Επίδραση των εκχυλισμάτων Cistanche Tubulosa στην αναπαραγωγική λειτουργία των αρσενικών σε διαβητικούς αρουραίους που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη-νικοτιναμίδιο-Ⅰ

1. Εισαγωγή

Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι μια κατάσταση κατά την οποία υπάρχουν αυξημένεςεπίπεδα γλυκόζηςστο αίμα λόγω της ανεπάρκειας του παγκρέατος να παράγει αρκετή ινσουλίνη ή της αδυναμίας του οργανισμού να τη χρησιμοποιήσει αποτελεσματικά. Σύμφωνα με τον ΠΟΥ, ο αριθμός των ατόμων με διαβήτη αυξήθηκε από 108 εκατομμύρια το 1980 σε 422 εκατομμύρια το 2014 [1]. Υπάρχουν τέσσερις κύριες κατηγορίες: ο προδιαβήτης (ένα στάδιο πριν από τον διαβήτη), ο τύπος 1 (όπου το πάγκρεας αποτυγχάνει να παράγει ινσουλίνη), ο τύπος 2 (το σώμα δεν χρησιμοποιεί ινσουλίνη) και ο διαβήτης κύησης (που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης). Το οξειδωτικό στρες συμβαίνει λόγω της ανισορροπίας μεταξύ της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και των αντιοξειδωτικών [2] που τελικά οδηγεί στη διαβητική κατάσταση. Οι επιπλοκές του διαβήτη περιλαμβάνουν νεφρική ανεπάρκεια, νευρική βλάβη, τύφλωση, εγκεφαλικό επεισόδιο, καρδιακή προσβολή, εμβρυϊκό θάνατο και στειρότητα. [1]. Μελέτες δείχνουν ότι οι πυρήνες του σπέρματος, το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) και τα μιτοχόνδρια υπέστησαν σημαντική βλάβη σε άνδρες διαβητικούς ασθενείς [3]. Το οξειδωτικό στρες κατά τη μεταφορά του σπέρματος θα αλλάξει τη διαδικασία του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος [4,5].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η διαδικασία της σπερματογένεσης ελέγχεται από τον άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-γοναδική (HPG). Η ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης (GnRH) που παράγεται από τον υποθάλαμο διεγείρει την παραγωγή της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH). Τα κύτταρα Leydig βρίσκονται δίπλα στο σπερματοφόρο σωληνάριο καιπαράγουν τεστοστερόνηυπό τον έλεγχο της LH. Η FSH ενεργοποιεί την παραγωγή αντιγονοδεσμευτικής πρωτεΐνης (ABP) που βοηθά στη διέλευση της ανδρικής ορμόνης. Έτσι, η υπογονιμότητα και άλλα προβλήματα προκύπτουν κυρίως λόγω των διαταραχών που παρουσιάζονται στον άξονα HPG. Η χορήγηση του συνδυασμού στρεπτοζοτοκίνης-νικοτιναμίδης προκαλεί διαβήτη σε πειραματικούς αρουραίους. Η στρεπτοζοτοκίνη είναι μια χημική ένωση τοξική για τα κύτταρα που παράγουν ινσουλίνη στο πάγκρεας και η νικοτιναμίδη είναι μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη που προστατεύει τα κύτταρα από πλήρη βλάβη [6].

Το Cistanche tubulosa είναι ένα είδος φυτού της ερήμου γνωστό και ως "Rou Cong-Rong" [7]. Είναι ένα μη χλωροφυλλικό παρασιτικό φυτό που αναπτύσσεται κυρίως στη ρίζα του δέντρου Calotropis procera και είναι ευρέως διαδεδομένο στην άνυδρη γη του Gansu, του Qinghai, του Xinjiang, της Μογγολίας, του Ιράν και της Ινδίας. Η κοινή ονομασία του Cistanche tubulosa είναι «Υάκινθος της Ερήμου». Είναι ευρέως αποδεκτό στην κινεζική παραδοσιακή ιατρική και του έχει δοθεί το όνομα «Ginseng of the Desert». Χρησιμοποιείται ευρέως στον ιατρικό τομέα για τη θεραπεία της νοσηρής λευκόρροιας, της άφθονης μητρορραγίας, των χρόνιων νεφρικών παθήσεων, της δυσκοιλιότητας, της ανικανότητας και της στειρότητας. Χημικά συστατικά τουΤο Cistanche tubulosa αποτελείται από μη πτητικές φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(PHGs), ιριδοειδή, λιγνάνες, πτητικά έλαια, αλδιτόλες, ολιγοσακχαρίτες και πολυσακχαρίτες [8]. Οι μελέτες δείχνουν ότιεχινακοσίδηαπό αυτό το βότανο προστατεύει τους κατεστραμμένους ινοβλάστες ρυθμίζοντας τα επίπεδα ROS [9]. Αυτή η ένωση παράγει αντιοξειδωτικές, αγγειοχαλαρωτικές και αντιφλεγμονώδεις δραστηριότητες μαζί με νευροπροστασία και πρόληψη της οστεοπόρωσης [10,11].

Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση τουΕκχύλισμα Cistanche tubulosaπου περιέχει ECH για την αναπαραγωγική δυσλειτουργία του διαβητικού αρουραίου που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη-νικοτιναμίδιο.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά

Το ECH και το CTE αγοράστηκαν από την Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Ταϊβάν). Τα τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) αγοράστηκαν από την Biovision (Σαν Φρανσίσκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Οι κυτταρικές σειρές LC-540 και TM3 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Έρευνας και Ανάπτυξης της Βιομηχανίας Τροφίμων (Hsinchu, Ταϊβάν). Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) πέντε εβδομάδων αγοράστηκαν από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Το Feed Lab Diet® αγοράστηκε από την PMI Nutrition International, Inc. (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Το 2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζύλιο (DPPH) ελήφθη από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Μεθανόλη και {2-υδροξυαιθυλ)-1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES) αγοράστηκαν επίσης από τη Sigma. Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco/F12 και η τρυψίνη-EDTA ελήφθησαν από την GIBCO (Νέα Υόρκη, ΝΥ, ΗΠΑ). 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2, 5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT), διχλωρο-διϋδρο-φθοροσκεΐνη διοξική (DCFH-DA), Το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και το νιτρομπλε τετραζόλιο (ΝΒΤ) αγοράστηκαν από τη Sigma. Τα ενζυματικά κιτ γλυκόζης ελήφθησαν από το Kyokutoseiyaku, Τόκιο, Ιαπωνία. Τα κιτ ELISA ινσουλίνης αγοράστηκαν από την Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Σουηδία). Το T-PER Tissue Protein Extraction Reagent αποκτήθηκε από την Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Πολυκλωνικά αντισώματα αντι-ανθρώπου/ποντικού/ποντικού/πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β NF-κB αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Υποδοχέας κατά ποντικού/ποντικού για πολυκλωνικά αντισώματα προηγμένης γλυκοζυλίωσης (RAGE), πολυκλωνικά αντισώματα anti-Human/Mouse/Rat Star Star και μονοκλωνικά αντισώματα κυτοχρωματικού P{30}Α1 για τον άνθρωπο/ποντικό/ποντίκι αγοράστηκαν από την Gene Tex (Irvine, CA, ΗΠΑ). Πολυκλωνικά αντισώματα CYP11A1 κατά του ανθρώπου/ποντικού/αρουραίου ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Το αντιδραστήριο Easy-Blue αγοράστηκε από την Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Η αγαρόζη και ο δείκτης DNA 100 bp ελήφθησαν από την Promega, Corporation (Madison, WI, USA). Το Mini Kit Lipid Tissue RNeasy αγοράστηκε από την QIAGEN, Hilden, Γερμανία.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Μέθοδοι

2.2.1. Ανάλυση In Vitro

Κυτταρική καλλιέργεια LC{{0}} και TM3: Οι κυτταρικές σειρές LC-540 καλλιεργήθηκαν στους 37 ◦C σε μέσο Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) συμπληρωμένο με διττανθρακικό νάτριο (1,5 g/L), L-γλουταμίνη (2 mM), μη απαραίτητα αμινοξέα (0.1 mM), πυροσταφυλικό νάτριο (1.0 mM) και εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) (10%) σε Θερμοκοιτίδα 5% CO2 (CO2 incubator, Napco 5410, Taiwan). Η κυτταρική σειρά ΤΜ3 καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με γλυκόζη (4,5 g/L), πυροσταφυλικό νάτριο (0,5 mM), L-γλουταμίνη (2,5 mM), διττανθρακικό νάτριο (1,2 g/L), {{ 28}}(2-υδροξυαιθυλο)-1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES, 15 mM) και ορός εμβρύου μόσχου (FCS, 10%) ή ορός αλόγου (5%) στους 37 ◦C σε 5% θερμοκοιτίδα CO2.

Προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρωνΕχινακοσίδη (ECH): Το αντιδραστήριο 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5- βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό βιωσιμότητας των κυττάρων. Η συγκέντρωση των κυττάρων ρυθμίστηκε στα 2 χ 105 κύτταρα / mL σε μια πλάκα 96-πηγαδιού. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 20 µL ECH (αραιωµένα σε 2% του µέσου) και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ◦C σε επωαστήρα 5% CO2. Αργότερα, προστέθηκαν 100 μL αντιδραστηρίου ΜΤΤ και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ◦C υπό σκοτεινές συνθήκες. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm (αναγνώστης ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Switzerland).

Σχετική κυτταρική βιωσιμότητα (%)=[(Δείγμα στα 570 nm − Τυφό στα 570 nm)]/[(Έλεγχος στα 570 − Άδειο στα 570)] × 100.

Δοκιμασία αναγωγής Nitroblue Tetrazolium (NBT) και Δοκιμασία 2,2-διφαινυλ-1-πικρυυλυδραζυλίου (DPPH): Ο αριθμός των κυττάρων προσαρμόστηκε σε 1× 1{{1{0}}6 κύτταρα/ mL. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 mg/mL ECH, ρεσβερατρόλης (RES) και τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) (μάρτυρας) και συγκαλλιεργήθηκαν για 18 ώρες στους 37 ◦C. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 0,3 mL διαλύματος NBT (0,1 mg/mL NBT, 5% FBS και 3% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) διαλυμένο σε 10 mL DMEM) και επωάστηκαν στους 37 °C σε 5% CO2 για 1 ώρα. Μετά από φυγοκέντρηση (στα 800 χ g για 3 λεπτά) το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και προστέθηκαν 200 μL DMSO και ανακινήθηκαν για 5 λεπτά σε έναν υπερηχητικό ταλαντωτή (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 630 nm. Για τη ριζική ανάλυση DPPH, το Trolox (σε αλκοόλη 95%) λήφθηκε ως πρότυπο. Στη συνέχεια, 75 μL διαλύματος DPPH 0,5 mM αναμίχθηκαν με 25 μL δειγμάτων και αφέθηκαν να αντιδράσουν σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος για 30 λεπτά. Το μίγμα αναταράχθηκε και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 517 nm.

Ανάλυση περιεχομένου αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS): Ο αριθμός κυττάρων προσαρμόστηκε σε 2 × 105 κύτταρα/mL σε μια 12-πλάκα φρεατίου που περιέχει 2% FBS. Στη συνέχεια, 50 μL/mL ECH, RES και AGEs προστέθηκαν στην πλάκα και επωάστηκαν στους 37 ◦C για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, 20, προστέθηκε 70 -διοξεική διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) και επωάστηκε στους 37°C για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση (400 χ g, 5 λεπτά), το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Μετά, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS και τα επίπεδα του ROS προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Ταυτοποίηση και ποσοτική ανάλυση της πρωτεΐνης: Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης (T-PER). Η κυτταρική πυκνότητα ρυθμίστηκε σε 2 × 105 κύτταρα/mL σε μια πλάκα 12- φρεατίου και 50 μL/mL ECH, RES, και ένας υποδοχέας για τον ανταγωνιστή του προηγμένου τελικού προϊόντος γλυκοζυλίωσης (RAGE) και τα AGEs προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ◦C σε επωαστήρα 5% CO2 για 24 ώρες. Μετά, προστέθηκαν 400 μL T-PER, αποξέστηκαν τα κύτταρα και φυγοκεντρήθηκαν στους 125,000× g για 20 λεπτά (4 ◦C). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ◦C (-80 ◦C καταψύκτη, Nuaire, Plymouth, MN, ΗΠΑ) για περαιτέρω ανάλυση. Ένα κιτ δικινχονικού οξέος (BCA) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, 10 μL τυπικού διαλύματος κυττάρων και 200 ​​μL αντιδραστηρίου BCA προστέθηκαν σε τρυβλία φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ◦C σε επωαστήρα 5% CO2 για 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 562 nm. Η ανάλυση ταυτοποίησης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS)-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Τα δείγματα παρασκευάστηκαν με την προσθήκη προϊόντος λύσης πρωτεΐνης σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης πρωτεΐνης και πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος western για την ανίχνευση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών.

2.2.2. Ανάλυση In Vivo

Σχεδιασμός μοντέλου ζώου: Εξήντα αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley (SD) εβδομάδων {{0} αγοράστηκαν από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Κάθε αρουραίος στεγάστηκε ξεχωριστά σε απολυμαντικά κλουβιά από ανοξείδωτο χάλυβα υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (23 ± 1 ◦C) και υγρασία (40–60%) με κύκλο φωτός 12 ωρών/12 ωρών σκότους. Τροφή και νερό παρείχαν κατά βούληση. Κάθε αρουραίος εξημερώθηκε την πρώτη εβδομάδα και δόθηκε εργαστηριακή δίαιτα τρωκτικών 5001 ως κύρια δίαιτα. Όλες οι διαδικασίες ακολουθούσαν το πρότυπο της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC Approval No. 101026) του Εθνικού Πανεπιστημίου Ωκεανών της Ταϊβάν, Ταϊβάν. Μετά την εξημέρωση, οι αρουραίοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: την ομάδα ελέγχου (Con) η οποία τράφηκε με εργαστηριακή δίαιτα 5001 και τη διαβητική ομάδα που έλαβε δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD, 40%) για ολόκληρο το πείραμα. Αφού τράφηκαν με το HFD για 4 εβδομάδες, στους αρουραίους της διαβητικής ομάδας εγχύθηκε στρεπτοζοτοκίνη (65 mg/kg) (STZ) για να προκληθεί σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ). Εντός 15 λεπτών από την ένεση του STZ, ενέθηκε νικοτιναμίδιο (230 mg/Kg σωματικού βάρους). Μια εβδομάδα μετά την ένεση, διεξήχθη από του στόματος δοκιμασία ανοχής γλυκόζης (OGTT) για να προσδιοριστεί η επιτυχής πρόκληση σακχαρώδους διαβήτη (ΣΔ). Μετά από αυτό, τα ζώα χωρίστηκαν σε έξι ομάδες: τον έλεγχο (ταΐστηκαν με εργαστηριακή δίαιτα 5001). Ομάδα DM (DM + 45% HFD); Ομάδα DMR (DM + ροσιγλιταζόνη: 0,571 mg/kg ΣΒ) + 45% HFD; Ομάδα DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg ΣΒ) + 45% HFD; Ομάδα DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg ΣΒ) + 45% HFD; και ομάδα DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg ΣΒ) + 45% HFD. Ως θετικός μάρτυρας λήφθηκε η ροσιγλιταζόνη (RSG). Τρεις δόσεις CTE (80, 160 και 320 mg/kg) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τη σύσταση των οδηγιών αξιολόγησης της λειτουργικής αξιολόγησης υγιεινών τροφών της Υπηρεσίας Τροφίμων και Φαρμάκων της Ταϊβάν (TFDA). Δόθηκαν θεραπείες μέχρι το τέλος του πειράματος. Όλοι οι πειραματικοί αρουραίοι θυσιάστηκαν μετά από 6 εβδομάδες. Το αίμα που συλλέχθηκε από τους αρουραίους φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για 15 λεπτά στους 4◦C. Το υπερκείμενο εξετάστηκε για την ακόλουθη ανάλυση:

Προσδιορισμός ολικής γλυκόζης, τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης: Ο προσδιορισμός της γλυκόζης πραγματοποιήθηκε με ενζυμικά κιτ γλυκόζης. Στη συνέχεια, 20 μL δειγμάτων πλάσματος αίματος προστέθηκαν στα αντιδραστήρια και διατηρήθηκαν στους 37 ◦C για 5 λεπτά. Τα ολικά τριγλυκερίδια και η συγκέντρωση ολικής χοληστερόλης προσδιορίστηκαν με χρήση ενζυματικών κιτ τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης. Στη συνέχεια, 10 μL πλάσματος αίματος προστέθηκαν στα αντιδραστήρια και το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 510 nm.

Ολική γλυκόζη/τριγλυκερίδιο/χοληστερόλη πλάσματος (mg/dL)=(Δείγμα − ABlank)/(Κανονικό − ABlank) × 200.

Δείγμα: Απορρόφηση δειγμάτων αίματος, ABlank: Τιμή απορρόφησης κιτ χωρίς δείγμα, Πρότυπο: Τιμή απορρόφησης του τυπικού αντιδραστηρίου, 200: τυπικά αντιδραστήρια σε συγκέντρωση 200 mg/dL.

Αξιολόγηση ινσουλίνης, λεπτίνης και ομοιοστατικού μοντέλου – Προσδιορισμός αντίστασης στην ινσουλίνη (HOMA-IR):Το επίπεδο ινσουλίνης προσδιορίστηκε με κιτ ELISA ινσουλίνης. Εδώ, 25µL πλάσματος αίματος προστέθηκε στοαντιδραστήρια, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Η συνολική περιεκτικότητα σε λεπτίνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ακιτ ανοσομετρικής ανάλυσης ενζύμου λεπτίνης.Μετά, 100µΤο L του πλάσματος αναλύθηκε και η απορρόφησημετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA. Το όλο πείραμα διεξήχθη σύμφωνα μεοδηγίες του κατασκευαστή. Η τιμή HOMA-IR προσδιορίστηκε από το μοντέλο ομοιόστασηςεξίσωση αξιολόγησης=Συγκέντρωση ινσουλίνης πλάσματος νηστείας (mg/mL)× γλυκόζη πλάσματος νηστείαςσυγκεντρώσεις (mmol/L)/22,5.

Υπεροξείδωση λιπιδίων πλάσματος: Εδώ, {{0}}.5 mL πλάσματος αίματος αναμίχθηκαν με 1 mL αντιδραστηρίου (15%, w/v τριχλωροξικό οξύ σε 0.25 N υδροχλωρικό οξύ (HCl ) και 0,375%, w/v θειοβαρβιτουρικό οξύ σε 0,25 Ν HCl) και τοποθετήθηκαν σε λουτρό νερού (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Switzerland) στους 100 °C για 15 λεπτά. Μετά από ψύξη, προστέθηκε 1 mL η-βουτανόλης, ανακινήθηκε έντονα και φυγοκεντρήθηκε στα 1500 x g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 532 nm [12].

Συγκέντρωση μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) (nM/mL)=[(Ένα δείγμα στα 532 nm − Άδειο στα 532 nm)/ (Ένα πρότυπο στα 532 nm − Άδειο στα 532 nm)] × 5.

στάνταρ στα 532 nm − Άδειο στα 532 nm)] × 5. Προσδιορισμός των επιπέδων τεστοστερόνης πλάσματος και ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH): Το κιτ ELISA τεστοστερόνης χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του επιπέδου τεστοστερόνης στο πλάσμα του αίματος. Το κιτ RIA χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης LH. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 μL πλάσματος και οι υπολογισμοί βασίστηκαν στη συγκέντρωση της ορμόνης LH-RP-3 (πρότυπο). Τα περαιτέρω βήματα έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Προσδιορισμός Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (TNF)- και συγκέντρωση ιντερλευκίνης-6 (IL-6): Το αντίσωμα που συλλαμβάνεται αραιώθηκε 250 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, προστέθηκε σε 96- πλάκα φρεατίου (100 µL/φρεάτιο) και διατηρήθηκε στους 4 ◦C για όλη τη νύχτα. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (1 φορά PBS, 0,05% Tween 20). Μετά από επώαση (1 ώρα) με 200 μg αραιωτικού προσδιορισμού, τα κύτταρα πλύθηκαν 5 φορές με ρυθμιστικό έκπλυσης και 100 μL πρότυπου διαλύματος TNF- ή δειγμάτων δοκιμής προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 2 ώρες. Μετά το πλύσιμο, προστέθηκαν 100 μL αντισωμάτων που ανιχνεύθηκαν με IL-6- και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε 5 φορές. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 480 μL ενζύμου υπεροξειδάση αβιδίνης-χρένο (HRP) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε πέντε φορές με ένα ρυθμιστικό έκπλυσης. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 100 μL διαλύματος υποστρώματος και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αργότερα, 50 μL διαλύματος τερματισμού (1Μ φωσφορικό οξύ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ανάλυση Παραμέτρων Σπέρματος και Όρχεων

Συλλογή δειγμάτων σπέρματος: Η συλλογή δειγμάτων σπέρματος πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως στο [13]. Το σπέρμα συλλέχτηκε από το υπερκείμενο και χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Ο αριθμός των σπερματοζωαρίων, η κινητικότητα του σπέρματος και το μη φυσιολογικό σπέρμα: Ο αριθμός των σπερματοζωαρίων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το αιμοκυτταρόμετρο και το διάλυμα μπλε τρυπανίου. Στη συνέχεια, 100 μL υγρού σπέρματος αναμίχθηκαν με διάλυμα μπλε τρυπανίου και ο αριθμός των σπερματοζωαρίων, η κινητικότητα και το ανώμαλο σπέρμα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο και μικροσκόπιο [14].

Nitro blue Tetrazolium NBT Reduction and Lipid Hyperoxidation of Sper and Orders: Η υπεροξείδωση των λιπιδίων και η μείωση του NBT αναλύθηκαν σύμφωνα με την ίδια διαδικασία ανάλυσης πλάσματος.

Προσδιορισμός της Δισμουτάσης Υπεροξειδίου (SOD) και Δραστικότητας Καταλάσης: Η δραστικότητα της Δισμουτάσης Υπεροξειδίου (SOD) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RANSEL. Εδώ, {{0}}.05 mL ομογενοποιημάτων όρχεων προστέθηκαν σε 1,7 mL διαλύματος αντίδρασης (0.05 mM ξανθίνη, 0,025 mM 2-({ {9}}ιωδοφαινυλ)- 3-(4-νιτροφαινόλη)-5-χλωριούχο φαινυλτετραζόλιο (INT)). Μετά την ανάμιξη, προστέθηκαν 0,25 mL οξειδάσης ξανθίνης (80 U/L) και αντέδρασαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 δευτερόλεπτα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 505 nm. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του ομογενοποιήματος των όρχεων προσδιορίστηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad DC και υπολογίστηκε η ειδική δράση του (U/mg πρωτεΐνης). Η δραστικότητα της καταλάσης (CAT) προσδιορίστηκε σύμφωνα με μια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [15].

Χρώση H&E (αιματοξυλίνη και ηωσίνη).

Ο όρχις εμποτίστηκε σε 10% φορμαλίνη για 24 ώρες και αποθηκεύτηκε στους 4 ◦C. Οι ιστοί ήταν μικρού μεγέθους και προσαρτήθηκαν στη διαφάνεια. Μετά τη στερέωση (95% μεθανόλη + 5% οξικό οξύ), οι αντικειμενοφόρες πλάκες βυθίστηκαν σε αιματοξυλίνη για 3 λεπτά, πλύθηκαν με τρεχούμενο νερό για 5 λεπτά και στη συνέχεια εμποτίστηκαν με 50%, 70% και 90% αλκοόλ για ένα λεπτό. Μετά από αυτό, οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν με ηωσίνη για 10 δευτερόλεπτα και εμποτίστηκαν σε αλκοόλη 100% για ένα λεπτό μέχρι να ξεθωριάσει. Τέλος, η αντικειμενοφόρος πλάκα εμποτίστηκε σε ξυλόλιο για ένα λεπτό. Αργότερα, η τσουλήθρα στέγνωσε στον αέρα και σφραγίστηκε. Ο χρωματισμένος σωλήνας τοποθετήθηκε σε ένα μικροσκόπιο αντίθεσης ανεστραμμένης φάσης (Μικροσκόπιο Διαφοράς Ανεστραμμένης Φάσης, Olympus CK-2, Τόκιο, Ιαπωνία) για να παρατηρηθεί η μορφολογία.

Ανάλυση του Υποθαλάμου

Οι αλληλουχίες γονιδίων KISS1, συζευγμένου με πρωτεΐνη G υποδοχέα (GPR) 54, καταστολέα της σηματοδότησης κυτοκίνης 3 (SOCS{4}}) και sirtuin 1 (SIRT1) αναγνωρίστηκαν από τη βάση δεδομένων γονιδίων NCBI (Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας). και ένα συγκεκριμένο αστάρι σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας το Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Εκχύλιση ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) από τον υποθάλαμο. Η εξαγωγή του RNA από τον υποθάλαμο του εγκεφάλου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Τα ληφθέντα mRNA μετρήθηκαν ποσοτικά με αντίστροφη μεταγραφή (RT) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Το συμπληρωματικό DNA που ελήφθη από την ανάλυση RT αποθηκεύτηκε στους -20 ◦C για μελλοντική χρήση. Το εκχυλισμένο DNA υποβλήθηκε σε ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας πολυμεράση Taq. Στη συνέχεια, ελήφθησαν 5~10 μL του προϊόντος PCR και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε κολλοειδές άγαρ 1,5%. Η εικόνα λήφθηκε σε σύστημα απεικόνισης UVP BioDoc-It. Ελήφθη αντίστροφα μεταγραφόμενο συμπληρωματικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (cDNA) και πραγματοποιήθηκε PCR χρησιμοποιώντας το κιτ IQ SYBR Green Supermix. Αργότερα, αναλύθηκε με το λογισμικό οπτικού συστήματος iQTM 5. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης (T-PER). Στη συνέχεια, 20 mg ομογενοποιήματος όρχεων προστέθηκαν σε 400 μL T-PER και φυγοκεντρήθηκαν (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germany) στους 4 ◦C (125,000× g ) για 20 λεπτά. Η ακόλουθη μέθοδος ήταν παρόμοια με την "ανάλυση ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης της πρωτεΐνης" σε in vitro ανάλυση.

2.3. Στατιστική ανάλυση

Τα πειραματικά αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (Μέση ± SD) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Πολλαπλές συγκρίσεις διαφορετικών ομάδων αναλύθηκαν με τη δοκιμή Duncan στην τιμή p < 0,05 ως το σημαντικό επίπεδο.

3. Αποτελέσματα

3.1. Ανάλυση In Vitro

3.1.1. Σύγκριση Αντιοξειδωτικών Δραστηριοτήτων ECH, CTE και RES

Μακροπρόθεσμη ηΤο υψηλό οξειδωτικό στρες και η χρόνια φλεγμονή είναι οι κύριες αιτίες του διαβητικούεπιπλοκές [16]. Τα CTE περιέχουν διάφοραφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες όπως η εχινακοσίδη(ECH) και ακτεοσίδημε δυνατότητα αντιοξειδωτικής δράσης [17]. Καθαρισμός ριζών DPPHδιεξήχθη ανάλυση για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης του ECH. Trolox και ρεσβερατρόλη(3,5,4'-τριυδροξυστιλβένιο, RES) ελήφθησαν ως πρότυπο και θετικός έλεγχος αντίστοιχα. Οπως φαίνεταιστο Σχήμα1, το ECH έδειξε καλύτερη δράση δέσμευσης ριζών και η δραστικότητα ήταν σημαντικά υψηλότερηαπό αυτό του θετικού μάρτυρα (ΑΠΕ).

3.1.2. Βιωσιμότητα κυττάρων ECH σε κύτταρα LC-540 και TM3 Leydig

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ΜΤΤ για την αξιολόγηση της κυτταρικής βιωσιμότητας διαφορετικών συγκεντρώσεων ECH. Τα κύτταρα LC-540 Leydig και τα κύτταρα TM3 Leydig έδειξαν περισσότερο από το 80% βιωσιμότητα μετά από θεραπεία με ECH (Εικόνα 2). Σε σύγκριση με τις άλλες συγκεντρώσεις, μια συγκέντρωση 100-μΜ (αραιώσεις 100 μΜ σε 2% FBS) του ECH έδειξε καλύτερη κυτταρική βιωσιμότητα σε κύτταρα TM3 Leydig. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η αυξημένη συγκέντρωση ECH δεν συνεισφέρει κάποια σημαντική τοξικότητα στα κύτταρα.

3.1.3. Επίδραση της ECH στην παραγωγή υπεροξειδίου που προκαλείται από AGE με ανάλυση NBT σε κύτταρα LC-540 και TM3 Leydig

Τα AGE προκαλούν οξειδωτική βλάβη στο σώμα λόγω της οξείδωσης της γλυκόζης και του σχηματισμού ελεύθερων ριζών όπως το Ο2-, οι ρίζες υδροξυλίου και οι ομάδες καρβονυλίου [18]. Αφού διεγέρθηκαν με 50 ug/mL AGEs, τα κύτταρα LC-540 (Εικόνα 3α) και TM3 (Εικόνα 3β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ECH και RES (5 μΜ και 10 μΜ το καθένα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου αυξήθηκε στην ομάδα ελέγχου (διεγερμένα AGEs), αλλά η παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου μειώθηκε μετά την ομάδα ελέγχου (διεγερμένα AGEs), αλλά η παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου μειώθηκε μετά την παραγωγή υπεροξειδίου και προστατευμένη τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη. Στην περίπτωση των κυττάρων LC-540, 10 μΜ ECH έδειξε σχεδόν παρόμοια δραστηριότητα με την κανονική ομάδα. Η παραγωγή υπεροξειδίου και στα δύο κύτταρα μειώθηκε με αύξηση της συγκέντρωσης τόσο του ECH όσο και του RES.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Επίδραση της ECH στην παραγωγή H2O2 σε κύτταρα LC-540 Leydig που διεγείρονται με AGE

Η δοκιμασία DCFH-DA εκτελέστηκε για την ανίχνευση της παρουσίας οξειδωτικών ειδών. Αφού εισέλθει στα κύτταρα, η φθορίζουσα χρωστική DCFH-DA οξειδώνεται από το ενδοκυτταρικό H2O2 και σχηματίζει διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCF). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, υπήρξε σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική παραγωγή H2O2 στην ομάδα που διεγείρεται από AGE (έλεγχος) ενώ η προσθήκη 10 μM ECH και RES μείωσε σημαντικά την παραγωγή H2O2 στα κύτταρα. Η χορήγηση 10 μΜ ECH είχε ως αποτέλεσμα μόνο το 47,1% περίπου της παραγωγής H2O2, σημαντικά χαμηλότερο από ό,τι στην ομάδα ελέγχου.

3.1.5. Επίδραση της ECH στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RAGE και NF-κB σε κύτταρα LC-540 Leydig που διεγείρονται με AGE

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western για να επιβεβαιωθεί η παρουσία RAGE σε κύτταρα LC-540 Leydig. Η επίδραση της ECH στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RAGE (Εικόνα 5α) και NF-κB (Εικόνα 5β) σε κύτταρα Leydig που διεγείρονται από AGEs φαίνονται στο Σχήμα 5. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγκέντρωση 50 μg/mL των AGEs προκάλεσε υψηλότερη RAGE και NF- Η έκφραση κΒ σε κύτταρα LC-540 Leydig και η συγκέντρωση 10 μΜ ECH και RES μείωσαν σημαντικά την έκφραση των RAGE και NF-κB. Η έκφραση του NF-κB ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε RES και ECH από ότι στους ανταγωνιστές RAGE. Έτσι, τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η ECH μείωσε το επίπεδο της φλεγμονής μειώνοντας το επίπεδο RAGE και NF-κB.

3.1.6. Επίδραση της ECH στο μονοπάτι σύνθεσης τεστοστερόνης σε κύτταρα LC{4}} Leydig που διεγείρονται με AGE.

Η διαδικασία της σπερματογένεσης και της ανδρικής υπογονιμότητας εξαρτάται από την παρουσία τεστοστερόνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, οι εκφράσεις των πρωτεϊνών StAR (Εικόνα 6α), CYP11A1 (Εικόνα 6β), CYP17A1 (Εικόνα 6γ) και HSD17 3 (Εικόνα 6δ) μειώθηκαν σημαντικά σε διεγερμένη από AGE LC{11 }} Κελιά Leydig (ομάδα ελέγχου). Οι εκφράσεις των πρωτεϊνών Star, CYP11A1, CYP17A1 και HSD17 3 αυξήθηκαν σημαντικά όταν προστέθηκαν ο ανταγωνιστής RAGE, RES και ECH. Η αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών Star και CYP11A1 παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες που έλαβαν θεραπεία με ECH και RES. Το επίπεδο έκφρασης του CYP17A1 ήταν σχεδόν παρόμοιο στις ομάδες RES και ECH. Οι εκφράσεις της πρωτεΐνης HSD17 3 σε κύτταρα Leydig που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ECH ήταν πολύ υψηλότερες από εκείνες των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ανταγωνιστές RES και RAGE. Η αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών Star, CYP11A1, CYP17A1 και HSD17 3 έδειξε τη φυσιολογική παραγωγή τεστοστερόνης.