Το Cistanche Tubulosa προστατεύει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες μέσω της ρύθμισης της απόπτωσης και του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από νευρογλοιακά κύτταρα: in Vivo και in vitro-Ⅱ

Τεστ Συμπεριφοράς

Δοκιμή κολύμβησης (Zhu et al., 2014)

Ο συντονισμός της κίνησης του σώματος σε ποντίκια μετρήθηκε με Swimming test. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε μια δεξαμενή νερού (25 cm ύψος και 10 cm σε διάμετρο) που περιείχε 10 cm νερό και δοκιμάστηκαν σε ένα ήσυχο περιβάλλον για να καταγραφεί η ακίνητη διάρκειά τους για 5 λεπτά.

Open Field Test (Kawai et al., 1998)

Η κινητική δραστηριότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή ανοιχτού πεδίου. Τα ποντίκια δοκιμάστηκαν σε ένα ήσυχο και χαμηλό φωτισμένο περιβάλλον και τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε ένα διαφανές ακρυλικό δοχείο 30 cm × 30 cm × 15 cm με διαχωριστικό πλέγμα 6 cm × 6 cm στο κάτω μέρος. Στα ποντίκια δόθηκε 10 λεπτά για να προσαρμοστούν στο περιβάλλον και στη συνέχεια μετρήθηκε η περιπλάνηση του αριθμού πλέγματος και η συχνότητα εκτροφής μεμονωμένων ποντικών πέντε συνεχόμενες φορές για να ληφθούν μέσες τιμές.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Δειγματοληψία εγκεφαλικού ιστού

Πριν από τη δειγματοληψία ιστού, τα ποντίκια τράφηκαν κατά βούληση με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και έλαβαν φαρμακευτική παρέμβαση για 14 συνεχόμενες ημέρες. Επιλέχθηκαν τέσσερα ποντίκια σε κάθε ομάδα και αποκεφαλίστηκαν γρήγορα. Το SN (Bregma: −2,75 mm −2,92 mm) από κάθε ζώο απομονώθηκε και τοποθετήθηκε σε πάγο. Οι ιστοί του εγκεφάλου ξεπλύθηκαν με 0,9% παγωμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου για την απομάκρυνση τυχόν αίματος και στέγνωσαν σε διηθητικό χαρτί πριν φυλαχτούν στους -80◦C. Τέσσερα ποντίκια από κάθε ομάδα αναισθητοποιήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά και το στήθος τους άνοιξε. Στη συνέχεια, μια βελόνα έγχυσης εισήχθη στην αριστερή κοιλία κάθε ζώου. Για να αφαιρεθεί το αίμα στο κυκλοφορικό σύστημα, κόπηκε το προσάρτημα του δεξιού κόλπου και εγχύθηκε στο ζώο φυσιολογικός ορός 4°C έως ότου το ήπαρ έγινε ωχρό για να εξασφαλιστεί η διαδοχική αιμάτωση. Μόλις το απόβλητο του δεξιού κόλπου έγινε διαυγές, κάθε ζώο εγχύθηκε με 4% σταθεροποιητικό παραφορμαλδεΰδης. Μετά την έγχυση, ο εγκεφαλικός ιστός κάθε ζώου στη συνέχεια αποκόπηκε προσεκτικά και σταθεροποιήθηκε εκ των υστέρων σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 24 ώρες. Οι σταθεροποιημένοι εγκεφαλικοί ιστοί στη συνέχεια ξεπλύθηκαν υπό τρεχούμενο νερό, αφυδατώθηκαν σε μια διαβαθμισμένη σειρά διαλυμάτων αιθανόλης και καθαρίστηκαν σε διάλυμα ξυλολίου. Ακολούθησε εμβάπτιση και εμφύτευση παραφίνης.

Αλλαγές της ποσότητας DA που μετρήθηκε με HPLC

Το SN με νανοσκόνη από κάθε ομάδα τοποθετήθηκε σε λουτρό πάγου που περιείχε 0,9% διάλυμα χλωριούχου νατρίου (αναλογία 1:9). Ο εγκεφαλικός ιστός ομογενοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό διαταράκτη κυττάρων και φυγοκεντρήθηκε στις 1200 rpm για 20 λεπτά στους 4°C για να ληφθεί το υπερκείμενο. Για HPLC, χρησιμοποιήθηκε στήλη Hypersil AA-ODS (2,1 mm x 200 mm, 5 μm) σε θερμοκρασία στήλης 30°C. Η ανίχνευση φθορισμού πραγματοποιήθηκε στα 280 nm λex και 340 nm λem. Ο όγκος της ένεσης ήταν 10 μL.

Έκφραση TH, GDNF, GFR 1 και Ret που ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία

Τομές παραφίνης (πάχους 5 μm) μεμονωμένου εγκεφαλικού ιστού απομονώθηκαν από κάθε ζώο και τοποθετήθηκαν σε λουτρό ζεστού νερού 40◦ για ισοπέδωση και πρόσφυση σε γυάλινες πλάκες. Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν σε φούρνο 60°C για 3-6 ώρες, ακολουθούμενη από αποκήρωση με ξυλόλιο, βαθμιδωτή αφυδάτωση με αιθανόλη και ανάκτηση αντιγόνου με επώαση σε ρυθμιστικό κιτρικού οξέος και θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων για 20 λεπτά. Τα πλακίδια ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν σε διάλυμα H2O2 3% σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Αφού πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS, τα πλακίδια ιστού επωάστηκαν με κανονικό ορό σε κλειστό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Η ανοσοϊστοχημική χρώση διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένας αναλυτής εικόνας Motic Med 6.0 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της τιμής της ενσωματωμένης οπτικής πυκνότητας στα θετικά χρωματισμένα κελιά.

Ανάλυση Western Blot σε ιστούς εγκεφάλου ποντικών

Αυτή η μελέτη αξιολόγησε την έκφραση πρωτεΐνης υδροξυλάσης τυροσίνης (TH), GDNF, GFR 1, Ret, Bcl2 και Bax. Το προϊόν λύσης εγκεφάλου από κάθε ομάδα ομογενοποιήθηκε για 3{{1{0}} λεπτά σε πάγο, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση σε χαμηλή θερμοκρασία, 20,000 rpm, στους 4 ◦C για 5 λεπτά για τη συλλογή του υπερκειμένου. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν υπό σταθερή πίεση χρησιμοποιώντας ένα πήκτωμα 10% SDS-PAGE όπως περιγράφεται παραπάνω. Η συγκέντρωση πρωτογενούς αντισώματος: TH 0,15 mg/ml, GDNF 0,5 mg/ml, GFR 1 0,8 mg/ml, Ret 0,63 mg/ml, Bcl-2 0,34 mg/ml και Bax 0,11 mg/ml. Η διαδικασία ήταν η ίδια με την παραπάνω.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI AGING ANTI-ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Στατιστική ανάλυση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε στατιστικό λογισμικό SPSS 20.0 για επεξεργασία και ανάλυση δεδομένων. Οι τιμές των παραμέτρων εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (¯x ± S). Η ANOVA χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση δεδομένων ενός παράγοντα. Το LSD ή το τεστ Games-Howell χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των ομάδων. Π< 0.05 (or P < 0.01) was considered as a statistically significant difference.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα ενεργά συστατικά της νανοσκόνης C. tubulosa

Στο εύρος της σάρωσης 200–400 nm, το ECH στο C. tubulosa και το VER στα 330 nm είχαν τη μέγιστη κορυφή απορρόφησης, η οποία εμφανίστηκε μέσα σε 20 λεπτά. Το ICA είχε μέγιστες κορυφές απορρόφησης στα 270 nm και εμφανίστηκε μετά από 20 λεπτά (Εικόνα 1Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αρνητικά δείγματα δεν παρενέβησαν στην ανίχνευση (Εικόνα 1Β). Τα δείγματα και ο έλεγχος είχαν τις ίδιες χρωματογραφικές κορυφές και το αρνητικό δείγμα δεν είχε καμία. Αυτό έδειξε ότι τα άλλα συστατικά του δείγματος δεν επηρέασαν το συστατικό που μετρήθηκε. Επιπλέον, τα τρία συστατικά και οι γειτονικές κορυφές μπορούν να φτάσουν στη γραμμή βάσης διαχωρισμού και ο βαθμός διαχωρισμού ήταν μεγαλύτερος από 1,5.

C. tubulosa Nanopowder Μειωμένη MPP+ -Επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα MES23.5

Η βιωσιμότητα των κυττάρων MES23.5 μειώθηκε σημαντικά με τις αυξανόμενες συγκεντρώσεις MPP+. Το Σχήμα 2F δείχνει τη σημαντική κυτταροτοξικότητα διαφορετικών συγκεντρώσεων MPP+.

Η νανοσκόνη C. tubulosa μείωσε την επαγόμενη από MPP+-κυτταροτοξικότητα και ενίσχυσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων MES23.5. Το Σχήμα 2G δείχνει ότι οι δόσεις νανοσκόνης C. tubulosa 10–250 μg/mL άσκησαν δοσοεξαρτώμενα προστατευτικά αποτελέσματα στα κύτταρα MES23.5 που έλαβαν θεραπεία με MPP+-.

Κυτταρομορφολογική Επίδραση Νανοσκόνης C. tubulosa

Τα κανονικά κύτταρα MES23.5 είχαν καλή κυτταρική προσκόλληση και είχαν σχήμα ατράκτου με σαφή κυτταρικά όρια και συνάψεις. Το MPP+-τα κατεστραμμένα κύτταρα MES23.5 εμφάνισαν κακή κυτταρική προσκόλληση και συρρίκνωση και πολλά αιωρήθηκαν στα μέσα με συσταλμένες συνάψεις. Αυτά τα κύτταρα συσσωματώθηκαν, συρρικνώθηκαν και στρογγυλά με κενοτόπια μέσα και οι πυρήνες διαλύθηκαν ή κατέρρευσαν. Η νανοσκόνη C. tubulosa σε διαφορετικές δόσεις βελτίωσε την κυτταρομορφολογία των κυττάρων MES23.5 σε διαφορετικούς βαθμούς βελτιώνοντας την κυτταρική προσκόλληση και τη συναπτική κάθαρση της ομάδας του φορέα. Τα κύτταρα MES23.5 στην ομάδα θεραπείας με υψηλή δόση C. tubulosa έδειξαν μορφολογία παρόμοια με την κανονική ομάδα ελέγχου (Εικόνες 2Α-Ε).

Επίδραση της Νανοσκόνης C. tubulosa στην Έκφραση TH και την απόπτωση στα κύτταρα

Το Σχήμα 3 δείχνει μια σημαντική μείωση στην έκφραση πρωτεΐνης ΤΗ στην ομάδα φορέα. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΤΗ αυξήθηκε διαφορετικά σε ομάδες που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικές δόσεις C. tubulosa. Ωστόσο, το τεστ LSD έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων που έλαβαν θεραπεία.

Το Σχήμα 4 δείχνει τα αποτελέσματα της αξιολόγησης της απόπτωσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό απόπτωσης στην ομάδα του φορέα ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό,τι στις άλλες ομάδες. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις νανοσκόνης C. tubulosa εμφάνισαν διαφορετικούς βαθμούς μείωσης στον αποπτωτικό ρυθμό σε σύγκριση με την ομάδα του φορέα. Τα κύτταρα στη μέση και υψηλής δόσης ομάδα θεραπείας με C. tubulosa είχαν την πιο σημαντική βελτίωση στον αποπτωτικό ρυθμό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες θεραπείας με C. tubulosa. Η δοκιμή LSD έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων που έλαβαν θεραπεία, αλλά σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας χαμηλής δόσης επίσης.

Επίδραση της νανοσκόνης C. tubulosa στην έκφραση της πρωτεΐνης Bcl2/Bax στα κύτταρα

Το Σχήμα 5 δείχνει ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Bcl2 στα κύτταρα της ομάδας φορέα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, η έκφραση της πρωτεΐνης Bax στα κύτταρα της ομάδας φορέα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό,τι στην κανονική ομάδα ελέγχου. Οι ομάδες θεραπείας με C. tubulosa έδειξαν αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης Bcl2 και μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης Bax σε κύτταρα MES23.5 που έλαβαν θεραπεία με MPP+-. Μεταξύ των τριών ομάδων που έλαβαν θεραπεία, υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο τεστ LSD. Αυτές οι επιδράσεις ήταν δοσοεξαρτώμενες.

Τεστ Συμπεριφοράς

Τα αποτελέσματα του τεστ Κολύμβησης έδειξαν ότι τα ποντίκια στην ομάδα του οχήματος είχαν σχετικά μεγάλες ακίνητες διάρκειες, οι οποίες αυξήθηκαν με την πάροδο του χρόνου. Την ημέρα 14, τα ποντίκια στην ομάδα του φορέα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη διάρκεια ακινητοποίησης από τα ποντίκια στην κανονική ομάδα ελέγχου. Η ακίνητη διάρκεια των ποντικών μέσα

τη χαμηλή δόσηC. tubulosaΗ ομάδα θεραπείας δεν διέφερε σημαντικά από εκείνη των ποντικών στην ομάδα φορέα. Ωστόσο, η στάσιμη διάρκεια των ποντικών στην ομάδα θεραπείας υψηλής δόσης C. tubulosa ήταν σημαντικά μικρότερη από αυτή των ποντικών στην ομάδα φορέα.

Τα αποτελέσματα της δοκιμής ανοιχτού πεδίου υποδηλώνουν ότι μετά από βλάβη που προκλήθηκε από MPTP στα ποντίκια, τα ποντίκια στην ομάδα οχήματος παρουσίασαν σημαντική μείωση στην ικανότητά τους για αυθόρμητη δραστηριότητα, όπως φαίνεται από τη συχνότητα εκτροφής. Μετά από μια 14-ημέρα διαχείριση τουΝανοσκόνη C. tubulosa, τα ποντίκια στις ομάδες θεραπείας μέτριας και υψηλής δόσης είχαν σημαντικά υψηλότερες συχνότητες εκτροφής σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα οχήματος (Εικόνες 6Α, Β).

Επίδραση της νανοσκόνης C. tubulosa στο περιεχόμενο DA σε ποντίκια

Οι αλλαγές στο περιεχόμενο DA του SN προσδιορίστηκαν με HPLC. Διαπιστώθηκε ότι η περιεκτικότητα σε DA στον εγκέφαλο της ομάδας του οχήματος μειώθηκε σημαντικά. Η περιεκτικότητα σε DA στους εγκεφάλους ποντικών PD στην ομάδα θεραπείας με χαμηλή δόση C. tubulosa δεν διέφερε σημαντικά από τα ποντίκια στην ομάδα φορέα. Ωστόσο,Θεραπεία C. tubulosaαύξησε τα επίπεδα DA στους εγκεφάλους ποντικών με PD κατά τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Οι εγκέφαλοι ποντικών PD που έλαβαν αγωγή με υψηλή δόση C. tubulosa είχαν σημαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα σε DA από τους εγκεφάλους ποντικών στην ομάδα φορέα (Εικόνα 6C).

Επίδραση της νανοσκόνης C. tubulosa στην έκφραση TH σε ποντίκια

Ο αριθμός των TH-θετικών κυττάρων και το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης TH στο SN των ποντικών PD που προκαλούνται από MPTP ήταν χαμηλότερα σε σύγκριση με τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου. Μετά τη θεραπεία με C. tubulosa, ο αριθμός των TH-θετικών κυττάρων και το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης TH στο SN των ποντικών PD που προκλήθηκαν από MPTP αυξήθηκαν, με σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας θεραπείας υψηλής δόσης C. tubulosa και της ομάδας φορέα με δοκιμή LSD? και υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων που έλαβαν θεραπεία (Εικόνα 7).

Επίδραση της νανοσκόνης C. tubulosa στην έκφραση πρωτεΐνης του GDNF και των υποδοχέων του, GFR 1 και Ret σε ποντίκια

Η έκφραση πρωτεΐνης του GDNF και των υποδοχέων του, GFR 1 και Ret, στα θετικά χρωματισμένα κύτταρα, αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Χρησιμοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης στο SN των διαφορετικών ομάδων ποντικών. Τα ευρήματα για τις διαφορετικές ομάδες ήταν παρόμοια χρησιμοποιώντας τις δύο μεθόδους ανίχνευσης. Η έκφραση του GDNF και των πρωτεϊνών του υποδοχέα του, GFR 1 και Ret, σε θετικά χρωματισμένα κύτταρα στο SN των ποντικών στην ομάδα φορέα, ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι στα ποντίκια της φυσιολογικής ομάδας ελέγχου. Διαφορετικές δόσεις θεραπείας με C. tubulosa αύξησαν τον αριθμό των κυττάρων GDNF-, GFR 1- και θετικών σε Ret (Εικόνες 8A-S).

Η έκφραση πρωτεΐνης των GDNF, GFR 1 και Ret στο SN των ποντικών στην ομάδα φορέα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στα ποντίκια της ομάδας ελέγχου. Αύξηση των συγκεντρώσεων θεραπείας τουC. tubulosa nanopowerενίσχυσε σημαντικά την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών. Η έκφραση πρωτεΐνης των GDNF, GFR 1 και Ret στο SN των ποντικών στην ομάδα θεραπείας υψηλής δόσης C. tubulosa ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό,τι στα ποντίκια στην ομάδα φορέα (Ρ< 0.01; Figures 8T, U). 

Επίδραση της νανοσκόνης C. tubulosa στην έκφραση πρωτεΐνης του Bcl2/Bax σε ποντίκια

Η έκφραση της πρωτεΐνης Bcl2 μειώθηκε σημαντικά και η έκφραση της πρωτεΐνης Bax ενισχύθηκε σημαντικά στο SN των ποντικών στην ομάδα φορέα (Ρ< 0.01) compared with the mice in the normal control group. High-dose C. tubulosa treatment significantly increased Bcl2 protein expression and significantly reduced Bax protein expression in the brains of the vehicle mice (P < 0.01; Figure 9). LSD test showed there was no significant difference between the middle-dose and high-dose groups but a significant difference between the low-dose group. 

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

ΠΔ και Απόπτωση

Η PD είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή. Σύμφωνα με τους Zhang et al. (2005), ο επιπολασμός είναι 10,7% στον κινεζικό πληθυσμό ηλικίας άνω των 55 ετών και 1,67% σε άτομα ηλικίας άνω των 65 ετών. Ο αριθμός των ασθενών με PD αυξάνεται ετησίως με την επιτάχυνση της παγκόσμιας γήρανσης, επιβαρύνοντας σοβαρά τις οικογένειες των ασθενών και την κοινωνία γενικότερα. Στον εγκέφαλο, οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες εμπλέκονται κυρίως στη σύνθεση και έκκριση του DA. Κατανέμονται ευρέως στο κεντρικό νευρικό σύστημα και εντοπίζονται κυρίως στο SN (80%). Η TH είναι το βασικό ένζυμο περιορισμού του ρυθμού για τη σύνθεση DA. Έτσι, η αναστολή της δραστηριότητας της TH μειώνει τη σύνθεση DA (Huot and Parent, 2007). Οι κύριες παθολογικές και βιοχημικές μεταβολές της PD είναι η απόπτωση των ντοπαμινεργικών νευρώνων στο SN, μια σημαντική μείωση της μελανοραβδωτής DA και ο σχηματισμός σωμάτων Lewy σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Dexter and Jenner, 2013). Η αιτιολογία της PD περιλαμβάνει σχετικούς γενετικούς παράγοντες, περιβαλλοντικούς παράγοντες και τη γήρανση του νευρικού συστήματος (Allam et al., 2005). Η παθογένεια της PD παραμένει ασαφής στη σύγχρονη ιατρική. Από τα τέλη της δεκαετίας του 1960, η θεραπεία υποκατάστασης με λεβοντόπα έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη θεραπεία της PD και έχει αναγνωριστεί ως σημαντικό σημείο καμπής στη θεραπεία της PD. Ωστόσο, η μακροχρόνια εφαρμογή αυτής της θεραπείας προκαλεί παρενέργειες και η θεραπεία δεν αντιμετωπίζει τις υποκείμενες αιτίες της PD (Del Sorbo and Albanese, 2008). Ως εκ τούτου, η ενεργός έρευνα για νέα φάρμακα ή μεθόδους θεραπείας που στοχεύουν στην προστασία των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι ζωτικής σημασίας για τη θεραπεία της PD.

Σε προηγούμενες μελέτες, η εφαρμογή της τελικής επισήμανσης dUTP με τη μεσολάβηση της δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης έδειξε ότι 0,6%-4,8% των ντοπαμινεργικών νευρώνων στο SN ασθενών με PD εμφάνισαν απόπτωση (Mochizuki et al., 1996). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε αποπτωτικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της χρωματικής συμπύκνωσης και των αποπτωτικών σωμάτων σε ντοπαμινεργικά κύτταρα (Anglade et al., 1997). Tompkins et al. (1997) πραγματοποίησαν μια υπερδομική ανάλυση αυτοψιών εγκεφαλικού ιστού από ασθενείς με PD, AD και διάχυτη σωματική νόσο Lewy (DLBD). Βρήκαν αποπτωτικά σώματα στο πυκνό στρώμα του SN σε ασθενείς με PD και DLBD, παρέχοντας πειστικές ενδείξεις νευρωνικής απόπτωσης σε PD και σχετικές ασθένειες. Επομένως, η μείωση ή η καταστολή της απόπτωσης στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες είναι θεμελιώδης για τη θεραπεία της PD.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το MPTP προκάλεσε συμπτώματα που μοιάζουν με PD. Το MPTP διασχίζει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και μεταβολίζεται από μονοαμινοξειδάσες τύπου Β στα αστροκύτταρα. Στη συνέχεια μετατρέπεται σε τοξικό MPP+, το οποίο συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια των ντοπαμινεργικών νευρώνων μέσω της πρόσληψης πρωτεΐνης του μεταφορέα DA. Δημιουργεί έτσι περίσσεια ελεύθερων ριζών οξυγόνου που αναστέλλουν τη δραστηριότητα του συμπλόκου Ι της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας και τη σύνθεση ATP. Αυτά τα συμβάντα προάγουν περαιτέρω τον σχηματισμό ελεύθερων ριζών και τις αντιδράσεις οξειδωτικού στρες και τελικά οδηγούν στον εκφυλισμό και τον θάνατο των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε MPP+ για να δημιουργήσει ένα in vitro όχημα σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες MES23.5 και MPTP για να προκαλέσει ένα ποντίκι φορέα για αμοιβαία επαλήθευση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης ΜΤΤ, το MPP+ μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων MES23.5, υποδηλώνοντας ότι το MPP+ ήταν κυτταροτοξικό στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι το C. tubulosa ενίσχυσε αποτελεσματικά την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και ανέστειλε την αύξηση της απόπτωσης που προκαλείται από MPP+-.

PD και GDNF

Ο GDNF είναι ένας νευροτροφικός παράγοντας, ο οποίος απομονώθηκε για πρώτη φορά από τους Lin et al. (1993). Οι Lin et al. (1993) έδειξε επίσης ότι το GDNF είχε συγκεκριμένες διατροφικές επιδράσεις στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες στον μεσεγκέφαλο των αρουραίων. Το GDNF, η νευρτουρίνη (NTN), η περσεφίνη (PSP) και η αρτεμίνη (ART) αποτελούν την οικογένεια GDNF. Είναι δομικά παρόμοιες και λειτουργικά σχετιζόμενες εκκριτικές πρωτεΐνες (Kotzbauer et al., 1996; Baloh et al., 1998; Milbrandt et al., 1998; Woodbury et al., 1998).

Ο υποδοχέας GDNF αποτελείται από δύο συστατικά. Το πρώτο συστατικό, το GFR, στερεώνεται στην εξωτερική μεμβράνη της γλυκοσυλφωσφατιδυλινοσιτόλης (GPI) και αγκυρώνεται στην επιφάνεια της κοννεξίνης. Το δεύτερο συστατικό είναι η πρωτεΐνη Ret. Η έρευνα έχει δείξει ότι υπάρχουν τέσσερις διαφορετικοί τύποι GFR: GFR 1, GFR 2, GFR 3 και GFR 4. Ο GFR 1 είναι ένας υποδοχέας υψηλής συγγένειας του GDNF (Onochie et al., 2000; Chen et al., 2001; Lindahl et al., 2001). Η πρωτεΐνη Ret είναι ένας λειτουργικός υποδοχέας του GDNF. Το ομοδιμερές μόριο του GDNF συνδέεται απευθείας με το GFR 1 για να σχηματίσει σύμπλοκα και αλληλεπιδρά με το Ret, με αποτέλεσμα τον διμερισμό και την ενεργοποίηση του Ret. Λόγω της αυτοφωσφορυλίωσης του Ret, το Ret ενεργοποιεί αρκετές κοινές οδούς σηματοδότησης TH. Απουσία πρωτεΐνης Ret, το GDNF προκαλεί πρωτεϊνική φωσφορυλίωση των MAPK, PI-3 και PLC-, επιπλέον της έκφρασης mRNA και της λειτουργικής δραστηριότητας του C-fos μέσω της πρωτεΐνης υποδοχέα του, GFR 1 (He et al., 2008).

Μελέτες έχουν δείξει ότι το GDNF είχε την ισχυρότερη προστατευτική επίδραση στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Rangasamy et al., 2010; Campos et al., 2012). Σε οχήματα που χρησιμοποιούν MPTP και 6-υδροξυντοπαμίνη (6-OHDA) για να προκαλέσουν βλάβη στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, το GDNF προστατεύει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες μειώνοντας την απόπτωση και προάγοντας την ανάπτυξη των νευραξόνων για την πρόκληση διαφοροποίησης βλαστοκυττάρων (Lucas et al., 2012; Littrell et al., 2013). Οι Lin et al. (1993) έδειξε ότι το GDNF προήγαγε ειδικά τη βιωσιμότητα, τη διαφοροποίηση και την αξονική ανάπτυξη των ντοπαμινεργικών νευρώνων για την προώθηση της πρόσληψης του DA στους νευρώνες. Η μελέτη έδειξε επίσης ότι το GDNF όχι μόνο απέτρεψε την οξεία τοξικότητα, αλλά μείωσε επίσης τη μακροπρόθεσμη τοξικότητα του MPP+ ή του 6-OHDA σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες, αποτρέποντας επιπλέον τον κυτταρικό θάνατο σε στρεσσαρισμένα ή κατεστραμμένα κύτταρα (Yu et al., 2010). Επιπλέον, το GDNF προώθησε τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστοκυττάρων προς τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες στον μεσεγκέφαλο (Lindsay, 1995) για τη διάσωση των ντοπαμινεργικών νευρώνων από τον ανάδρομο εκφυλισμό (Hong-Juan et al., 2011).

Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση του GDNF στο SN μειώθηκε σημαντικά σε ζωικά οχήματα (Yang et al., 2010). Αυτό υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς παθογένεσης σε αρουραίους PD. Η έγχυση 5-15 μg/d GDNF στην πλευρική κοιλία ή στο ραβδωτό σώμα ενός ζώου-οχήματος που επάγεται από MPTP για τρεις διαδοχικούς μήνες προώθησε τη μέλαινα ραβδωτά επισκευή του ντοπαμινεργικού συστήματος στο ζώο-φορέα (Grondin et al., 2002). Μελέτες της θεραπείας με GDNF για PD σε ζωικά οχήματα έδειξαν ότι η ενδοεγκεφαλική ένεση του GDNF σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου, όπως το SN, ο κερκοφόρος πυρήνας και η πλάγια κοιλία, βελτίωσε τις κινητικές διαταραχές που σχετίζονται με ζωικά μοντέλα PD, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης κινητικής δραστηριότητας, της μυϊκής ακαμψίας και τρόμος (Grondin et al., 2002). Ωστόσο, το GDNF δεν μπορεί να περάσει απευθείας από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Επομένως, η τοπική εγκεφαλική ένεση του GDNF ενέχει σημαντικό κίνδυνο και δυσκολίες στην κλινική εφαρμογή. Οι εφαρμογές για την εισαγωγή εξωγενούς GDNF μέσω μικροσφαιρών ελεγχόμενης απελευθέρωσης, καψουλών παρατεταμένης αποδέσμευσης και ιικών γονιδίων εξακολουθούν να μελετώνται (Liang et al., 2010; Yang et al., 2010; Qiao et al., 2012). Δεδομένων των περιορισμών των διαφόρων τεχνικών για την εισαγωγή εξωγενούς GDNF στον εγκέφαλο, οι νευροπροστατευτικοί παράγοντες που προάγουν την απελευθέρωση του ενδογενούς GDNF είναι σημαντικοί για κλινική εφαρμογή.

ΠΔ καιC. tubulosaΝανοσκόνη

Η PD είναι πιο συχνή σε ενήλικες μέσης ηλικίας και σε ηλικιωμένους. Η θεωρία της TCM θεωρεί ότι η PD εντοπίζεται κυρίως στον εγκέφαλο και οφείλεται κυρίως σε ηπατική και νεφρική ανεπάρκεια, εκτός από ανεπάρκεια ζωτικής ενέργειας και αίματος. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, η θεραπεία της PD θα πρέπει επομένως να επικεντρώνεται στην αναζωογόνηση των νεφρών και του μυελού των οστών.Οι Yang et al. (2010)χρησιμοποίησε τυχαιοποιημένες, διπλά-τυφλές και ελεγχόμενες με εικονικό φάρμακο κλινικές δοκιμές και διαπίστωσε ότι η συνδυαστική θεραπεία με χρήση συνταγών Madopar και τονωτικών νεφρών ανακούφισε τις κινητικές δυσλειτουργίες ασθενών με PD. Το αποτέλεσμα της θεραπείας ήταν καλύτερο από μια μεμονωμένη θεραπεία χρησιμοποιώντας Madopar. Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας της μονοθεραπείας TCM ή της συνταγογράφησης σύνθετων σε PD έχει επιβεβαιωθεί σε μοντέλα ζώων με PD και κλινικές εφαρμογές. Οι εφαρμογές TCM για τονισμό των νεφρών και την προώθηση της κυκλοφορίας του αίματος μείωσαν τη δόση της μονοθεραπείας για PD χρησιμοποιώντας Madopar. Μερικές μελέτες έχουν προτείνει ότι η TCM βελτίωσε τα συμπτώματα της PD και προστάτευσε τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, οι οποίοι μπορεί να είχαν στενή σχέση με την προώθηση της ενδογενούς έκφρασης GDNF (Hong-Juan et al., 2011; Qiao et al., 2012).

Η τονωτική ένωση των νεφρών που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη,C. tubulosaνανοσκόνη, που περιέχεταιCistanche, επιμέδιο, καιΡίζωμα πολυγωνικό. Η σύγχρονη έρευνα προτείνει ότι η χημική σύσταση τουCistancheείναι το ECH, το οποίο προστατεύει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες στο SN στα ποντίκια PD που προκαλούνται από MPTP και αναστέλλει τη μείωση του DA και του μεταφορέα DA (Zhao et al., 2010). Επιπλέον, αποτρέπει 6-επαγόμενη από το OHDA μείωση της DA και προστατεύει τους ραβδωτούς ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Chen et al., 2007). Το Epimedium αναστέλλει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και ασκεί νευροπροστατευτικούς ρόλους (Liu et al., 2011). Τα φλαβονοειδή επιμέδιο προάγουν αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστοκυττάρων (Yao et al., 2010).

Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ,C. tubulosaη νανοσκόνη ανταγωνίστηκε την αύξηση της MPP+-προκαλούμενη απόπτωση με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Βελτίωσε σημαντικά την έκφραση TH στοin vitroόχημα και είχε σημαντικές αντι-αποπτωτικές επιδράσεις σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Τα ποντίκια-φορέα που προκλήθηκαν από MPTP εμφάνισαν διαταραχές συμπεριφοράς και μείωσαν σημαντικά την έκφραση TH στους ιστούς του μεσεγκεφάλου και τα επίπεδα DA, που είναι τυπικά παθολογικά χαρακτηριστικά της PD. Διαφορετικές δόσεις απόC. tubulosaΗ νανοσκόνη μείωσε τη στατική διάρκεια, ενίσχυσε τις αυτόνομες δραστηριότητες, βελτίωσε τις διαταραχές συμπεριφοράς, αύξησε τα επίπεδα DA στον εγκέφαλο και αύξησε την έκφραση TH στα οχήματα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότιC. tubulosaΗ νανοσκόνη άσκησε προστατευτικά αποτελέσματα στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, βελτιώνοντας έτσι τις διαταραχές συμπεριφοράς των οχημάτων. Διαφορετικές δόσεις απόC. tubulosaη νανοσκόνη αύξησε την έκφραση της πρωτεΐνης GDNF και των πρωτεϊνών υποδοχέα της στον εγκέφαλο ποντικών-φορέων. Υψηλή δόσηC. tubulosaΗ θεραπεία ρύθμισε σημαντικά την έκφραση Bcl2 και μείωσε την έκφραση Bax, γεγονός που υποδηλώνει ότιC. tubulosaνανοσκόνηςμπορεί να προάγει την έκφραση και την έκκριση GDNF στον εγκέφαλο ποντικού που έχει υποστεί βλάβη από MPTP. Επιπλέον, μπορεί να ασκήσει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες και να ελαχιστοποιήσει την απόπτωση των νευρώνων μέσω των νευροτροφικών ρόλων υποστήριξης του GDNF.

Αυτή η μελέτη έδειξε ότιC. tubulosaη νανοσκόνη άσκησε προστατευτικά αποτελέσματα στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες και στα δύοin vitroκαιin vivoκαι αυξημένη έκφραση TH για τη βελτίωση του περιεχομένου DA. Βελτίωσε επίσης τις διαταραχές συμπεριφοράς σε ποντίκια-φορείς που προκλήθηκαν από MPTP, ρύθμισε την πρωτεϊνική έκφραση του GDNF και των πρωτεϊνών υποδοχέων του στο SN και είχε αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα στα ποντίκια PD. Ο μηχανισμός που διέπει τις κλινικές επιδράσεις τουC. tubulosaη νανοσκόνη σε PD μπορεί να περιλαμβάνει αύξηση της περιεκτικότητας του ενδογενούς GDNF στον εγκέφαλο και συνεπώς μείωση της βλάβης στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12