Διαφορετικά αντιιικά συστήματα ζύμης αποτρέπουν τη θανατηφόρα παθογένεση που προκαλείται από τον μυκοϊό LA

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα αντιιικά συστήματα διατηρούνται αξιοσημείωτα από βακτήρια σε θηλαστικά, αποδεικνύοντας ότι μοναδικές γνώσεις για αυτά τα συστήματα μπορούν να αποκτηθούν με τη μελέτη μικροβιακών οργανισμών. Σε αντίθεση με τα βακτήρια, ωστόσο, όπου η μόλυνση από φάγο μπορεί να είναι θανατηφόρα, δεν είναι γνωστή καμία κυτταροτοξική ιική συνέπεια στον εκκολαπτόμενο ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, παρόλο που είναι χρόνια μολυσμένος με έναν δίκλωνο μυκοϊό RNA που ονομάζεται LA. Αυτό εξακολουθεί να ισχύει παρά την προηγούμενη αναγνώριση διατηρημένων αντιιικών συστημάτων που περιορίζουν την αναπαραγωγή του LA. Εδώ, δείχνουμε ότι αυτά τα συστήματα συνεργάζονται για να αποτρέψουν την αχαλίνωτη αντιγραφή LA, η οποία προκαλεί θνησιμότητα σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε υψηλές θερμοκρασίες. Εκμεταλλευόμενοι αυτήν την ανακάλυψη, χρησιμοποιούμε μια οθόνη υπερέκφρασης για να αναγνωρίσουμε αντιικές λειτουργίες για τα ομόλογα ζυμομύκητα της πρωτεΐνης δέσμευσης polyA (PABPC1) και της πρωτεΐνης Larp1 που περιέχει τον τομέα La, που εμπλέκονται και τα δύο στην ιική έμφυτη ανοσία στον άνθρωπο. Χρησιμοποιώντας μια συμπληρωματική προσέγγιση απώλειας λειτουργίας, προσδιορίζουμε νέες αντιικές λειτουργίες για τις διατηρημένες εξωνουκλεάσες RNA REX2 και MYG1. τα ρυθμιστικά σύμπλοκα χρωματίνης SAGA και PAF1. και HSF1, τον κύριο μεταγραφικό ρυθμιστή της απόκρισης πρωτεοστατικού στρες. Μέσω της διερεύνησης αυτών των αντιιικών συστημάτων, δείχνουμε ότι η παθογένεση του LA σχετίζεται με μια ενεργοποιημένη απόκριση πρωτεοστατικού στρες και τη συσσώρευση κυτταροτοξικών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Αυτά τα ευρήματα προσδιορίζουν το πρωτεοτοξικό στρες ως μια υποκείμενη αιτία της παθογένεσης του LA και προάγουν περαιτέρω τη ζύμη ως ένα ισχυρό μοντέλο συστήματος για την ανακάλυψη και τον χαρακτηρισμό διατηρημένων αντιιικών συστημάτων.

Όλα τα εργαστηριακά στελέχη και οι περισσότερες περιβαλλοντικές απομονώσεις του εκκολαπτόμενου ζυμομύκητα S. cerevisiae έχουν μολυνθεί με έναν δίκλωνο RNA (dsRNA) ιό που ονομάζεται LA (1, 2). Το LA ανήκει στην ευρέως διασπαρμένη οικογένεια των ενδογενών ιών dsRNA Totiviridae. Όπως όλοι οι ιοί αυτής της οικογένειας, το γονιδίωμα LA dsRNA είναι συσκευασμένο μέσα σε ένα ιοσωμάτιο που το προστατεύει από την πέψη που προκαλείται από τον ξενιστή. Οι οπές στο ιοσωματίδιο επιτρέπουν την εξώθηση μεταγραφών RNA στο κυτταρόπλασμα που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη καψιδίου, Gag, η οποία περιλαμβάνει το μεγαλύτερο μέρος του σωματιδίου. Το μεταγράφημα LA κωδικοποιεί επίσης μια πρωτεΐνη σύντηξης Gag-pol, που παράγεται σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα από την πρωτεΐνη Gag, η οποία έχει δραστικότητα RNA πολυμεράσης εξαρτώμενη από RNA. Κάθε βιριόν περιέχει μια πρωτεΐνη Gag-pol, η οποία ευθύνεται για την αντιγραφή και τη μεταγραφή του LA εντός του σωματιδίου. Η ενθυλάκωση των μεταγραφών του ιού μέσα στα εκκολαπτόμενα σωματίδια και η σύνθεση του αρνητικού κλώνου RNA από το Gag-pol για να σχηματιστεί το γονιδίωμα dsRNA ολοκληρώνει τον κύκλο αντιγραφής LA (2). Για την παραγωγή αυτών των πρωτεϊνών, το LA χρησιμοποιεί χαρακτηριστικά χαρακτηριστικά των ιών RNA που βρίσκονται στους ανθρώπους, συμπεριλαμβανομένου ενός μηχανισμού "αποσπάσεως καπακιού" που εφοδιάζει τα μεταγραφήματα LA με ένα κάλυμμα 5'-μεθυλίου και έναν μηχανισμό μετατόπισης ριβοσωματικού πλαισίου για την παραγωγή πρωτεϊνών σύντηξης Gag και Gag-pol από μια ενιαία μεταγραφή (3, 4).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Πρόσφατες μελέτες βακτηριακών αντιιικών συστημάτων έχουν δείξει ότι μοιράζονται αξιοσημείωτη εξελικτική διατήρηση με τον άνθρωπο, αποκαλύπτοντας τη δυνατότητα των μικροβιακών οργανισμών να παρέχουν νέες γνώσεις για την ιική έμφυτη ανοσία (5-11). Πράγματι, οι πρώιμες μελέτες που αφορούσαν το LA οδήγησαν στην ανακάλυψη δύο αντιιικών συστημάτων που στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι συμβάλλουν στην έμφυτη ανοσία έναντι διαφόρων ιών RNA στα θηλαστικά (12-17). Το πρώτο από αυτά τα αντιιικά συστήματα περιλαμβάνει τα γονίδια SKI2, 3 και 8, τα οποία κωδικοποιούν υπομονάδες ενός συντηρημένου συμπλόκου που σχετίζεται με ριβόσωμα που αντιτίθεται στη μετάφραση μεταγραφών που δεν έχουν ουρές πολυ(Α) όπως αυτές που κωδικοποιούνται από το LA (18-23). Μια ξεχωριστή οδός εξασθένησης του LA εμφανίζεται μέσω του Xrn1 (επίσης γνωστής ως SKI1), μιας εξοριβονουκλεάσης 5'-3' που αποικοδομεί τα μη καλυμμένα mRNAs (24-26).

Βρήκαμε πρόσφατα ότι η μιτοχονδριακή ενδονουκλεάση DNA/RNA Nuc1 καταστέλλει τη συσσώρευση LA σε σποριοποιούμενα κύτταρα, αντιπροσωπεύοντας μια νέα αντιική οδό ζύμης (27). Το Nuc1 είναι ένα ομόλογο της ενδονουκλεάσης G (EndoG) που βρίσκεται σε όλους τους ευκαρυώτες και σε πολλούς προκαρυώτες και είναι περισσότερο γνωστό για το ρόλο του στην προώθηση του κατακερματισμού του γονιδιώματος κατά τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο θηλαστικών, έναν εξέχοντα μηχανισμό τελευταίας λύσης ιικής άμυνας (28, 29). Παραδόξως, ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι εγγενής στη σπορίωση ζυμομύκητα και το Nuc1 θραύσματα του DNA από νεκρά μειωτικά προϊόντα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, επιπλέον του ρόλου του στην εξασθένιση των επιπέδων του ιού LA που κληρονομούνται από τα επιζώντα σπόρια (27, 30, 31).

Παρά την πανταχού παρούσα παρουσία του LA σε εργαστηριακά στελέχη, δεν έχει αποδοθεί καμία συνέπεια της καταλληλότητας και επομένως το LA θεωρείται σε μεγάλο βαθμό ως ένα αβλαβές συστατικό. Εδώ, δείχνουμε ότι η μόλυνση από LA είναι στην πραγματικότητα θανατηφόρα για τη ζύμη και ότι πρέπει να εξασθενήσει ενεργά μέσω της ιικής έμφυτης ανοσίας για να διατηρηθεί η βιωσιμότητα. Συγκεκριμένα, σε στελέχη που στερούνται αντιιικών οδών NUC1 και SKI παράλληλης δράσης, ο αριθμός αντιγράφων LA αυξάνεται μαζικά, οδηγώντας σε θνησιμότητα σε υψηλές θερμοκρασίες.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Σκεφτήκαμε ότι ο περαιτέρω χαρακτηρισμός του LA και οι παράγοντες που διατηρούν την αναπαραγωγή του σε χαμηλό επίπεδο θα μπορούσαν να αποκαλύψουν νέα αντιιικά συστήματα. Ο εντοπισμός των συνθηκών που οδηγούν στην παθογένεση του LA μας επέτρεψε να χρησιμοποιήσουμε προσεγγίσεις βιοπληροφορικής και γενετικής εξέτασης για να ανακαλύψουμε νέα αντιιικά γονίδια. Χρησιμοποιώντας μια οθόνη για υπερεκφρασμένα γονίδια που καταστέλλουν τη θνησιμότητα υπό όρους nuc1Δ ski3Δ, προσδιορίζουμε αντιικές λειτουργίες για τα ομόλογα ζυμομύκητα της πρωτεΐνης που δεσμεύει πολυ(Α) (PABPC1) και την πρωτεΐνη Larp1 που περιέχει τον τομέα La, τα οποία εμπλέκονται και τα δύο στην ιική έμφυτη ανοσία στον άνθρωπο (32, 33). Επιπλέον, γενετικές μελέτες απώλειας λειτουργικότητας εντόπισαν δώδεκα νέα αντιιικά γονίδια. Μεταξύ αυτών είναι το εξαιρετικά διατηρημένο σύμπλεγμα μεταγραφικού συνενεργοποιητή SAGA και αρκετές εξωνουκλεάσες RNA συμπεριλαμβανομένων των REX2 και MYG1, και οι δύο έχουν διακριτά αλλά κακώς χαρακτηρισμένα ανθρώπινα και βακτηριακά ομόλογα (34-37).

Τέλος, χαρακτηρίζουμε την παθογένεση του LA χρησιμοποιώντας κυτταρικές βιολογικές μεθόδους και διαπιστώνουμε ότι το υψηλό ιικό φορτίο προκαλεί πρωτεοστατικό στρες. Καθώς η υψηλή θερμοκρασία είναι γνωστό ότι επιδεινώνει το πρωτεοστατικό στρες, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το καταστροφικό πρωτεοστατικό στρες είναι η αιτία της επαγόμενης από το LA θνησιμότητας. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, δείχνουμε ότι οι μεταλλάξεις nuc1Δ ski3Δ παρουσιάζουν ευαισθησία εξαρτώμενη από το LA στο αζετιδίνη-2-καρβοξυλικό οξύ (AZC), ένα ανάλογο προλίνης που είναι γνωστό ότι προκαλεί ορθοστατικό στρες (38). Επιπλέον, επιδεικνύουμε μια αντιική λειτουργία για τον HSF1, έναν συντηρημένο μεταγραφικό παράγοντα που ανιχνεύει και κατευθύνει την απόκριση στο ορθοστατικό στρες. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ανθρώπινος Hsf1 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην αναπαραγωγή και/ή την παθογένεια διαφόρων ιών, συμπεριλαμβανομένων των HIV, SARS-Cov-2 και του ιού του δάγκειου πυρετού, αν και οι μηχανισμοί είναι ασαφείς (39). Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέα παραδείγματα έμφυτης ανοσιακής διατήρησης από τα μικρόβια στον άνθρωπο και περαιτέρω ζύμες υψηλού φωτός ως ένα ισχυρό μοντέλο συστήματος για την ανακάλυψη νέων αντιιικών συστημάτων.

Αποτελέσματα

Τα αντιιικά συστήματα NUC1, SKI και XRN1 Yeast συνεργάζονται για την πρόληψη της παθογένεσης του LA.

Οι προηγούμενες μελέτες μας για το NUC1 επικεντρώθηκαν σε μειοτικά κύτταρα (27). Για τη διερεύνηση της αντιϊκής λειτουργίας NUC1 σε φυτικά αναπτυσσόμενη ζύμη, εξετάσαμε τον αριθμό αντιγράφων LA σε μιτωτικά απλοειδή κύτταρα στο υπόβαθρο του στελέχους BY4742 αναφοράς. Παρατηρήσαμε τα επίπεδα του LA dsRNA χρησιμοποιώντας χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο του ηλεκτροφορημένου RNA και βρήκαμε ότι ένα διπλό μετάλλαγμα nuc1Δ ski3Δ έδειξε μεγάλη αύξηση στο LA dsRNA (Εικ. 1Α). Επιβεβαιώσαμε αυτά τα ευρήματα χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ανοσοφθορισμού με ένα αντίσωμα dsRNA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αναδιπλασιαζόμενων ιών RNA (40, 41). Αυτές οι εικόνες έδειξαν ότι το LA dsRNA συσσωρεύτηκε σε εστίες, που θυμίζουν θέσεις "ιικού εργοστασίου" αντιγραφής του ιού που παρατηρείται σε ανθρώπινα κύτταρα (Εικ. 1Β και Παράρτημα SI, Εικ. S1) (42). Σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα σε υπόβαθρα άλλων στελεχών (24, 27, 43), το western blotting έδειξε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης Gag ήταν αυξημένα στα μεταλλάγματα nuc1Δ και ski3Δ (Εικ. 1C). Επιπλέον, δείξαμε ότι ένας διπλός μεταλλάκτης nuc1Δ ski3Δ συσσώρευσε μαζικά αυξημένα επίπεδα Gag (Εικ. 1C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το NUC1 και το SKI3 συμμετέχουν σε ξεχωριστές αντιικές οδούς και ότι η απώλεια και των δύο οδών οδηγεί σε πολύ αυξημένο ιικό φορτίο LA.

Για να προσδιορίσουμε εάν το υψηλό ιικό φορτίο LA επηρεάζει την ικανότητα των κυττάρων, εξετάσαμε την ανάπτυξη ζυμομυκήτων χρησιμοποιώντας δοκιμές ανάπτυξης κηλίδας. Λεπτά ελαττώματα ανάπτυξης των απλών μεταλλαγμάτων nuc1Δ και ski3Δ παρατηρήθηκαν στους 37 βαθμούς όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με γλυκερίνη αντί για γλυκόζη ως πηγή άνθρακα, μια κατάσταση υπό την οποία η ζύμη βασίζεται στη μιτοχονδριακή αναπνοή (Εικ. 1D). Αξιοσημείωτα, αν και οι διπλές μεταλλάξεις nuc1Δ ski3Δ αναπτύχθηκαν κανονικά σε 30 βαθμούς, εμφάνισαν θνησιμότητα υπό όρους στους 37 βαθμούς ανεξάρτητα από την πηγή άνθρακα (Εικ. 1D). Όπως αναμενόταν, η βιωσιμότητα σε υψηλή θερμοκρασία αποκαταστάθηκε σε ένα διπλό μετάλλαγμα nuc1Δ ski3Δ από ένα πλασμίδιο που εκφράζει NUC1- το οποίο προκάλεσε μια αντίστοιχη μείωση στα επίπεδα Gag (Εικ. 1 C και D). Για να επιβεβαιώσουμε ότι το ελάττωμα ανάπτυξης του διπλού μεταλλάγματος nuc1Δ ski3Δ προκλήθηκε από το LA, κατασκευάσαμε ένα ισογονικό στέλεχος που σκληρύνθηκε από LA (LA{0) και προσδιορίσαμε την ανάπτυξή του σε υψηλές θερμοκρασίες. Βρήκαμε ότι το ελάττωμα ανάπτυξης ανακουφίστηκε πλήρως, υπονοώντας ότι η υπό όρους θνησιμότητα ήταν αποτέλεσμα απεριόριστης αναπαραγωγής LA (Εικ. 1D). Για να αξιολογήσουμε τα αποτελέσματα του υψηλού αριθμού αντιγράφων LA στην καταλληλότητα των κυττάρων υπό βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης, μετρήσαμε τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού σε υγρή καλλιέργεια. Αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης στα διπλά μεταλλάγματα nuc1Δ ski3Δ σε σύγκριση με τον άγριο τύπο στους 30 βαθμούς που αντιστράφηκε στα στελέχη L-A0, αποδεικνύοντας ότι το υψηλό φορτίο LA είναι επιζήμιο για την καταλληλότητα ακόμη και σε κύτταρα χωρίς στρες (Παράρτημα SI, Εικ. S2).

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τον τρόπο με τον οποίο το NUC1 αλληλεπιδρά με γνωστά αντιιικά μονοπάτια, δοκιμάσαμε τη σχέση του με το XRN1. Βρήκαμε ότι ένας διπλός μεταλλάκτης nuc1Δ xrn1Δ συσσώρευσε πολύ υψηλά επίπεδα Gag σε σύγκριση με είτε μεμονωμένο μετάλλαγμα και εμφάνισε εξαρτώμενη από LA θνησιμότητα υπό όρους σε υψηλή θερμοκρασία (Παράρτημα SI, Εικ. S3 Α και Β), υποδηλώνοντας ότι τα NUC1 και XRN1 δρουν σε παράλληλες οδούς για την εξασθένηση του LA. Αντικατοπτρίζοντας τους βασικούς μη πλεονάζοντες ρόλους τους στη ρύθμιση χύμα mRNA, ένα xrn1Δ ski3Δ διπλό μετάλλαγμα είναι αβίωτο, ακόμη και σε στελέχη που δεν διαθέτουν LA (44). Για να προσδιορίσουμε εάν το XRN1 αντιπροσωπεύει ένα αντιιικό σύστημα ανεξάρτητο τόσο από το NUC1 όσο και από το SKI3, χρησιμοποιήσαμε ένα πλασμίδιο υψηλού αντιγράφου για την υπερέκφραση του XRN1 σε ένα διπλό μετάλλαγμα nuc1Δ ski3Δ. Πράγματι, παρατηρήσαμε μια ουσιαστική μείωση στα επίπεδα Gag και καταστολή της υπό όρους θνησιμότητας nuc1Δ ski3Δ χρησιμοποιώντας υπερέκφραση XRN1 που καθοδηγείται από πλασμίδιο (Εικ. 1 C και D). Συμπεραίνουμε ότι τα Nuc1, Ski3 και Xrn1 αντιτίθενται συγκλίνοντα στον αναδιπλασιασμό του LA και ότι το μαζικά αυξημένο ιικό φορτίο LA σε μεταλλάξεις nuc1Δ ski3Δ ή nuc1Δ xrn1Δ προκάλεσε θανατηφόρα παθογένεση σε υψηλές θερμοκρασίες (Εικ. 1Ε).

Μια γενετική οθόνη βασισμένη σε βιοπληροφορική εντοπίζει νέους αντιιικούς παράγοντες.

Η εξαρτώμενη από το LA θνησιμότητα των διπλών μεταλλαγμάτων nuc1Δ ski3Δ αύξησε την πιθανότητα να εντοπιστούν άλλοι αντιιικοί παράγοντες μέσω συνδυαστικών μελετών μεταλλάξεων. Για να εντοπίσουμε νέους υποψήφιους αντιιικούς παράγοντες, αναζητήσαμε μια επιμελημένη βάση δεδομένων γενετικής αλληλεπίδρασης για διαγραφές γονιδίων που προκάλεσαν ελάττωμα συνθετικής ανάπτυξης όταν συνδυάστηκαν με nuc1Δ σε τουλάχιστον δύο μελέτες προσυμπτωματικού ελέγχου υψηλής απόδοσης (45). Εκτός από την αναμενόμενη παρουσία διαγραφών XRN1 και SKI σε αυτό το σύνολο δεδομένων, βρήκαμε δεκαέξι επιπλέον γονίδια. Χρησιμοποιήσαμε γενετική διασταύρωση για να φτιάξουμε τριπλούς μεταλλάκτες που συνδυάζουν διαγραφές καθενός από αυτά τα δεκαέξι γονίδια με το nuc1Δ ski3Δ και επιβεβαιώσαμε έξι που προκάλεσαν σοβαρά ελαττώματα ανάπτυξης (Πίνακας 1). Προσδιορίσαμε ότι οι συνθετικοί φαινότυποι ανάπτυξης που προκαλούνται από καθένα από αυτά τα γονίδια αντιστράφηκαν στα στελέχη LA{11}}, υποδηλώνοντας ότι κωδικοποιούν πρωτεΐνες κατά των ιών (Πίνακας 1). Παρακάτω περιγράφουμε την επιβεβαίωση πολλών από αυτές τις επισκέψεις οθόνης ως νέους αντιιικούς παράγοντες.

Ένα γονίδιο που εντοπίστηκε στην οθόνη μας, το REX2, κωδικοποιεί μια εξωνουκλεάση RNA 3'-5' που διατηρείται από βακτήρια στους ανθρώπους (35). Τόσο το Rex2 όσο και το ανθρώπινο ομόλογό του REXO2 εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια και περιέχουν μια περιοχή EXOIII που βρίσκεται ευρέως σε προκαρυωτικές και ευκαρυωτικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της διεγειρόμενης από ιντερφερόνη αντιιικής πρωτεΐνης ISG20 (36, 37, 46-48). Βρήκαμε ότι ένα στέλεχος διπλής μετάλλαξης rex2Δ nuc1Δ συσσώρευσε πολύ αυξημένα επίπεδα Gag σε σύγκριση με είτε μεμονωμένο μετάλλαγμα και εμφάνισε ελαττώματα ανάπτυξης που εξαρτώνται από το LA, συμπεριλαμβανομένης της θνησιμότητας σε υψηλή θερμοκρασία (Εικ. 2 Α και Β, και Παράρτημα SI, Εικ. S2). Ένα στέλεχος μονής μετάλλαξης rex2Δ εμφάνισε μια ελαφρά αύξηση στα επίπεδα Gag, αν και αυτή η επίδραση ήταν οριακή (Εικ. 2Β). Για να εξετάσουμε αυστηρά τις συνέπειες του rex2Δ για τον αριθμό αντιγράφων LA, ποσοτικοποιήσαμε το LA RNA χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Αυτές οι μετρήσεις επιβεβαίωσαν ότι τα στελέχη rex2Δ nuc1Δ συσσωρεύουν πολύ αυξημένα επίπεδα LA, αν και αποκάλυψαν επίσης ότι ένα μοναδικό μετάλλαγμα rex2Δ δεν συσσώρευσε αυξημένο LA RNA (Εικ. 2C). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ο αντιιικός ρόλος του Rex2 είναι εμφανής μόνο απουσία λειτουργίας NUC1. Αξιοσημείωτα, οι τριπλοί μεταλλάκτες nuc1Δ ski3Δ rex2Δ και nuc1Δ xrn1Δ rex2Δ ήταν μη βιώσιμοι υπό όλες τις συνθήκες ανάπτυξης και αυτά τα ελαττώματα αντιστράφηκαν στα στελέχη L-A0 (Εικ. 2D). Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν το σοβαρό παθογόνο δυναμικό του μυκοϊού LA και προσδιορίζουν έναν νέο αντιϊκό ρόλο για μια εξαιρετικά διατηρημένη μιτοχονδριακά εντοπισμένη εξωνουκλεάση RNA.

Εικ. 1. Η εξασθένηση του LA προστατεύει τη ζύμη από θανατηφόρα παθογένεση. (Α) Εμφανίζεται ένα πήκτωμα ολικού RNA χρωματισμένο με βρωμιούχο αιθίδιο που παρασκευάζεται από τα υποδεικνυόμενα στελέχη, με τη ζώνη LA dsRNA των 4,6 kb να υποδεικνύεται με ένα βέλος. (Β) Ο ανοσοφθορισμός χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση του LA dsRNA (πορτοκαλί) σε κύτταρα των υποδεικνυόμενων γονότυπων. Αυτά τα στελέχη θεραπεύτηκαν από τον ασθενώς άφθονο ιό L-BC dsRNA για την εξάλειψη της χρώσης του υποβάθρου (Λεπτομέρειες μεθόδου). Η χρώση DAPI του DNA είναι μπλε. (Γραμμή κλίμακας, 1 μm.) (C) Εμφανίζεται η κηλίδα Western των επιπέδων πρωτεΐνης LA Gag και 3-φωσφογλυκερικής κινάσης (Pgk1) στα υποδεικνυόμενα στελέχη. Οι δείκτες μοριακού βάρους υποδεικνύονται στα δεξιά. (D) Δείχνονται δοκιμές ανάπτυξης κηλίδας των στελεχών από 1C. Τα στελέχη επισημάνθηκαν σε μέσο -Leu που περιείχαν είτε γλυκόζη είτε γλυκερόλη και αναπτύχθηκαν στις υποδεικνυόμενες θερμοκρασίες. (Ε) Η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη Nuc1 συνεργάζεται με τις κυτοσολικές πρωτεΐνες Xrn1 και SkiC για τη ρύθμιση του επιπέδου πρωτεΐνης LA και τη διασφάλιση της φυσικής κατάστασης των κυττάρων.

Ένα άλλο γονίδιο που εντοπίστηκε στην οθόνη μας ήταν το MYG1, το ομόλογο ζυμομύκητα του γονιδίου 1 πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων MelanocYte, μια εξωνουκλεάση 3'-5' RNA που έχει ομόλογα σε όλα τα taxa (34). Τα μεταλλαγμένα στελέχη που συνδυάζουν myg1Δ και nuc1Δ εμφάνισαν μεγάλες αυξήσεις στην πρωτεΐνη Gag και LA RNA σε σύγκριση με τα μεμονωμένα μεταλλάγματα και εμφάνισαν σοβαρά ελαττώματα ανάπτυξης που εξαρτώνται από LA σε υψηλή θερμοκρασία και σε υγρή καλλιέργεια (Εικ. 2C και Παράρτημα SI, Σχ. S2, S4 Α και Γ). Όπως και με το rex2Δ, ένα στέλεχος μονής μετάλλαξης myg1Δ έδειξε μικρή αύξηση στο επίπεδο Gag και καμία αλλαγή στο LA RNA (Εικ. 2C και Παράρτημα SI, Εικ. S4C). Μπορέσαμε να ανακτήσουμε τριπλούς μεταλλάκτες nuc1∆ ski3∆ myg1∆, αν και είχαν εξαιρετικά αργή ανάπτυξη σε 30 βαθμούς και συσσώρευσαν ακόμη υψηλότερα επίπεδα Gag (Παράρτημα SI, Εικ. S4 A και C). Αυτά τα ελαττώματα ανάπτυξης αντιστράφηκαν επίσης σε στελέχη L-A0 (Παράρτημα SI, Σχήμα S4A). Το MYG1 αντιπροσωπεύει έτσι έναν νέο αντιιικό παράγοντα, που δρα παράλληλα τόσο με το NUC1 όσο και με το σύμπλεγμα SKI.

Πίνακας 1. Προσδιορισμός νέων υποψηφίων αντιιικών παραγόντων με χρήση βιοπληροφορικής προσέγγισης

Οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε υπερέκφραση του ανθρώπινου MYG1 σχετίζονται με την αυτοάνοση διαταραχή λεύκη, υποδηλώνοντας ότι το MYG1 μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην ανθρώπινη έμφυτη ανοσία (49, 50). Εξερευνήσαμε αυτή τη δυνατότητα χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο που εκφράζει ανθρώπινο MYG1 υπό τον έλεγχο ενός συστατικού προαγωγέα ζυμομύκητα (34) και βρήκαμε ότι το ανθρώπινο MYG1 διέσωσε το ελάττωμα ανάπτυξης υπό όρους ενός μεταλλάγματος nuc1Δ myg1Δ (Παράρτημα SI, Σχήμα S4D). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η αντιική λειτουργία του ζυμομύκητα MYG1 μπορεί να επιτευχθεί από το ανθρώπινο MYG1, υποδηλώνοντας μια πιθανή αντιική λειτουργία του MYG1 στους ανθρώπους.

Εικ. 2. Εντοπίζονται νέοι αντιιικοί παράγοντες αξιοποιώντας την παθογένεση του LA. (Α) Παρουσιάζεται κηλιδιακή ανάλυση στελεχών ελαττωματικών σε NUC1 και REX2. Τα στελέχη εντοπίστηκαν σε μέσα SC που περιείχαν είτε γλυκόζη είτε γλυκερόλη και αναπτύχθηκαν στην υποδεικνυόμενη θερμοκρασία. (Β) Western blotting των επιπέδων LA Gag και πρωτεΐνης Pgk1 των στελεχών στο Σχήμα 2Α. Οι δείκτες μοριακού βάρους υποδεικνύονται στα δεξιά. (C) Το LA RNA ποσοτικοποιήθηκε με qPCR και κανονικοποιήθηκε σε ενδογενές ACT1 RNA. Δείχνονται το μέσο επίπεδο RNA και το SD. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (μη ζευγαρωμένη δοκιμή Student's t). (D) Παρουσιάζεται κηλιδιακή ανάλυση στελεχών ελαττωματικών σε τρεις παράλληλες αντιικές οδούς που περιέχουν ένα πλασμίδιο που εκφράζει NUC1. Τα στελέχη εντοπίζονται σε μέσο -URA ή σε συνθετικό πλήρες (SC) μέσο συμπληρωμένο με 0,1% 5-φθοροοροτικό οξύ (5-FOA).

Μια άλλη κατηγορία γονιδίων που προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη βιοπληροφορική μας οθόνη ήταν η γονιδιακή έκφραση. Τα CDC73 και SPT3 κωδικοποιούν υπομονάδες των συντηρημένων συμπλοκών που σχετίζονται με τη χρωματίνη PAF1 και SAGA, αντίστοιχα. Τόσο το cdc73∆ όσο και το spt3∆ προκάλεσαν θνησιμότητα εξαρτώμενη από το LA όταν συνδυάστηκαν με το nuc1Δ ski3Δ (Πίνακας 1). Επειδή το SAGA (SptAda-Gcn5-Ακετυλοτρανσφεράση) έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την αντιϊκή γονιδιακή έκφραση στον μύκητα της καστανιάς Cryphonectria parasitica, ερευνήσαμε περαιτέρω αυτό το σύμπλεγμα (51). Ένα στέλεχος διπλής μετάλλαξης spt3Δ nuc1Δ συσσώρευσε αυξημένα επίπεδα Gag και εμφάνισε θνησιμότητα εξαρτώμενη από το LA σε υψηλές θερμοκρασίες (Παράρτημα SI, Εικ. S4 B και C). Το SAGA είναι ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα και επιβεβαιώσαμε ότι οι διαγραφές σε πολλά άλλα γονίδια που κωδικοποιούν υπομονάδες SAGA είχαν τις ίδιες φαινοτυπικές συνέπειες με το spt3Δ (Παράρτημα SI, Πίνακας S1 και S4C). Μαζί με τα ευρήματα από το C. parasitica, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το σύμπλεγμα SAGA ελέγχει την έκφραση αντιικού γονιδίου σε διάφορα είδη μυκήτων.

Ο έλεγχος υψηλής καταστολής αντιγραφής προσδιορίζει αντιιικούς παράγοντες ζύμης που είναι επίσης αντιιικοί στους ανθρώπους.

Δεδομένου ότι η υπερέκφραση XRN1 κατέστειλε τα ελαττώματα ανάπτυξης ενός στελέχους nuc1Δ ski3Δ, υποθέσαμε ότι η υπερέκφραση άλλων αντιιικών παραγόντων θα είχε παρόμοιο αποτέλεσμα, το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως οθόνη για τον εντοπισμό νέων αντιιικών συστημάτων. Χρησιμοποιήσαμε μια οθόνη καταστολής πλασμιδίου υψηλού αντιγράφου για να ανιχνεύσουμε γονίδια των οποίων η υπερέκφραση μείωσε την υπό όρους θνησιμότητα ενός στελέχους nuc1Δ ski3Δ (Λεπτομέρειες μεθόδου). Χρησιμοποιώντας αυτήν την οθόνη, αναγνωρίσαμε τα SRO9, SLF1 και PAB1 ως καταστολείς υψηλού αντιγράφου του nuc1Δ ski3Δ, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες δέσμευσης RNA που σχετίζονται με ριβόσωμα (Εικ. 3Α) (52, 53). Οι Sro9 και Slf1 είναι παράλογες πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχή του λύκου-αυτοαντιγόνου (La) που βρίσκονται ευρέως σε ευκαρυώτες. Συγκεκριμένα, το ανθρώπινο ομόλογό τους, το Larp1, εντοπίστηκε πρόσφατα σε διαλογές για πρωτεΐνες συνδεδεμένες με το SARS-Cov-2 συν το κλώνο ssRNA ή το νουκλεοκαψίδιο (32, 54). Το Larp1 ήταν ένα σημαντικό επίκεντρο σε μία από αυτές τις μελέτες και αποδείχθηκε ότι μειώνει την αντιγραφή του SARS-Cov-2 στα ανθρώπινα κύτταρα, αν και ο μηχανισμός του δεν είναι γνωστός (32). Το PAB1 κωδικοποιεί την εξαιρετικά συντηρημένη πρωτεΐνη σύνδεσης PolyA, η οποία είναι ένας κοινός στόχος αναστολής του ιού στους ανθρώπους μέσω διαφορετικών μηχανισμών (33). Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του PAB1 ή του SRO9 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα Gag σε ένα μετάλλαγμα nuc1Δ ski3Δ, εξηγώντας τους φαινοτύπους διάσωσης (Εικ. 3Β). Περιέργως, αν και η υπερέκφραση του SLF1 διέσωσε το ελάττωμα ανάπτυξης nuc1Δ ski3Δ εξίσου καλά με το SRO9, δεν οδήγησε σε καμία μείωση στα επίπεδα Gag (Εικ. 3 Α και Β). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι τα PAB1 και SRO9 διασώζουν κύτταρα καταστέλλοντας την αντιγραφή του LA και ότι το SLF1 προστατεύει τα κύτταρα από τις παθογόνες συνέπειες της αυξημένης ιικής αντιγραφής.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Ένας υψηλός αριθμός αντιγράφων LA οδηγεί σε κυτταροτοξικό πρωτεοστατικό στρες.

Για να κατανοήσουμε τους αποκλίνοντες μηχανισμούς των αντιικών δραστηριοτήτων Sro9 και Slf1, εξετάσαμε ποιες θα μπορούσαν να είναι οι φυσιολογικές συνέπειες της παθογένεσης του LA και πώς το SRO9/SLF1 μπορεί να τις επηρεάσει διαφορετικά. Σημειώσαμε μια προηγούμενη μελέτη στην οποία οι διαγραφές του NUC1 ή των γονιδίων του συμπλέγματος SKI οδήγησαν σε ασθενή επαγωγή ενός γονιδίου αναφοράς GFP που ελέγχεται από το Hsf1 (55), ενός συντηρημένου μεταγραφικού παράγοντα που ανιχνεύει το πρωτεοστατικό στρες και ενεργοποιεί την απόκριση γονιδιακής έκφρασης (56-58 ). Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με αυτόν τον ανταποκριτή (HSE-GFP), επιβεβαιώσαμε αυτά τα αποτελέσματα και προσδιορίσαμε ότι ένας διπλός μεταλλάκτης nuc1Δ ski3Δ προκάλεσε συνεργική και εξαρτώμενη από LA ενεργοποίηση του HSE-GFP (Εικ. 3C και Παράρτημα SI, Εικ. S5). Υποθέσαμε ότι η μαζική παραγωγή Gag που παρατηρήθηκε σε μεταλλάξεις nuc1Δ ski3Δ αντιπροσώπευε αυτή την απόκριση πρωτεοστατικού στρες. Υποστηρίζοντας αυτό, η ενεργοποίηση HSE-GFP ενός διπλού μεταλλάγματος nuc1Δ ski3Δ αναστράφηκε με υπερέκφραση PAB1 ή SRO9, αντικατοπτρίζοντας τις συνέπειες αυτών των γονιδίων για τη συσσώρευση Gag (Εικ. 3 B και C). Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση του παραλόγου SLF1 SRO9 δεν εμπόδισε την ενεργοποίηση του HSE-GFP. Η εξελικτική απόκλιση των παράλογων γονιδίων SRO9 και SLF1 οδήγησε έτσι σε διαφορετικούς αντιιικούς μηχανισμούς, με το SRO9 να καταστέλλει τη συσσώρευση ιικής πρωτεΐνης και το σχετικό πρωτεοστατικό στρες και το SLF1 να προστατεύει φαινομενικά τα κύτταρα από τις τοξικές συνέπειες του επαγόμενου από τον ιό πρωτεοστατικό στρες.

Εικ. 3. Η υπερέκφραση παραγόντων ελέγχου μετάφρασης ανακουφίζει την παθογένεση του LA. (Α) Δείχνονται δοκιμές ανάπτυξης κηλίδας των κατασταλτικών αντιγραφής SRO9, SLF1 και PAB1. Τα στελέχη εντοπίστηκαν σε μέσα –LEU που περιείχαν είτε γλυκόζη είτε γλυκερόλη και αναπτύχθηκαν στις υποδεικνυόμενες θερμοκρασίες. (Β) Western blotting για επίπεδα πρωτεΐνης LA Gag, Pgk1, Sro9 και Slf1 στα στελέχη από 3Α. Οι δείκτες μοριακού βάρους υποδεικνύονται στα δεξιά. (Γ) Χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση της έκφρασης HSE GFP στα υποδεικνυόμενα στελέχη (n {{0}}). Το πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο σημειώνονται με τα γκρίζα πλαίσια. Η διάμεση ένταση GFP σημειώνεται από τις μαύρες γραμμές μέσα. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (μη ζευγαρωμένη δοκιμή Student's t). (Δ) Μικροσκοπία φθορισμού του Hsp104-GFP σε ενδεικνυόμενα στελέχη. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με DAPI για να οπτικοποιηθούν οι πυρήνες. (Γραμμή κλίμακας, 1 μm.) Το ποσοστό των κυττάρων με 3+ εστίες GFP εμφανίζεται στα δεξιά. n=3. 75 έως 140 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε αντίγραφο.

Το πρωτεοστατικό στρες συχνά σχετίζεται με τη συσσώρευση κυτταροτοξικών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων που μπορούν να απεικονιστούν χρησιμοποιώντας GFP συγχωνευμένη με την πρωτεϊνική αποσυσσωμάτωση Hsp104, έναν άμεσο στόχο της μεταγραφικής ενεργοποίησης του Hsf1 που είναι γνωστό ότι συνεντοπίζεται με συσσωματώματα πρωτεΐνης (59, 60). Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τα πρωτεοστατικά ελαττώματα που σχετίζονται με την παθογένεση του LA, χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία φθορισμού για να απεικονίσουμε τις εστίες Hsp104-GFP σε μια ποικιλία στελεχών. Όπως αναμενόταν, κύτταρα άγριου τύπου που αναπτύχθηκαν σε 30 μοίρες σπάνια συσσώρευσαν παρατηρήσιμες εστίες Hsp104-GFP. Ενώ οι απλές μεταλλάξεις nuc1Δ και ski3Δ έμοιαζαν με άγριου τύπου, εντυπωσιακά, μια διπλή μετάλλαξη nuc1Δ ski3Δ εμφάνισε περισσότερο από το 25% των κυττάρων με τρεις ή περισσότερες εστίες Hsp104-GFP (Εικ. 3D). Όπως με όλους τους άλλους φαινότυπους που έχουμε παρατηρήσει για το nuc1Δ ski3Δ, η συσσώρευση των εστιών Hsp104-GFP εξαρτιόταν από την παρουσία LA (Εικ. 3D). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι το υψηλό ιικό φορτίο που προκαλείται από τη διαγραφή των NUC1 και SKI3 οδήγησε στη συσσώρευση εστιών Hsp104-GFP ενδεικτικές της συσσωμάτωσης κυτταροτοξικών πρωτεϊνών.

Δεδομένου ότι η παθογένεση του LA συσχετίστηκε με πρωτεοστατικά ελαττώματα, υποθέσαμε ότι το Hsf1 θα λειτουργούσε ως αντιιικός παράγοντας. Η διαγραφή του HSF1 είναι θανατηφόρα, επομένως χρησιμοποιήσαμε το ευαίσθητο στη θερμοκρασία αλληλόμορφο hsf1-848 που προέρχεται από μια συλλογή στελεχών που δημοσιεύτηκε προηγουμένως (61). Το αλληλόμορφο hsf1-848 εμφάνισε απουσία ανάπτυξης στους 39 βαθμούς, φαινότυπο ενδιάμεσης ανάπτυξης στους 37 βαθμούς και κανένα εμφανές ελάττωμα ανάπτυξης στους 35 βαθμούς (Εικ. 4Α). Οι δοκιμές κηλίδων έδειξαν ότι οι φαινότυποι ανάπτυξης hsf1-848 στους 35 βαθμούς και στους 37 βαθμούς ενισχύθηκαν σημαντικά όταν συνδυάστηκαν είτε με nuc1Δ είτε με ski3Δ και ότι αυτά τα ελαττώματα ανάπτυξης αντιστράφηκαν σε στελέχη που δεν είχαν τον ιό LA (Εικ. 4Α) . Όπως αναμενόταν, η βιωσιμότητα όλων των μεταλλαγμένων στελεχών hsf1-848 παρέμεινε σε κύτταρα που αναπτύχθηκαν στους 39 βαθμούς ανεξάρτητα από την παρουσία LA. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας τετραδικές ανατομές, δείξαμε ότι οι τριπλοί μεταλλάκτες hsf1-848 nuc1Δ ski3Δ ήταν αβίωτοι στην επιτρεπτή θερμοκρασία εάν είχαν μολυνθεί με LA αλλά υγιείς εάν προέρχονταν από στέλεχος LA0 (SI Παράρτημα, Εικ. S6). Χρησιμοποιώντας western blotting, βρήκαμε ότι τα hsf1-848 nuc1Δ και hsf1-848 ski3Δ συσσώρευσαν αυξημένες ποσότητες LA Gag σε σύγκριση με τα μεμονωμένα μεταλλάγματα (Εικ. 4Β). Μαζί με τις κυτταρικές βιολογικές μελέτες μας, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ρυθμιζόμενη απόκριση πρωτεοστατικού στρες με Hsf1-λειτουργεί ως αντιικό σύστημα στη ζύμη, αντιτιθέμενο στις παθογόνες συνέπειες της ανεξέλεγκτης αντιγραφής του LA.

Καθώς τα πρωτεοστατικά ελαττώματα είναι γνωστό ότι επιδεινώνονται και οδηγούν σε κυτταροτοξικότητα σε υψηλές θερμοκρασίες (59), ένα απλό μοντέλο αποδίδει τις θανατηφόρες συνέπειες της παθογένεσης του LA σε υψηλές θερμοκρασίες σε καταστροφικό πρωτεοστατικό στρες. Για να δοκιμάσουμε περαιτέρω αυτό το μοντέλο, αντιμετωπίσαμε στελέχη με αζετιδίνη-2-καρβοξυλικό οξύ (AZC), ένα ανάλογο προλίνης που ενσωματώνεται σε πρωτεΐνες που οδηγεί σε ορθοστατικό στρες (38). Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι το nuc1Δ ski3Δ εμφάνισε ισχυρή ευαισθησία στο AZC με τρόπο που εξαρτάται από τον ιό LA (Εικ. 4C και Παράρτημα SI, Σχ. S6). Περαιτέρω, βρήκαμε ότι το nuc1Δ ski3Δ παρουσίασε ευαισθησία σε 5% αιθανόλη, μια κατάσταση που προκαλεί επίσης πρωτεοστατικά ελαττώματα, αλλά όχι σε 0.5 M NaCl, που προκαλεί οσμωτικό στρες (Παράρτημα SI, Εικ. S6). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι οι θανατηφόρες συνέπειες της παθογένεσης του LA οφείλονται ειδικά στο συντριπτικό πρωτεοστατικό στρες.

Εικ. 4. Η απόκριση θερμικού σοκ καταστέλλει την παθογένεση του LA. (Α) Παρουσιάζεται κηλιδική ανάλυση στελεχών ελαττωματικών σε HSF1, NUC1 και SKI3 με ή χωρίς LA. Τα στελέχη επισημάνθηκαν σε μέσα SC που περιείχαν γλυκόζη και αναπτύχθηκαν στην υποδεικνυόμενη θερμοκρασία. (Β) Western blotting για επίπεδα πρωτεΐνης LA Gag και Pgk1 των ενδεικνυόμενων στελεχών. Οι δείκτες μοριακού βάρους υποδεικνύονται στα δεξιά. (Γ) Παρουσιάζεται κηλιδική ανάλυση στελεχών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με το πρωτεοτοξικό ανάλογο προλίνης, αζετιδίνη-2-καρβοξυλικό οξύ (AZC). Στελέχη εντοπίστηκαν σε μέσα SC που περιείχαν γλυκόζη συμπληρωμένη με ή χωρίς 0.1 mg/mL AZC και αναπτύχθηκαν στους 30 βαθμούς.

Συζήτηση

Παρά την πανταχού παρούσα παρουσία του σε εργαστηριακά στελέχη, οι μελέτες του ιού LA dsRNA έχουν περιοριστεί λόγω της φαινομενικά καλοήθους φύσης του. Εδώ, δείχνουμε ότι το LA έχει βαθιές συνέπειες για τη ζύμη όταν ο πολλαπλασιασμός του είναι ανεξέλεγκτος και ότι διαφορετικά έμφυτα ανοσοποιητικά συστήματα διατηρούν την αντιγραφή του LA σε ανεκτό επίπεδο. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι, σε στελέχη που δεν διαθέτουν τα αντιιικά γονίδια NUC1 και SKI3 παράλληλης δράσης, ο αναδιπλασιασμός του LA ρυθμίζεται μαζικά προς τα πάνω, οδηγώντας σε ορθοστατικό στρες και υπό όρους θνησιμότητα σε υψηλές θερμοκρασίες. Αξιοποιώντας αυτή τη νέα ανακάλυψη, χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορικές και προηγούμενες γενετικές οθόνες για να εντοπίσουμε νέα γονίδια ζυμομύκητα που λειτουργούν για να περιορίσουν την αντιγραφή του LA ή να προστατεύσουν τα κύτταρα από τις παθογόνες συνέπειες της απεριόριστης αναπαραγωγής του LA. Καθώς αυτές οι οθόνες δεν ήταν κορεσμένες, το γονιδίωμα της ζύμης πιθανότατα κωδικοποιεί πολλούς άλλους αντιικούς παράγοντες. Πολλές διορατικές μελέτες έχουν διεξαχθεί σε ζυμομύκητες που μελετούν την αντιγραφή εξωγενώς εισαγόμενων ιικών RNA από άλλους οργανισμούς και θα είναι ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν οι αντιιικοί παράγοντες LA δρουν παρόμοια σε αυτά τα ιικά RNA (62, 63).

Δεδομένου του σαφούς κινδύνου μόλυνσης από LA, ο τρόπος με τον οποίο παραμένει παρόλα αυτά ενόψει της διαρκώς παρούσας αντιιικής δραστηριότητας είναι μπερδεμένος. Μια εξήγηση για αυτό το παράδοξο μπορεί να είναι ότι το LA παρέχει ένα αντισταθμιστικό όφελος. Ένα πιθανό πλεονέκτημα του LA είναι ότι επιτρέπει σε ορισμένα στελέχη να διατηρούν δορυφορικούς ιούς που κωδικοποιούν εκκρινόμενες τοξίνες που σκοτώνουν γειτονικά μη μολυσμένα κύτταρα. Ωστόσο, το LA υπάρχει σε πολλά στελέχη που δεν διαθέτουν δορυφόρους "Killer", επομένως αυτή η εξήγηση είναι ανεπαρκής για να εξηγήσει την εμμονή της μόλυνσης από LA. Εικάζουμε λοιπόν ότι το LA μπορεί να έχει κάποιο κρυπτικό όφελος που αντισταθμίζει τις επιβλαβείς δυνατότητές του.

Η ανακάλυψή μας του Rex2 ως παράγοντα εξασθένησης του ιού επεκτείνει το οπλοστάσιο των γνωστών μιτοχονδριακών αντιικών παραγόντων πέρα ​​από το Nuc1 και υποδηλώνει ότι τα μιτοχόνδρια αποτελούν βασικό αντιικό κόμβο στη ζύμη. Πράγματι, τα μιτοχόνδρια διαδραματίζουν κεντρικούς ρόλους στην ιική άμυνα ως προγραμματισμένος ρυθμιστής κυτταρικού θανάτου και ως πλατφόρμα για αντιϊκή σηματοδότηση στον άνθρωπο. Πώς οι μιτοχονδριακές νουκλεάσες εξασθενούν έναν ιό που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα του ζυμομύκητα; Μια πιθανότητα είναι ότι αυτά τα ένζυμα, ενώ στοχεύουν στα μιτοχόνδρια, μπορεί ωστόσο να συσσωρεύονται σε χαμηλά αλλά επαρκή επίπεδα στο κυτταρόπλασμα για να επιτύχουν άμεσα την εξασθένηση του LA. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, δείξαμε προηγουμένως ότι το Nuc1 συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα των μειοτικών κυττάρων, αν και οι μέθοδοί μας δεν μπόρεσαν να το ανιχνεύσουν στο κυτταρόπλασμα των μιτωτικών κυττάρων (27). Μια άλλη υπόθεση είναι ότι κάποια πτυχή του κύκλου αντιγραφής LA εμφανίζεται σε στενή σχέση με τα μιτοχόνδρια. Για παράδειγμα, οι μεταγραφές LA μπορεί να συσχετίζονται και πιθανώς να διασχίζουν τα μιτοχόνδρια, εκθέτοντάς τα σε Nuc1 και/ή Rex2. Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την πιθανή γενική σημασία των μιτοχονδρίων για την ιική έμφυτη ανοσία στους ευκαρυώτες και τοποθετούν το σύστημα ζυμομύκητα-LA ως ισχυρό μοντέλο για περαιτέρω μελέτες αυτού του θέματος.

Το αντιιικό σύμπλεγμα SKI ​​που σχετίζεται με τη μετάφραση ριβοσωμάτων και η ταυτοποίησή μας των Pab1, Sro9 και Slf1 ως κατασταλτών υψηλού αντιγράφου της παθογένεσης του LA αποκαλύπτουν περαιτέρω το μεταφραστικό ριβόσωμα ως βασικό κόμβο αντιϊκής δράσης ζυμομύκητα. Το εύρημα ότι το PAB1 (πρωτεΐνη σύνδεσης πολυΑ) καταστέλλει το LA είναι εκπληκτικό δεδομένης της απουσίας ουρών πολυΑ στα μεταγραφήματα LA, υποδηλώνοντας ότι το Pab1 δεν δρα απευθείας στο LA. Προηγούμενα ευρήματα έδειξαν ότι τα μεταγραφήματα LA ανταγωνίζονται με τα mRNA ζυμομύκητα polyA+ για τη σύλληψη ριβοσωμικών υπομονάδων 60S για να σχηματίσουν μεταφραστικά σύμπλοκα 80S (64). Ένα μοντέλο που εξηγεί τα ευρήματά μας είναι ότι το Pab1 ενισχύει τη μετάφραση των mRNA που περιέχουν ουρά polyA, το οποίο στη συνέχεια εξαντλεί τη διαθεσιμότητα υπομονάδων 60S για μεταγραφές LA για μετάφραση. Οι ρόλοι των Sro9 και Slf1 στη μετάφραση είναι λιγότερο κατανοητοί, αλλά οι λειτουργίες τους μπορεί παρομοίως να σχετίζονται με τον ανταγωνισμό των μεταγραφών LA για υπομονάδες 60S. Είναι σημαντικό ότι τα ομόλογα των Pab1 και Sro9/Slf1 εμπλέκονται στην ανθρώπινη ιική άμυνα και περαιτέρω μελέτες αυτών των γονιδίων σε ζυμομύκητες θα ρίξουν φως στους αντιιικούς μηχανισμούς που διατηρούνται από τη ζύμη στον άνθρωπο.

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

Προσδιορίσαμε έναν αντιιικό ρόλο για τον διατηρημένο μεταγραφικό παράγοντα HSF1 μαζί με μια απόκριση πρωτεοστατικού στρες που προκαλείται από το LA που περιλαμβάνει τη συσσώρευση εστιών Hsp104-GFP, ενός ενεργοποιημένου δείκτη HSF1- κυτταροτοξικών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το μοντέλο στο οποίο η παθογένεση του LA προκαλείται από πρωτεοτοξικό στρες. Ανακαλύψαμε επίσης αντιιική λειτουργία για το σύμπλεγμα SAGA, το οποίο έχει αποδειχθεί ότι δρα ως συνενεργοποιητής της επαγωγής γονιδίου στόχου Hsf1 μετά από θερμικό σοκ (65, 66). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι τα υψηλά επίπεδα LA οδηγούν στην εξαρτώμενη από SAGA ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων Hsf1 τα οποία στη συνέχεια πραγματοποιούν την αντιική λειτουργία, φωτίζοντας ένα πιθανό πρόγραμμα έκφρασης αντιιικού γονιδίου σε εκκολαπτόμενους ζυμομύκητες. Αυτό το μοντέλο κάνει πολλές ελεγχόμενες προβλέψεις που μπορεί να σχετίζονται με την παθογένεση του ιού σε άλλους οργανισμούς. Πράγματι, ο ανθρώπινος HSF1 ελέγχει επίσης την έκφραση πρωτεολυτικών ρυθμιστικών παραγόντων. Ενώ οι αντιικές λειτουργίες του ανθρώπινου HSF1 έχουν περιγραφεί, δεν είναι σαφές τι ρόλο παίζει η απόκριση του ορθοστατικού στρες σε αυτό (39). Τα ευρήματά μας φωτίζουν ένα ισχυρό σύστημα για να διακρίνουμε την αντιική λειτουργία του Hsf1 σε σχέση με τον ρόλο του στην ενεργοποίηση της απόκρισης του πρωτεοστατικού στρες.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Οι T. Nakayashiki, CP Kurtzman, HK Edskes, RB Wickner, Yeast prions [URE3] και [PSI+] είναι ασθένειες. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 102, 10575–10580 (2005).

2. RB Wickner, Τ. Fujimura, R. Esteban, Ιοί και πριόνια του Saccharomyces cerevisiae. Adv. Virus Res. 86, 1–36 (2013).

3. T. Fujimura, R. Esteban, Μηχανισμός Cap-snatching in yeast LA double-stranded RNA virus. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 108, 17667–17671 (2011).

4. JD Dinman, T. Icho, RB Wickner, Μια -1 μετατόπιση ριβοσωματικού πλαισίου σε έναν δίκλωνο ιό RNA ζυμομύκητα σχηματίζει μια πρωτεΐνη σύντηξης gag-pol. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 88, 174–178 (1991).

5. A. Bernheim et al., Οι προκαρυωτικές οχιές παράγουν διάφορα αντιικά μόρια. Nature 589, 120–124 (2021).

6. A. Bernheim, R. Sorek, Το πανάνοσο σύστημα των βακτηρίων: Η αντιϊκή άμυνα ως κοινοτικός πόρος. Nat. Rev. Microbiol. 18, 113–119 (2020).

7. AG Johnson et al., Bacterial masterminds αποκαλύπτουν έναν αρχαίο μηχανισμό κυτταρικού θανάτου. Science 375, 221–225 (2022).

8. BR Morehouse et al., STING cyclic dinucleotide sensing προέρχεται από βακτήρια. Nature 586, 429–433 (2020).

9. G. Ofir et al., Αντιϊική δραστηριότητα βακτηριακών περιοχών TIR μέσω μορίων ανοσολογικής σηματοδότησης. Nature 600, 116–120 (2021).

10. KM Slavik et al., cGAS-like receptors ανιχνεύουν το RNA και ελέγχουν τη σηματοδότηση 3'2'-cGAMP σε Drosophila. Nature 597, 109–113 (2021).

11. AT Whiteley et al., Βακτηριακά cGAS-όπως ένζυμα συνθέτουν διάφορα νουκλεοτιδικά σήματα. Nature 567, 194–199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' mRNA εξωνουκλεάση Xrn1 ελέγχει τη συσσώρευση δίκλωνου RNA και τις αντι-ιικές αποκρίσεις. Μικρόβιο ξενιστή κυττάρων. 17, 332–344 (2015).

13. SC Eckard et al., Το εξώσωμα SKIV2L RNA περιορίζει την ενεργοποίηση των υποδοχέων τύπου RIG-I. Nat. Immunol. 15, 839–845 (2014).

14. M. Miyashita, H. Oshiumi, M. Matsumoto, T. Seya, DDX60, μια ελικάση κουτιού DEXD/H, είναι ένας νέος αντιιικός παράγοντας που προάγει τη μεσολάβηση του υποδοχέα τύπου RIG-I. ΜοΙ. Cell Biol. 31, 3802–3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Χωροχρονικός χαρακτηρισμός της αντιϊκής δραστηριότητας της συσσωμάτωσης XRN1-DCP1/2 ενάντια στους ιούς κυτταροπλασματικού RNA για την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου. Cell Death Differ 27, 2363–2382 (2020).

16. RE Rigby, J. Rehwinkel, RNA degradation in antiviral immunity and autoimmunity. Trends Immunol. 36, 179–188 (2015).

17. Οι F. Shiromoto et al., Η επαγωγή έκφρασης Ski2 με τη μεσολάβηση IL-1βήτα/ATF3- ενισχύει την αποικοδόμηση του ιού της ηπατίτιδας Β x mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 503, 1854–1860 (2018).

18. JT Brown, X. Bai, AW Johnson, Οι αντιικές πρωτεΐνες ζύμης Ski2p, Ski3p και Ski8p υπάρχουν ως σύμπλοκο in vivo. RNA 6, 449-457 (2000).

19. DC Masison et al., Decoying the cap- mRNA degradation system by a double-stranded RNA virus and poly(A)-mRNA surveillance by a yeast antiviral system. ΜοΙ. Cell Biol. 15, 2763-2771 (1995).

20. C. Schmidt et al., The cryo-EM structure of a ribosome-Ski2-Ski3-Ski8 helicase complex. Science 354, 1431–1433 (2016).

21. AM Searfoss, RB Wickner, 3' poly(A) είναι απαραίτητο για μετάφραση. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 97, 9133–9137 (2000).

22. EA Toh, Ρ. Guerry, RB Wickner, Chromosomal superkiller mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 136, 1002–1007 (1978).

23. A. Zinoviev, RK Ayupov, IS Abaeva, CUT Hellen, TV Pestova, Extraction of mRNA from Stalled Ribosomes by the Ski Complex. ΜοΙ. Cell 77, 1340–1349 e1346 (2020).

24. SG Ball, C. Tirtiaux, RB Wickner, Genetic control of La and L-(Bc) Dsrna copy number in killer systems of SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Genetics 107, 199-217 (1984).

25. R. Esteban, L. Vega, T. Fujimura, 20S RNA narnavirus αψηφά την αντιική δράση του SKI1/XRN1 στο Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, 25812–25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 είναι ένας ειδικός για το είδος περιοριστικός παράγοντας ιού σε ζυμομύκητες. PLoS Pathog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao et al., Meiotic viral attenuation through an ancestral apoptotic pathway. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Ενδονουκλεάση G είναι μια αποπτωτική DNase όταν απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια. Nature 412, 95–99 (2001).

29. BJ Thomson, Ιοί και απόπτωση. Int. J. Εχρ. Pathol. 82, 65–76 (2001).

30. MD Eastwood, SW Cheung, KY Lee, J. Moffat, MD Meneghini, Αναπτυξιακά προγραμματισμένη πυρηνική καταστροφή κατά τη διάρκεια της γαμετογένεσης ζυμομύκητα. Dev. Cell 23, 35-44 (2012).

31. MD Eastwood, MD Meneghini, Αναπτυξιακός συντονισμός διαφοροποίησης γαμετών με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε σποριογόνο ζυμομύκητα. Eukaryot Cell 14, 858–867 (2015).

32. N. Schmidt et al., The SARS-CoV-2 RNA-protein interactome in infected human cells. Nat. Microbiol. 6, 339–353 (2021).

33. RW Smith, NK Gray, Poly(A)-binding protein (PABP): Ένας κοινός ιικός στόχος. Biochem. J. 426, 1–12 (2010).

34. R. Grover et al., Myg1 exonuclease συνδέει τα πυρηνικά και μιτοχονδριακά μεταφραστικά προγράμματα μέσω επεξεργασίας RNA. Nucleic Acids Res. 47, 5852–5866 (2019).

35. EV Koonin, Μια διατηρημένη αρχαία περιοχή ενώνεται με την αυξανόμενη υπεροικογένεια των 3'-5' εξωνουκλεασών. Curr. Biol. 7, R604-606 (1997).

36. M. Szewczyk et al., Human REXO2 ελέγχει βραχέα μιτοχονδριακά RNA που δημιουργούνται από μηχανήματα επεξεργασίας και αποσύνθεσης mtRNA για την πρόληψη της συσσώρευσης δίκλωνου RNA. Nucleic Acids Res. 48, 5572–5590 (2020).

37. Y. Zuo, MP Deutscher, Exoribonuclease superfamilies: Structural analysis and phylogenetic κατανομή. Nucleic Acids Res. 29, 1017–1026 (2001).

38. EW Trotter, L. Berenfeld, SA Krause, GA Petsko, JV Gray, Η κακή αναδίπλωση πρωτεΐνης και η αύξηση της θερμοκρασίας προκαλούν διακοπή της G1 μέσω ενός κοινού μηχανισμού που εξαρτάται από τον παράγοντα θερμικού σοκ στο Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 98, 7313–7318 (2001).

39. A. Reyes, AJ Navarro, B. Diethelm-Varela, AM Kalergis, PA Gonzalez, Υπάρχει ρόλος για τον HSF1 στις ιογενείς λοιμώξεις; FEBS Open Bio 12, 1112–1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, Το διπλόκλωνο RNA παράγεται από ιούς RNA θετικού κλώνου και ιούς DNA αλλά όχι σε ανιχνεύσιμες ποσότητες από ιούς RNA αρνητικού κλώνου. J. Virol. 80, 5059–5064 (2006).

41. S. Welsch et al., Σύνθεση και τρισδιάστατη αρχιτεκτονική των τόπων αναπαραγωγής και συναρμολόγησης του ιού δάγγειου πυρετού. Μικρόβιο ξενιστή κυττάρων. 5, 365–375 (2009).

42. I. Fernandez de Castro, R. Tenorio, C. Risco, Εργοστάσια συναρμολόγησης ιών σε έναν κόσμο λιπιδίων. Curr. Γνώμη. Virol. 18, 20–26 (2016).

43. YX Liu, CL Dieckmann, Υπερπαραγωγή σωματιδίων που μοιάζουν με ιούς ζυμομύκητα από στελέχη ανεπαρκή σε μιτοχονδριακή νουκλεάση. ΜοΙ. Cell Biol. 9, 3323-3331 (1989).

44. AW Johnson, RD Kolodner, Synthetic lethality of sep1 (xrn1) ski2 and sep1 (xrn1) ski3 mutants of Saccharomyces cerevisiae είναι ανεξάρτητο από τον ιό φονέα και προτείνει ένα γενικό ρόλο για αυτά τα γονίδια στον έλεγχο της μετάφρασης. ΜοΙ. Cell Biol. 15, 2719-2727 (1995).

45. C. Stark et al., BioGRID: Ένα γενικό αποθετήριο για σύνολα δεδομένων αλληλεπίδρασης. Nucleic Acids Res. 34, D535–539 (2006).

46. ​​L. Espert et al., ISG20, μια νέα επαγόμενη από ιντερφερόνη RNase ειδική για μονόκλωνο RNA, ορίζει μια εναλλακτική οδό κατά του ιού έναντι των γονιδιωματικών ιών RNA. J. Biol. Chem. 278, 16151–16158 (2003).

47. T. Hanekamp, ​​PE Thorsness, YNT20, ένας καταστολέας παράκαμψης του yme1 yme2, κωδικοποιεί μια πιθανή 3'-5' εξωνουκλεάση εντοπισμένη στα μιτοχόνδρια του Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet 34, 438-448 (1999).

48. A. van Hoof, P. Lennertz, R. Parker, Τρία συντηρημένα μέλη της οικογένειας RNase D έχουν μοναδικές και αλληλοεπικαλυπτόμενες λειτουργίες στην επεξεργασία των 5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP και RNase P RNAs σε ζυμομύκητες . EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, Συσχέτιση αυξημένης έκφρασης MYG1 και πολυμορφισμού προαγωγέα του με την εξέλιξη της νόσου και την υψηλότερη ευαισθησία σε ασθενείς με λεύκη. J. Dermatol. Sci. 71, 195–202 (2013).

50. K. Kingo et al., MYG1, ένα νέο γονίδιο που σχετίζεται με μελανοκύτταρα, έχει αυξημένη έκφραση στη λεύκη. J. Dermatol. Sci. 44, 119–122 (2006).

51. IB Andika, A. Jamal, H. Kondo, N. Suzuki, σύμπλοκο SAGA μεσολαβεί στη μεταγραφική προς τα πάνω ρύθμιση της σίγησης του αντιιικού RNA. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 114, E3499–E3506 (2017).

52. SG Sobel, SL Wolin, Οι πρωτεΐνες που περιέχουν δύο ζυμομύκητες La είναι πρωτεΐνες που δεσμεύουν το RNA που συνδέονται με πολυριβοσώματα. ΜοΙ. Biol. Cell 10, 3849-3862 (1999).

53. A. Proweller, JS Butler, Ribosomal Association of poly(A)-binding protein in poly(A)-deficient Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271, 10859–10865 (1996).

54. DE Gordon et al., Ένας χάρτης αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης SARS-CoV-2 αποκαλύπτει στόχους για επαναχρησιμοποίηση φαρμάκων. Nature 583, 459–468 (2020).

55. O. Brandman et al., Ένα σύμπλεγμα ποιοτικού ελέγχου δεσμευμένο σε ριβόσωμα ενεργοποιεί την αποικοδόμηση των νεοφυών πεπτιδίων και σηματοδοτεί το μεταφραστικό στρες. Cell 151, 1042-1054 (2012).

56. J. Anckar, L. Sistonen, Ρύθμιση της λειτουργίας HSF1 στην απόκριση θερμικής καταπόνησης: Επιπτώσεις στη γήρανση και στις ασθένειες. Annu. Rev. Biochem. 80, 1089–1115 (2011).

57. J. Li, J. Labbadia, RI Morimoto, Rethinking HSF1 in stress, development, and organismal health. Trends Cell Biol. 27, 895–905 (2017).

58. PK Sorger, HR Pelham, Καθαρισμός και χαρακτηρισμός πρωτεΐνης σύνδεσης στοιχείου θερμικού σοκ από ζυμομύκητα. EMBO J. 6, 3035-3041 (1987).

59. EJ Solis et al., Ο ορισμός της βασικής λειτουργίας του ζυμομύκητα Hsf1 αποκαλύπτει ένα συμπαγές μεταγραφικό πρόγραμμα για τη διατήρηση της ευκαρυωτικής πρωτεόστασης. ΜοΙ. Cell 63, 60–71 (2016).

60. JR Glover, S. Lindquist, Hsp104, Hsp70 και Hsp40: Ένα νέο σύστημα συνοδών που διασώζει προηγουμένως συσσωματωμένες πρωτεΐνες. Cell 94, 73-82 (1998).

61. Z. Li et al., Συστηματική εξερεύνηση βασικής λειτουργίας γονιδίου ζυμομύκητα με μεταλλαγμένα ευαίσθητα στη θερμοκρασία. Nat. Biotechnol. 29, 361–367 (2011).

62. RY Zhao, Yeast for virus research. Microb. Cell 4, 311–330 (2017).

63. T. Panavas, E. Serviene, J. Brasher, PD Nagy, Η οθόνη σε επίπεδο γονιδιώματος ζυμομύκητα αποκαλύπτει ανόμοια σύνολα γονιδίων ξενιστών που επηρεάζουν την αναπαραγωγή των ιών RNA. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. USA 102, 7326–7331 (2005).

64. Y. Ohtake, RB Wickner, Η διάδοση του ιού ζυμομύκητα εξαρτάται κρίσιμα από τη συγκέντρωση ελεύθερης ριβοσωμικής υπομονάδας 60S. ΜοΙ. Cell Biol. 15, 2772-2781 (1995).

65. Τα σύμπλοκα τροποποίησης χρωματίνης SB Kremer, DS Gross, SAGA και Rpd3 ρυθμίζουν δυναμικά τη δομή και την έκφραση του γονιδίου θερμικού σοκ. J. Biol. Chem. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach et al., Hsf1 και Hsp90 ενορχηστρώνουν εξαρτώμενη από τη θερμοκρασία παγκόσμια μεταγραφική αναδιαμόρφωση και αρχιτεκτονική χρωματίνης στο Candida albicans. Nat. Commun. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Η συσσώρευση των ουρών CAT εμποδίζει την αποικοδόμησή τους και προκαλεί πρωτεοτοξικότητα στο S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. L. Magtanong et al., Τα δίκτυα γενετικής αλληλεπίδρασης καταστολής δόσης ενισχύουν τα λειτουργικά διαγράμματα καλωδίωσης του κυττάρου. Nat. Biotechnol. 29, 505–511 (2011).

69. V. Bilanchone et al., Το ρετροτρανσποζόνιο Ty3 πειράζει τα σώματα επεξεργασίας RNA ζυμομύκητα για να μολύνει νέα γονιδιώματα. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan et al., Cytosolic proteostasis μέσω εισαγωγής λανθασμένων πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια. Nature 543, 443–446 (2017).