grΓλώσσα
Σπίτι / Η γνώση / Περιεχόμενο

Η γνώση

Προστατευτική ανοσία κατά της λοίμωξης SARS CoV-2 που προκαλείται από εμβολιασμό DNA σε χάμστερ

Nov 17, 2023

Αφηρημένη

Η ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων κατά του COVID-19 αποτελεί επείγουσα ανάγκη για την παγκόσμια δημόσια υγεία. Η πρωτεΐνη ακίδας του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) είναι ένας σημαντικός στόχος για το εμβόλιο για τον COVID-19. Για να ανταποκριθούμε γρήγορα στο ξέσπασμα της πανδημίας SARS-CoV-2, ένα εμβόλιο με βάση το νουκλεϊκό οξύ είναι μια νέα επιλογή, πέρα ​​από το παραδοσιακό εμβόλιο απενεργοποιημένου ιού ή το εμβόλιο ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Εδώ, αναφέρουμε ένα εμβόλιο DNA που περιέχει το γονίδιο ακίδας για παράδοση μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Τα γονίδια ακίδας του SARS-CoV και του SARS-CoV-2 βελτιστοποιήθηκαν με κωδικόνια για έκφραση κυττάρων θηλαστικών και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν σε φορείς έκφρασης κυττάρων θηλαστικών, που ονομάζονται pSARS-S και pSARS2-S, αντίστοιχα. Η έκφραση πρωτεΐνης ακίδας επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα μετά από παροδική έκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Μετά την ανοσοποίηση, συλλέχθηκαν οροί για αναλύσεις τίτλου αντισώματος ειδικού αντιγόνου και εξουδετερωτικού αντισώματος. Βρήκαμε ότι τόσο η ανοσοποίηση του pSARS-S όσο και του pSARS2-S προκάλεσε παρόμοια επίπεδα αντισωμάτων κατά του S2 του SARS-CoV-2. Αντίθετα, μόνο η ανοσοποίηση του pSARS2-S προκάλεσε αντισώματα έναντι του τομέα δέσμευσης υποδοχέα του SARS-CoV-2. Βρήκαμε περαιτέρω ότι η ανοσοποίηση pSARS2-S, αλλά όχι η ανοσοποίηση pSARS-S, θα μπορούσε να προκαλέσει πολύ υψηλούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων κατά του SARS-CoV-2. Περαιτέρω αναλύσαμε τις αποκρίσεις Τ-κυττάρων ειδικών για την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S και βρήκαμε ότι οι ανοσολογικές αποκρίσεις ήταν προκατειλημμένες προς το Th1. Είναι σημαντικό ότι η ανοσοποίηση του pSARS2-S σε χάμστερ θα μπορούσε να προκαλέσει προστατευτική ανοσία έναντι της πρόκλησης SARS-CoV-2 in vivo. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ο εμβολιασμός DNA θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την προστασία από τον COVID-19.


Desert ginseng—Improve immunity (23)

Οφέλη από το cistanche-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Σύνοψη συγγραφέα

Ο SARS-CoV-2 συνεχίζει να απειλεί την παγκόσμια υγεία και η ανάπτυξη του εμβολίου SARS-CoV-2 αποτελεί επείγουσα προτεραιότητα για την ανάσχεση της επιδημίας COVID-19. Εδώ, αναπτύξαμε εμβόλια DNA που περιέχουν το γονίδιο ακίδας από τον SARS-CoV-2 και παραδίδονται μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Παρατηρήσαμε ότι το εμβόλιο DNA προκάλεσε μια μακροχρόνια χυμική απόκριση κατά του SARS-CoV-2 και τα αντισώματα ορού που προέκυψαν απέκλεισαν αποτελεσματικά τη δέσμευση του SARS-CoV-2 RBD στον υποδοχέα εισόδου του (ACE2). Είναι σημαντικό ότι το εμβόλιο DNA προκάλεσε ισχυρές Th1-προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις κατά του SARS-CoV-2, οι οποίες θα μπορούσαν να παρέχουν προστατευτική δράση με χαμηλές παρενέργειες. Τέλος, δείξαμε ότι το εμβόλιο SARS-CoV-2 DNA προσέφερε προστατευτική αποτελεσματικότητα έναντι της μόλυνσης από SARS-CoV-2 σε συριακά χάμστερ. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι ο εμβολιασμός με DNA θα μπορούσε να είναι μια χρήσιμη προσέγγιση για τον έλεγχο της πανδημίας COVID-19 στο εγγύς μέλλον.

Εισαγωγή

Η αναδυόμενη μολυσματική ασθένεια COVID-19, που προκαλείται από το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο που σχετίζεται με τον κοροναϊό 2 (SARS-CoV-2), είχε σημαντικές οικονομικές επιπτώσεις σε χώρες που επλήγησαν από την έξαρση της νόσου το 2019-2020 [1]. Σε παγκόσμιο επίπεδο, έχουν καταγραφεί περισσότερα από 118 εκατομμύρια επιβεβαιωμένα κρούσματα COVID-19 και περισσότεροι από 2,6 εκατομμύρια άνθρωποι πέθαναν από COVID-19, έως τον Μάρτιο του 2021 [2]. Το παγκόσμιο ποσοστό θνησιμότητας είναι περίπου 2,2%. Αν και το ποσοστό θνησιμότητας του SARS-CoV-2 είναι χαμηλότερο από αυτό της μόλυνσης από MERS-CoV και SARS-CoV, η μεταδοτικότητά του είναι υψηλότερη. Αρκετά εμβόλια κατά του COVID-19 έχουν εγκριθεί για επείγουσα χρήση τον Δεκέμβριο του 2020, αλλά η πανδημία του COVID-19 παραμένει διεθνής απειλή από τη στιγμή που γράφονται αυτές οι γραμμές.

Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Η πρωτεΐνη Spike (S) είναι η επιφανειακή πρωτεΐνη του κοροναϊού που είναι υπεύθυνη για τις διαδικασίες προσκόλλησης του ιού στο ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 του υποδοχέα ξενιστή (ACE2), την είσοδο κυττάρων και τη σύντηξη μεμβράνης ιού-κυττάρου για την απελευθέρωση ιικού RNA στα κύτταρα ξενιστές. Μεταξύ των δομικών πρωτεϊνών του SARS-CoV, η πρωτεΐνη ακίδα είναι το κυρίαρχο αντιγόνο που επάγει εξουδετερωτικά αντισώματα [3]. Με βάση προηγούμενες μελέτες για το SARS και το MERS, τα εμβόλια με βάση την πρωτεΐνη S έχει αποδειχθεί ότι επάγουν εξουδετερωτικά αντισώματα και ανοσοαποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων στους κοροναϊούς και προστατεύουν τα ζώα από την πρόκληση του ιού [4, 5]. Λόγω της υψηλής ανοσογονικότητας της πρωτεΐνης S, θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος για την ανάπτυξη εμβολίου SARS-CoV-25–7]. Τα υποψήφια εμβόλια για τον COVID-19 θα μπορούσαν να αναπτυχθούν χρησιμοποιώντας απενεργοποιημένο ιό, ανασυνδυασμένα ή συνθετικά ιικά συστατικά, ανασυνδυασμένο ιό ή mRNA ή DNA ιού. Η τελευταία προσέγγιση είναι ιδιαίτερα ελκυστική επειδή το ιικό DNA μπορεί να παραχθεί γρήγορα και εύκολα σε όλο τον κόσμο χωρίς σύστημα ψυχρής αλυσίδας. Επιπλέον, πλήρως συνθετικό DNA που προέρχεται από την αλληλουχία που κωδικοποιεί την ιική πρωτεΐνη θα μπορούσε να προκαλέσει τόσο χυμικές όσο και προκαλούμενες από κύτταρα ανοσοαποκρίσεις έναντι των παθογόνων [1]8, 9].

Το εμβόλιο DNA είναι μια ιδανική πλατφόρμα εμβολίων με πολλά πλεονεκτήματα, όπως εύκολο σχεδιασμό και παραγωγή, σταθερότητα σε μια σειρά θερμοκρασιών και χαμηλό κόστος παραγωγής. Ως εκ τούτου, η πλατφόρμα εμβολίου DNA είναι κατάλληλη για ταχεία και μεγάλης κλίμακας κατασκευή κατά τη διάρκεια εστιών μολυσματικών ασθενειών. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα εμβόλια DNA μπορούν να διεγείρουν αποτελεσματικά κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις έναντι παθογόνων σε μοντέλα πρόκλησης10]. Επιπλέον, πρόσφατες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι τα εμβόλια DNA είναι ασφαλή και αποτελεσματικά υποψήφιοι για τη θεραπεία ή την πρόληψη μολυσματικών ασθενειών, όπως ο HIV-1, ο ιός Ζίκα, ο ιός Έμπολα, ο MERS-CoV και οι ιοί της γρίπης.11]. Καθώς η πανδημία του COVID{0}} έχει εξαπλωθεί σε παγκόσμιο επίπεδο και σοβαρά, πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι τα εμβόλια DNA προκάλεσαν ειδικές για αντιγόνο αποκρίσεις Τ-κυττάρων και εξουδετερωτικά αντισώματα και προστάτευσαν περαιτέρω τα ζώα έναντι της πρόκλησης SARS-CoV-2 [12, 13].

Η κύρια πρόκληση των εμβολίων DNA είναι η κακή απόδοση της παροχής DNA στα κύτταρα για έκφραση αντιγόνου και κατά συνέπεια η κακή αποτελεσματικότητα των εμβολίων. Για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα παροχής DNA, μπορούν να χρησιμοποιηθούν φυσικές μέθοδοι ή χημικές μέθοδοι. Οι φυσικές μέθοδοι περιλαμβάνουν ρεύμα αέρα υψηλής πίεσης (π.χ. Biojector), παράδοση DNA με επικάλυψη χρυσού με πιστόλι γονιδίων, διάταξη μικροβελόνων και ηλεκτροδιάτρηση (EP). Οι χημικές μέθοδοι περιλαμβάνουν λιποσώματα, ιοσώματα, νανοσωματίδια και πεπτίδια που διεισδύουν στα κύτταρα.14]. Στο ξέσπασμα του ιού Ζίκα το 2015, ένα εμβόλιο DNA Zika που χορηγήθηκε μέσω ηλεκτροδιάτρησης αναπτύχθηκε σε κλινική δοκιμή φάσης 1 εντός 7 μηνών.15]. Το EP σε συνδυασμό με τον εμβολιασμό DNA αυξάνει σημαντικά την αποτελεσματικότητα των εμβολίων DNA [16–18]. Λόγω των επιτυχημένων αποτελεσμάτων πειραμάτων σε ζώα μετά από εμβολιασμό DNA με EP, έχουν αναπτυχθεί πολλές διαφορετικές συσκευές ηλεκτροδιάτρησης για ανθρώπους, συμπεριλαμβανομένων των Cellectra® (Inovio Inc., ΗΠΑ) και TriGrid® (Ichor Medical Systems, ΗΠΑ).

Αυτή η μελέτη περιγράφει έναν εμβολιασμό DNA με EP που μπορεί να προκαλέσει εξουδετερωτικά αντισώματα και προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις Th1-. Τα χάμστερ που ανοσοποιήθηκαν με αυτήν την τεχνική παρήγαγαν εξουδετερωτικά αντισώματα κατά του SARS-CoV-2. Επιπλέον, τα ανοσοποιημένα χάμστερ επέδειξαν προστατευτική ανοσία σε μια πρόκληση ιού SARS-CoV-2.

Μέθοδοι

Δήλωση Δεοντολογίας

Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC) του NHRI (Αριθμός πρωτοκόλλου: NHRI-IACUC-109077-A).

Κυτταρικές Γραμμές

Ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική σειρά HEK293T καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM, GIBCO) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό αδρανοποιημένου με θερμότητα (FBS, HyClone), 100 U/mL πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (GIBCO) και 2 mL glutamine (GIBCO). Κύτταρα Vero καλλιεργήθηκαν σε μέσο Μ199 (GIBCO) με 5% FBS στους 37 βαθμούς.

Τιτλοδότηση ιών

Οι παραλλαγές SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020 και hCoV-19/Taiwan/78/2020 (παραλλαγή D614G)) ελήφθησαν από τα Κέντρα Ελέγχου Νοσημάτων (CDC) ) στην Ταϊβάν. Ο ιός ενισχύθηκε σε κύτταρα Vero που αναπτύχθηκαν σε μέσο Μ199 συμπληρωμένο με 2 ug/mL TPCK-τρυψίνη (Sigma) στους 37 βαθμούς. Ο τίτλος του ιού προσδιορίστηκε ως προς τη μολυσματική δόση ιστοκαλλιέργειας 50% (TCID50) χρησιμοποιώντας μια τυπική μέθοδο [19]. Εν συντομία, τα κύτταρα Vero σπάρθηκαν (2,4×104 κύτταρα/ανά φρεάτιο) σε τρυβλία 96-φρεατίου και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Μ199 με 5% FBS στους 37 βαθμούς για 24 ώρες για να σχηματιστεί μια μονοστιβάδα. Την επόμενη ημέρα, παρασκευάστηκαν σειριακές αραιώσεις 10- και ο αραιωμένος ιός (100 μL/φρεάτιο) προστέθηκε σε μονοστιβάδες κυττάρων Vero με οκτώ επαναλήψεις ανά αραίωση. Μετά από 4 ημέρες επώασης στους 37 βαθμούς, καταγράφηκαν τα επαγόμενα από τον ιό κυτταροπαθητικά αποτελέσματα (CPE) σε κάθε φρεάτιο και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως TCID50/mL σύμφωνα με τη μέθοδο των Reed και Muench. Όλα τα πειράματα με SARS-CoV-2 διεξήχθησαν στο εργαστήριο βιοασφάλειας επιπέδου 3 (BSL-3) και εγκρίθηκαν από το CDC της Ταϊβάν.

Desert ginseng—Improve immunity (10)

Οφέλη από το cistanche-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Κατασκευή και Χαρακτηρισμός Πλασμιδίου

Οι αλληλουχίες DNA που κωδικοποιούν πλήρους μήκους γονίδια SARS-Spike (Αριθμός πρόσβασης GenBank DQ412574) και SARS-CoV-2 (αριθμός πρόσβασης GenBank: MN908947) βελτιστοποιήθηκαν για χρήση κωδικονίων ποντικιού και συντέθηκαν από την GenScript Biotech. Διαφορετικά θραύσματα του S (tRBD, tRBDTM, tSARS2-S, tSdTM) κατασκευάστηκαν επίσης και ενισχύθηκαν μεμονωμένα με PCR. Όλα τα γονίδια υποκλωνοποιήθηκαν στον κλινικά χρησιμοποιούμενο φορέα pVAX1 με την αλληλουχία Kozak ενσωματωμένη στο 5' άκρο των γονιδίων. Το πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε DH5 Ε. coli για ενίσχυση πλασμιδίου. Τα πλασμίδια εκχυλίστηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα στήλης Qiagen χωρίς ενδοτοξίνες (EndoFree Plasmid Mega Kit).

Παροδική έκφραση και Western Blot

Τα κύτταρα HEK293T επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια DNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο PolyJet™ (SignaGen Laboratories) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 8% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και στυπώθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της ακίδας κουνελιού (40592-Τ62, Sino Biological). Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα αντι-κουνελιού συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (HRP). Οι ειδικές πρωτεΐνες στη μεμβράνη έγιναν ορατές με αντιδραστήριο ECL (Thermo Scientific).

Ανοσοποίηση Ζώων

Τα ποντίκια BALB/c, C57BL/6 και συριακά χάμστερ ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Εκτροφής και Έρευνας Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Ποντίκια ή χάμστερ χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ 6 και 12 εβδομάδων. Αναισθητοποιημένα ποντίκια ή χάμστερ εμβολιάστηκαν με 100 μL διαλύματος που περιείχε υποδεικνυόμενο DNA σε διάστημα 3-εβδομάδων, ακολουθούμενο από ηλεκτροδιάτρηση με ηλεκτροδιάτρηση BTX (ECM830) χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια διάταξης δύο βελόνων (διάμετρος 5-mm ( BTX 45–0121)). Πραγματοποιήθηκε ενδομυϊκή ηλεκτροδιάτρηση σε σταθερή τάση 75 V με 10 παλμούς στα 50 msec/παλμό και με διαστήματα 100 msec μεταξύ των παλμών. Δείγματα αίματος ποντικών και χάμστερ συλλέχθηκαν με δειγματοληψίες αίματος υπογνάθιου ή οπισθοκογχικού, αντίστοιχα. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν στο Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων των Εθνικών Ινστιτούτων Ερευνών Υγείας (NHRI) και διατηρήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ιδρυματικής φροντίδας των ζώων.

Ανοσοδοκιμασία

Η παρουσία S-ειδικών αντισωμάτων στους ορούς προσδιορίστηκε με ELISA. Εν συντομία, 50 μL 4 ug/mL ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (Sino Biological) σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού 0.1 Μ (pH 9,5) επικαλύφθηκαν σε μικροπλάκες 96-πηγαδιού με ολονύκτια επώαση στους 4°C βαθμός . Οι επικαλυμμένες πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με 0,05% Tween 20 σε PBS και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 3% BSA σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Αραιωμένοι οροί από ανοσοποιημένα ζώα εφαρμόστηκαν σε φρεάτια σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Μετά την προσθήκη συζευγμένου με HRP κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Thermo Scientific) ή συζευγμένου με HRP κατσίκας αντι-χάμστερ IgG (Arigo Biolaboratorie), η ανάλυση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας SureBlue TMB 1-Υπόστρωμα Συστατικού Υπεροξειδάσης (KPL). Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA στα 450 nm.

Εξουδετέρωση μόλυνσης από τον ιό SARS-CoV-2

Τα κύτταρα Vero σπάρθηκαν (2,4×104 κύτταρα/φρεάτιο) σε 96-πλάκες φρεατίου για 24 ώρες για να σχηματιστεί μια μονοστιβάδα. Οι προάνοσοι οροί και οι αντιοροί κατά της πρωτεΐνης S SARS-CoV-2 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία στους 56 βαθμούς για 30 λεπτά για να καταστραφούν οι ασταθείς στη θερμότητα μη ειδικές ιικές ανασταλτικές ουσίες. Οι οροί αραιώθηκαν σε αρχική αραίωση 1/20 με μέσο M199, προστέθηκαν σε φρεάτιο που περιείχε 200 TCID50 ιού SARS-CoV-2 σε όγκο 0,2 mL και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 2 ώρες. Στη συνέχεια, το μίγμα ιού-ορού εμβολιάστηκε σε μονοστιβάδες κυττάρων Vero και επωάστηκε στους 37 βαθμούς. Παρασκευάστηκαν τετραπλούν για κάθε αραίωση ορού. Τα χαρακτηριστικά CPE σε κάθε φρεάτιο καταγράφηκαν μετά από 4-5 ημέρες επώασης. Ο τίτλος εξουδετέρωσης ήταν ανάλογος με την υψηλότερη αραίωση του ορού που απέτρεψε τη μόλυνση στο 50% των τετραπλών εμβολιασμών.

ACE2 Ανταγωνισμός ELISA

Η ELISA ανταγωνισμού ACE2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ ορολογικής δοκιμασίας εξουδετέρωσης του τίτλου αντισωμάτων Anti-SARS-CoV-2 (ACROBiosystems) σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο. Εν συντομία, 96-πλάκες φρεατίων επικαλύφθηκαν με 0,5 ug/mL SARS-CoV-2-S RBD πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς . Η πλάκα πλύθηκε και μπλοκαρίστηκε με ρυθμιστικό αποκλεισμού στους 37 βαθμούς για 1,5 ώρα. Μετά από τρεις πλύσεις, βιοτινυλιωμένο ανθρώπινο ACE2 (0.12 ug/mL) προστέθηκε στα φρεάτια, ακολουθούμενο από αραίωση των δειγμάτων ορού και επώαση στους 37 βαθμούς για 1 ώρα. Για τη δημιουργία μιας τυπικής καμπύλης, χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά αντισώμα εξουδετέρωσης κατά του SARS-CoV-2 όπως παρέχεται από το κιτ. Η πλάκα πλύθηκε και προστέθηκε διάλυμα εργασίας στρεπταβιδίνης-HRP σε κάθε φρεάτιο για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Η πλάκα στη συνέχεια πλύθηκε και η δοκιμασία αναπτύχθηκε με επώαση με διάλυμα εργασίας υποστρώματος TMB στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με ένα διάλυμα διακοπής που παρέχεται. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA στα 450 nm. Η ανταγωνιστική δραστηριότητα των αντισωμάτων ορού εκφράστηκε ως το αντίστοιχο επίπεδο αντισώματος αναφοράς.

Δοκιμασία Παραγωγής Κυτοκίνης

Οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA κυτοκίνης. Σπληνοκύτταρα από ανοσοποιημένα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε πυκνότητα 5x106 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 24-πλάκες φρεατίου. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 5 ug/mL ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SARS-CoV-2 Spike (ACROBiosystems) στους 37 βαθμούς για 3 ημέρες. Το υπερκείμενο συλλέχτηκε και προσδιορίστηκε για παραγωγή κυτοκίνης. Τα IL-2, IL-5, IL-13 και IFN- ποντικιού ποσοτικοποιήθηκαν με ELISA χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο σύνολο αντισωμάτων (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πρόκληση ζώων

Συριακά χάμστερ (n=8 ανά ομάδα) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά με ένεση με βελόνα με πλασμιδικό DNA (100 ug/ζώο), ακολουθούμενη από ηλεκτροδιάτρηση ΒΤΧ όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Τέσσερις εβδομάδες μετά τον τελευταίο εμβολιασμό, τα χάμστερ προκλήθηκαν ενδορινικά με 105 TCID50 SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020) σε 50 μL υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο. Το σωματικό τους βάρος (n=4 ανά ομάδα) καταγραφόταν κάθε μέρα για 9 ημέρες μετά την πρόκληση. Τέσσερα χάμστερ σε κάθε ομάδα θυσιάστηκαν την ημέρα 3 μετά την πρόκληση για ποσοτικοποίηση ιικού φορτίου. Για τον προσδιορισμό του ιικού φορτίου στον πνεύμονα, οι ιστοί του αριστερού πνεύμονα ομογενοποιήθηκαν σε 2 mL PBS χρησιμοποιώντας ένα gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotec). Μετά από φυγοκέντρηση στα 600 xg για 5 λεπτά, το διαυγασμένο υπερκείμενο συλλέχτηκε για τιτλοδότηση ζωντανού ιού (δοκιμασία TCID50) και ποσοτικοποίηση ιικού RNA.

Ποσοτικοποίηση Φορτίου Ιϊκού RNA

Ένα διαυγασμένο υπερκείμενο ομογενοποιημένου ιστού αριστερού πνεύμονα από μολυσμένα με SARS-CoV-2-χάμστερ συλλέχτηκε για ανίχνευση ιικού φορτίου. Η εκχύλιση RNA διεξήχθη σε υπερκείμενο ιστού που λύθηκε με TRIzol LS (Ambion) και 10 ng του RNA χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο για αντιδράσεις RT-qPCR. Η RT-qPCR πραγματοποιήθηκε σε σύστημα QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (ABI) χρησιμοποιώντας το κιτ KAPA PROBE FAST Universal One-Step qRT-PCR (KR1282, Roche) με εκκινητές και ανιχνευτές ειδικά για SARS-CoV{{11} (E_Εμπρός Sarbeco: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT, E_Οπίσθια Sarbeco: ATATTGCAGCAGCAGTACGCACACA, E_Sarbeco Probe: FAM-ACACTAGCCATCCTTTACTGCGCTTCG-BH1)20].

Cistanche deserticola—improve immunity (7)

Οφέλη από σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

Στατιστική ανάλυση

Τα στατιστικά δεδομένα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Η στατιστική σημασία των διαφορικών ευρημάτων μεταξύ των πειραματικών ομάδων προσδιορίστηκε με τη δοκιμή Mann-Whitney με δύο ουρές. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν η τιμή p ήταν μικρότερη ή ίση με 0.05.

Αποτελέσματα

Κατασκευή πλασμιδίου και έκφραση αντιγόνου των υποψηφίων εμβολίων

Δημιουργήθηκαν πέντε παραλλαγές του SARS-CoV-2 και ένα κατασκεύασμα SARS-CoV που περιέχει διαφορετικά θραύσματα DNA που κωδικοποιεί πρωτεΐνη ακίδα (Σχήμα 1Α). Επειδή η έκφραση αντιγόνου συσχετίστηκε ισχυρά με την αποτελεσματικότητα του εμβολίου, σχεδιάσαμε διαφορετικά θραύσματα πρωτεΐνης ακίδας, συμπεριλαμβανομένων των RBD (aa319-aa541), RBD σε TM (aa319-aa1236) ή Spike με διαμεμβρανική περιοχή (TM) διαγραφή (aa13-aa1213), με αλληλουχία οδηγό ενεργοποίησης πλασμινογόνου ανθρώπινου ιστού (tPA) που μπορεί να αυξήσει την έκκριση αντιγόνων [21]. Η περιοχή RBD σε TM μπορεί να διατηρήσει την περιοχή S2, η οποία είναι σημαντική για το σχηματισμό της δομής έξι έλικας για τη σύντηξη των κυττάρων [22, 23]. Αυτές οι κατασκευές ήταν οι εξής: πλήρους μήκους S του SARS-CoV (pSARS-S) και SARS-CoV-2 (pSARS2-S), ακίδα πλήρους μήκους με την αλληλουχία οδηγό ιστού-πλασμινογόνου ενεργοποιητής (ptSARS2-S), περιοχή RBD (ptRBD), περιοχή RBD σε διαμεμβρανική περιοχή (ptRBDTM) και ακίδα με διαγραφή της διαμεμβρανικής περιοχής (PTSD). Ο φορέας, το pSARS-S και το pSARS2-S διαμολύνθηκαν και εκφράστηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Το πλήρους μήκους S θα μπορούσε να ανιχνευθεί στο αντίστοιχο μοριακό βάρος (Σχήμα 1Β). Η παραλλαγή S του SARS2-CoV-2 με μια οδηγό αλληλουχία ενεργοποιητή ιστού-πλασμινογόνου ανιχνεύθηκε με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της ακίδας. Τα δεδομένα έδειξαν ότι κάθε παραλλαγή παρατηρήθηκε στο αναμενόμενο μοριακό βάρος (Σχήμα 1C). Τα επίπεδα έκφρασης των παραλλαγών ptSARS2-S, ptRBDTM και ptSdTM ήταν παρόμοια, ενώ η έκφραση ptRBD ήταν υψηλότερη σε όλες τις παραλλαγές.

Fig 1. Design and expression of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. (A) Schematic diagram of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. tPA, leader sequence from tissue-plasminogen activator; TM, transmembrane domain. (B, C) Western blot analysis of spike protein. HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids (vector, pSARS-S, pSARS2-S, and S variants fused with the tPA leader sequence). The cell lysates were collected and probed with an anti-spike antibody, and an anti-β-actin antibody was used as an internal control.


Εικ. 1. Σχεδιασμός και έκφραση παραλλαγών κατασκευής ακίδας SARS-CoV και SARS-CoV-2.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα των παραλλαγών κατασκευής ακίδων SARS-CoV και SARS-CoV-2. tPA, αλληλουχία οδηγός από ενεργοποιητή ιστού-πλασμινογόνου. TM, διαμεμβρανική περιοχή. (Β, Γ) Ανάλυση στυπώματος Western της πρωτεΐνης ακίδας. Τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια (φορέας, pSARS-S, pSARS2-S και S παραλλαγές συντηγμένες με την αλληλουχία οδηγό tPA). Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και διερευνήθηκαν με ένα αντίσωμα κατά της ακίδας και ένα αντίσωμα κατά της ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Ανοσογονικότητα Υποψήφιων Εμβολίων

Για να εξεταστεί η ανοσογονικότητα διαφορετικών παραλλαγών, τα ποντίκια BALB/c ενέθηκαν ενδομυϊκά δύο φορές σε διάστημα 3-βδομάδας με 100 ug φορέα, pSARS-S και pSARS2-S ακολουθούμενη από ηλεκτροδιάτρηση in vivo (Σχήμα 2Α). Οι οροί συλλέχθηκαν την εβδομάδα 4 και την εβδομάδα 6 μετά την πρώτη ανοσοποίηση. Τα δεδομένα έδειξαν ότι οι οροί των ανοσοποιημένων ζώων με pSARS-S και pSARS2-S μπορούσαν να αναγνωρίσουν και τις πλήρους μήκους περιοχές S και S2 του SARS-CoV-2 με παρόμοιους τίτλους αντισωμάτων IgG (Σχήμα 2Β και 2Γ). Αντίθετα, οροί από ανοσοποιημένα ζώα με pSARS2-S θα μπορούσαν να αυξήσουν υψηλούς τίτλους αντισωμάτων κατά της RBD (SARS-CoV-2) την εβδομάδα 4 και την εβδομάδα 6 (Εικ. 2Δ), σε σύγκριση με την ομάδα pSARS-S. Συνεπώς, οροί ανοσοποιημένων ζώων με pSARS2- αλλά όχι ανοσοποιημένων ζώων με pSARS-S θα μπορούσαν να εξουδετερώσουν τη μόλυνση από SARS-CoV-2Εικ. 2Ε). Οι γεωμετρικοί μέσοι τίτλοι (log2) των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στην ομάδα ανοσοποίησης pSARS2-S στις εβδομάδες 4 και 6 ήταν 9,3 και 10,3, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανοσοποίηση pSARS-S δεν μπορεί να προκαλέσει αντισώματα διασταυρούμενης εξουδετέρωσης έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2. Τα ειδικά για το RBD αντισώματα ήταν κρίσιμα για την εξουδετέρωση της δραστηριότητας έναντι της μόλυνσης από SARS-CoV-2. Το πλήρους μήκους S του SARS-CoV-2 μπορεί πράγματι να προκαλέσει υψηλά επίπεδα εξουδετερωτικών τίτλων αντισωμάτων έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2.

Fig 2. Antibody response in mice after immunization with SARS-CoV and SARS-CoV-2 S DNA vaccines. (A) BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of indicated plasmid, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (B-D, F, G) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein, S2 region, and RBD were evaluated by ELISA. (E, H) Vaccine-induced neutralizing antibody against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Εικ. 2. Απόκριση αντισωμάτων σε ποντίκια μετά από ανοσοποίηση με εμβόλια SARS-CoV και SARS-CoV-2 S DNA.

(Α) Ποντίκια BALB/c (n=4 ανά ομάδα) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά δύο φορές σε διάστημα 3- εβδομάδας με 100 ug του υποδεικνυόμενου πλασμιδίου, ακολουθούμενο από ηλεκτροδιάτρηση. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την πρώτη ανοσοποίηση. (BD, F, G) Τα αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ακίδας πλήρους μήκους SARS-CoV-2, της περιοχής S2 και της RBD αξιολογήθηκαν με ELISA. (Ε, Η) Το επαγόμενο από το εμβόλιο εξουδετερωτικό αντίσωμα κατά του SARS-CoV-2 αξιολογήθηκε με δοκιμασία εξουδετέρωσης. Οι τίτλοι αντισωμάτων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM και οι τίτλοι εξουδετέρωσης εκφράζονται ως ο γεωμετρικός μέσος όρος με ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95%. *Π<0.05 by the Mann-Whitney test.

Για να διερευνήσουμε περαιτέρω εάν η αντικατάσταση της αλληλουχίας οδηγού μπορεί να αυξήσει την έκκριση πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε μια αλληλουχία οδηγό από έναν ενεργοποιητή ιστού-πλασμινογόνου για τη σύντηξη διαφορετικών παραλλαγών της πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S. Όλες οι παραλλαγές περιέχουν την περιοχή RBD της πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S. Μετά από δύο δόσεις ανοσοποίησης DNA, οι οροί που συλλέχθηκαν την εβδομάδα 4 και την εβδομάδα 6 αναλύθηκαν για αντίσωμα IgG και τίτλους αντισωμάτων εξουδετέρωσης. Η ανοσοποίηση με ptSARS2-S προκάλεσε υψηλότερους τίτλους αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης S πλήρους μήκους την εβδομάδα 4 από την ανοσοποίηση ptRBD, ptRBDTM και ptSdTM (S1A Εικ). Οι τίτλοι αντισωμάτων αντι-RBD της ανοσοποίησης ptRBD ήταν υψηλότεροι από εκείνους της ανοσοποίησης ptSARS2-S (1496,2 έναντι 530,9, p=0,057) την εβδομάδα 4 (S1B Εικ). Ωστόσο, η ανοσοποίηση ptRBD και ptSARS2-S προκάλεσε παρόμοια επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων την εβδομάδα 4 (S1C Εικ). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην ανάλυση ορών της εβδομάδας 6. Η ανοσοποίηση ptRBD προκάλεσε υψηλότερα επίπεδα αντισωμάτων αντι-RBD σε σύγκριση με την ανοσοποίηση ptSARS2-S (12589,3 έναντι 1000,0, p=0},028) αλλά τα ίδια επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων (9,3 έναντι 9.6 (log2)) (Εικ. 2F, 2G και 2H). Επειδή οι συντηγμένες με αλληλουχία οδηγό tPA παραλλαγές δεν προκάλεσαν υψηλότερους τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων από την ανοσοποίηση pSARS2-S, χρησιμοποιήσαμε pSARS2-S για περαιτέρω έρευνα.

Ανταγωνιστική δέσμευση αντισωμάτων ορού και ACE2 στον SARS-CoV-2 RBD

Για να εξετάσουμε την ικανότητα των αντισωμάτων ορού να παρεμβαίνουν στην αλληλεπίδραση ACE2-RBD, πραγματοποιήσαμε μια ανταγωνιστική ορολογική δοκιμασία SARS-CoV-2. Σε αυτή τη δοκιμασία, αντισώματα ορού προστέθηκαν σε πλάκες ELISA προεπικαλυμμένες με πρωτεΐνη SARS-CoV-2 RBD, ακολουθούμενα από την προσθήκη ανθρώπινης πρωτεΐνης ACE2. Ως αναφορά χρησιμοποιήθηκε ένα ειδικό εξουδετερωτικό αντίσωμα κατά του SARS-CoV-2 RBD. Όπως φαίνεται στοΕικ. 3, αντισώματα ορού από ποντίκια ανοσοποιημένα με pSARS2-S δεσμεύτηκαν στο RBD και απέκλεισαν τη δέσμευση ACE2, που ισοδυναμούσε με περίπου 353 ug/mL αντισώματος αναφοράς, ενώ ο ορός pSARS-S ισοδυναμούσε με 56 ug/mL αντισώματος αναφοράς. Επομένως, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι η ανοσοποίηση του pSARS2-S θα μπορούσε να προκαλέσει ανταγωνιστικά αντισώματα που εμποδίζουν αποτελεσματικά τη σύνδεση του SARS-CoV-2 RBD στον υποδοχέα ACE2. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν συνεπές με τον τίτλο ELISA έναντι του SARS-CoV2 RBD (Εικ. 2Δ), και υποστηρίζεται από τη μελέτη σχετικά με τη διαφορά των αλληλουχιών RBD μεταξύ SARS-CoV και SARS-CoV-2 [24].


Fig 3. Competitive activity of immunized mouse sera against the RBD/ACE2 interaction. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at week 8 after the first immunization. Serum antibodies that compete with ACE2 for RBD binding were evaluated by competitive SARS-CoV-2 serology assay. The competitive activity of the mouse sera is expressed as the equivalent level of anti-RBD (SARS-CoV-2 spike protein) antibody (reference antibody). Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Σχήμα 3. Ανταγωνιστική δραστηριότητα ανοσοποιημένων ορών ποντικών έναντι της αλληλεπίδρασης RBD/ACE2.

Ποντίκια BALB/c (n=4 ανά ομάδα) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά δύο φορές σε διάστημα 3-βδομάδας με 100 ug φορέα, pSARS-S ή pSARS2-S, ακολουθούμενη από ηλεκτροδιάτρηση. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν την εβδομάδα 8 μετά την πρώτη ανοσοποίηση. Τα αντισώματα ορού που ανταγωνίζονται το ACE2 για τη δέσμευση RBD αξιολογήθηκαν με ανταγωνιστική ορολογική δοκιμασία SARS-CoV-2. Η ανταγωνιστική δραστηριότητα του ορού ποντικού εκφράζεται ως το ισοδύναμο επίπεδο αντισώματος κατά της RBD (SARS-CoV-2 ακίδα πρωτεΐνης) (αντίσωμα αναφοράς). Οι τίτλοι αντισωμάτων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM. *Π<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S DNA μακροχρόνια χυμική ανοσία που προκαλείται από το εμβόλιο και προσφέρει διασταυρούμενη προστασία κατά του SARS-CoV-2 με μετάλλαξη D614G

Συγκεκριμένα, η μακροχρόνια διατήρηση των τίτλων αντισωμάτων IgG έναντι πλήρους μήκους S παρατηρήθηκε στις 20 εβδομάδες μετά την πρώτη ανοσοποίηση (Σχήμα 4Α). Οι γεωμετρικοί μέσοι τίτλοι (log2) για το εξουδετερωτικό αντίσωμα SARS-CoV-2 έφθασαν στο 10,8 την εβδομάδα 8 μετά από ανοσοποιήσεις pSARS2-S, μειώνοντας ελαφρά σε 9,1 την εβδομάδα 12 και σε 8,8 την εβδομάδα 20 (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ανοσοποίηση του pSARS2-S προσδίδει μια μακροχρόνια χυμική απόκριση κατά του SARS-CoV-2. Επιπλέον, το εμβόλιο pSARS2-S DNA με τον γονότυπο D614 προκάλεσε μια εξουδετερωτική απόκριση αντισωμάτων έναντι του ιού που περιέχει τη μετάλλαξη D614G (Εικ. 4Γ), το οποίο είναι παρόμοιο με τους τίτλους εξουδετέρωσης έναντι του γονότυπου D614. Επομένως, το pSARS2-S μπορεί να προσφέρει διασταυρούμενη προστασία έναντι της πιο διαδεδομένης και κυρίαρχης παραλλαγής D614G του SARS-CoV-2.

Fig 4. SARS-CoV-2 S DNA vaccine induced long-term humoral immunity and cross-protection against the SARS-CoV-2 with D614G mutation. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized three times at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (A) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (B, C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 with D614 or G614 genotypes was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Εικ. 4. Το εμβόλιο SARS-CoV-2 S DNA προκάλεσε μακροχρόνια χυμική ανοσία και διασταυρούμενη προστασία έναντι του SARS-CoV-2 με μετάλλαξη D614G.

Ποντίκια BALB/c (n=4 ανά ομάδα) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά τρεις φορές σε διάστημα 3-βδομάδας με 100 ug φορέα, pSARS-S ή pSARS2-S, ακολουθούμενη από ηλεκτροδιάτρηση. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την πρώτη ανοσοποίηση. (Α) Τα αντισώματα κατά του SARS-CoV-2 πλήρους μήκους πρωτεΐνης ακίδας αξιολογήθηκαν με ELISA. (Β, Γ) Η επαγόμενη από το εμβόλιο εξουδετερωτική δραστηριότητα κατά του SARS-CoV-2 με γονότυπους D614 ή G614 αξιολογήθηκε με δοκιμασία εξουδετέρωσης. Οι τίτλοι αντισωμάτων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM και οι τίτλοι εξουδετέρωσης εκφράζονται ως ο γεωμετρικός μέσος όρος με ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95%. *Π<0.05 by the Mann-Whitney test.

Επαγωγή Th1- Ή Th2-Προκατειλημμένων απαντήσεων

Τα τελεστικά CD4+ Τ κύτταρα μπορούν να υποδιαιρεθούν σε δύο κύρια λειτουργικά υποσύνολα, Th1 και Th2, με βάση τις εκκρινόμενες κυτοκίνες κατά την ενεργοποίηση. Τα κύτταρα Th1 παράγουν φλεγμονώδεις κυτοκίνες (IFN-) και συμμετέχουν σε κυτταρομεσολαβούμενες ανοσολογικές αποκρίσεις προς ενδοκυτταρικά βακτήρια και ιούς, ενώ τα κύτταρα Th2 εκκρίνουν κυρίως βοηθούν τα Β κύτταρα να παράγουν αντισώματα αλλά επίσης προάγουν την ανοσία που προκαλείται από ηωσινόφιλα (IL-5 και IL{ {9}}), με αποτέλεσμα χυμικές ή αλλεργικές αποκρίσεις [25, 26]. Επιπλέον, οι μηχανισμοί που εξαρτώνται από τα κύτταρα Th2 μπορεί να συμβάλλουν στην ενισχυμένη αναπνευστική νόσο που σχετίζεται με το εμβόλιο (VAERD), όπως φαίνεται από μελέτες υποψηφίων εμβολίων SARS-CoV [27, 28], τα οποία υπογραμμίζουν ότι μια ισορροπημένη απόκριση των Τ κυττάρων είναι κρίσιμη για την ασφαλή ανάπτυξη εμβολίου για τον COVID-1929]. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, τα ποντίκια BALB/c και C57BL/6 ανοσοποιήθηκαν με φορέα, pSARS-S και pSARS2-S δύο φορές σε διάστημα 3-εβδομάδων. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 7 ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση και τα σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν με πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S (5 ug/mL) για 3 ημέρες. Σε ποντίκια BALB/c (Εικ. 5A–5D), η έκκριση των κυτοκινών τύπου Th1 IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) και IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) ήταν υψηλή μετά από διέγερση με πρωτεΐνη S στο pSARS2-S ομάδα ανοσοποίησης, αλλά ανιχνεύθηκαν πολύ χαμηλά επίπεδα των κυτοκινών τύπου Th2 IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) και IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ποντικούς C57BL/6, η ομάδα ανοσοποίησης pSARS2-S προκάλεσε υψηλότερη ποσότητα IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) και IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) και IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Εικ. 5Ε–5Η). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το pSARS2-S θα μπορούσε να προκαλέσει Th1-προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις.

Fig 5. T cell response in mice after immunization with pSARS-S and SARS2-S DNA vaccines. BALB/c (A-D) and C57BL/6 (E-H) mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Splenocytes were collected at week 4 after the first immunization, and the levels of secreted IFN-γ (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G), and IL-13 (D, H) were evaluated after restimulation with recombinant SARS-CoV-2 S protein. Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Εικ. 5. Απόκριση Τ κυττάρων σε ποντικούς μετά από ανοσοποίηση με εμβόλια DNA pSARS-S και SARS2-S.

Ποντίκια BALB/c (AD) και C57BL/6 (EH) (n=4 ανά ομάδα) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά δύο φορές σε διάστημα 3- εβδομάδας με 100 ug φορέα, pSARS-S ή pSARS{{ 8}}S, ακολουθούμενο από ηλεκτροδιάτρηση. Τα σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν την εβδομάδα 4 μετά την πρώτη ανοσοποίηση και τα επίπεδα της εκκρινόμενης IFN- (A, E), IL{11}} (B, F), IL-5 (C, G) και IL -13 (D, H) αξιολογήθηκαν μετά από επαναδιέγερση με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S. Οι τίτλοι αντισωμάτων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM. *Π<0.05 by the Mann-Whitney test.

Πρόκληση για την προφυλακτική αποτελεσματικότητα των εμβολίων DNA κατά του SARS-CoV-2

Για να διερευνηθεί η προστατευτική αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού pSARS2-S, τα συριακά χάμστερ ανοσοποιήθηκαν δύο φορές με 100 ug DNA σε διάστημα 3-εβδομάδας και προκλήθηκαν ενδορινικά με τον ιό SARS-CoV-2 την εβδομάδα 7 (Σχήμα 6Α). Μετά την ανοσοποίηση, συλλέχθηκαν οροί της εβδομάδας 4 και της εβδομάδας 6 για αναλύσεις τίτλου αντισωμάτων κατά της ακίδας (IgG) και τίτλου αντισωμάτων εξουδετέρωσης. Η ανοσοποίηση με pSARS2-S προκάλεσε υψηλότερα επίπεδα τίτλων αντισωμάτων anti-Spike από την ανοσοποίηση ptRBD την εβδομάδα 4 (1584,9 έναντι 50,1) και την εβδομάδα 6 (1995,3 έναντι 63,1) στα χάμστερ (Σχήμα 6Β). Σύμφωνα με τους τίτλους αντισωμάτων anti-Spike, οι οροί των χάμστερ που έχουν ανοσοποιηθεί με pSARS2-S αύξησαν πολύ υψηλούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων (6,5 την εβδομάδα 4 και 6,4 την εβδομάδα 6 (log2)), αλλά οι οροί του φορέα ή Τα ανοσοποιημένα με ptRBD χάμστερ δεν (Εικ. 6Γ). Μετά την πρόκληση με SARS-CoV-2, το σωματικό βάρος του χάμστερ παρακολουθούνταν καθημερινά. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι ο τίτλος του ιού στους πνεύμονες χάμστερ έφτασε σε υψηλό επίπεδο 3 ημέρες μετά την πρόκληση [30]. Επομένως, τα μισά χάμστερ από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν την ημέρα 3 και αναλύθηκε το ιικό φορτίο στον πνεύμονα. Το σωματικό βάρος των εμβολιασμένων με φορέα χάμστερ μειώθηκε σταδιακά και το ποσοστό του σωματικού βάρους που χάθηκε ήταν 11,1% στις 6 ημέρες μετά την πρόκληση. Αντίθετα, η ανοσοποίηση με pSARS2-S προστάτευσε τα χάμστερ από την απώλεια σωματικού βάρους (Εικ. 6Δ). Επιπλέον, οι τίτλοι μολυσματικού ιού και ο αριθμός των αντιγράφων ιικού RNA στην ομάδα pSARS2-S παρουσίασαν μειώσεις 2,29 και 1,37 log10 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα (Εικ. 6Ε και 6ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο εμβολιασμός pSARS2-S παρέχει προστασία έναντι της μόλυνσης από SARS-CoV-2 σε συριακά χάμστερ.

Fig 6. Prophylactic efficacy of SARS-CoV-2 S DNA vaccine in SARS-CoV-2-infected hamsters. (A) Time course of DNA vaccination and SARS-CoV-2 challenge. Syrian hamsters were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of control, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected by retroorbital blood sampling at weeks 4 and 6 after the first immunization. At 4 weeks after the second immunization, Syrian hamsters were intranasally challenged with 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. (D) Body weight change (%) of the hamsters was recorded every day after the SARS-CoV-2 challenge. Virus titers (E) and viral RNA copies (F) in the lungs of SARS-CoV-2-infected hamsters at 3 days post-challenge were determined by TCID50 assay and qRT-PCR, respectively. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Εικ. 6. Προφυλακτική αποτελεσματικότητα του εμβολίου SARS-CoV-2 S DNA σε μολυσμένα με SARS-CoV-2-χάμστερ.

(Α) Χρονική πορεία εμβολιασμού DNA και πρόκληση SARS-CoV-2. Τα συριακά χάμστερ ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά δύο φορές σε διάστημα 3-βδομάδας με 100 ug ελέγχου, pSARS-S ή pSARS2-S, ακολουθούμενη από ηλεκτροπόρωση. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν με οπισθοκογχική δειγματοληψία αίματος στις εβδομάδες 4 και 6 μετά την πρώτη ανοσοποίηση. Στις 4 εβδομάδες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση, τα συριακά χάμστερ προκλήθηκαν ενδορινικά με 105 TCID50 SARS-CoV-2. (Β) Τα αντισώματα κατά του SARS-CoV-2 πλήρους μήκους πρωτεΐνης ακίδας αξιολογήθηκαν με ELISA. (Γ) Η επαγόμενη από το εμβόλιο εξουδετερωτική δραστηριότητα κατά του SARS-CoV-2 αξιολογήθηκε με δοκιμασία εξουδετέρωσης. (Δ) Η αλλαγή σωματικού βάρους (%) των χάμστερ καταγράφηκε κάθε μέρα μετά την πρόκληση SARS-CoV-2. Οι τίτλοι του ιού (Ε) και τα αντίγραφα ιικού RNA (F) στους πνεύμονες των μολυσμένων με SARS-CoV-2-μολυσμένα χάμστερ 3 ημέρες μετά την πρόκληση προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία TCID50 και το qRT-PCR, αντίστοιχα. Οι τίτλοι αντισωμάτων παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM και οι τίτλοι εξουδετέρωσης εκφράζονται ως ο γεωμετρικός μέσος όρος με ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95%. *Π<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Συζήτηση

Έχουν ξεκινήσει περισσότερες από 80 κλινικές δοκιμές εμβολίων για τον COVID-19 και οι μελέτες ανοσογονικότητας και πρόκλησης ιών σε ζώα αποτελούν κρίσιμα βήματα στις διαδικασίες ανάπτυξης εμβολίων. Τα εμβόλια DNA για τη μόλυνση από SARS-CoV-2 έχουν αναπτυχθεί εντατικά για διαφορετικές προσεγγίσεις χορήγησης. Η ηλεκτροδιάτρηση είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση που μπορεί να ενισχύσει την παροχή DNA και την αντιγονικότητα των ανοσογόνων in vivo. Έχουν αναφερθεί δύο μελέτες εμβολίων DNA, από τους Yu et al. [13] και Smith et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 μειώσεις στα ιικά φορτία στη βρογχοκυψελιδική πλύση μετά από πρόκληση σε σύγκριση με τους ελέγχους. Smith et al. διαπίστωσε ότι η ανοσοποίηση ποντικών και ινδικών χοιριδίων με INO-4800 (που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη S πλήρους μήκους) με ηλεκτροδιάτρηση θα μπορούσε να προκαλέσει εξουδετερωτικά αντισώματα κατά της λοίμωξης SARS-CoV-2 και να εμποδίσει τη σύνδεση της πρωτεΐνης S στον υποδοχέα ACE2, αλλά δεν παρέχουν δεδομένα πρόκλησης ζώων. Σε αυτήν την αναφορά, αξιολογήσαμε διαφορετικές παραλλαγές για υποψήφια εμβόλια DNA και βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη S πλήρους μήκους (pSARS2-S) είναι η πιο κατάλληλη για περαιτέρω ανοσολογική μελέτη. Αν και οι SARS-CoV και SARS-CoV-2 μοιράζονται 76% ομολογία στις πρωτεΐνες S τους [31, 32], η ανοσοποίηση του pSARS-S δεν μπορεί να επάγει αντισώματα κατά της RBD της πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S ή εξουδετερωτικούς τίτλους αντισωμάτων έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2Εικ. 2). Πράγματι, τα αντισώματα κατά της RBD παίζουν σημαντικό ρόλο στην παρεμπόδιση της ιογενούς λοίμωξης. Ωστόσο, η ανοσοποίηση μόνο με RBD (ptRBD) δημιούργησε υψηλούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε ποντίκια αλλά όχι σε χάμστερ (Εικ.2Hκαι6C). Υποθέσαμε ότι αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να οφείλεται στο ότι το πεπτίδιο σήματος (ενεργοποιητής ιστού-πλασμινογόνου) αποτυγχάνει να διευκολύνει την έκκριση της πρωτεΐνης RBD στα χάμστερ. Ο λεπτομερής μηχανισμός απαιτεί περαιτέρω μελέτη στο μέλλον. Σημειώσαμε επίσης ότι η ανοσοποίηση ptRBDTM (που κωδικοποιεί ένα θραύσμα από το RBD στη διαμεμβρανική περιοχή του S) προκάλεσε χαμηλότερους τίτλους αντισωμάτων εξουδετέρωσης από την ανοσοποίηση ptRBD (Εικ.2HκαιS1C). Τα αποτελέσματα μπορεί να αντικατοπτρίζουν την ασταθή δομή της πρωτεΐνης RBD-TM. Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι ανοσοαποκρίσεις Th1/Th2, τα σπληνοκύτταρα από ανοσοποιημένα ποντίκια διεγέρθηκαν με πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S. Βρήκαμε ότι η ανοσοποίηση του pSARS2-S προκάλεσε ισχυρές Th1-προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις με υψηλότερα επίπεδα έκκρισης IFN- -μετά τη διέγερση (Εικ. 5), αλλά η ανοσοποίηση του pSARS-S προκάλεσε μόνο χαμηλά επίπεδα έκκρισης IFN- -. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των αποκρίσεων των Τ κυττάρων μεταξύ της πρωτεΐνης ακίδας του SARS-CoV και του SARS-CoV-2 δεν είναι υψηλή (Εικ. 5). Επιπλέον, η ανάλυση IFN-ELISPOT αποκάλυψε ότι ανιχνεύθηκαν λιγότερες αποκρίσεις Τ κυττάρων έναντι της περιοχής S1 σε ποντικούς C57BL/6 και BALB/c ανοσοποιημένους με pSARS-S.S2 Εικ), το οποίο υποστηρίζεται επίσης από τη μελέτη του Smith [12]. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το εμβόλιο SARS ενδέχεται να μην παρέχει πλήρη προστατευτική δράση έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2. Η ανάπτυξη εμβολίων DNA είναι σημαντική για την ταχεία απόκριση στην πανδημική μόλυνση από κορωνοϊό. Ως εκ τούτου, η επιτυχία του εμβολίου DNA κατά του SARS-CoV-2 θα μπορούσε να εφαρμοστεί και σε άλλες επείγουσες μολυσματικές ασθένειες.

Οι διαφορετικές κατασκευές που χρησιμοποιήθηκαν στα εμβόλια SARS-SoV-2 DNA προκάλεσαν διαφορετικά επίπεδα εξουδετερωτικών τίτλων αντισωμάτων. Η αλληλουχία οδηγός tPA έχει χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της έκφρασης και της έκκρισης αντιγόνου σε εμβόλια DNA [21, 33–35]. Ωστόσο, η αλληλουχία οδηγός tPA δεν αύξησε σημαντικά τους τίτλους αντισωμάτων σε αυτήν την αναφορά. Για να αυξηθεί περαιτέρω η αποτελεσματικότητα του εμβολίου, διαφορετικές αλληλουχίες οδηγοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να αντικαταστήσουν την φυσική αλληλουχία οδηγού της πρωτεΐνης ακίδας. Η αλληλουχία οδηγός IgE χρησιμοποιήθηκε στο εμβόλιο INO-4800 DNA και στο εμβόλιο MERS-CoV [5, 12]. Επιπλέον, η τροποποιημένη αλληλουχία πρωτεΐνης ακίδας μπορεί επίσης να αυξήσει την ανοσογονικότητα του εμβολίου. Μια σταθεροποιημένη πρωτεΐνη ακίδας έχει σχεδιαστεί με μετάλλαξη της θέσης της φουρίνης και άλλων περιοχών για τη δημιουργία μιας δομής πρόγχυσης (S{0}}P) που μπορεί να αυξήσει την έκφραση της πρωτεΐνης ακίδας ~10-πλάσια [36]. Ένα ιδανικό εμβόλιο DNA θα πρέπει να βελτιστοποιεί την κατασκευή και το σύστημα χορήγησης πλασμιδικού DNA για να αυξήσει το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης.

Desert ginseng—Improve immunity

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Τα μοντέλα ζώων είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη εμβολίων για τον COVID-19. Έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετά ζωικά μοντέλα για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων για τον COVID-19, συμπεριλαμβανομένων των πρωτευόντων πλην του ανθρώπου [13, 37], ανθρώπινα διαγονιδιακά ποντίκια ACE2 [38] και συριακά χάμστερ [39]. Το ACE2 του συριακού χάμστερ έχει υψηλή ομοιότητα με το ανθρώπινο ACE2 και η συγγένεια δέσμευσής του με την πρωτεΐνη S του SARS-CoV-2 προβλέφθηκε υψηλότερη από το ACE2 ποντικού [40]. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα διαγονιδιακά ποντίκια ACE2 ως μοντέλα πρόκλησης SARS-CoV-2, αλλά όχι ποντίκια άγριου τύπου. Μελέτες μετάδοσης του SARS-CoV-2 έχουν δείξει ότι ο ιός μπορεί να μολύνει αποτελεσματικά τα αφελή χάμστερ μέσω άμεσης επαφής ή μέσω αεροζόλ [41]. Η ενδορινική μόλυνση του SARS-CoV-2 μπορεί να αναπαραχθεί και να προκαλέσει παθογένεση στους πνεύμονες των συριακών χάμστερ [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>μείωση 5% από την αρχική τιμή), η οποία συσχετίστηκε με μεγαλύτερη διάρκεια της νόσου [42]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το συριακό χάμστερ είναι επίσης ένα κατάλληλο ζωικό μοντέλο για την αξιολόγηση των εμβολίων COVID-19. Με βάση τη διαθεσιμότητα ζωικών μοντέλων, επιλέξαμε τα χάμστερ ως το μοντέλο πρόκλησης SARS-CoV-2 για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του εμβολίου. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η ανοσοποίηση με pSARS2-S, αλλά όχι με ptRBD, μπορεί να προκαλέσει υψηλούς τίτλους αντισωμάτων αντι-Spike IgG και εξουδετερωτικούς τίτλους αντισωμάτων (Εικ. 6Β και 6Γ). Αντίστοιχα, τα χάμστερ που έχουν ανοσοποιηθεί με pSARS2-, αλλά όχι τα χάμστερ που έχουν ανοσοποιηθεί με ptRBD, δημιούργησαν ανοσοαποκρίσεις έναντι της πρόκλησης SARS-CoV-2. Σημειώσαμε ότι η ανοσοποίηση ptRBD θα μπορούσε να προκαλέσει υψηλά επίπεδα εξουδετερωτικών τίτλων αντισωμάτων σε ποντίκια αλλά όχι σε χάμστερ. Τα αντικρουόμενα αποτελέσματα μπορεί να είναι επειδή η RBD μόνη της δεν εκφράζεται σταθερά στα χάμστερ. Το μοντέλο χάμστερ χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αξιολόγηση του εμβολίου COVID-19 που βασίζεται σε φορέα ορότυπου αδενοϊού 26 (Ad26). Μία μεμονωμένη ανοσοποίηση με το εμβόλιο που βασίζεται σε φορέα Ad26 που εκφράζει μια σταθεροποιημένη πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 που προκάλεσε αντιδράσεις εξουδετέρωσης αντισωμάτων και προστατεύει από τη μόλυνση από SARS-CoV-2 που προκαλείται απώλεια βάρους, μερική θνησιμότητα και ιική αναπαραγωγή στον πνεύμονα [39]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μοντέλο χάμστερ είναι κατάλληλο για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων COVID-19.

Πολλές προσπάθειες ανάπτυξης εμβολίων SARS-CoV-2 βασίζονται στην ερευνητική εμπειρία των MERS-CoV και SARS-CoV. Σε παγκόσμιο επίπεδο, αρκετά εμβόλια για τον COVID-19 έχουν εγκριθεί για επείγουσα χρήση τον Δεκέμβριο του 2020, συμπεριλαμβανομένων των εμβολίων COVID-19 που βασίζονται σε φορείς RNA και αδενοϊού. Τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των διαφορετικών πλατφορμών εμβολίων έχουν συζητηθεί [43]. Τα εμβόλια φορέα αδενοϊού μπορεί να προκαλέσουν ισχυρότερες ανοσολογικές αποκρίσεις από τα εμβόλια DNA και mRNA, αλλά η αποτελεσματικότητα του εμβολίου τους θα μπορούσε να μειωθεί μέσω της προϋπάρχουσας ανοσίας έναντι των φορέων Ad [44]. Σε σύγκριση με το εμβόλιο DNA, το εμβόλιο mRNA χρειάζεται εξαιρετικά χαμηλή θερμοκρασία για αποθήκευση και μεταφορά [45]. Ως εκ τούτου, το εμβόλιο DNA θα μπορούσε να είναι μια πιθανή πλατφόρμα εμβολίου, ειδικά κατά τη χρήση έκτακτης ανάγκης.

Η μελέτη μας προτείνει τη δυνατότητα ενός εμβολίου DNA για ανθρώπινη χρήση. Περαιτέρω μελέτες θα μπορούσαν να διερευνήσουν την αποτελεσματικότητα αυτού του εμβολίου DNA που χορηγείται χρησιμοποιώντας ενδοδερμική (ID) ένεση, η οποία είναι πιο βολική για κλινική εφαρμογή, επειδή η βελόνα για την ενδοφλέβια ένεση έχει βάθος περίπου 18 mm στον άνθρωπο και επηρεάζει περισσότερους ιστούς από την ένεση ID με EP. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα του εμβολίου θα πρέπει να δοκιμαστεί σε ηλικιωμένα ποντίκια ως μοντέλο για ηλικιωμένους ανθρώπους, επειδή αυτός ο πληθυσμός επηρεάζεται ιδιαίτερα σοβαρά όταν μολύνεται από τον SARS-CoV-2. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η απόκριση των κυττάρων Th2 έχει συσχετιστεί με ενισχυμένη αναπνευστική νόσο (VAERD) μετά τον εμβολιασμό εμβολίων αδρανοποιημένου ιού κατά του RSV [46], ιός ιλαράς [47] και SARS-CoV [27, 48]. Αντίθετα, αναφέρθηκαν λιγότερο σοβαρές περιπτώσεις SARS-CoV που προκύπτουν από την επαγωγή της ανταπόκρισης των κυττάρων Th1 [49]. Ως εκ τούτου, οι ισχυρές Th1-προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από το εμβόλιο DNA υποδηλώνουν ότι οι παρενέργειες είναι απίθανο να είναι ένα σημαντικό πρόβλημα [50]. Εκτός από αυτό, ανησυχίες σχετικά με τα εμβόλια με βάση τις πρωτεΐνες έχουν εγερθεί λόγω της χρήσης άλατος αλουμινίου ή ανοσοενισχυτικών τύπου γαλακτώματος λαδιού σε νερό, τα οποία οδηγούν σε προκατειλημμένες ανοσοαποκρίσεις Th{{4} και αυξάνουν τις πιθανές παρενέργειες [51, 52]. Συνοπτικά, το εμβόλιο DNA για τον COVID-19 μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της πανδημίας COVID-19 στο εγγύς μέλλον.

βιβλιογραφικές αναφορές

  1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Οικονομικές συνέπειες της επιδημίας COVID-19: Η ανάγκη για ετοιμότητα για επιδημία. Μέτωπο Δημόσιας Υγείας. 2020; 8:241. pmid:325743072. Κέντρο Επιστήμης και Μηχανικής Συστημάτων (CSSE) [Διαδίκτυο]. Πίνακας ελέγχου COVID-19. Πανεπιστήμιο Johns Hopkins. [αναφέρθηκε στις 11 Φεβρουαρίου 2021]. Διαθέσιμο από:
  2. 3. Buchholz UJ, Bukreyev Α, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao Κ, et al. Συνεισφορά των δομικών πρωτεϊνών του κορωνοϊού με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο στην προστατευτική ανοσία. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid:15210961
  3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao Κ, et al. Ένα εμβόλιο DNA προκαλεί εξουδετέρωση του κορωνοϊού SARS και προστατευτική ανοσία σε ποντίκια. Φύση. 2004;428(6982):561–4. pmid: 15024391
  4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Ένα συνθετικό συναινετικό εμβόλιο DNA κατά της πρωτεϊνικής ακίδας επάγει προστατευτική ανοσία έναντι του κορονοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής σε πρωτεύοντα μη ανθρώπινα θηλαστικά. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid:26290414
  5. 6. Εμβόλια Krammer F. SARS-CoV-2 υπό ανάπτυξη. Φύση. 2020;586(7830):516–27. pmid:32967006
  6. 7. Khalaj-Hedayati A. Προστατευτική ανοσία κατά των υποψηφίων εμβολίων υπομονάδας SARS με βάση την πρωτεΐνη Spike: Μαθήματα για την ανάπτυξη εμβολίου για τον κορωνοϊό. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid:32695833
  7. 8. Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, et al. Χυμικές και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από εμβόλια DNA 3a κατά του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) ή του κορωνοϊού τύπου SARS σε ποντίκια. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16 (1): 73–7. pmid:18987164
  8. 9.Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Διέγερση εξουδετερωτικών αντισωμάτων με εμβόλια DNA που εκφράζουν τριμερή γλυκοπρωτεΐνης φακέλου τύπου 1 διαλυτού σταθεροποιημένου ιού ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας συζευγμένα με C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid:15078953
  9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Βελτιστοποίηση εμβολίου DNA κατά του SARS. DNA Cell Biol. 2007; 26(10):721–6. pmid:17665998
  10. 11.Gary EN, Weiner DB. Εμβόλια DNA: η ώρα έναρξης είναι τώρα. Curr Opin Immunol. 2020; 65:21–7. pmid:32259744
  11. 12. Smith TRF, Patel Α, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, et αϊ. Ανοσογονικότητα ενός υποψηφίου εμβολίου DNA για τον COVID-19. Nat Commun. 2020; 11(1):2601. pmid:32433465
  12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, et al. Προστασία εμβολίου DNA κατά του SARS-CoV-2 σε μακάκους ρέζους. Επιστήμη. 2020; 369 (6505): 806–11. pmid:32434945
  13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Μέθοδοι χορήγησης για την αύξηση της κυτταρικής πρόσληψης και της ανοσογονικότητας των εμβολίων DNA. Εμβόλιο. 2016; 34 (46): 5488–94. pmid:27742218
  14. 15. Kudchodkar SB, Choi Η, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong Μ, et αϊ. Ταχεία ανταπόκριση σε μια αναδυόμενη μολυσματική ασθένεια - Διδάγματα από την ανάπτυξη ενός συνθετικού εμβολίου DNA που στοχεύει τον ιό Ζίκα. Μικρόβια μολύνουν. 2018; 20 (11–12): 676–84. pmid:2955534516. Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Έμφυτη μοριακή και κυτταρική υπογραφή στο δέρμα που προηγείται των μακροχρόνιων αντιδράσεων των κυττάρων Τ μετά από εμβολιασμό με ηλεκτροδιάτρηση DNA. J Immunol. 2020; 204 (12): 3375–88. pmid:32385135
  15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, et αϊ. Μια νέα πρωτότυπη συσκευή για τη χορήγηση εμβολίου DNA με ενισχυμένη ηλεκτροδιάτρηση ταυτόχρονα τόσο στο δέρμα όσο και στους μυς. Εμβόλιο. 2011; 29 (39): 6771–80. pm:21199706
  16. 18. Williams Μ, Ewing D, Blevins Μ, Sun Ρ, Sundaram AK, Raviprakash KS, et αϊ. Ενισχυμένη ανοσογονικότητα και προστατευτική αποτελεσματικότητα ενός τετραδύναμου εμβολίου DNA του δάγγειου πυρετού χρησιμοποιώντας ηλεκτροδιάτρηση και ενδοδερμική χορήγηση. Εμβόλιο. 2019; 37 (32): 4444–53. pmid:31279565
  17. 19. Ramakrishnan MA. Προσδιορισμός του τίτλου τελικού σημείου 50% χρησιμοποιώντας έναν απλό τύπο. World J Virol. 2016; 5 (2): 85–6. pmid:27175354
  18. 20. Corman VM, Landt Ο, Kaiser Μ, Molenkamp R, Meijer Α, Chu DK, et al. Ανίχνευση του νέου κοροναϊού 2019 (2019-nCoV) με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Euro Surveill. 2020. pmid:31992387
  19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q, et al. Η αλληλουχία σήματος του ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστού (tPA) ενισχύει την ανοσογονικότητα του εμβολίου κατά της φυματίωσης που βασίζεται σε MVA. Immunol Lett. 2017; 190:51–7. pmid:28728855
  20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y, et αϊ. Μηχανισμός σύντηξης 2019-nCoV και αναστολέων σύντηξης που στοχεύουν τον τομέα HR1 σε πρωτεΐνη ακίδας. Cell ΜοΙ Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid:32047258
Μπορεί επίσης να σας αρέσει