Διαμεσολαβούμενη από CAR-ουδετερόφιλα Παροχή μικροπεριβάλλοντος όγκου ανταποκρινόμενων νανοφαρμάκων για χημειο-ανοσοθεραπεία γλοιοβλάστωμα

Το γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι ένας από τους πιο επιθετικούς και θανατηφόρους συμπαγείς όγκους στον άνθρωπο. Ενώ αποτελεσματικά θεραπευτικά, όπως τα νεοεμφανιζόμενα χιμαιρικά κύτταρα υποδοχέα αντιγόνου (CAR)-T και τα χημειοθεραπευτικά, έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία διαφόρων καρκίνων, η αποτελεσματικότητά τους στη θεραπεία GBM έχει παρεμποδιστεί σε μεγάλο βαθμό από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και τους φραγμούς αίματος-εγκεφάλου-όγκου. Τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα διασχίζουν αποτελεσματικά φυσιολογικούς φραγμούς και εμφανίζουν ανοσία τελεστή έναντι παθογόνων, αλλά η σύντομη διάρκεια ζωής και η αντίσταση στην επεξεργασία του γονιδιώματος των πρωτογενών ουδετερόφιλων έχουν περιορίσει την ευρεία εφαρμογή τους στην ανοσοθεραπεία. Εδώ κατασκευάζουμε γενετικά ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα με γονιδιακό knock-in με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas{4} για να εκφράσουμε διάφορες κατασκευές CAR αντι-GBM με τομείς σηματοδότησης ειδικά για Τ CD3ζ ή ουδετερόφιλα. Τα ουδετερόφιλα CAR με την καλύτερη αντικαρκινική δράση παράγονται για να χορηγούν και να απελευθερώνουν ειδικά και μη επεμβατικά νανο φάρμακα που ανταποκρίνονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου για να στοχεύσουν το GBM χωρίς την ανάγκη πρόκλησης πρόσθετης φλεγμονής στα σημεία του όγκου. Αυτή η συνδυαστική χημειο-ανοσοθεραπεία επιδεικνύει ανώτερες και ειδικές αντι-GBM δραστηριότητες, μειώνει τη χορήγηση φαρμάκου εκτός στόχου και παρατείνει τη διάρκεια ζωής σε θηλυκά ποντίκια που φέρουν όγκους. Μαζί, αυτό το βιομιμητικό σύστημα χορήγησης φαρμάκων CAR-ουδετερόφιλων είναι μια ασφαλής, ισχυρή και ευέλικτη πλατφόρμα για τη θεραπεία της GBM και πιθανώς άλλων καταστροφικών ασθενειών.

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

Το γλοιοβλάστωμα (GBM) χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό θνησιμότητας, μικρή διάρκεια ζωής και κακή πρόγνωση με υψηλή τάση υποτροπής1,2. Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα τόσο της χειρουργικής όσο και των χημειο-φαρμάκων παρεμποδίζεται κυρίως από τη λεπτή εγκεφαλική δομή και τον φυσιολογικό αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB) ​​ή τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBTB)3–5. Ειδικότερα, η χορήγηση φαρμάκου στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) για τη θεραπεία όγκων του εγκεφάλου είναι πολύ δύσκολη:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Η έμφυτη ανοσία και η πλαστικότητα των ουδετερόφιλων έναντι διαφόρων καρκίνων12–16, συμπεριλαμβανομένου του GBM, διερευνήθηκαν λιγότερο από την εφαρμογή τους ως κυτταρικοί φορείς στη χορήγηση φαρμάκων8–10. Τα ουδετερόφιλα που κυκλοφορούν στο αίμα φιλοξενούν το μικροπεριβάλλον του υποξικού όγκου (TME), όπου γίνονται ετερογενή ουδετερόφιλα σχετιζόμενα με τον όγκο (TANs), βασικό συστατικό του ανοσοκατασταλτικού TME που συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου και στη θεραπευτική αντίσταση12,17. Παρόμοια με τα μακροφάγα, βρέθηκαν αντικαρκινικοί φαινότυποι N1 και υπέρ όγκου N2 των TAN εντός του υποξικού TME18-21. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες θεραπευτικές στρατηγικές για την άμεση στόχευση των ουδετερόφιλων με εστίαση στην εξάντληση ή την αναστολή των ουδετερόφιλων12,22, οδηγώντας σε αρκετές κλινικές δοκιμές (π.χ. αναστολέας CCR5 Maraviroc στο NCT03274804). Έτσι, η άμεση εφαρμογή μη επεξεργασμένων ουδετερόφιλων ως νανοφορέων μπορεί να θέσει επιπλέον κίνδυνο για καρκινοπαθείς, στους οποίους τα ουδετερόφιλα διακίνησης φαρμάκων μπορεί να επαναπρογραμματιστούν στον ανοσοκατασταλτικό φαινότυπο N2 προ-όγκου εντός του TME μετά την εγκατάλειψη σε θέσεις όγκου13,23. Επιπλέον, θα πρέπει να διερευνηθούν και να ενισχυθούν οι εγγενείς αντινεοπλασματικές δραστηριότητες των παρελθοντικών ουδετερόφιλων για την επίτευξη βελτιστοποιημένης θεραπευτικής αποτελεσματικότητας όταν χρησιμοποιούνται ως φορέας φαρμάκου σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά.

Οφέλη από σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

Η τροποποίηση του χιμαιρικού υποδοχέα αντιγόνου (CAR) έχει ενισχύσει σημαντικά τις αντικαρκινικές δραστηριότητες των ανοσοκυττάρων Τ ή φυσικών φονέων (NK)24-27. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητά τους σε συμπαγείς όγκους εξακολουθεί να είναι περιορισμένη λόγω εν μέρει της σχετικά χαμηλής ικανότητας διακίνησης και διείσδυσης όγκου. Η παρουσία φυσιολογικών BBB και BBTB εμποδίζει περαιτέρω την αποτελεσματικότητα αυτών των αναδυόμενων θεραπευτικών σκευασμάτων κατά της GBM στον εγκέφαλο. Υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός μηχανικής CAR και ουδετερόφιλων υψηλής κινητικότητας μπορεί να διατηρήσει τον αντικαρκινικό φαινότυπο N1 και να αποφέρει εξαιρετική θεραπευτική αποτελεσματικότητα στη θεραπεία της GBM. Τα πρωτογενή ουδετερόφιλα είναι βραχύβια και ανθεκτικά στην επεξεργασία του γονιδιώματος28, περιορίζοντας την εφαρμογή τους στην ανοσοθεραπεία κατευθυνόμενη από CAR. Τα ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (hPSCs), τα οποία είναι πιο προσιτά στη γονιδιακή επεξεργασία και ικανά να διαφοροποιούνται μαζικά σε ουδετερόφιλα, θα μπορούσαν να παρέχουν μια απεριόριστη πηγή ουδετερόφιλων CAR υψηλής ποιότητας για στοχευμένη ανοσοθεραπεία υπό χημικά καθορισμένες συνθήκες χωρίς ξένο29. Τα ουδετερόφιλα φαγοκυτταρώνουν επίσης κατά προτίμηση μικροβιακά παθογόνα με τραχιές ή μακριές επιφάνειες, όπως το S. aureus και το E. coli30, τα οποία θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για το σχεδιασμό νανοσωματιδίων στη χορήγηση φαρμάκων με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων. Πράγματι, οι Safari et al. ανέφερε πρόσφατα την προτιμώμενη φαγοκυττάρωση των ενδοφλεβίως χορηγούμενων επιμήκων σωματιδίων, χωρίς περίπλοκη τροποποίηση της επιφάνειας, από κυκλοφορούντα ουδετερόφιλα30. Ένας τέτοιος εύκολος και βιοεμπνευσμένος σχεδιασμός σε νανοσωματίδια φορτωμένα με φάρμακα μπορεί να μεγιστοποιήσει τη φόρτωση του φαρμάκου σε ουδετερόφιλα και να επιτρέψει θεραπευτικά επίπεδα χορήγησης φαρμάκου σε στοχευμένες τοποθεσίες.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>Το 20% των χορηγούμενων νανοφαρμάκων χορηγείται στους όγκους του εγκεφάλου από ουδετερόφιλα CAR σε σύγκριση με το 1% από τα ελεύθερα νανοφάρμακα. Συνοπτικά, το βιομιμητικό μας σύστημα χορήγησης φαρμάκων CAR-ουδετερόφιλων είναι μια ασφαλής, ισχυρή και ευέλικτη πλατφόρμα για τη θεραπεία της GBM και άλλων καταστροφικών ασθενειών.

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

Αποτελέσματα

Έλεγχος δομών CAR ειδικών για ουδετερόφιλα για ενισχυμένες αντικαρκινικές δραστηριότητες

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >Το 90% και η πλειονότητα των στοχευόμενων κλώνων είναι ετερόζυγοι (Συμπληρωματικό Σχήμα 1a–d). Η έκφραση CAR σε κατασκευασμένα hPSC επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με RT-PCR και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CLTX-IgG4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1e–g). Όπως αναμενόταν, τα hPSC που εκφράζουν CAR διατήρησαν υψηλά επίπεδα έκφρασης πολυδύναμων δεικτών, συμπεριλαμβανομένων των OCT4, SSEA4 και SOX2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1στ).

Για την παραγωγή de novo CAR-ουδετερόφιλων, τα hPSC που εκφράζουν CAR διαφοροποιήθηκαν αρχικά σε πολυδύναμα αιμοποιητικά και στη συνέχεια σε μυελοειδή προγονικά με ειδική για το στάδιο θεραπεία κυτοκίνης35 (Εικ. 2c). Η επακόλουθη χρήση του G-CSF και του αγωνιστή ρετινοϊκού οξέος AM580 προώθησε την ισχυρή παραγωγή ουδετερόφιλων36. Παρόμοια με τα αντίστοιχά τους στο περιφερικό αίμα (PB), τα ουδετερόφιλα CLTX-CAR που προέρχονται από hPSC παρουσίασαν τυπική μορφολογία ουδετερόφιλων και επιφανειακούς δείκτες CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b και CD18 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Στη συνέχεια προσδιορίσαμε τα αποτελέσματα της έκφρασης CAR στην κυτταροτοξικότητα κατά του όγκου των ουδετερόφιλων που προέρχονται από hPSC, συγκαλλιεργώντας τα με κύτταρα U87MG γλοιοβλαστώματος (GBM) in vitro. Όπως αναμενόταν, τα ουδετερόφιλα CLTX-CAR που προέρχονται από hPSC παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα εξόντωσης όγκου σε σύγκριση με τα ουδετερόφιλα PB (Εικ. 2δ), σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις σε κύτταρα CLTX CAR-T27. Μεταξύ αυτών των διαφορετικών CAR, το CAR #1 μεσολάβησε ανώτερες δραστηριότητες θανάτωσης όγκου στα ουδετερόφιλα hPSC. Συγκεκριμένα, το CAR #4 με βάση την αλυσίδα είναι λιγότερο αποτελεσματικό στην πρόκληση θανάτωσης όγκων με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων, κάτι που μπορεί να οφείλεται στο χαμηλότερο αντίγραφο του ITAM σε από τη ζ-υπομονάδα και στη χαμηλότερη έκφραση των CAR που φέρουν στην επιφάνεια του κυττάρου28. Τα ουδετερόφιλα απελευθερώνουν κυτταροτοξικά δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-) για να σκοτώσουν τα κύτταρα-στόχους. Η παραγωγή ROS και TNF- (Εικ. 2e, f) από διαφορετικά ουδετερόφιλα συνέπεσε καλά με την αυξημένη κυτταρόλυση τους. Όπως αναμενόταν, η παραγωγή ROS και TNF- από διαφορετικά ουδετερόφιλα μετά από συγκαλλιέργεια με φυσιολογικά γλοιακά κύτταρα SVG p12 παρέμεινε τόσο χαμηλή όσο η ομάδα αρνητικού ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα 3a, b). Επιπλέον, αυξημένη αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα των CAR-ουδετερόφιλων παρατηρήθηκε μόνο σε συνεπώαση με κύτταρα GBM, συμπεριλαμβανομένων U87MG, πρωτογενών ενήλικων κυττάρων GBM43 και παιδιατρικών κυττάρων SJ-GBM2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 3γ), καταδεικνύοντας την υψηλή ειδικότητα του CLTX μας -ΑΥΤΟΚΙΝΗΤΟ. Αξιοσημείωτα, τα ουδετερόφιλα CAR εμφάνισαν υψηλή βιοσυμβατότητα με φυσιολογικά SVG p12 γλοιακά κύτταρα, hPSCs και κύτταρα προερχόμενα από hPSC (Συμπληρωματικό Σχήμα 3d), σύμφωνα με μια προηγούμενη παρατήρηση ότι τα απενεργοποιημένα πρωτογενή ουδετερόφιλα δεν σκοτώνουν τα υγιή κύτταρα16. Συλλογικά, τα ουδετερόφιλα CAR που προέρχονται από hPSC, ιδιαίτερα τα ουδετερόφιλα CAR που φέρουν CD3ζ, παρουσίασαν ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα κατά του όγκου και παρήγαγαν περισσότερα ROS και TNF- in vitro, υπογραμμίζοντας τις δυνατότητές τους στη στοχευμένη ανοσοθεραπεία.

Εικ. 1|Σχηματική απεικόνιση της ενισχυμένης αποτελεσματικότητας κατά του γλοιοβλαστώματος χρησιμοποιώντας συνδυαστική ανοσοθεραπεία ουδετερόφιλων CAR και νανο-φαρμάκων που ανταποκρίνονται στο μικροπεριβάλλον όγκου. Τα ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα κατασκευάστηκαν με CARs και διαφοροποιήθηκαν σε CAR-ουδετερόφιλα που είναι φορτωμένα με ακατέργαστα νανοσωματίδια πυριτίου (SiO2 NPs) που περιέχουν τιραπαζαμίνη (TPZ) ή άλλα φάρμακα που στοχεύουν στην υποξία, ως διπλή ανοσοχημειοθεραπεία. β Τα συστηματικά χορηγούμενα CAR-ουδετερόφιλα@R-SiO2- TPZ NP αρχικά επιτίθενται σε εξωτερικά νορμοξικά καρκινικά κύτταρα σχηματίζοντας ανοσολογικές συνάψεις και σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω φαγοκυττάρωσης. Μετά την απόπτωση, τα CAR-ουδετερόφιλα θα μπορούσαν στη συνέχεια να απελευθερώσουν R-SiO2-TPZ NPs, τα οποία ξεπερνιούνται από τα καρκινικά κύτταρα. Στη συνέχεια, τα νανο-προφάρμακα ανταποκρίνονται στο υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου και σκοτώνουν αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα. TEOS ορθοπυριτικό τετρααιθυλεστέρα, BTES δις[3-(τριαιθοξυσιλυλ)προπυλ]τετρασουλφίδιο, ΤΡΖ τιραπαζαμίνη, ΒΤΖ βενζοτριαζινύλιο.

Τα ουδετερόφιλα CAR διατήρησαν ανώτερες αντικαρκινικές δραστηριότητες κάτω από ανοσοκατασταλτικά μικροπεριβάλλοντα όγκου

Παρόμοια με τα μακροφάγα, στο ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον του όγκου βρέθηκαν φαινότυποι κατά του όγκου N1 και N2 των ουδετεροφίλων που σχετίζονται με τον όγκο17. Τα ουδετερόφιλα N2 υπέρ του όγκου διαδραματίζουν κρίσιμους ρόλους στην αγγειογένεση, τη μετάσταση και την ανοσοκαταστολή του όγκου, αλλά η θεραπευτική στόχευση αυτού του τύπου κυττάρου ήταν προκλητική.

Αντί για μια στρατηγική συστημικής εξάντλησης22, εδώ αξιολογήσαμε τη δυνατότητα της μηχανικής CAR στη διατήρηση του αντικαρκινικού φαινοτύπου των ουδετερόφιλων. Τα ουδετερόφιλα που προέρχονται από CAR hPSC και PB υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υποξία (3% O2) και TGF, τα οποία συμβάλλουν στην ανοσοκαταστολή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου37,38, για να αξιολογηθεί η παρατεταμένη δραστικοκτονική τους δράση. Ενώ τα ουδετερόφιλα PB παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη κυτταρόλυση έναντι των κυττάρων GBM υπό ανοσοκατασταλτικές συνθήκες, τα ουδετερόφιλα CAR διατήρησαν υψηλές δραστηριότητες θανάτωσης όγκου (Συμπληρωματικό Σχήμα 4α). Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν επίσης στην απελευθέρωση TNF και στη δημιουργία ROS (Συμπληρωματικό Σχήμα 4b, c) από PB ή CAR-ουδετερόφιλα υπό ανοσοκατασταλτικές και φυσιολογικές συνθήκες. Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω τον φαινότυπο των ουδετερόφιλων υπό συνθήκες υποξίας και TGF, μετρήσαμε την έκφραση του N1-ειδικού iNOS και της N2- N2-ειδικής αργινάσης στα απομονωμένα ουδετερόφιλα με κυτταρομετρία ροής (Συμπληρωματικό Σχήμα. 4d–f). Σε σύγκριση με τη νορμοξία, η ανοσοκατασταλτική υποξία και ο TGF μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης του iNOS και αύξησαν τα επίπεδα αργινάσης στα ουδετερόφιλα PB, ενώ τα ουδετερόφιλα CAR διατήρησαν υψηλά επίπεδα έκφρασης του iNOS. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Syk-Erk οδηγεί στην παραγωγή ROS39–42. Επομένως, εντοπίσαμε και συγκρίναμε την ενεργοποίηση Syk-Erk σε μη τροποποιημένα ουδετερόφιλα και CAR-ουδετερόφιλα και τα αποτελέσματά μας πρότειναν μια σημαντικά υψηλότερη ενεργοποίηση της οδού Syk-Erk στα ουδετερόφιλα CAR υπό υποξία (Συμπληρωματικό Σχήμα 5a–d), η οποία μπορεί να διατηρήσει την αμετάβλητη παραγωγή ROS των CAR-ουδετερόφιλων υπό υποξία. Συνολικά, τα ουδετερόφιλα CAR διατήρησαν έναν αντικαρκινικό φαινότυπο και διατήρησαν υψηλές αντικαρκινικές δραστηριότητες υπό συνθήκες μίμησης μικροπεριβάλλοντος όγκου in vitro, υπογραμμίζοντας τις δυνατότητές τους στη στοχευμένη ανοσοθεραπεία.

Εικ. 2|Έλεγχος δομών χιμαιρικού υποδοχέα αντιγόνου (CAR) ειδικών για ουδετερόφιλα με ενισχυμένες αντικαρκινικές δραστηριότητες που προκαλούνται από ουδετερόφιλα. ένα Σχηματικό διάφορων δομών CAR. β Σχηματική δομή του CAR #1 και στοχευμένη στρατηγική knock-in στον ασφαλή τόπο αποθήκευσης AAVS1 ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων (hPSCs). Το κατακόρυφο βέλος υποδεικνύει το sgRNA στόχευσης AAVS1. Τα κόκκινα και μπλε οριζόντια βέλη υποδεικνύουν εκκινητές για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας στόχευσης και της ομοζυγωτίας, αντίστοιχα. HDR: επισκευή ομόλογου ανασυνδυασμού. γ Σχηματική βελτιστοποιημένη διαφοροποίηση ουδετερόφιλων από hPSCs υπό χημικά καθορισμένες συνθήκες. δ Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κυτταροτοξικότητας έναντι κυττάρων γλοιοβλαστώματος U87MG σε διαφορετικές αναλογίες στόχου ουδετερόφιλου προς όγκο χρησιμοποιώντας ενδεικνυόμενα ουδετερόφιλα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD πέντε ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων, δοκιμασία t Student με δύο ουρές. Προσδιορίστηκε η παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) (e) και η ανάλυση ELISA της απελευθέρωσης TNF (f) από διαφορετικά ουδετερόφιλα μετά από συγκαλλιέργεια με κύτταρα U87MG. n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD, δοκιμή t Student δύο ουρών. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Παρασκευή και χαρακτηρισμός ουδετεροφίλων CAR hPSC φορτωμένων με νανοσωματίδια SiO2 που περιέχουν τιραπαζαμίνη (TPZ)

Τα ουδετερόφιλα PB έχουν χρησιμοποιηθεί ως κυτταρικοί φορείς για την παροχή απεικονιστικών και θεραπευτικών φαρμάκων στους όγκους του εγκεφάλου8-10, αν και η στοχευμένη διήθηση ουδετερόφιλων απαιτεί χειρουργική επέμβαση ή φλεγμονή που προκαλείται από το φως και η χορήγηση φαρμάκου εκτός στόχου μπορεί να αποτελεί ανησυχία11. Για να βελτιώσουμε περαιτέρω τις αντικαρκινικές δραστηριότητες των ουδετερόφιλων CAR, παρασκευάσαμε νανοσωματίδια πυριτίου (SiO2-NP) με τραχιά ή λεία επιφάνεια για να φορτώσουμε χημειοθεραπευτικά φάρμακα ή φάρμακα ακτινοβολίας σε ουδετερόφιλα. Οι εικόνες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) έδειξαν ότι και τα δύο νανοσωματίδια SiO2 ήταν καλά διασκορπισμένα και παρουσίαζαν σφαιρική μορφολογία με ομοιόμορφο μέγεθος (Εικ. 3α, Συμπληρωματικό Σχήμα 6α). Η ανάλυση κατανομής σύνθεσης μέσω σάρωσης TEM (STEM) με φασματοσκοπία ακτίνων Χ διασπαρμένης ενέργειας (EDS) έδειξε ότι το στοιχείο θείου (S) κατανεμήθηκε ομοιόμορφα μέσα σε ολόκληρα τα ακατέργαστα νανοσωματίδια SiO2 (R-SiO2) (Εικ. 3β). Χρησιμοποιώντας ισόθερμες προσρόφησης-εκρόφησης αζώτου (N2) και την αντίστοιχη ανάλυση κατανομής μεγέθους πόρων, τα μεγέθη πόρων των NPs R- και SSiO2 μετρήθηκαν ως 25 nm και 35 nm (Εικ. 3γ, Συμπληρωματικό Σχήμα 6b), αντίστοιχα. Δεδομένης της υψηλής επιφάνειας και του μεγάλου μεγέθους πόρων, τα θεραπευτικά φάρμακα θα μπορούσαν να φορτωθούν αποτελεσματικά σε NPs R- και S-SiO2, όπως παραδειγματίζεται από την ανταποκρινόμενη στην υποξία προ-φάρμακο τιραπαζαμίνη (TPZ) (Εικ. 3δ, Συμπληρωματικό Σχ. 6γ). . Μετά τη φόρτωση TPZ, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στη διασπορά, τη μορφολογία και το μέγεθος του R-SiO2-TPZ χρησιμοποιώντας TEM και ανάλυση δυναμικής σκέδασης φωτός (Συμπληρωματικό Σχήμα 6d, e). Οι τετρασουλφιδικοί δεσμοί που ενσωματώνονται στα NPs R-SiO2 είναι ευαίσθητοι σε αναγωγικά περιβάλλοντα και μπορούν να αποικοδομηθούν γρήγορα από τη μεγάλη ποσότητα γλουταθειόνης (GSH) που υπάρχει στα καρκινικά κύτταρα43. Στη συνέχεια προσδιορίσαμε την ικανότητα αποικοδόμησης της GSH των NPs R-SiO2-TPZ παρουσία 10 mM, 1 mM και 10 μM GSH, που ήταν ίδιες με τις ενδοκυτταρικές συνθήκες των καρκινικών κυττάρων, των φυσιολογικών κυττάρων και των εξωκυτταρικών περιβαλλόντων43, αντίστοιχα. Μετά από επεξεργασία 10 mM GSH, η αρχική σφαιρική δομή των NPs R-SiO2-TPZ καταστράφηκε σοβαρά μετά από 24 ώρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 6f, g). Τα νανοσωματίδια διαλύθηκαν πλήρως σε μικρά συντρίμμια μετά από 48 ώρες, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση TPZ με τρόπο που ανταποκρίνεται στην GSH (Εικ. 3e). Τα υπολείμματα των NPs R-SiO2 δεν προκάλεσαν καμία σημαντική κυτταροτοξικότητα στα δοκιμασμένα κύτταρα in vitro (Συμπληρωματικό Σχήμα 6h), υποδεικνύοντας τη σχετική ασφάλεια των NPs R-SiO2.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε τη σκοπιμότητα χρήσης SiO2-TPZ NPs για τη φόρτωση θεραπευτικών φαρμάκων σε ουδετερόφιλα CAR ως συνδυαστική χημειοανοσοθεραπεία για την επίτευξη ενισχυμένης θεραπευτικής αποτελεσματικότητας. Μετά τη φυγοκέντρηση, μετρήσαμε την κυτταρική πρόσληψη των NPs SiO2-TPZ από ουδετερόφιλα χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Εικ. 3f, g) και εντοπίσαμε μια πιο σημαντική κυτταρική πρόσληψη NPs R-SiO2-TPZ από το S-SiO2- TPZ NPs από ουδετερόφιλα. Η περιεκτικότητα σε κυτταρικό Si στα ουδετερόφιλα μετρήθηκε ως 11,3 και 19,1 ng Si/ug πρωτεΐνης για λείο και τραχύ SiO2 NPs@TPZ (Εικ. 3h), αντίστοιχα, με επαγωγικά συζευγμένη φασματομετρία μάζας πλάσματος (ICP-MS). Δεδομένης της υψηλής ικανότητας φόρτισης σε ουδετερόφιλα, τα NPs R-SiO2-TPZ χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα. Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να δοκιμάσουμε τις φυσιολογικές λειτουργίες των ουδετερόφιλων CAR μετά τη φόρτωση των NPs R-SiO2-TPZ. Δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 3i, Συμπληρωματικό Σχήμα 6i), στην ικανότητα μετανάστευσης μεταξύ των πηγαδιών (Εικ. 3j), στη χημειοταξία και στην αντίστοιχη ταχύτητα (Εικ. 3k, l) των ουδετερόφιλων CAR πριν ή μετά τη φόρτωση του R-SiO2 –ΤΡΖ NP, αποδεικνύοντας την υψηλή βιοσυμβατότητά τους. Πραγματοποιήθηκε επίσης ανάλυση φόρτωσης νανο-φαρμάκου εξαρτώμενης από το χρόνο και η μέγιστη περιεκτικότητα φόρτωσης επιτεύχθηκε σε 1 ώρα μετά την επώαση κυττάρων-ΝΡ (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a). Περισσότερο από το 95% των ουδετερόφιλων CAR φορτώθηκαν επιτυχώς με NPs R-SiO2-TPZ (Συμπληρωματικό Σχήμα 7β). Το επίπεδο έκφρασης του CD11b, μιας πρωτεΐνης επιφάνειας ουδετερόφιλων που μεσολαβεί στη λειτουργία προσκόλλησης και μετανάστευσης κατά τη διέγερση του φλεγμονώδους μορίου, δεν άλλαξε στα ουδετερόφιλα CAR με ή χωρίς φόρτωση R-SiO2-TPZ (Συμπληρωματικό Σχήμα 7c, d). Το υπεροξείδιο ή τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) απελευθερώνονται από τα ενεργά ουδετερόφιλα για να σκοτώσουν μικρόβια και κύτταρα όγκου44. Όπως αναμενόταν, η παραγωγή ROS από ουδετερόφιλα CAR αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με Ν-Φορμυλμεθειονίνη-λευκυλ-φαινυλαλανίνη (fMLP) και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην παραγωγή ROS από ουδετερόφιλα CAR πριν και μετά τη φόρτωση R-SiO{{48} ΤΠΖ (Εικ. 3μ). Συνολικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα ουδετερόφιλα CAR με φορτίο R-SiO2-TPZ διατήρησαν τις φυσιολογικές δραστηριότητες των ουδετερόφιλων άγριου τύπου και μπορούσαν να μεταναστεύσουν ενεργά προς φλεγμονώδη ερεθίσματα, υπογραμμίζοντας τις δυνατότητές τους στη στοχευμένη χημειοανοσοθεραπεία καρκίνου.

Τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με νανοσωματίδια R-SiO2-TPZ σκοτώνουν αποτελεσματικά τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την επίδραση του R-SiO2-TPZ στην ικανότητα θανάτωσης όγκου των ουδετερόφιλων CAR. Η στενή αλληλεπίδραση τελεστή-στόχου ήταν απαραίτητη προϋπόθεση για την κυτταρόλυση με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων. Όπως αναμενόταν, τα CAR-ουδετερόφιλα@R-SiO2-TPZ σχημάτισαν ανοσοσυνάψεις με καρκινικά κύτταρα εντός 2 ωρών και εμφάνισαν παρόμοιους αριθμούς αλληλεπίδρασης τελεστή-στόχου με τα ουδετερόφιλα CAR χωρίς φάρμακο (Εικ. 4α, Συμπληρωματικό Σχήμα 8) . Συγκεκριμένα, δεν βρέθηκαν παρατηρήσιμες αλληλεπιδράσεις μεταξύ CAR-ουδετερόφιλων@RSiO2-TPZ και μη καρκινικών σωματικών κυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 8), υπογραμμίζοντας την ειδικότητα του CLTX-CAR έναντι των όγκων του εγκεφάλου. Επιπλέον, τα NPs R-SiO2-TPZ απελευθερώθηκαν από τα ουδετερόφιλα στο μέσο καλλιέργειας (Συμπληρωματικό Σχήμα 9a, β) 12 ώρες μετά τη συγκαλλιέργεια και εισήλθαν στα υπόλοιπα κύτταρα όγκου (Εικ. 4α). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την ταυτόχρονη επώαση ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με SiO2-TPZ NP με κύτταρα όγκου, έως και 95% των καρκινικών κυττάρων περιείχαν NPs R-SiO2-TPZ (Εικ. 4α, Συμπληρωματικό Σχήμα 9γ), υποδεικνύοντας επιτυχή καταρράκτη μεταφοράς που περιλαμβάνει ουδετερόφιλα φορείς που ασκούν τη λειτουργία των τελεστικών κυττάρων τους και υφίστανται απόπτωση, απελευθερώνοντας έτσι παθητικά NPs R-SiO2-TPZ στα καρκινικά κύτταρα στόχους45. Επικυρώσαμε επίσης την υποξική ανταποκρινόμενη λειτουργία και την κυτταροτοξικότητα του προ-φαρμάκου TPZ εντός καρκινικών κυττάρων με ανάλυση φασματοσκοπίας παραμαγνητικού συντονισμού ηλεκτρονίων (EPR) της δημιουργίας ριζών από TPZ (Συμπληρωματικό Σχήμα 9δ) και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του TOPRO-3 στον όγκο κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχ. 9ε) υπό υποξία και νορμοξία. Για να προσδιορίσουμε την κυτταρόλυση των ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με NP R-SiO2-TPZ, εφαρμόσαμε ένα in vitro μοντέλο επαναπροκλήσεως όγκου νορμοξίας-υποξίας (Εικ. 4β). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη νορμοξική συγκαλλιέργεια, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO{2-TPZ NPs ή όχι εμφάνισαν παρόμοια αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα (Εικ. 4γ) και τα δύο ήταν υψηλότερα από αυτά των ουδετερόφιλων PB φορτωμένων με R -SiO2-TPZ NP ή όχι και R-SiO2- TPZ NP μόνο. Η ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα οφείλεται κυρίως στην αυξημένη ικανότητα στόχευσης όγκου των ουδετερόφιλων μετά από μηχανική CAR. Μετά από επιπλέον 12 και 24- ώρες υποξικής συγκαλλιέργειας με καρκινικά κύτταρα, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO2-TPZ NP εμφάνισαν ανώτερη αντικαρκινική ικανότητα σε σύγκριση με άλλες ομάδες (Εικ. 4δ, ε). Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με NPs R-SiO{2-TPZ εμφάνισαν εξαιρετική κυτταρόλυση έναντι επανασπορευμένων φρέσκων καρκινικών κυττάρων (Εικ. 4στ), υποδεικνύοντας την αντικαρκινική ικανότητα του απελευθερωμένου R-SiO{2-TPZ νανοσωματίδια μετά από απόπτωση ουδετερόφιλων.

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ανάλυση αλληλουχίας RNA (RNA-seq) σε κύτταρα όγκου για να αποσαφηνίσουμε τον πιθανό μοριακό μηχανισμό που υποκρύπτει ενισχυμένη αντικαρκινική κυτταρόλυση ουδετερόφιλων με έκφραση CAR και R-SiO2-TPZ NPs. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι σε σύγκριση με τα NPs ελέγχου και R-SiO2-TPZ, τα CAR-ουδετερόφιλα φορτωμένα με ή χωρίς NPs R-SiO{2-TPZ μείωσαν σημαντικά την έκφραση του κυτταροπλάσματος και των γονιδίων της μεμβράνης στα καρκινικά κύτταρα ( Συμπληρωματικό Σχ. 10α, Σχ. 4ζ), υποστηρίζοντας περαιτέρω τη φαγοκυττάρωσή τους των καρκινικών κυττάρων κατά τη συγκαλλιέργεια. Ενώ όλες οι πειραματικές ομάδες αύξησαν το κυτταρικό οξειδωτικό στρες στα καρκινικά κύτταρα, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO2-TPZ ξεπέρασαν τις άλλες ομάδες στην ενεργοποίηση σηματοδότησης οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα CAR με R-SiO2-TPZ προώθησαν σημαντικά την απόπτωση και μείωσαν τον πολλαπλασιασμό στα καρκινικά κύτταρα. Για να κατανοήσουμε περαιτέρω τις βελτιωμένες αντικαρκινικές δραστηριότητες των ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με R-SiO2-TPZ, εφαρμόσαμε έναν αναστολέα φαγοκυττάρωσης κυτοχαλασίνη D και έναν δεσμευτή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) και έναν αναστολέα ROS GSK2795039 στη συγκαλλιέργεια όγκου-ουδετερόφιλου. Η κυτταρόλυση των καρκινικών κυττάρων από CAR-ουδετερόφιλα μειώθηκε σημαντικά κατά 5 μM κυτοχαλασίνη D, 5 mM NAC και 100 nM GSK2795039 (Συμπληρωματικό Σχήμα 10b, c), υποδεικνύοντας τον εξέχοντα ρόλο της φαγοκυττάρωσης και του ROS στο νετεροφιλικό κύτταρο CAR φόνος. Το υπόλοιπο 40%-50% λύση καρκινικών κυττάρων παρουσία ουδετερόφιλων και NAC ή GSK2795039 υποδηλώνει τη συμμετοχή μηχανισμού ανεξάρτητου από ROS στη θανάτωση όγκου που προκαλείται από ουδετερόφιλα που αξίζει περαιτέρω έρευνα.

Εικ. 3|Παρασκευή και χαρακτηρισμός ουδετεροφίλων CAR hPSC φορτωμένων με νανοσωματίδια SiO2 που περιέχουν τιραπαζαμίνη (TPZ). a–e Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) (α) και φασματοσκοπία διασποράς ενέργειας (EDS) εικόνες στοιχειακής χαρτογράφησης (β) ακατέργαστων νανοσωματιδίων SiO2. c Εμφανίζεται η ισόθερμη προσρόφηση-εκρόφηση αζώτου των ακατέργαστων νανοσωματιδίων SiO2 μαζί με το διάγραμμα κατανομής μεγέθους πόρων Barrett-JoynerHalenda (BJH). Τα βιολογικά τριπλούν πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα. Το περιεχόμενο φόρτωσης TPZ σε νανοσωματίδια SiO2 (d) και γλουταθειόνη (GSH)--αποκριτική απελευθέρωση TPZ (e) μετρήθηκε στον υποδεικνυόμενο χρόνο. n=3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. Μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για το (ε). Εικόνες φθορισμού (f) και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (g) ουδετερόφιλων φορτωμένων με λείο και τραχύ SiO2-TPZ. Τα βιολογικά τριπλούν πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα. Η περιεκτικότητα κυτταρικού SiO2 σε ουδετερόφιλα CAR που προέρχονται από hPSC μετρήθηκε. n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα, t-test Student με δύο ουρές. Κυτταρική βιωσιμότητα (i), n=3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα, μετεμψύχωση (j), n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα, ικανότητες χημειοέλξης (k, l), n=20 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα και Η ικανότητα δημιουργίας ROS (m) ουδετερόφιλων CAR που προέρχονται από hPSC φορτωμένα με ή χωρίς ακατέργαστο SiO2-TPZ παρουσιάστηκε, n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα, δοκιμασία t Student με δύο ουρές. PMA: οξική μυριστική φορβόλη. Όλα τα δεδομένα σε αυτό το σχήμα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Λειτουργική αξιολόγηση ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με νανο φάρμακα χρησιμοποιώντας βιομιμητικά μοντέλα γλοιοβλαστώματος in vitro

Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω τις δραστηριότητες των ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με R-SiO2-TPZ NP, εφαρμόσαμε ένα μοντέλο όγκου αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB) ​​βασισμένο σε διακυψελίδες χρησιμοποιώντας ανθρώπινα εγκεφαλικά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικ. 5α, Συμπληρωματικό Σχήμα 11α). Όπως αναμενόταν, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO2-TPZ NP εμφάνισαν εξαιρετική ικανότητα μετανάστευσης στο in vitro μοντέλο BBB (Εικ. 5β), σκοτώνοντας αποτελεσματικά στοχευμένα καρκινικά κύτταρα μετά τη μετεμψύχωση τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε υποξικές συνθήκες (Εικ. 5γ , d) και απελευθέρωση περισσότερων φλεγμονωδών κυτοκινών (Εικ. 5e) που μπορεί να προσελκύουν άλλα τελεστικά κύτταρα για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα CAR δεν επηρέασαν σημαντικά τη βιωσιμότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά τη μετεμψύχωση (Συμπληρωματικό Σχήμα 11β). Τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO{17}}TPZ NP διατήρησαν εξαιρετική ικανότητα μετεμψύχωσης κατά τη διάρκεια του δεύτερου πειράματος μετανάστευσης (Εικ. 5στ) και ανώτερη αντικαρκινική ικανότητα σε σύγκριση με άλλες ομάδες (Εικ. 5g). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα τρισδιάστατο (3D) μοντέλο σφαιροειδούς όγκου για την αξιολόγηση της ικανότητας διείσδυσης στον όγκο των ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με R-SiO2-TPZ NP (Εικ. 5h). Τα ουδετερόφιλα CAR σταδιακά μετανάστευσαν προς το κέντρο του σφαιροειδούς όγκου και κατανεμήθηκαν ομοιόμορφα στο σφαιροειδές μετά από 8 ώρες επώασης (Εικ. 5i). Παρατηρήθηκε υψηλός βαθμός συνεντοπισμού μεταξύ ουδετερόφιλων CAR και R-SiO2-TPZ NPs (Συμπληρωματικό Σχήμα 12a–c), αποδεικνύοντας ότι τα NP R-SiO2-TPZ ενθυλακώθηκαν σταθερά στο CAR -ουδετερόφιλα κατά τη διήθηση του όγκου πριν από την κυτταρόλυση τους. Χωρίς χορήγηση με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων, τα NP R-SiO2-TPZ βρέθηκαν μόνο στο εξωτερικό στρώμα των σφαιροειδών όγκου. Σε σύγκριση με τα R-SiO2-TPZ NPs και τα CAR-ουδετερόφιλα, τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με R-SiO2-TPZ NP εμφάνισαν ανώτερη αντικαρκινική κυτταρόλυση στο τρισδιάστατο μοντέλο όγκου (Εικ. 5j). Τα CAR-neutrophils@R-SiO2 NPs μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την παροχή άλλων φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένης της κλινικής τεμοζολομίδης (TMZ) και του JNJ- 64619187, σε τρισδιάστατα μοντέλα όγκων και να σκοτώνουν αποτελεσματικά τα κύτταρα GBM (Συμπληρωματικό Σχ. 12d–f). Συνολικά, τα συνδυαστικά ουδετερόφιλα CAR και νανο φάρμακα εμφάνισαν εξαιρετικές αντικαρκινικές δράσεις σε βιομιμητικό μικροπεριβάλλον όγκου που μιμούνται συνθήκες in vitro, υπογραμμίζοντας τις θεραπευτικές δυνατότητες της συνδυαστικής χημειοανοσοθεραπείας με βάση τα ουδετερόφιλα.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κατανομή in vivo των νανοσωματιδίων R-SiO2-TPZ που χορηγούνται από ουδετερόφιλα CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >Το 20% των χορηγούμενων νανοφαρμάκων χορηγήθηκε σε όγκους του εγκεφάλου από ουδετερόφιλα CAR σε σύγκριση με το 1% από ελεύθερα νανοφάρμακα, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές6. Η στοχευμένη χορήγηση NPs R-SiO2-TPZ στον εγκέφαλο ξενιστή μέσω του BBB από CAR-ουδετερόφιλα επιβεβαιώθηκε επίσης με ιστολογική ανάλυση (Εικ. 6δ). Αντίθετα, τα NP R-SiO2-TPZ μόνα τους συσσωρεύονται κυρίως στο ήπαρ και τη σπλήνα. Συλλογικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ενισχυμένη στοχευμένη χορήγηση R-SiO2-TPZ NPs από ουδετερόφιλα CAR χωρίς την ανάγκη πρόκλησης πρόσθετης φλεγμονής στην περιοχή του όγκου, υπογραμμίζοντας τη σκοπιμότητα και την ασφάλεια της χημειοανοσοθεραπείας με βάση τα ουδετερόφιλα στη θεραπεία του καρκίνου.

Η συνδυαστική χημειοανοσοθεραπεία των CAR-ουδετερόφιλων και των νανοσωματιδίων R-SiO2-TPZ επέδειξε εξαιρετικές δράσεις κατά του γλοιοβλαστώματος in vivo

Για να προσδιοριστεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με R-SiO2-TPZ NP, ένα in situ μοντέλο ξενομοσχεύματος γλοιοβλαστώματος καθιερώθηκε στους ποντικούς NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) που εκφράζουν κύτταρα λουσιφεράσης U87G. Τα ποντίκια που έφεραν όγκους χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως 5 χ 106 ουδετερόφιλα εβδομαδιαίως (Εικ. 7a) και το φορτίο όγκου στους ξενιστές μετρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε (Εικ. 7b, c). Σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν PBS ή PB-ουδετερόφιλα, η θεραπεία με CAR-ουδετερόφιλα και CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs επιβράδυνε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου. Τα ουδετερόφιλα CAR@R-SiO2-TPZ NPs εμφάνισαν πολύ υψηλότερη αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα από οποιαδήποτε άλλη πειραματική ομάδα. Αντίθετα, τα ουδετερόφιλα ΡΒ προώθησαν σημαντικά την ανάπτυξη όγκου στον εγκέφαλο, με αποτέλεσμα τον θάνατο ποντικών που φέρουν όγκο ήδη από την 23η ημέρα (Εικ. 7δ), υποδηλώνοντας ότι τα μη σχεδιασμένα ουδετερόφιλα μπορεί να θέτουν επιπλέον κινδύνους. Στη συνέχεια μετρήσαμε την απελευθέρωση ανθρώπινης κυτοκίνης στο πλάσμα διαφορετικών πειραματικών ομάδων ποντικών (Εικ. 7e). Όλες οι πειραματικές ομάδες που δεν ήταν PBS παρήγαγαν ανιχνεύσιμο TNF και IL-6 στο πλάσμα από την ημέρα 5 έως την ημέρα 26, υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση των ανθρώπινων ουδετερόφιλων κατά τη διέγερση του όγκου. Σε συμφωνία με τον παρατηρούμενο υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης όγκου, τα μη τροποποιημένα ουδετερόφιλα απελευθέρωσαν σταδιακά περισσότερη IL-6 και TNF, τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε σύνδρομο απελευθέρωσης κυτοκίνης σε ασθενείς και απαιτούν πιο εις βάθος μελέτες ασφάλειας με αναστολείς IL-646,47 . Σημειωτέον, τα NP CAR-ουδετερόφιλα@RSiO2-TPZ εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα παραγωγής κυτοκίνης σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (ημέρα 19 και ημέρα 26), υποδηλώνοντας δυνητικά χαμηλό κίνδυνο συνδρόμου απελευθέρωσης κυτοκίνης σε ασθενείς που έλαβαν χημειοανοσοθεραπεία με βάση τα ουδετερόφιλα CAR. Η βιοσυμβατότητα των συνδυαστικών CAR-ουδετερόφιλων και NPs R-SiO2-TPZ αξιολογήθηκε μέσω εβδομαδιαίας μέτρησης του σωματικού βάρους και παρακολούθησης των παθολογικών αλλαγών στα κύρια όργανα των ποντικών. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα σωματικά βάρη μεταξύ ποντικών που έλαβαν θεραπεία με CAR ουδετερόφιλα@R-SiO2-TPZ NP και οποιωνδήποτε άλλων πειραματικών ομάδων (Εικ. 7στ), υποδεικνύοντας ελάχιστη συστημική τοξικότητα και εξαιρετική βιοσυμβατότητα των CAR-ουδετερόφιλων @ ​​R-SiO2-TPZ NPs εντός 28 ημέρες θεραπείας. Η ιστολογική ανάλυση σε κύρια όργανα που τεμαχίστηκαν από ποντίκια την ημέρα 30 έδειξε ότι τα ποντίκια που έλαβαν CAR-ουδετερόφιλα@R-SiO2-TPZ NP δεν προκάλεσαν αξιοσημείωτες ανωμαλίες ή βλάβες οργάνων στην καρδιά, το συκώτι, τον σπλήνα, τους πνεύμονες και τους νεφρούς (Συμπληρωματικό Σχ. 13), επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την ασφάλεια των συνδυαστικών CAR-ουδετερόφιλων και R-SiO2-TPZ NPs.

Εικ. 4|Τα ουδετερόφιλα CAR φορτωμένα με νανοσωματίδια R-SiO2-TPZ σκοτώνουν αποτελεσματικά τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Παρουσιάστηκαν αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσολογικών συνάψεων που υποδεικνύονται από πολωμένη συσσώρευση F-ακτίνης στη διεπιφάνεια μεταξύ CAR-ουδετερόφιλων και κυττάρων όγκου στις 6, 12 και 24 ώρες. Τα νανοσωματίδια R-SiO2-TPZ που απελευθερώθηκαν από τα ουδετερόφιλα CAR κατά τη φαγοκυττάρωση των καρκινικών κυττάρων απορροφήθηκαν από τα καρκινικά κύτταρα. Τριπλότυπα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα. β Σχηματική ανάλυση κυτταροτοξικότητας κατά του όγκου που προκαλείται από ουδετερόφιλα. Η κυτταροτοξικότητα έναντι των κυττάρων γλοιοβλαστώματος U87MG πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικές αναλογίες στόχου ουδετερόφιλων προς όγκο χρησιμοποιώντας ενδεικνυόμενα ουδετερόφιλα στις 24 ώρες (c), 36 ώρες (d), 48 ώρες (e) και 72 ώρες (f). n=3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD, μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). g Ανάλυση αλληλουχίας μαζικού RNA πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα U87MG υπό διάφορες συνθήκες. Ο χάρτης θερμότητας δείχνει επίπεδα έκφρασης επιλεγμένου κυτταροπλάσματος, μεμβράνης, οξειδωτικού στρες, απόπτωσης και γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό στα ενδεικνυόμενα κύτταρα γλοιοβλαστώματος. n=2 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Εικ. 5|Λειτουργική αξιολόγηση ουδετερόφιλων CAR φορτωμένων με νανοσωματίδια R-SiO2-TPZ χρησιμοποιώντας μοντέλα βιομιμητικού γλοιοβλαστώματος (GBM) in vitro. μια Σχηματική του in vitro μοντέλου όγκου μας GBM με αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB), το οποίο αποτελείται από ενδοθηλιακά κύτταρα στη μεμβράνη κυτταρικού ενθέτου και κύτταρα όγκου στον πυθμένα του ίδιου διαβυθίσματος. β Δείχνεται ανάλυση μετανάστευσης transwell των ουδετερόφιλων στις 12 ώρες. Η αντι-GBM κυτταροτοξικότητα των ενδεικνυόμενων ουδετερόφιλων στις 24 ώρες (c) και 36 ώρες (d) μετρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ELISA της IL-6 και του TNF που απελευθερώθηκε από τα υποδεικνυόμενα ουδετερόφιλα στις 36 ώρες. f Εμφανίζεται η δεύτερη μετανάστευση διαφορετικών ουδετερόφιλων στις 48 ώρες. g Η αντι-GBM κυτταροτοξικότητα των ενδεικνυόμενων ουδετερόφιλων στις 60 ώρες μετρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε. h–j Σχηματικό μοντέλο τρισδιάστατου (3D) όγκου διηθημένου από ουδετερόφιλα in vitro παρουσιάστηκε στο (h). Παρουσιάστηκαν αντιπροσωπευτικές φθορίζουσες εικόνες διεισδυμένων ουδετερόφιλων στα τρισδιάστατα μοντέλα όγκων. Το DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση του πυρηνικού κυττάρου και το CD45 χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση ουδετερόφιλων. Ράβδοι ζυγαριάς, 200 μm. Τα βιολογικά τριπλούν πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα. j Η αντίστοιχη ικανότητα θανάτωσης όγκου των ενδεικνυόμενων ουδετερόφιλων μετρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ κυτταροτοξικότητας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD πέντε ανεξάρτητων βιολογικών αντιγράφων, μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Ενώ τα NP CAR-ουδετερόφιλα@R-SiO2-TPZ επιβράδυναν σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια με ξενομόσχευμα, η διαφορά στην επιβίωση των ζώων σε πειραματικές ομάδες CAR-ουδετερόφιλων, SiO2-TPZ NPs και CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs είναι ασήμαντη (p > 0.05), το οποίο πιθανώς οφείλεται στον θάνατο βραχύβιων ουδετερόφιλων κατά την προετοιμασία και την έγχυση των κυττάρων. Στη συνέχεια επικεντρωθήκαμε σε αυτές τις τρεις ομάδες και προσδιορίσαμε εάν ο μειωμένος χρόνος προετοιμασίας των κυττάρων και οι αυξημένες δόσεις των CAR-ουδετερόφιλων και των νανοφαρμάκων θα έκαναν οποιαδήποτε διαφορά στην επιβίωση των ζώων (Εικ. 7g). Όταν χορηγήθηκαν συστηματικά 6 φορές, τα NPs CAR-ουδετερόφιλα@R-SiO2-TPZ ξεπέρασαν τις άλλες δύο ομάδες στην παράταση της διάρκειας ζωής των ποντικών που φέρουν όγκο (Εικ. 7h), ενώ η διαφορά της επιβίωσης των ζώων σε ομάδες CAR-ουδετερόφιλων και SiO2- Τα TPZ NPs παρέμειναν ασήμαντα. Ενώ μια παρόμοια καμπύλη επιβίωσης της ομάδας R-SiO{2- TPZ παρατηρήθηκε μεταξύ αυτών των δύο ανεξάρτητων μελετών σε ζώα, μειωμένος χρόνος απομόνωσης κυττάρων και προετοιμασίας για ένεση από συνολικά ~4 ώρες σε 1 ώρα κατά τη διάρκεια των πρώτων 4 ουδετερόφιλων Οι δόσεις οδήγησαν σε βελτιωμένη επιβίωση ζώων σε ομάδες CAR-ουδετερόφιλων πριν από την ημέρα 32. Συλλογικά, τα δεδομένα μας κατέδειξαν τη σημασία της προετοιμασίας των ουδετερόφιλων και της βελτιστοποίησης της δοσολογίας σε μελλοντικές κλινικές εφαρμογές των θεραπευτικών ουδετερόφιλων.

Συζήτηση

Τα ουδετερόφιλα ποντικού έχουν αποδειχθεί ως ισχυροί φορείς για την αποτελεσματική παροχή νανοφαρμάκων σε φλεγμονώδεις μετεγχειρητικούς όγκους εγκεφάλου8,9. Ωστόσο, η σκοπιμότητα και η ασφάλεια της χρήσης ανθρώπινων ουδετερόφιλων στη χορήγηση φαρμάκων παραμένουν αδιευκρίνιστα. Η μεγάλη ποσότητα ουδετερόφιλων ποντικών (10 φορές υψηλότερη από τον συνολικό αριθμό των κυκλοφορούντων ουδετερόφιλων σε ποντίκια11) που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες για την επίτευξη θεραπευτικού οφέλους μπορεί να εμποδίσει περαιτέρω την κλινική μετάφρασή τους, καθώς η εξαγωγή μεγάλου αριθμού ουδετερόφιλων από καρκινοπαθείς μπορεί να οδηγήσει σε ουδετεροπενία και άλλους κινδύνους. Για να αντιμετωπίσουμε αυτές τις προκλήσεις, αξιοποιήσαμε τη δύναμη των αυτοανανεούμενων hPSC για τη λήψη απεριόριστων de novo ανθρώπινων ουδετερόφιλων29. Αναπτύξαμε ένα ισχυρό βιοεμπνευσμένο σύστημα χορήγησης φαρμάκων με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων με CAR-engineering29 και χρησιμοποιήσαμε μηχανικά ανθρώπινα ουδετερόφιλα CAR ως νανοφορέα με εντυπωσιακές αντικαρκινικές δραστηριότητες. Τα ακατέργαστα NP SiO2 λειτουργούν καλύτερα από τα λεία SiO2 NP σε φορείς CAR-ουδετερόφιλων, σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι τα ουδετερόφιλα φαγοκυτταρώνουν κατά προτίμηση ακατέργαστα μικροβιακά παθογόνα30. Τα ουδετερόφιλα αναφέρθηκε ότι προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη των κυττάρων του γλοιώματος48. Παρατηρήσαμε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα υπέρ του όγκου των μη τροποποιημένων ουδετερόφιλων στη μελέτη μας σε ζώα, υπογραμμίζοντας την αναγκαιότητα της μηχανικής CCAR ή άλλων τροποποιήσεων στα ουδετερόφιλα για να διασφαλιστεί η ασφάλειά τους στη χορήγηση φαρμάκων και σε άλλες θεραπευτικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα, η χορήγηση φαρμάκου με τη μεσολάβηση CAR εξαρτάται αποκλειστικά από τη φυσική χημειο-ελκυστική ικανότητα του GBM, αλλά όχι από τα ενισχυμένα μετεγχειρητικά φλεγμονώδη σήματα, υποδηλώνοντας την υψηλή ειδικότητα και τη θεραπευτική δυνατότητα του συστήματος χορήγησης φαρμάκου στην εκρίζωση των βαθιά διηθημένων γλοιωμάτων που δεν μπορεί να αφαιρεθεί με χειρουργική επέμβαση. Δεδομένου ότι η χειρουργική εκτομή και η επικουρική χημειοθεραπεία/ακτινοθεραπεία είναι οι κύριες κλινικές παρεμβάσεις για το GBM12, η ​​συνδυαστική θεραπεία με νανοφορείς ουδετερόφιλων CAR και χειρουργική/ακτινοθεραπεία μπορεί να επιτύχει τη βέλτιστη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και αξίζει περαιτέρω διερεύνηση. Ειδικά για τα κύτταρα Τ και ΝΚ κατασκευάσματα CAR έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ενίσχυση των αντικαρκινικών δράσεων των Τ και ΝΚ κυττάρων, αλλά ειδικά για ουδετερόφιλα CAR που βελτιώνουν τις αντικαρκινικές λειτουργίες των ουδετερόφιλων δεν έχουν περιγραφεί. Οι χιμαιρικοί ανοσοϋποδοχείς CD4ζ και CD4 αναφέρθηκε προηγουμένως ότι ενισχύουν την κυτταρόλυση των ουδετερόφιλων έναντι κυττάρων που έχουν μορφομετατραπεί με HIVenv in vitro. Ακόμα, η αποτελεσματικότητα λύσης ήταν μόνο ~10% σε αναλογία τελεστή προς στόχο (Ε: Τ) 10:128. Το Fc RIIA (CD32a) είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας μονής αλυσίδας χαμηλής συγγένειας για μονομερή IgG που εκφράζεται σε υψηλό βαθμό σε ουδετερόφιλα (30,000 έως 60,000 μόρια/κύτταρο31) και η απολίνωση του επάγει Fc - εξαρτώμενες λειτουργίες στα ουδετερόφιλα, όπως η απελευθέρωση των περιεχομένων των κόκκων, η κινητοποίηση Ca2+, η κυτταροτοξικότητα κατά του όγκου και η φαγοκυττάρωση49. Δεδομένου του εξέχοντος ρόλου του CD32a στην ενεργοποίηση και τη λειτουργία των ουδετερόφιλων, σχεδιάσαμε και δοκιμάσαμε κατασκευές CAR που βασίζονται σε CD32a. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το CD3ζ μεσολαβεί σημαντικά καλύτερη κυτταρόλυση από το CD32a όταν εκφράζεται σε ουδετερόφιλα που προέρχονται από hPSC, γεγονός που μπορεί εν μέρει να οφείλεται στα υψηλότερα αντίγραφα των ITAMs στο CD3ζ από το CD32a: τρία και ένα αντίγραφα, αντίστοιχα, και σε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ζ παρά στην κυτταρική επιφάνεια των ουδετερόφιλων28. Όπως το CD32a, το Fc RIII (CD16b) είναι ένας άλλος υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για μονομερή IgG και εκφράζεται σε πολύ υψηλότερο επίπεδο από το CD32a στα ουδετερόφιλα31. Ενώ η διασύνδεση του CD16b προκαλεί μόνο κινητοποίηση και αποκοκκίωση Ca2+, αλλά όχι φαγοκυττάρωση και κυτταρόλυση στα ουδετερόφιλα28,50, θα εξακολουθεί να ενδιαφέρει μελλοντικές μελέτες η διεξαγωγή συστηματικής σύγκρισης σχετικά με τις ικανότητες των CD3ζ- και CD16b -CAR στην ενεργοποίηση και ενίσχυση των αντικαρκινικών λειτουργιών των ουδετερόφιλων.

Εικ. 6|Κατανομή in vivo των νανοσωματιδίων R-SiO2-TPZ (NPs) που χορηγούνται από ουδετερόφιλα CAR. μια Σχηματική των ενδοφλεβίως χορηγούμενων Cy5-επισημασμένων CAR neutrophil@R-SiO2 NPs και R-SiO2 NPs για in vivo μελέτη παρακολούθησης κυττάρων. 5 × 105 κύτταρα U87MG που εκφράζουν λουσιφεράση (Luci) εμφυτεύθηκαν στερεοτακτικά στον δεξιό πρόσθιο εγκέφαλο ποντικών NRG. Μετά από 4 ημέρες, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ενδοφλέβια θεραπεία με PBS, 5 × 106 Cy5-επισημασμένα CAR neutrophil@R-SiO2 NPs και R-SiO2 NPs. b Η εξαρτώμενη από το χρόνο βιοκατανομή των ουδετερόφιλων Cy5+ σε ολόκληρο το σώμα, τον εγκέφαλο και άλλα όργανα προσδιορίστηκε και ποσοτικοποιήθηκε με απεικόνιση φθορισμού τις υποδεικνυόμενες ώρες. γ Η βιοκατανομή των CAR neutrophil@R-SiO2 NPs και R-SiO2 NPs σε ποντίκια 24 ώρες μετά την έγχυση αναλύθηκε με επαγωγικά συζευγμένη φασματομετρία οπτικής εκπομπής πλάσματος (ICP-OES) με βάση το στοιχείο Si και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ποσοστό της ενέσιμης δόσης ανά γραμμάριο ιστού (%ID/g). n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SD. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης. δ Παρουσιάστηκαν αντιπροσωπευτικές εικόνες φθορισμού CD45 και SiO2 στα ενδεικνυόμενα ξενομοσχεύματα γλοιοβλαστώματος που απομονώθηκαν από ποντικούς που φέρουν όγκο. Ράβδοι ζυγαριάς, 100 μm. Τα βιολογικά τριπλούν πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα.

Εικ. 7|Οι in vivo αντικαρκινικές δραστηριότητες συνδυαστικών CAR-ουδετερόφιλων και νανοσωματιδίων R-SiO2-TPZ (NPs) αξιολογήθηκαν μέσω ενδοφλέβιας ένεσης. μια Σχηματική των ενδοφλεβίως χορηγούμενων PBS, PB-ουδετερόφιλων, CAR-ουδετερόφιλων και CAR-ουδετερόφιλων@ R-SiO2-TPZ NPs για in vivo μελέτη θανάτωσης όγκου. 5 × 105 κύτταρα U87MG που εκφράζουν λουσιφεράση (Luci) εμφυτεύθηκαν στερεοτακτικά στον δεξιό πρόσθιο εγκέφαλο ποντικών NRG. Μετά από 4 ημέρες, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ενδοφλέβια αγωγή με ενδεικνυόμενα ουδετερόφιλα εβδομαδιαία για ένα μήνα. Το χρονοεξαρτώμενο φορτίο όγκου προσδιορίστηκε (β) και ποσοτικοποιήθηκε (γ) με βιοφωταύγεια απεικόνιση (BLI) τις υποδεικνυόμενες ημέρες. Τα δεδομένα είναι μέσος όρος ± SD για ποντίκια στο (β) (n=5), μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). d Η καμπύλη Kaplan-Meier που καταδεικνύει την επιβίωση των υποδεικνυόμενων πειραματικών ομάδων (n=5) εμφανίστηκε. Ο απελευθερωμένος ανθρώπινος παράγοντας νέκρωσης όγκου- (TNF) και IL-6 στο περιφερικό αίμα (e) και το σωματικό βάρος (f) διαφορετικών ομάδων ποντικού μετρήθηκαν τις υποδεικνυόμενες ημέρες. Τα δεδομένα είναι μέσος όρος ± SD, n=5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα. g, h Αξιολογήθηκε η αντικαρκινική δραστηριότητα αυξημένων συχνοτήτων δοσολογίας CAR-ουδετερόφιλων και RSiO2-TPZ NPs. g Σχηματική των ενδοφλεβίως χορηγούμενων CAR-ουδετερόφιλων, R-SiO2-TPZ NPs και CAR-ουδετερόφιλων@ R-SiO2-TPZ NPs για in vivo μελέτη εξόντωσης όγκου. Η καμπύλη Kaplan-Meier που καταδεικνύει την επιβίωση των υποδεικνυόμενων πειραματικών ομάδων εμφανίστηκε (n=5). Οι καμπύλες Kaplan-Meier αναλύθηκαν με τη δοκιμή λογαριθμικής κατάταξης. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Παρουσιάσαμε επίσης εδώ μια αρθρωτή και ευέλικτη πλατφόρμα χορήγησης φαρμάκων ουδετερόφιλων hPSC που μπορεί να ανασχεδιαστεί και να συντονιστεί στο μέλλον για να υποστηρίξει άλλες προσπάθειες που βασίζονται σε ουδετερόφιλα για τη θεραπεία άλλων ανθρώπινων ασθενειών. Πρώτον, η μηχανική CAR είναι πιο προσιτή στα hPSCs παρά στα πρωτεύοντα Τ κύτταρα του ανοσοποιητικού και τα ουδετερόφιλα. Απαιτείται μόνο μία φορά επεξεργασία γονιδιώματος για να επιτευχθεί σταθερή και ομοιογενής έκφραση διαφόρων CAR29. Εκτός από τα CLTX CAR, κατασκευάσαμε επίσης σταθερές γραμμές hPSC που εκφράζουν μια καθολική αντιφλουορεσκεΐνη (FITC)51 ή αντι-PD-L1 CAR52, και τα δύο θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη λήψη καθολικών συμπαγών νανοφορέων CAR-ουδετερόφιλων που στοχεύουν τον όγκο. Άλλες γενετικές τροποποιήσεις, όπως η ίνωση που στοχεύει τα αντι-FAP CARs53, μπορούν επίσης να πραγματοποιηθούν για να κατευθύνουν τους νανοφορείς ουδετερόφιλων για τη θεραπεία θανατηφόρων εκφυλιστικών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφαλικού τραύματος και της καρδιακής ίνωσης. Επιπλέον, τα hPSC που εκφράζουν CAR θα μπορούσαν επίσης να προσαρμοστούν εύκολα για να παράγουν κύτταρα CAR-T ή CAR-NK29 και οι συνδυασμοί αυτών των ανοσοθεραπειών με νανοφορείς CAR-ουδετερόφιλων μπορούν να επιτύχουν βέλτιστα θεραπευτικά οφέλη κατά του όγκου. Τέλος, το βιοεμπνευσμένο μας σύστημα νανοφαρμάκων που ανταποκρίνεται στη γλουταθειόνη (GSH) είναι μια αρθρωτή και ευέλικτη πλατφόρμα για τη φόρτωση πολλά υποσχόμενων χημειοθεραπευτικών ή ραδιενεργών φαρμάκων σε ουδετερόφιλα CAR για στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων, όπως παραδειγματίζεται από τα κλινικά TMZ, JNJ64619187, TPZ. Μελλοντικές μελέτες για τη δοκιμή άλλων νανοσωματιδίων μπορεί να αποδώσουν βελτιστοποιημένη φόρτωση φαρμάκων σε ουδετερόφιλα και να επιτύχουν μέγιστη in vivo θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Ενώ έχουμε αποδείξει τη θεραπευτική ιδέα της χρήσης ουδετερόφιλων CAR για τη συγκεκριμένη και αποτελεσματική χορήγηση χημειο-φαρμάκων σε όγκους εγκεφάλου σε όλη τη ΒΒΒ, υπάρχουν μερικοί περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Πρώτον, ο εμβολιασμός κυττάρων όγκου 4-ημέρα μπορεί να μην είναι αρκετός για την καθιέρωση όγκων που μιμούνται το κλινικό σενάριο για θεραπευτική διερεύνηση και είναι απαραίτητη μελλοντική εργασία με διαφορετικές περιόδους εμβολιασμού όγκου για την ανακεφαλαίωση των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης του γλοιοβλαστώματος και της θεραπευτικής ανταπόκρισης σε διαφορετικά ασθενείς54,55. Δεύτερον, τα ανοσοανεπαρκή ποντίκια που χρησιμοποιήσαμε εδώ δεν έχουν προσαρμοστική ανοσία και άλλα προκλινικά μοντέλα με άθικτο ανοσοποιητικό σύστημα, όπως σκύλοι κατοικίδιων ζώων με αυθόρμητο γλοίωμα56, χρειάζονται για την καλύτερη αξιολόγηση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας των ουδετεροφίλων CAR που παράγονται in vitro. Ιδιαίτερα, απαιτείται προσδιορισμός τοξικότητας εκτός στόχου των ουδετερόφιλων CAR με ή χωρίς φόρτωση νανοφαρμάκων σε ζώα με έγχυση, συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου απελευθέρωσης κυτοκίνης, της νευροτοξικότητας και των τοξικοτήτων εκτός του στόχου που παρατηρούνται στα κύτταρα CAR-T57, παρά τη σύντομη διάρκεια ζωής. των ουδετερόφιλων. Ενώ οι εφικτές προσεγγίσεις, όπως η μηχανική υποανοσογόνου καθολικού δότη hPSCs58–61 και οι τραπεζικές βιβλιοθήκες με αντιγόνο ανθρώπινων λευκοκυττάρων (HLA)-ομοζυγώτων hPSC62, είναι άμεσα διαθέσιμες για την αποφυγή του πιθανού κινδύνου νόσου μοσχεύματος έναντι ξενιστή (GvHD), προκλινικά ζωικά μοντέλα με Το άθικτο ανοσοποιητικό σύστημα είναι ακόμα απαραίτητο για την αξιολόγηση της μεταφραστικής δυνατότητας των θεραπευτικών μας ουδετερόφιλων. Τέλος, παρατηρήθηκε περιορισμένη αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα και παράταση της διάρκειας ζωής των ζώων των θεραπευτικών νανοφαρμάκων CAR-ουδετερόφιλων. Επομένως, η μελλοντική διερεύνηση πιο αποτελεσματικών φαρμάκων χημειοθεραπείας ή ραδιοευαισθητοποιητών και συνδυαστικών θεραπειών με κλασικό CAR-T και χειρουργική εκτομή είναι απαραίτητη για την επίτευξη μέγιστης αντικαρκινικής αποτελεσματικότητας των θεραπευτικών ουσιών CAR-ουδετερόφιλων. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη σχετικά με τη σχεδίαση που βασίζεται σε μηχανισμούς οδήγησε σε ένα πιο αποτελεσματικό φάρμακο KL{-50 που υπερνικά την επίκτητη αντίσταση όπως παρατηρείται στο κλινικό φάρμακο TMZ63 και μπορεί έτσι να ενσωματωθεί στη σπονδυλωτή μας πλατφόρμα νανοφαρμάκων CAR-ουδετερόφιλων για μια πιθανή καλύτερη θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Η παράταση της διάρκειας ζωής των ουδετερόφιλων σε 5 ημέρες μέσω θεραπείας με CLON-G (κασπάσες-λυσοσωμική διαπερατότητα μεμβράνης-αναστολή οξειδωτικής-νεκρόπτωσης συν παράγοντας διέγερσης αποικίας κοκκιοκυττάρων64) ή/και χρήση ενός μακροπρόθεσμου συστήματος ελεγχόμενης απελευθέρωσης φαρμάκου στα ουδετερόφιλα CAR μπορεί επίσης να επιτύχουν παρατεταμένη in vivo αντικαρκινική αποτελεσματικότητα μετά από απόπτωση ουδετερόφιλων. Συλλογικά, τα ευρήματά μας έδειξαν ξεκάθαρα ότι τα ουδετερόφιλα CAR με φορτίο R-SiO2-TPZ θα μπορούσαν να διατηρήσουν τον αντικαρκινικό φαινότυπο N1 και να σκοτώσουν αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα υπό διάφορες συνθήκες που μοιάζουν με θέση όγκου in vitro. Λειτουργικά ουδετερόφιλα CAR θα μπορούσαν επίσης να παραχθούν σε μεγάλες ποσότητες από κατασκευασμένα hPSC για να παραδώσουν με ακρίβεια νανο φάρμακα που ανταποκρίνονται στο μικροπεριβάλλον όγκου για να στοχεύσουν τη GBM in vivo, οδηγώντας σε μια συνδυαστική χημειοανοσοθεραπεία με ισχυρές και ειδικές αντι-GBM δραστηριότητες και ελάχιστη χορήγηση φαρμάκων εκτός στόχου. παρατεταμένη διάρκεια ζωής σε ποντίκια που φέρουν όγκο.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Yang F. et al. Συνεργική ανοσοθεραπεία γλοιοβλαστώματος με διπλή στόχευση IL-6 και CD40. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, Μ., Xia, Υ., Bettegowda, C. & Weller, Μ. Τρέχουσα κατάσταση ανοσοθεραπείας για γλοιοβλάστωμα. Nat. Κλιν. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Η ενδοογκική χορήγηση IL-12 ενισχύει την ανοσοθεραπεία των κυττάρων CAR-T σε ένα προκλινικό μοντέλο γλοιοβλαστώματος. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils ως αναδυόμενοι θεραπευτικοί στόχοι. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils ως αναδυόμενος θεραπευτικός στόχος και εργαλείο για τη θεραπεία του καρκίνου. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Μετα-ανάλυση της παράδοσης νανοσωματιδίων σε όγκους χρησιμοποιώντας μια φυσιολογικά βασισμένη προσέγγιση φαρμακοκινητικής μοντελοποίησης και προσομοίωσης. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Ανάλυση μεταφοράς νανοσωματιδίων σε όγκους. Nat. Σεβ. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Χορήγηση αντικαρκινικού φαρμάκου με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων για την καταστολή της μετεγχειρητικής υποτροπής κακοήθους γλοιώματος. Nat. Nanotechnol. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, Μ. et αϊ. Παρακολούθηση απεικόνισης μαγνητικής τομογραφίας μηχανικών ουδετερόφιλων που ενεργοποιούνται με φλεγμονή για στοχευμένη θεραπεία του γλοιώματος που αντιμετωπίζεται χειρουργικά. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Η εκκίνηση με φωτοευαισθητοποίηση μικροπεριβαλλόντων όγκου βελτιώνει την παροχή νανοθεραπευτικών μέσω της διήθησης ουδετερόφιλων. Adv. Μητήρ. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Θεραπεία καρκίνου: Διακίνηση ουδετερόφιλων σε νανοφαρμακευτικά φάρμακα για τον καρκίνο. Nat. Nanotechnol. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Ρόλος των ουδετερόφιλων στο γλοίωμα και στις εγκεφαλικές μεταστάσεις. Εμπρός. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Πόλωση φαινοτύπου ουδετεροφίλου που σχετίζεται με όγκο από TGF-βήτα: «Ν1» έναντι «Ν2» ΤΑΝ. Cancer Cell (2009).

14. Blaisdell, Α. et αϊ. Τα ουδετερόφιλα αντιτίθενται στην καρκινογένεση του επιθηλίου της μήτρας μέσω του καθαρισμού των υποξικών καρκινικών κυττάρων. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, Κ. et αϊ. Η ανακούφιση της υποξίας του όγκου απελευθερώνει το ογκοκτόνο δυναμικό των ουδετερόφιλων. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et αϊ. Τα ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα αναγνωρίζουν ειδικά και σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Ποικιλομορφία και πλαστικότητα ουδετερόφιλων στην εξέλιξη και τη θεραπεία του όγκου. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Πρόοδος της έρευνας σχετικά με τα βλαστοκύτταρα του γλοιώματος στο ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον του γλοιώματος. Εμπρός. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng Α., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, Β. Ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον γλοιωμάτων. Εργαστήριο. Ερευνήστε. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung Ε. et al. Πλαστικότητα, ετερογένεια και αντίσταση καρκινικών κυττάρων σε κρίσιμες μικροπεριβαλλοντικές κόγχες στο γλοίωμα. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Αναδυόμενες ανοσοθεραπείες για κακοήθη γλοίωμα: Από την ανοσογονιδιωματική στην κυτταρική θεραπεία. Νευρο. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Η επαγόμενη από ουδετερόφιλα φερρόπτωση προάγει τη νέκρωση του όγκου στην εξέλιξη του γλοιοβλαστώματος. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Φαινοτυπική ποικιλομορφία και πλαστικότητα στους κυκλοφορούντες υποπληθυσμούς ουδετερόφιλων στον καρκίνο. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Φυσικά φονικά κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπινα iPSC κατασκευασμένα με χιμαιρικούς υποδοχείς αντιγόνου ενισχύουν τη δράση κατά του όγκου. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Τα στοχευμένα κύτταρα CAR T υψηλής συγγένειας μεταλλαγμένης ιντερλευκίνης-13 ενισχύουν την παροχή βιοαποδομήσιμων φθοριζόντων νανοσωματιδίων με δυνατότητα κλικ στο γλοιοβλάστωμα. Bioact. Μητήρ. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Ένα νέο σύστημα χορήγησης συνδέτη για μη επεμβατική απεικόνιση και θεραπευτική εκμετάλλευση του περιορισμένου όγκου βιοδείκτη IL13R 2. Νευρο. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Κατευθυνόμενα από χλωροτοξίνες CAR T κύτταρα για ειδική και αποτελεσματική στόχευση του γλοιοβλαστώματος. Sci. Μετάφρ. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Αντιγονοειδική κυτταρόλυση από ουδετερόφιλα και ΝΚ κύτταρα που εκφράζουν χιμαιρικούς ανοσοϋποδοχείς που φέρουν περιοχές σηματοδότησης ζήτα ή γάμμα. J. Immunol. 161, 375-384 (1998).

29. Chang, Υ. et αϊ. Τεχνολογία χιμαιρικών ουδετερόφιλων υποδοχέων αντιγόνου από ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα για στοχευμένη ανοσοθεραπεία καρκίνου. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Τα ουδετερόφιλα φαγοκυτταρώνουν κατά προτίμηση τα επιμήκη σωματίδια ευκαιρία για επιλεκτική στόχευση σε οξείες φλεγμονώδεις νόσους. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Έκφραση, ρόλος και ρύθμιση των υποδοχέων Fc ουδετερόφιλων. Εμπρός. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Σημασία των τυροσινών ITAM αλυσίδας υποδοχέα fc στην ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και στην in vivo αυτοάνοση αρθρίτιδα. Εμπρός. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Ο ρόλος των πολυμορφικών μορφών ουδετερόφιλου Fc RIIa (CD32) και Fc RIIIb (CD16) στη φαγοκυττάρωση ανθρώπινων IgG1- και IgG3-οψωνισμένων βακτηρίων και ερυθροκυττάρων. Μετάγγιση. Med. Αναθ. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Οι υποδοχείς Fc ανθρώπινου ουδετερόφιλου ξεκινούν και παίζουν εξειδικευμένους μη περιττούς ρόλους σε φλεγμονώδεις ασθένειες που προκαλούνται από αντισώματα. Ασυλία, ανοσία. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Υ. et αϊ. Χημικά καθορισμένη παραγωγή ανθρώπινου αιμογενούς ενδοθηλίου και οριστικών αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Αποτελεσματική και ταχεία παραγωγή λειτουργικών ουδετερόφιλων από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα με χρήση τροποποιημένου mRNA με ETV2-. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Ο ρόλος της υποξίας στο μικροπεριβάλλον του όγκου και η ανάπτυξη καρκινικών βλαστοκυττάρων: μια νέα προσέγγιση για την ανάπτυξη θεραπείας. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux Α. et al. Επίδραση του μικροπεριβάλλοντος του υποξικού όγκου και της πλαστικότητας των καρκινικών κυττάρων στην έκφραση των σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού. Cancer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Role of protein-tyrosine kinase Syk in oxidative stress signaling in B κύτταρα. Αντιοξειδωτικά οξειδοαναγωγικό σήμα. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. Κυψελοειδής σηματοδότηση μέσω ROS και ROS. Oxidat. Med. Κύτταρο. Μακροζωία. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Μια οδός ενεργοποίησης Ras που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση Syk της πρωτεϊνικής κινάσης C. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ Η κινάση τυροσίνης SYK: Ένας κρίσιμος παράγοντας σε ποικίλες βιολογικές λειτουργίες. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Ένα νανοσύνθετο που ανταποκρίνεται σε όγκους σε μικροπεριβάλλον για αέριο υδρόθειο και δυναμική θεραπεία ενζύμων ενισχυμένης τριτροπικής μορφής. Adv. Μητήρ. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Μηχανισμοί ενεργοποίησης οξειδάσης NADPH και βακτηριακή αντίσταση. Εμπρός. Κύτταρο. Μολύνω. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Τα ουδετερόφιλα επιτρέπουν την τοπική και μη επεμβατική παροχή λιποσωμάτων σε φλεγμονώδεις σκελετικούς μυς και ισχαιμική καρδιά. Adv. Μητήρ. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et αϊ. Σύνοψη έγκρισης από τον FDA: τοσιλιζουμάμπη για τη θεραπεία του σοβαρού ή απειλητικού για τη ζωή συνδρόμου απελευθέρωσης κυτοκινών που προκαλείται από χιμαιρικούς υποδοχείς αντιγόνου Τ-λεμφοκύτταρα. Oncologist 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Σύνδρομο απελευθέρωσης κυτοκίνης και σχετική νευροτοξικότητα στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et αϊ. Τα ουδετερόφιλα προάγουν τον φαινότυπο του κακοήθους γλοιώματος μέσω του S100A4. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Ειδική για τα κύτταρα, εξαρτώμενη από την ενεργοποίηση ρύθμιση της λειτουργίας δέσμευσης προσδέματος ουδετερόφιλου CD32A. Blood https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από ανθρώπινους υποδοχείς Fc για IgG. Immunol. Σήμερα. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Ρύθμιση της τοξικότητας που μοιάζει με σύνδρομο απελευθέρωσης κυτοκίνης με τη μεσολάβηση των κυττάρων CAR T χρησιμοποιώντας προσαρμογείς χαμηλού μοριακού βάρους. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Υ. et al. Ένας νέος χιμαιρικός υποδοχέας αντιγόνου που περιέχει μια σηματοδοτική περιοχή JAK-STAT μεσολαβεί ανώτερα αντικαρκινικά αποτελέσματα. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Στόχευση της καρδιακής ίνωσης με μηχανικά Τ κύτταρα. Φύση. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-ειδικά ΝΚ κύτταρα για στοχευμένη θεραπεία γλοιοβλαστώματος. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. CAR T κύτταρα για όγκους εγκεφάλου: Διδάγματα και ο δρόμος μπροστά. Immunol. Αναθ. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Δεδομένα ασφάλειας και ενδιάμεσης επιβίωσης μετά από ενδοκρανιακή χορήγηση M032, ενός γενετικά τροποποιημένου ογκολυτικού HSV-1 που εκφράζει IL-12, σε σκύλους κατοικίδιων ζώων με σποραδικά γλοιώματα. Νευροχειρουργική. Εστίαση 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Πρόσφατες εξελίξεις και ανακαλύψεις στους μηχανισμούς και τις λειτουργίες των κυττάρων CAR T. Nat. Rev. Cancer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, Β. et αϊ. Δημιουργία υποανοσογονικών Τ κυττάρων από γενετικά τροποποιημένα αλλογενή ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, Τ. et al. Τα υποανοσογόνα παράγωγα των επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων αποφεύγουν την ανοσολογική απόρριψη σε πλήρως ανοσοεπαρκείς αλλογενείς δέκτες. Nat. Biotechnol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Δημιουργία υποανοσογονικών ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. HLA DR Η επεξεργασία του γονιδιώματος με TALEN σε ανθρώπινα iPSC παρήγαγε ανοσο-ανεκτικά δενδριτικά κύτταρα. Stem Cells Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane Α. et al. Η αντιστοίχιση MHC βελτιώνει τη μεταμόσχευση νευρώνων που προέρχονται από iPSC σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, Κ. et αϊ. Σχεδιασμός παραγόντων με βάση μηχανισμό που στοχεύουν επιλεκτικά το ανθεκτικό στα φάρμακα γλοίωμα. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Η στόχευση πολλαπλών οδών κυτταρικού θανάτου επεκτείνει τη διάρκεια ζωής και διατηρεί τη λειτουργία των ουδετερόφιλων ανθρώπων και ποντικών για μετάγγιση. Sci. Μετάφρ. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Δείκτες φθορισμού για συνεχή και ειδική για τη γενεαλογία αναφορά φάσεων κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Biotechnol. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et αϊ. Χημικά καθορισμένη παραγωγή ανθρώπινων οριστικών αιμοποιητικών βλαστικών και προγονικών κυττάρων. STAR Πρωτοκ. 4, 101953 (2023).