Η εχινακοσίδη προστατεύει από 6-επαγόμενη από υδροξυντοπαμίνη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και φλεγμονώδεις αντιδράσεις στα κύτταρα PC12 μέσω της μείωσης της παραγωγής ROS

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang, 1,2 Zhao-Hong Xuan, 3 Shuo Tian, ​​1 και Guan-Hua Du1,2

Η νόσος του Πάρκινσον (PD) είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια ντοπαμινεργικών (DA) νευρώνων στη μέλαινα ουσία. Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις εμπλέκονται στον μηχανισμό της κυτταρικής βλάβης στην PD. 6-Η υδροξυντοπαμίνη (6-OHDA), ένα ανάλογο ντοπαμίνης, βλάπτει ειδικά τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες.Εχινακοσίδη(ECH) είναι ένας φαινυλαιθανοειδές γλυκοζίτης που απομονώνεται από τα στελέχη τουCistanche σάλσα, που δείχνει μια ποικιλία νευροπροστατευτικών επιδράσεων σε προηγούμενες μελέτες. Η παρούσα μελέτη ήταν να διερευνήσει την επίδρασή της έναντι της νευροτοξικότητας που προκαλείται από 6-OHDA και των πιθανών μηχανισμών σε κύτταρα PC12. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 6-OHDA μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων, μείωσε τη δραστηριότητα οξείδωσης-μείωσης, μείωσε το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και προκάλεσε απόπτωση με τη μεσολάβηση των μιτοχονδρίων σε σύγκριση με κύτταρα PC12 που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Ωστόσο,εχινακοσίδηΗ θεραπεία μείωσε σημαντικά αυτές τις αλλαγές που προκλήθηκαν από το 6-OHDA. Επιπλέον,εχινακοσίδηθα μπορούσε επίσης να ανακουφίσει σημαντικά τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από το 6-OHDA. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότιεχινακοσίδηθα μπορούσε να μειώσει την 6-προκαλούμενη από το OHDA παραγωγή ROS σε κύτταρα PC12. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο υποκείμενος μηχανισμός τουεχινακοσίδηκατά της νευροτοξικότητας που προκαλείται από 6-OHDA ενδέχεται να περιλαμβάνει την εξασθένιση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και των φλεγμονωδών αποκρίσεων μειώνοντας την παραγωγή ROS.

1. Εισαγωγή

Νόσος Πάρκινσον (PD)είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από τον αργά προοδευτικό εκφυλισμό των νευρώνων της ντοπαμίνης στη μέλαινα ουσία pars compacta [1]. Αν και τα νευροπαθολογικά χαρακτηριστικά της PD περιγράφονται καλά, η αιτιολογία παραμένει ακόμη απροσδιόριστη. Σημειωτέον, αρκετές παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία εμπλέκεται στην παθογένεση της PD και στον εκφυλισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων [2, 3]. Τα μιτοχόνδρια περιέχουν πολλά οξειδοαναγωγικά ένζυμα και οι φυσικές ανεπάρκειες της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης δημιουργούν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [4]. Πρόσφατα, αυξανόμενα στοιχεία από μελέτες σε ανθρώπους και ζώα υποδεικνύουν ότι η νευροφλεγμονή είναι επίσης σημαντικός παράγοντας στην απώλεια νευρώνων στην PD [5].

6-Η υδροξυντοπαμίνη (6-OHDA) είναι ειδική για τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες σε μοντέλα τρωκτικών εντός του ραβδιού και σε ορισμένα κύτταρα [6-11]. Το κύτταρο PC12 έχει γίνει ένα δημοφιλές κυτταρικό μοντέλο για την έρευνα PD επειδή αυτή η κυτταρική σειρά διαθέτει πολλά χαρακτηριστικά των DAergic νευρώνων. Έχει χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο in vitro για τη μελέτη της PD και για τον προσδιορισμό της επίδρασης προστατευτικών και θεραπευτικών παραγόντων. Η εχινακοσίδη (Εικόνα 1) είναι ένας φαινυλαιθανοειδής γλυκοσίδης που απομονώνεται και καθαρίζεται από τα στελέχη τουCistanche σάλσα[12], ένα παρασιτικό φυτό ιθαγενές στη βορειοδυτική Κίνα, το οποίο χρησιμοποιείται ως δοκιμή των υποκείμενων μηχανισμών της εχινακοσίδης ενάντια στα κύτταρα PC12 που προκαλείται από 6-OHDA.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά. Η εχινακοσίδη ελήφθη από τα Εθνικά Ινστιτούτα Ελέγχου Τροφίμων και Φαρμάκων (Πεκίνο, Κίνα). Το RPMI-1640 και ο εμβρυϊκός βόειος ορός ελήφθησαν από την Gibco

(Grand Island, NY, ΗΠΑ). 6-OHDA, MTT, 2,7-διοξεική διχλωροδιϋδροφθοροσκεΐνη, ιωδιούχο προπίδιο (PI) και ρεσαζουρίνη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το κιτ δοκιμασίας βιοφωταύγειας ΑΤΡ ελήφθη από την Promega (Madison, ΗΠΑ). Το κιτ ανάλυσης 5,5,6,6 -Tetrachloro-1,1,3,{3 -τετρααιθυλο βενζιμιδαζολυλ ιωδιούχο καρβοκυανίνη (JC-1) ελήφθη από το Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, Κίνα). Το κιτ Cytochrome C ELISA και το φθορογόνο υπόστρωμα Ac-DVD-AMC ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Τα κιτ IL-1 και IL-6 ELISA ελήφθησαν από την εταιρεία περιορισμένης ευθύνης της Boster Bio-engineer (Wuhan, Κίνα). Η συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Spectramax M5 αγοράστηκε από την εταιρεία Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA).

2.2. Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία. Τα κύτταρα PC12 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό ορό αλόγου και 5 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Οι συνθήκες διατηρήθηκαν στους 37∘C σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5 τοις εκατό CO2 [19]. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 105 κύτταρα/mL. Μετά από 80 τοις εκατό συρροή, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις εχινακοσίδης σε μέσο RPMI-1640 χωρίς ορό για 1 ώρα. Στη συνέχεια, 6-OHDA προστέθηκε στα φρεάτια σε τελική συγκέντρωση 100 Μ και επωάστηκε για άλλη Μετά την επεξεργασία, παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλαγές στο μικροσκόπιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ [19]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, προστέθηκε ΜΤΤ στην τελική συγκέντρωση 0,5 mg/mL σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37°C.

2.3.Μορφολογικές Αλλαγές και Δοκιμασία Βιωσιμότητας Κυττάρων PC12. Μετά τη θεραπεία, παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλαγές στο μικροσκόπιο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ [19]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, ΜΤΤ στην τελική συγκέντρωση των 0,5 mg/mL προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37∘C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε σε 100 L διμεθυλοσουλφοξείδιο με ανάδευση για 15 λεπτά σε αναδευτήρα πλάκας μικροτιτλοδότησης και η απορρόφηση διαβάστηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Spectramax Μ5. Συμπληρωματική και Εναλλακτική Ιατρική Βασισμένη σε Αποδείξεις

2.4. Ενδοκυττάριος Προσδιορισμός Επιπέδου ATP. Το κυτταρικό επίπεδο ATP μετρήθηκε με κιτ δοκιμασίας βιοφωταύγειας ATP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η φωταύγεια παρακολουθήθηκε σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στη λειτουργία φωταύγειας μετά την προσθήκη 100 L λουσιφερίνης και λουσιφεράσης [20].

2.5. Μέτρηση Δραστηριότητας Οξείδωσης-Μείωσης Μιτοχονδρίων από Resazurin. Μετά την επεξεργασία, η ρεσαζουρίνη σε τελική συγκέντρωση 5 M προστέθηκε στα φρεάτια και η ένταση φθορισμού εξετάστηκε σε διέγερση 530 nm και εκπομπή 590 nm [21].

2.6. Μέτρηση δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης από JC-1. Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανάλυσης JC-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την επεξεργασία, το μέσο καλλιέργειας αφαιρέθηκε και φορτώθηκε με διάλυμα JC-1 για 15 λεπτά στους 37°C στο σκοτάδι. Η ένταση φθορισμού της αναλογίας κόκκινου/πράσινου προσδιορίστηκε σε διέγερση 490 nm και εκπομπή 530 nm (πράσινα φθορίζοντα μονομερή) και 590 nm (κόκκινα φθορίζοντα συσσωματώματα), αντίστοιχα [22].

2.7. Ποσοτικοποίηση της απελευθέρωσης κυτοχρώματος C. Τα επίπεδα του κυτοσολικού κυτοχρώματος C μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [23]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα λύθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 g για 15 λεπτά, και στη συνέχεια το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως κυτταροπλασματικό κλάσμα και χρησιμοποιήθηκε για μετρήσεις απελευθέρωσης κυτοχρώματος C.

2.8. Προσδιορισμός της δραστηριότητας Caspase-3. Η δραστηριότητα Caspase-3 πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις αναφορές με τροποποίηση [24]. Εν συντομία, μετά την επεξεργασία, το ρυθμιστικό λύσης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 12 000 g για 10 λεπτά. Η δραστηριότητα κασπάσης-3 δοκιμάστηκε στα προκύπτοντα υπερκείμενα με μέτρηση της πρωτεολυτικής διάσπασης του φθορογόνου υποστρώματος Ac-DVD-AMC με μήκος κύματος διέγερσης 380 nm και μήκος κύματος εκπομπής 460 nm.

2.9. Δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα PC12. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 r/min για 5 λεπτά και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 70 τοις εκατό αιθανόλη όλη τη νύχτα στους 4°C. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε PBS (που περιέχει 50 g/mL RNaseA), χρωματίστηκαν με PI στην τελική συγκέντρωση 10 Μ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και διαβάστηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής στους 488 διέγερση nm [10].

2.10. Μέτρηση επιπέδου IL{-1 και IL-6 με ανάλυση ELISA. Το μέσο καλλιέργειας κυττάρων PC12 συλλέχθηκε μετά την επεξεργασία και οι συγκεντρώσεις IL-1 και IL-6 μετρήθηκαν με κιτ ELISA που διατίθενται στο εμπόριο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του ανθρώπου-κατασκευαστή.

2.11. Προσδιορισμός Επιπέδου Ενδοκυτταρικού Αντιδραστικού Είδη Οξυγόνου. Μετά από επώαση με 6-OHDA, τα κύτταρα φορτώθηκαν με 10Μ H2DCFH-DA για 30 λεπτά στους 37°C στο σκοτάδι. Η ένταση φθορισμού του DCF μετρήθηκε σε διέγερση

Μήκος κύματος Συμπληρωματικής και Εναλλακτικής Ιατρικής Βασισμένης σε Αποδείξεις Μήκος κύματος 495 nm και μήκος κύματος εκπομπής 530 nm σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών [25].

2.12. Στατιστική ανάλυση. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από -δοκιμή. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε αποδεκτή στο <>

3. Αποτελέσματα

3.1. Επίδραση της εχινακοζίδης στη μορφολογία και τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα PC12 που έχουν καταστραφεί από 6-OHDA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2(Α), η βιωσιμότητα των κυττάρων PC12 δεν είχε σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση του 0.1~10 M της θεραπείας με εχινακοσίδη για

24 h. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2(Β), εντός 24 ωρών από τη θεραπεία μόνο με 6-OHDA, η πλειονότητα των κυττάρων PC12 είχε υποστεί μορφολογικές αλλαγές όπως φυσαλίδες μεμβράνης και συρρίκνωση των κυττάρων. Η ταυτόχρονη θεραπεία με εχινακοσίδη προστάτευσε τα κύτταρα από 6-ζημία OHDA. Η ανάλυση MTT έδειξε ότι η θεραπεία των κυττάρων PC12 με 6-OHDA μόνο οδήγησε σε μείωση κατά περίπου 25 τοις εκατό στην κυτταρική επιβίωση εντός 24 ωρών, ενώ η συν-θεραπεία με {{10}}.1 M, 1 M, και η εχινακοσίδη 10 Μ έδειξαν μείωση της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από 6-OHDA (όλα < 0,01,="" εικόνα="">

3.2. Επίδραση της εχινακοσίδης στη δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων που προκαλείται από το 6-OHDA σε κύτταρα PC12. Τα κυτταρικά επίπεδα ATP μειώθηκαν σημαντικά μετά από επώαση 24 ωρών με 100M 6-OHDA, ενώ η συν-θεραπεία με 1 Mand 10 M εχινακοσίδη ανακούφισε 6-ΑΤΡ με τη μεσολάβηση OHDA μείωσε τις αναβολικές αλλαγές στα κύτταρα PC12 . Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συν-θεραπεία με 1 Mand 10 M εχινακοσίδης θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την εξασθένιση της οξείδωσης-μείωσης των μιτοχονδρίων που προκαλείται από 6-OHDA (και < 0,05="" και="" εικόνα="">

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3(γ), η θεραπεία με 100 M 6- OHDA για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία ( < {="" {11}}.01).="" ωστόσο,="" η="" μείωση="" του="" δυναμικού="" της="" μιτοχονδριακής="" μεμβράνης="" που="" προκαλείται="" από="" το="" 6-ohda="" μειώθηκε="" σημαντικά="" με="" τη="" συν-θεραπεία="" με="" 0,1="" μ,="" 1="" μ="" και="" 10="" μ="" εχινακοσίδης="" (όλα=""><>

3.3. Απόπτωση της εχινακοσίδης με τη μεσολάβηση των μιτοχονδρίων σε κύτταρα PC12 κατά της νευροτοξικότητας του 6-OHDA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 6-Η έκθεση σε OHDA είχε ως αποτέλεσμα αύξηση του κυτοσολικού κυτοχρώματος C κατά 167 τοις εκατό σε σχέση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία ( < 0.{{10}}1).="" η="" εχινακοσίδη="" στη="" δόση="" των="" 0.1="" m,="" 1="" m="" και="" 10μ="" θα="" μπορούσε="" να="" μειώσει="" σημαντικά="" την="" απελευθέρωση="" του="" κυτοχρώματος="" c="" στο="" κυτοσόλιο="" που="" προκαλείται="" από="" 6-ohda="" (="">< 0,05,="">< 0,01,="" και="">< 0,01,="" αντιστοίχως·="" εικόνα="">

Η δραστηριότητα κασπάσης{{0}} αυξήθηκε κατά περίπου 3.3-πλάσια σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία μετά από 6-έκθεση σε OHDA ( < 0.01.="" ).="" αντίθετα,="" η="" συν-θεραπεία="" με="" 1="" m="" και="" 10="" m="" εχινακοσίδης="" έδειξε="" σημαντική="" μείωση="" στη="" δραστηριότητα="" κασπάσης-3="" σε="" σύγκριση="" με="" κύτταρα="" που="" υποβλήθηκαν="" σε="" αγωγή="" με="" 6-ohda,="" αντίστοιχα="" (και="">< 0,05="" και="" εικόνα="" 4(="" β)).το="" pi="" είναι="" η="" διαπερατότητα="" της="" μεμβράνης="" και="" γενικά="" αποκλείεται="" από="" τα="" βιώσιμα="" κύτταρα.="" έτσι,="" χρησιμοποιείται="" συνήθως="" για="" τον="" εντοπισμό="" νεκρών="" κυττάρων="" σε="" έναν="" πληθυσμό.="" τα="" αποτελέσματα="" έδειξαν="" ότι="" ο="" ρυθμός="" απόπτωσης="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" μετά="" από="" επωάσεις="" 24="" ωρών="" με="" 100="" μ="" 6-ohda,="" ενώ="" η="" συν-θεραπεία="" με="" εχινακοσίδη="" 1="" και="" 10="" μ="" μείωσε="" σημαντικά="" την="" απόπτωση="" που="" προκαλείται="" από="" 6-ohda=""><0,05,><0,01, αντιστοίχως,="" εικόνα="">

3.4. Αντιφλεγμονώδης επίδραση της εχινακοσίδης σε κύτταρα PC12 που προκαλείται από 6-OHDA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο 6-Η έκθεση σε OHDA είχε ως αποτέλεσμα αύξηση της IL-1 σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία ( < 0.05;="" εικόνα="" 4(α)).="" ωστόσο,="" 10="" m="" εχινακοσίδης="" θα="" μπορούσαν="" να="" μειώσουν="" σημαντικά="" την="" απελευθέρωση="" il-1="" που="" προκαλείται="" από="" 6-ohda="" (="">< 0,05;="" εικόνα="">

Το επίπεδο IL{{0}} αυξήθηκε επίσης σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς θεραπεία ( < 0.01).="" ωστόσο,="" η="" συν-θεραπεία="" με="" 0,1,="" 1="" και="" 10="" μ="" εχινακοσίδης="" μείωσε="" σημαντικά="" την="" απελευθέρωση="" il-6="" σε="" σύγκριση="" με="" κύτταρα="" που="" υποβλήθηκαν="" σε="" θεραπεία="" με="" 6-ohda="" (και="">< 0,05="" και="" εικόνα="">

3.5. Επίδραση του ECH στην παραγωγή ROS που προκαλείται από το 6-OHDA σε κύτταρα PC12. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 6-OHDA έδειξαν σημαντική αύξηση (περίπου 1,4-πλάσια) των ενδοκυτταρικών ROS σε σύγκριση με κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία ( < 0.01).="" αυτή="" η="" αύξηση="" μετριάστηκε="" σημαντικά="" με="" την="" ταυτόχρονη="" επώαση="" με="" 0.1,="" 1="" και="" 10="" μ="" εχινακοσίδη="" (="">< 0.05,="">< 0.01="" και="">< 0.01,="" αντιστοίχως;="" εικόνα="" 6)="">

4. Συζήτηση

Η εχινακοσίδη είναι ένα από τα κύρια συστατικά των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων που εκχυλίζονται από μια διάσημη παραδοσιακή αναφερόμενη εχινακοσίδη έχει αντι-αποπτωτικές και νευροπροστατευτικές ιδιότητες σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες [18]. In vivo μελέτη ανέφερε ότι η εχινακοσίδη είχε νευροπροστατευτικές επιδράσεις και βελτίωση της συμπεριφοράς στο μοντέλο ποντικού της ντοπαμινεργικής νευρωνικής βλάβης που προκαλείται από MPTP, ενώ περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι η εχινακοσίδη προκάλεσε μείωση της ρύθμισης της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 και της κασπάσης-8 στο MPP plus -προκαλούμενη απόπτωση των νευρώνων με κοκκώδη παρεγκεφαλίδα [16]. Μια άλλη in vivo μελέτη ανέφερε τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις της εχινακοσίδης στους ραβδωτούς ντοπαμινεργικούς νευρώνες που τραυματίστηκαν από το 6-OHDA [17]. Ωστόσο, οι κυτταρικοί και μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις δράσεις δεν είναι πλήρως κατανοητοί, ειδικά για την επιρροή τους στη μιτοχονδριακή λειτουργία και τις αποκρίσεις της φλεγμονής. Έτσι, η τρέχουσα μελέτη μας διερεύνησε τις επιδράσεις της εχινακοσίδης στη μιτοχονδριακή λειτουργία και τις αποκρίσεις της φλεγμονής για να διαλευκάνει τον μηχανισμό της έναντι της PD. Τα αποτελέσματα έδειξαν αρχικά ότι η εχινακοσίδη μείωσε σημαντικά τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από το {{9}OHDA στα κύτταρα PC12 μέσω της προστασίας της μιτοχονδριακής λειτουργίας και της αντιφλεγμονής.

Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία εμπλέκεται εδώ και πολύ καιρό στον θάνατο των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ραβδωτού σώματος στη νόσο του Πάρκινσον και στα πειραματικά μοντέλα της [26]. Τα μιτοχόνδρια εμπλέκονται σε βάθος στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) μέσω των φορέων ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες [27]. Μια μεγάλη ποικιλία ROS παράγεται κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού μεταβολισμού στα βιολογικά συστήματα, αλλά η συσσώρευσή τους πέρα ​​από

Η απαιτούμενη ποσότητα μπορεί δυνητικά να βλάψει τα λιπίδια, τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα.

6-Το OHDA, ένα ανάλογο κατεχολαμίνης, προκαλεί ειδικό εκφυλισμό των νευρώνων της μέλαινας ουσίας. Η νευροτοξικότητα που προκαλείται από το 6-OHDA οφείλεται, εν μέρει, στην παραγωγή ROS [28-32].

Η OHDA οδηγεί σε θάνατο νευρώνων επηρεάζοντας τη λειτουργία των μιτοχονδρίων, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης της παραγωγής ATP, της διαταραχής του μεταβολισμού των ROS και της επαγωγής απόπτωσης [10, 33, 34]. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματά μας κατέδειξαν επίσης ότι 6-Το OHDA κατέστρεψε τη λειτουργία οξειδωτικής αναγωγής των μιτοχονδρίων, μείωσε το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης, προκάλεσε απόπτωση που προκαλείται από μιτοχόνδρια και αύξησε την παραγωγή ROS στα κύτταρα PC12.

Η ρεσαζουρίνη είναι ένας δείκτης φθορισμού που είναι ενδιάμεσος μόνο μεταξύ των τελικών μειώσεων του μοριακού οξυγόνου και της οξειδάσης του κυτοχρώματος. Ως εκ τούτου, το οξειδωτικό-μειωτικό δυναμικό της ρεσαζουρίνης επιτρέπει στην αναπνευστική αλυσίδα να λειτουργεί σχεδόν στο τέλος, γεγονός που θα παρέχει μια πιο ακριβή και ευαίσθητη ένδειξη της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Το JC-1 είναι ένας ευαίσθητος στο δυναμικό της μεμβράνης ανιχνευτής που εντοπίζεται στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη όπου σχηματίζει είτε μονομερή (πράσινο) είτε συσσωματώματα (κόκκινο) με βάση το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Έτσι, η ρεσαζουρίνη και το JC-1 είναι πολύτιμα αναλυτικά εργαλεία για την εξέταση της μιτοχονδριακής λειτουργίας [35]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι οι μειώσεις της οξειδωτικής-μειωτικής δραστηριότητας των μιτοχονδρίων και του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης μπορεί να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην ντοπαμινεργική νευροτοξικότητα που προκαλείται από 6-OHDA. Το αποτέλεσμά μας έδειξε επίσης μιτοχονδριακή οξειδωτική-αναγωγική δραστηριότητα και δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ότι η βελτίωση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας μπορεί να είναι ένας καλύτερος τρόπος για την επιβράδυνση του προοδευτικού ντοπαμινεργικού νευροεκφυλισμού που συνήθως σχετίζεται με την PD.

Είναι γενικά αποδεκτό ότι η κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από 6- OHDA προκαλείται από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, που χαρακτηρίζεται από απελευθέρωση κυτοχρώματος C και ενεργοποίηση κασπάσης-3 [36]. Ένα αποπτωτικό ερέθισμα πυροδοτεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο όπου στη συνέχεια ενεργοποιεί την κασπάση-3 και άλλες κατάντη κασπάσες. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα PC12 που εκτέθηκαν σε 100 M 6-OHDA ενίσχυσαν την απελευθέρωση κυτοχρώματος C και εξαρτώμενα από την κασπάση ανέστειλαν την απελευθέρωση κυτοχρώματος C και την ενεργοποίηση της κασπάσης- 3. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η εχινακοσίδη θα μπορούσε να αναστείλει την απόπτωση με τη μεσολάβηση των μιτοχονδρίων μειώνοντας την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια σε κυτοσόλη και ενεργοποίηση κασπάσης-3.

Η φλεγμονή είναι ένα νευροπαθολογικό χαρακτηριστικό του παρκινσονικού εγκεφάλου και επίσης σε πειραματικά μοντέλα της νόσου. Οι θεραπευτικές στρατηγικές που προσανατολίζονται στη μείωση της φλεγμονής και στην αναστολή της παραγωγής αυτών των φλεγμονωδών παραγόντων μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη νευροπροστατευτική στρατηγική για τη θεραπεία της νόσου του Πάρκινσον και των συναφών καταστάσεων [37]. Πολλές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν επίσης στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και κατά τη διάρκεια της μεταθανάτιας ανάλυσης σε ασθενείς με Πάρκινσον αποκάλυψαν αυξημένα επίπεδα κυτοκινών, όπως η ιντερλευκίνη-1 (IL-1) και η ιντερλευκίνη-6 (IL{{4} }), υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση της προφλεγμονώδους απόκρισης[38, 39]. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκθεση σε 100 Mof{8}}OHDA επαγόμενη από την απελευθέρωση IL{-1 και IL-6 σε κύτταρα PC12. Ωστόσο, η θεραπεία με εχινακοσίδη θα μπορούσε δοσοεξαρτώμενα να αναστείλει την απελευθέρωση IL{-1 και IL-6 που προκαλείται από το 6-OHDA. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι μειωτικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις εμπλέκονται επίσης στους μηχανισμούς της εχινακοσίδης έναντι της νευροτοξικότητας που προκαλείται από 6-OHDA.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας έδειξαν ότι η εχινακοσίδη ήταν σε θέση να μπλοκάρει τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από 6-OHDA στα κύτταρα PC12 και οι μηχανισμοί μπορεί να σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή προστασία και την αντιφλεγμονή μέσω της μείωσης της παραγωγής ROS. Οι πληροφορίες που παρέχονται από αυτή την εργασία θα είναι χρήσιμες για την αποσαφήνιση του μηχανισμού της εχινακοσίδης για την αντι-PD. Συνάγεται το συμπέρασμα ότι η εχινακοσίδη μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική επιλογή για την πρόληψη και τη θεραπεία της PD.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δεν έχουν δηλώσει σύγκρουση συμφερόντων

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από Grants από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81473383) και το Εθνικό Μείζον Έργο Επιστήμης και Τεχνολογίας (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008 και 2013ZX09102106).