Η εξαρτώμενη από το DNA καταλυτική υπομονάδα πρωτεϊνικής κινάσης (DNA-PKcs) οδηγεί την εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου σε αρσενικά ποντίκια

Κάκωση νεφρούπροκαλεί επιθηλιακή αποδιαφοροποίηση και μυοΦιενεργοποίηση βροβλαστών κατά τη διάρκεια τηςεξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου. Εδώ, εμείςΦικαι ότι η έκφραση των DNA-PKcs είναι σημαίνουσαΦιαυξήθηκε κατακόρυφα στονεφρικούς ιστούς και των δύο χρόνιων νεφρικών παθήσεωνασθενείς και αρσενικά ποντίκιαπου προκαλείται από μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρακαιμονόπλευρη βλάβη ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. In vivo, νοκ-άουτ DNA-PKc ή θεραπεία με το είδος τουΦιο αναστολέας c NU7441 παρεμποδίζει τηνανάπτυξη χρόνιας νεφρικής νόσουσε αρσενικά ποντίκια. In vitro, DNA-PKcs deΦιΤο ciency διατηρεί τον φαινότυπο των επιθηλιακών κυττάρων και αναστέλλειΦιενεργοποίηση βρωβλαστών που προκαλείται από τον μετασχηματισμό του αυξητικού παράγοντα-βήτα 1. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το TAF7, ως πιθανό υπόστρωμα του DNA-PKcs, ενισχύει την ενεργοποίηση του mTORC1 ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση RAPTOR, η οποία στη συνέχεια προάγει τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό σε τραυματισμένα επιθηλιακά κύτταρα και μυοΦιβροβλάστες. Συνολικά, τα DNA-PKcs μπορούν να ανασταλούν για τη διόρθωση του μεταβολικού επαναπρογραμματισμού μέσω της σηματοδότησης TAF7/mTORC1 στοχρόνια νεφρική νόσοςκαι χρησιμεύει ως πιθανός στόχος για θεραπείαχρόνια νεφρική νόσος. 

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΜΑΘΕΤΕ ΓΙΑ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ CISTANCHE ΓΙΑΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ

Χρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) επηρεάζει το 10% των ενηλίκων παγκοσμίως1. Η ΧΝΝ αποτελεί τεράστιο βάρος για την παγκόσμια δημόσια υγεία, καθώς έχει μεγάλη πιθανότητα να εξελιχθεί σε αυτήννεφρική νόσο τελικού σταδίου(ESRD), που απαιτεί αιμοκάθαρση ή μεταμόσχευση νεφρού1,2. Η νεφρική διάμεση ίνωση είναι ένα από τα κύρια παθολογικά χαρακτηριστικά της ΧΝΝ2-4. Πολλά από τα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά της ινώσεως των νεφρών κοινοποιούνται σε άλλες ινωτικές ασθένειες, όπως η κίρρωση του ήπατος και οι μυοκαρδιοπάθειες5. Δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες για τη ΧΝΝ, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για καλύτερη κατανόηση των παθολογικών μηχανισμώνυποκείμενη ΧΝΝ.

Στους τραυματισμένους νεφρούς, η διάμεση ίνωση περιλαμβάνει την ανώμαλη έκφραση πλεονεκτικών παραγόντων, όπως ο μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-βήτα 1 (TGF- 1), η αποδιαφοροποίηση του επιθηλίου και η ενεργοποίηση των μυοϊνοβλαστών2. Ως βασικός μεσολαβητής της διάμεσης ίνωσης, το TGF- 1 όχι μόνο ενεργοποιεί την έκφραση ινωτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της ακτίνης λείου μυός ( -SMA), της ινονεκτίνης (FN) και των κολλαγόνων, αλλά προάγει επίσης τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό που μοιάζει με το φαινόμενο Warburg του νεφρικά κύτταρα6,7. Πρόσφατα, αναδυόμενα στοιχεία κατέδειξαν τη σχέση μεταξύ μεταβολικής απορρύθμισης και διάμεσης ίνωσης, αποκαλύπτοντας ότι ο μεταβολικός επαναπρογραμματισμός συμβαίνει στα νεφρικά κύτταρα (νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα8,9 και μυοϊνοβλάστες10) κατά τη διάρκεια της νεφρικής βλάβης και συμβάλλει στην ανάπτυξη ΧΝΝ. Ο μεταβολικός επαναπρογραμματισμός στα νεφρικά κύτταρα προκαλεί δραστική μείωση της οξείδωσης λιπαρών οξέων (FAO) και μεταβολική στροφή προς τη γλυκόλυση, συμβάλλοντας στη διήθηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού και στη διάμεση ίνωση7,11,12. Επιπλέον, κλινικά δεδομένα έχουν αποκαλύψει ότι οι οδοί του μεταβολισμού και της φλεγμονής είναι απορυθμισμένες σε ασθενείς με ΧΝΝ7. Η αποκατάσταση του FAO ή η αναστολή της γλυκόλυσης μέσω γενετικών ή φαρμακολογικών μεθόδων εξασθενεί την ίνωση σε διάφορα ζωικά μοντέλα νεφρικής ίνωσης11,13-15.

Στους μοριακούς μηχανισμούς του μεταβολικού επαναπρογραμματισμού, ο στόχος των θηλαστικών της ραπαμυκίνης (mTOR), που είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης, δρα στη ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων και στη διατήρηση της μεταβολικής ομοιόστασης16,17. Δύο διακριτά λειτουργικά σύμπλοκα του mTOR έχουν οριστεί σύμφωνα με τις πρωτεΐνες δέσμευσής του. Το σύμπλεγμα MTOR 1 (mTORC1) αλληλεπιδρά με τον ειδικό του ρυθμιστή RAP TOR και είναι ευαίσθητο στη ραπαμυκίνη18,19. Το σύμπλεγμα mTOR 2 (mTORC2) ρυθμίζεται από το RICTOR20. Η χρόνια ενεργοποίηση του mTORC1 προάγει τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένης της νεφρικής διάμεσης ίνωσης9,21-23, αλλά οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτή την ενεργοποίηση, ειδικά στη διάμεση ίνωση, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι.

Η εξαρτώμενη από το DNA πρωτεϊνική κινάση (DNA-PK), ένα τριμερές σύμπλοκο που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα (DNA-PKcs) και ένα ετεροδιμερές Ku70/80, ενεργοποιείται από θραύσματα διπλής αλυσίδας DNA (DSBs)24,25 ή ROS26. Μια πολύ γνωστή λειτουργία του DNA-PK είναι η μεσολάβηση της μη ομόλογης σύνδεσης άκρου (NHEJ), η οποία ενώνει προγραμματισμένα DSB που δημιουργούνται κατά τον ανασυνδυασμό V(D)J και παίζει βασικό ρόλο στον ανασυνδυασμό των λεμφοκυττάρων25. Ως αποτέλεσμα, μεταλλάξεις στα DNA-PKcs σταματούν την ανάπτυξη των Τ και Β λεμφοκυττάρων, λόγω της ανεπάρκειας του ανασυνδυασμού V (D) J27,28. Ωστόσο, η επιβράδυνση της ανάπτυξης ή η υψηλή συχνότητα ανάπτυξης λεμφώματος Τ-κυττάρων δεν εμφανίστηκε σε ποντίκια με νοκ-άουτ DNA-PKcs28. Αν και είναι αισθητήρας DNA DSB, το DNA-PKcs έχει κάποιες ασυνήθιστες ιδιότητες, όπως η συσσώρευση στα κύτταρα σε επίπεδο πολύ μεγαλύτερο από αυτό που πιθανότατα χρειάζεται για το NHEJ29. Επιπλέον, το DNA-PKcs βρίσκεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα30. Σε συμφωνία με τις ασυνήθιστες ιδιότητές του, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι το DNA-PKcs έχει πρόσθετες λειτουργίες εκτός του NHEJ31. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα USF-1 με τη μεσολάβηση του DNA-PKcs προάγει τη σύνθεση λιπαρών οξέων που προκαλείται από την ινσουλίνη32 και το DNA-PKcs προάγει τη μεταβολική πτώση κατά τη γήρανση33. Η έρευνα σχετικά με τις μη NHEJ λειτουργίες των PKcs του DNA, όπως ο μεταβολισμός και η γήρανση, μόλις ξεκίνησε και μια σειρά από ερωτήματα παραμένουν αναπάντητα31. Επιπλέον, ως μία από τις κινάσες που σχετίζονται με τη φωσφοϊνοσιτιδική 3-κινάση (PI3K), το DNA-PK βρέθηκε ότι ρυθμίζει την ενεργοποίηση του mTOR34.

Σε αυτή την εργασία, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το DNA-PKcs μεσολαβεί στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης RAPTOR/mTORC1 μέσω της φωσφορυλίωσης του παράγοντα 7 που σχετίζεται με την πρωτεΐνη δέσμευσης TATA-box (TAF7) στη ΧΝΝ. Η αναστολή του DNA-PKcs διορθώνει τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό σε τραυματισμένα επιθηλιακά κύτταρα και μυοϊνοβλάστες σε ΧΝΝ. Τα DNA-PKcs μπορεί να χρησιμεύσουν ως νέος πιθανός στόχος για τη θεραπεία της ΧΝΝ.

Αποτελέσματα

Το DNA-PKcs είναι αυξημένο στους νεφρούς ασθενών με ΧΝΝ και σε ποντίκια με νεφρική ίνωση

Η δραστικότητα του DNA-PKcs αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση της αυτοφωσφορυλίωσης S2056 σε DNA-PKcs (p-DNA-PKcs) σε υγιείς ιστούς ανθρώπινου νεφρού και CKD. Τα μη όγκου τμήματα των δειγμάτων νεφρεκτομής χρησιμοποιήθηκαν ως «υγιείς» ιστοί νεφρών, οι οποίοι συλλέχθηκαν από ασθενείς με νεφρικό καρκίνωμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το p-DNA-PKcs ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμο σε αυτούς τους φυσιολογικούς ιστούς των νεφρών, αλλά τα επίπεδα πρωτεΐνης του p-DNA-PKcs ήταν αξιοσημείωτα αυξημένα σε ιστούς ανθρώπινου νεφρού ΧΝΝ (Εικ. 1α). Για να προσδιοριστεί η συνάφεια της δραστηριότητας του DNA-PKcs και της νεφρικής ίνωσης in vivo, η έκφραση της φιμπρονεκτίνης (FN), ενός κρίσιμου γονιδίου που σχετίζεται με την ίνωση των νεφρών, αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση και πραγματοποιήθηκε επίσης χρώση Sirius red για να αναλυθεί ο βαθμός της διάμεσης ίνωσης σε ασθενείς με ΧΝΝ (Εικ. 1α). Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν μια θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης του p-DNA-PKcs και του βαθμού διάμεσης ίνωσης (P=0.005, Εικ. 1b, c). Επιπρόσθετα, τα επίπεδα έκφρασης των DNA-PKcs αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών ανθρώπινου CKD (Nephroseq). Βρήκαμε ότι τα επίπεδα mRNA των DNA-PKcs αυξήθηκαν σημαντικά κατά περισσότερο από 1.{20}}πλάσιο σε ιστούς νεφρικής βιοψίας 48 ασθενών με ΧΝΝ σε σύγκριση με τους ελέγχους (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α), παρουσιάζοντας σημαντική θετική συσχέτιση με τον βαθμό νεφρική ίνωση σε ασθενείς (Συμπληρωματικό Σχ. 1β). Επιπλέον, τα αποτελέσματα της ταυτόχρονης χρώσης με ανοσοφθορισμό των p-DNA-PKcs με λεκτίνη Lotus tetragonolobus (LTL) (δείκτης νεφρικού σωληναρίου) ή -SMA (δείκτης μυοϊνοβλαστών) έδειξαν ότι το DNA-PKcs ρυθμίστηκε προς τα πάνω και στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και μυοϊνοβλάστες των ιστών των νεφρών από ασθενείς με ΧΝΝ (Εικ. 1δ, ε). Η ανάλυση μιας διαθέσιμης διαδικτυακής βάσης δεδομένων αλληλουχίας μονοκύτταρου RNA νεφρού (http://humphreyslab.com/SingleCell/) 35 αποκάλυψε ότι το DNA-PKcs mRNA εκφραζόταν ευρέως στα νεφρικά κύτταρα και ρυθμίστηκε προς τα πάνω στους διαβητικούς νεφρούς του ανθρώπου σε σύγκριση με τους νεφρούς ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα . 1γ).

Για να προσδιορίσουμε περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ δραστηριότητας DNA-PKcs και ανάπτυξης νεφρικής ίνωσης, εξετάσαμε στη συνέχεια την έκφραση και τη δραστηριότητα των DNA-PKcs σε δύο μοντέλα νεφρικής ίνωσης σε ποντίκια, μονόπλευρη απόφραξη ουρητήρα (UUO) και μονόπλευρη ισχαιμία-επαναιμάτωση (UIR). Η ανοσοϊστοχημική χρώση των p-DNA-PKcs έδειξε ότι το p-DNA PKcs προκλήθηκε σημαντικά την ημέρα 3 σε σύγκριση με τους ψευδείς μάρτυρες στο μοντέλο UUO και τα επίπεδα πρωτεΐνης του p-DNA-PKcs αυξήθηκαν περαιτέρω καθώς αναπτύχθηκε ίνωση των νεφρών από την ημέρα 3 έως την ημέρα 14 (Εικ. 1στ). Τα αποτελέσματα Western blot και qRT-PCR έδειξαν ότι τα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης και mRNA των DNA-PKcs ήταν επίσης σημαντικά ρυθμισμένα προς τα πάνω στους ιστούς των νεφρών ποντικών UUO σε σύγκριση με τους εικονικούς ελέγχους (Εικ. 1 g και Συμπληρωματικό Σχήμα 1e). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ποντικούς UIR (Εικ. 1h και Συμπληρωματικό Σχήμα 1d, f). Η πιθανή σύνδεση μεταξύ DNA-PKcs και CKD μας ώθησε να διερευνήσουμε περαιτέρω τον ρόλο και τις μηχανιστικές επιπτώσεις των DNA PKcs στη ΧΝΝ.

Προοδευόμενη από DNA-PKcs εξέλιξη της ΧΝΝ σε ποντικούς

Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε ποντίκια νοκ-άουτ DNA-PKcs στα οποία το κωδικοποιημένο με DNA-PKcs γονίδιο Prkdc αποκλείστηκε χρησιμοποιώντας CRISPR/cas9 όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α). Τα ετερόζυγα (+/−) και τα ομόζυγα (−/−) νοκ-άουτ και άγριου τύπου (WT) ποντίκια DNA-PKcs διακρίθηκαν με γονότυπο, όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 2α. Τα επίπεδα πρωτεΐνης Prkdc mRNA (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ) και DNA-PKcs (Εικ. 2e) δεν ανιχνεύθηκαν σε ιστούς νεφρών ποντικών DNA-PKcs−/−, υποδεικνύοντας επιτυχές νοκ-άουτ των DNA-PKcs σε ποντίκια. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της στρατηγικής νοκ-άουτ DNA-PKcs στη νεφρική βλάβη και ίνωση, ενήλικα (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) DNA-PKcs-/- και αρσενικά ποντίκια ελέγχου WT υποβλήθηκαν σε UUO και υποβλήθηκαν σε ευθανασία 7 ημέρες μετά την επέμβαση. Η χρώση PAS αποκάλυψε ότι ο βαθμός σωληναριακής ατροφίας και διαστολής που προκαλείται από την UUO βελτιώθηκε σημαντικά σε ποντίκια DNA-PKcs-/- σε σύγκριση με τους ελέγχους WT (Εικ. 2α). Η νεφρική ίνωση επίσης βελτιώθηκε σημαντικά σε ποντίκια DNA-PKcs-/- σε σύγκριση με ποντίκια WT, όπως παρατηρήθηκε και ποσοτικοποιήθηκε με χρώση Masson (Εικ. 2β). Εικόνες ανοσολογικής επισήμανσης για εναπόθεση ενδιάμεσου κολλαγόνου Ι και -SMA έδειξαν ότι και οι δύο κλασικοί προϊβρωτικοί δείκτες μειώθηκαν σημαντικά στους νεφρούς UUO των ποντικών DNA-PKcs-/- σε σύγκριση με τους ελέγχους WT (Εικ. 2c, d). Τα επίπεδα πρωτεϊνών των προφιβρωτικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων των FN και -SMA, μειώθηκαν επίσης σημαντικά στους νεφρούς UUO των ποντικών DNA-PKcs-/-, όπως αναλύθηκε με στύπωμα Western (Εικ. 2e). Η ανάλυση QRT-PCR έδειξε ότι η εξάλειψη των DNA-PKcs σε ποντίκια μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης των κρίσιμων γονιδίων νεφρικής ίνωσης, συμπεριλαμβανομένων των Col1a1, Col3a1, Fn1 και Acta2, τα οποία ρυθμίστηκαν σε μεγάλο βαθμό στους νεφρούς UUO. Σε συμφωνία με τη μειωμένη ίνωση, το νοκ-άουτ DNA PKcs μείωσε επίσης τα επίπεδα mRNA του δείκτη νεφρικής βλάβης KIM-1 που προκαλείται από UUO (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ). Επιπλέον, η φλεγμονή είναι ένα κύριο χαρακτηριστικό της ίνωσης των νεφρών και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της νεφρικής ίνωσης. Έτσι, αναλύσαμε δείκτες που σχετίζονται με φλεγμονή, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών Il1, Il6, Tnf και Mcp1, με qRT-PCR. Στο μοντέλο UUO, βρήκαμε ότι η ανοδική ρύθμιση των φλεγμονωδών κυτοκινών που προκαλείται από την UUO μειώθηκε σημαντικά από το νοκ-άουτ DNA-PKcs (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ). Καθώς τόσο οι κλινικές μελέτες όσο και τα ζωικά μοντέλα παρουσιάζουν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των μακροφάγων και της έκτασης της νεφρικής ίνωσης, τα διηθημένα μακροφάγα στους ιστούς των νεφρών αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημική χρώση για τον δείκτη μακροφάγων F4/80. Οι εικόνες αποκάλυψαν πολλά διεισδυμένα μακροφάγα σε αποφραγμένους νεφρούς ποντικών WT 7 ημέρες μετά την UUO, τα οποία μειώθηκαν αισθητά από το νοκ-άουτ DNA-PKcs (Εικ. 2στ). Ενδιαφέρον, DNA-PKcs

Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω τον αντίκτυπο του νεφρικού σωληναριακού DNA-PKcs στη νεφρική ίνωση, κατασκευάσαμε εγγύς νεφρικό σωληναριακό επιθηλιακό κύτταρο με συγκεκριμένο DNA-PKcs knockout in vivo χρησιμοποιώντας ποντίκια CRISPR/cas9 knockin (Συμπληρωματικό Σχήμα 2e, f). Μετά από υποκαψική έγχυση αδενο-σχετιζόμενου ιού (AAV) που περιέχει οδηγό RNA (gRNA) για DNA-PKcs για τρεις εβδομάδες, τα ποντίκια κεντρικού νεφρικού σωληναριακού κυττάρου knockout DNA-PKcs υποβλήθηκαν σε UUO και ευθανατίστηκαν 7 ημέρες μετά την επέμβαση. Η χρώση με ανοσοφθορισμό των DNA-PKcs έδειξε απουσία DNA-PKcs σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα (Εικ. 2h) αλλά ήταν ακόμα έκφραση σε -SMA θετικούς μυοϊνοβλάστες (Συμπληρωματικό Σχήμα 2g) ποντικών cas9 που ενέθηκαν με AAV-gRNA, σε σύγκριση με σε ποντίκια cas9 στους οποίους έγινε ένεση με ένα AAV χωρίς gRNA για DNA PKcs. Η ανάλυση Western blot έδειξε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα των DNA PKcs και των προφιβρωτικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων των FN και -SMA, μειώθηκαν επίσης σημαντικά στους νεφρούς UUO ποντικών cas9 που έλαβαν ένεση με AAV-sgRNA, σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας ελέγχου (Εικ. 2g) . Παρόμοια με το μοντέλο UUO, τα νοκ-άουτ ποντίκια DNA-PKcs προστατεύτηκαν επίσης από CKD που προκαλείται από UIR (Συμπληρωματικό Σχήμα 2h–m). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διαγραφή των DNA-PKcs εξασθενεί την εξέλιξη της ΧΝΝ σε ποντικούς.

Για να προσδιοριστεί εάν η υπερέκφραση του DNA-PKcs στον νεφρό είναι επαρκής για την πρόκληση νεφρικής ίνωσης, τα πλασμίδια υπερέκφρασης του ανθρώπινου DNA-PKcs (Addgene: 83317) χορηγήθηκαν στους νεφρούς του ποντικού μέσω μιας μεθόδου έγχυσης υψηλής πίεσης στη φλέβα της ουράς, όπως περιγράφεται σε πολλές προηγούμενες μελέτες36. Τριάντα έξι ώρες μετά την ένεση πλασμιδίου DNA-PKcs, στα ποντίκια χορηγήθηκε χειρουργική επέμβαση UUO για 7 ημέρες. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η έκτοπη έκφραση των ανθρώπινων DNA-PKcs είναι επαρκής για να οδηγήσει την εξέλιξη της νεφρικής ίνωσης in vivo (Συμπληρωματικό Σχήμα 3).

Η αναστολή της δραστηριότητας του DNA-PKcs εξασθενεί την ανάπτυξη ΧΝΝ σε ποντικούς

Αυτά τα ευρήματα μας οδήγησαν να εξετάσουμε την πιθανότητα ότι οι αναστολείς των DNA PKcs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την προστασία από τη νεφρική ίνωση. Για να ελέγξουμε την υπόθεσή μας, ενήλικα (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αρσενικά ποντίκια WT υποβλήθηκαν σε καθημερινή αγωγή με τον εξαιρετικά ειδικό αναστολέα DNA-PKcs NU7441 ξεκινώντας 1 ημέρα μετά τη χειρουργική επέμβαση UUO. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU και τα ποντίκια ελέγχου υποβλήθηκαν σε ευθανασία 7 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση UUO και η δραστηριότητα του DNA-PKcs αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με NU7441 ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση των DNA-PKcs στους ιστούς του παιδιού UUO ( Εικ. 3α). Ο βαθμός σωληναριακής ατροφίας και διαστολής που προκλήθηκε από UUO βελτιώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με NU7441 σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα, όπως φαίνεται από τη χρώση PAS (Εικ. 3β). Οι ιστοπαθολογικές αναλύσεις της χρώσης Masson αποκάλυψαν περίπου 50% μείωση της νεφρικής διάμεσης ίνωσης στους αποφραγμένους (UUO) νεφρούς ποντικών που έλαβαν NU{14}}σε σύγκριση με τους νεφρούς UUO ελέγχου φορέα (Εικ. 3γ). Εικόνες χρώσης με ανοσοφθορισμό έδειξαν ότι η εναπόθεση του ενδιάμεσου κολλαγόνου Ι που προκαλείται από UUO μειώθηκε σημαντικά με τη θεραπεία NU7441 (Εικ. 3e). Τα επίπεδα πρωτεϊνών των προφιβρωτικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων των FN και -SMA, που αναλύθηκαν με στύπωμα Western ήταν επίσης σημαντικά μειωμένα στους νεφρούς UUO ποντικών που έλαβαν NU{19}} σε σύγκριση με τους μάρτυρες φορέα (Εικ. 3στ). Η ανάλυση QRT-PCR έδειξε ότι η θεραπεία NU7441 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης των κρίσιμων γονιδίων νεφρικής ίνωσης, συμπεριλαμβανομένων των Col1a1, Col3a1, Fn1 και Acta2, σε ιστούς νεφρών ποντικών UUO σε σύγκριση με μάρτυρες φορέα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4α). Επιπροσθέτως, η διείσδυση μακροφάγων στους ιστούς των νεφρών ποντικών UUO μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με NU7441 σε σύγκριση με μάρτυρες φορέα (Εικ. 3d). Το NU7441 μείωσε επίσης τα επίπεδα έκφρασης δεικτών που σχετίζονται με φλεγμονή, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών Il1, Il6, Tnf και Mcp1, σε ιστούς νεφρών ποντικών UUO, όπως αναλύθηκε με qRT-PCR (Συμπληρωματικό Σχήμα 4a). Περαιτέρω, ποντίκια νοκ-άουτ DNA PKcs υποβλήθηκαν επίσης σε θεραπεία με NU7441 για να εξεταστεί το ενδεχόμενο εκτός στόχου του NU7441. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το NU7441 δεν είχε εμφανές αντι-ινωτικό αποτέλεσμα σε ποντίκια νοκ-άουτ DNA-PKcs (Εικ. 3g, h), υποδηλώνοντας μια συγκεκριμένη δράση του NU7441 σε DNA-PKcs σε αυτό το πειραματικό περιβάλλον.

Η προστατευτική δράση του NU7441 έναντι της νεφρικής βλάβης που προκαλείται από UUO και της νεφρικής ίνωσης επεκτάθηκε στην επαγόμενη από UIR ΧΝΝ. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία NU7441 προστατεύει επίσης από νεφρική βλάβη και ίνωση που προκαλείται από το UIR σε σύγκριση με τους ελέγχους με όχημα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4b–h). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της δραστικότητας του DNA-PKcs από το NU7441, εξασθενεί την εξέλιξη της ΧΝΝ σε ποντικούς.

Εικ. 3|Η αναστολή της δραστηριότητας του DNA-PKcs εξασθενεί την ανάπτυξη ΧΝΝ σε ποντικούς UUO. μια ανοσοϊστοχημική χρώση του p-DNA-PKcs σε νεφρά ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 (40 mg/kg) ή φορέα που υποβλήθηκε σε UUO (ημέρα 7), ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). β Χρώση PAS νεφρών ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκε σε UUO, ράβδοι κλίμακας: 50 μm. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). γ Masson χρώση νεφρών ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκε σε UUO, ράβδοι κλίμακας: 50 μm. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). δ Ανοσοϊστοχημική χρώση του F4/80 σε νεφρά ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκε σε UUO, ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). e Χρώση ανοσοφθορισμού του COL1A1 σε νεφρά ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκε σε UUO, ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). f Επίπεδα πρωτεΐνης FN και -SMA σε νεφρούς ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκαν σε UUO. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). g Επίπεδα πρωτεΐνης FN και -SMA σε νεφρά ποντικών DNA-PKcs−/− ή WT που έλαβαν θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκαν σε UUO. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). h Χρώση με κόκκινο Sirius νεφρών DNA-PKcs−/− ή ποντικών WT που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7441 ή φορέα που υποβλήθηκαν σε UUO. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα ποσοτικοποίησης (μέσος όρος ± SD, n=6 ποντικοί από κάθε ομάδα). Χρησιμοποιήθηκε μη ζευγαρωμένη δοκιμή t δύο ουρών για τον προσδιορισμό των τιμών p για a, c, e. Η μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των τιμών p για b, d, h. Οι αμφίδρομες ANOVA ακολουθούμενες από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Šídák χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των τιμών p για τα f, g. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Η αναστολή του DNA-PKcs διατηρεί τον φαινότυπο των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και ρυθμίζει την ενεργοποίηση των διάμεσων ινοβλαστών in vitro

Ο τραυματισμός του επιθηλίου και η ενεργοποίηση των μυοϊνοβλαστών είναι κεντρικά γεγονότα στην παθογένεση της ΧΝΝ2. Η ανοσοχρώση αποκάλυψε ότι τα p-DNAPKcs προκλήθηκαν προφανώς από τη διέγερση του TGF 1 και στα HK-2 κύτταρα (Εικ. 4a) και στα πρωτογενή σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 5a). Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν ότι τα επίπεδα φωσφορυλίωσης και ολικής πρωτεΐνης των DNA-PKcs ήταν επίσης σημαντικά ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα HK{10}} που έχουν υποστεί επεξεργασία με TGF 1 ή H2O2 (Εικ. 4i και Συμπληρωματικό Σχήμα 5β). Επιπλέον, DNA-PKcs νοκ-άουτ HK-2 κύτταρα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας CRISPR-Cas9 και καλλιεργήθηκαν πρωτεύοντα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού WT και DNA-PKcs-/-. Η επιτυχής κατασκευή των DNA-PKcs νοκ-άουτ HK-2 κυττάρων επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Συμπληρωματικό Σχήμα 5γ). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το νοκ-άουτ των DNA-PKcs ή η αναστολή του DNA-PKcs από το NU7441 βελτίωσε την αποδιαφοροποίηση των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων, όπως φαίνεται από τα χαμηλότερα επίπεδα παραγωγής FN και Col1A1 μετά από έκθεση σε TGF 1 σε DNA-PKcs νοκ-άουτ ή NU{27 }}επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 4b–d, k, l). Ωστόσο, το νοκ-άουτ KU80 ενίσχυσε την παραγωγή FN που προκαλείται από τον TGF 1 σε σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 4m). Όπως το μοντέλο UUO, το νοκ-άουτ DNA-PKcs δεν επιδείνωσε τις θραύσεις του DNA στα κύτταρα HK-2 που προκλήθηκαν από το H2O2 (Συμπληρωματικό Σχήμα 5δ). Το KU70/80 αναγνωρίζει πρώτα τα σπασμένα άκρα του DNA στο DSB και στη συνέχεια στρατολογεί DNA-PKc για να σχηματίσει DNA-PK που είναι απαραίτητο για την επιδιόρθωση του DSB μέσω του NHEJ37. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα DNA-PKcs ενίσχυσαν την προϊνωτική δράση των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων στη ΧΝΝ ανεξάρτητα από τη λειτουργία επιδιόρθωσης του DSB.

Για να διερευνηθεί εάν το DNA-PKcs εμπλέκεται στην ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των διάμεσων ινοβλαστών καλλιεργήθηκαν. Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν ότι τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης και ολικής πρωτεΐνης των DNA-PKcs ρυθμίστηκαν επίσης σημαντικά προς τα πάνω σε κύτταρα NRK-49F που έχουν υποστεί αγωγή με TGF 1 (Εικ. 4j). Η ανοσοχρώση αποκάλυψε ότι η δραστηριότητα των DNA-PKcs προκλήθηκε αξιοσημείωτα από την επεξεργασία με TGF 1 σε κύτταρα NRK-49F (Εικ. 4e) αλλά αναστέλλεται σημαντικά από τη θεραπεία με NU7441. Η θεραπεία των κυττάρων NRK{10}}F με TGF 1 προκάλεσε ενεργοποίηση ινοβλαστών και διαφοροποίηση μυοϊνοβλαστών με ανοδική ρύθμιση των COL1, -SMA και FN, ενώ η προεπεξεργασία με NU7441 αμβλύνει σημαντικά τον προφιβρωτικό φαινότυπο (Εικ. 4f, g, n). Επιπλέον, η θεραπεία NU7441 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NRK-49F που προκλήθηκε από τον TGF 1 σε σύγκριση με τους μάρτυρες φορέα, όπως υποδεικνύεται από τη χρώση EdU (Εικ. 4h). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή του DNA-PKcs διατηρεί τον φαινότυπο των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και ρυθμίζει την ενεργοποίηση των διάμεσων ινοβλαστών που προκαλείται από τον TGF 1 in vitro.

Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης τον μηχανισμό της έκφρασης DNA-PKcs που προκαλείται από το TGF 1-. Πρώτον, βρήκαμε πολλαπλές πιθανές θέσεις δέσμευσης του SMAD2 στην περιοχή προαγωγέα του DNA-PKcs μέσω της ανάλυσης προφίλ δέσμευσης του μεταγραφικού παράγοντα JASPAR 38. Δεύτερον, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας λουσιφεράσης έδειξαν ότι η υπερέκφραση του SMAD2 αύξησε τη μεταγραφική ενεργοποίηση των DNA-PKcs (Συμπληρωματικό Σχήμα 5e) . Επιπρόσθετα, αναλύθηκε επίσης η επίδραση των DNA-PKcs στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης SMAD. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το νοκ-άουτ DNA-PKcs ανέστειλε την ενεργοποίηση του SMAD2/SMAD3 σε μοντέλο ποντικού UUO (Συμπληρωματικό Σχήμα 5στ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το SMAD2/SMAD3 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του DNA PKcs, ενώ το DNA-PKcs ενεργοποίησε το SMAD2/SMAD3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 5g), σχηματίζοντας έναν θετικό βρόχο.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΤΑ ΝΕΦΡΑ