai, S.; Jiang, J.; Wang, Ζ.; et al. Πέρα από τα Τ κύτταρα: Κατανόηση του ρόλου του PD-1/PD-L1 σε μακροφάγους που σχετίζονται με όγκους. J. Immunol. Res. 2019, 2019, 1919082. [CrossRef]

48. Cheng, A.-L.; Hsu, C.; Chan, S.-L.; Choo, S.-P.; Kudo, M. Προκλήσεις συνδυαστικής θεραπείας με αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. J. Hepatol. 2020, 72, 307–319. [CrossRef]

49. Hack, S.-P.; Spahn, J.; Chen, Μ.; Cheng, A.-L.; Kaseb, Α.; Kudo, Μ.; Lee, HC; Yopp, Α.; Chow, Ρ.; Qin, S. IMbrave 050: Δοκιμή φάσης ΙΙΙ του atezoli zumab συν bevacizumab σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα υψηλού κινδύνου μετά από θεραπευτική εκτομή ή κατάλυση. Μελλοντικός Oncol. 2020, 16, 975–989. [CrossRef]

50. Park, S.-S.; Dong, Η.; Liu, Χ.; Harrington, S.-M.; Krco, C.-J.; Grams, Μ.-Ρ.; Mansfield, A.-S.; Furutani, Κ.-Μ.; Olivier, K.-R.; Kwon, E.-D. Το PD-1 Περιορίζει την επαγόμενη από την ακτινοθεραπεία αποκοιλιακή επίδραση. Cancer Immunol. Res. 2015, 3, 610–619. [CrossRef]

51. Demaria, S.; Ng, Β.; Devitt, M.-L.; Babb, J.-S.; Kawashima, Ν.; Liebes, L.; Formenti, S.-C. Η αναστολή της ιοντίζουσας ακτινοβολίας απομακρυσμένων όγκων που δεν έχουν υποβληθεί σε θεραπεία (αποσκοπικό αποτέλεσμα) προκαλείται από το ανοσοποιητικό. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004, 58, 862–870. [CrossRef] [PubMed]