Χαρακτηριστικοί υποδοχείς που μοιάζουν με διόδια Έκφραση γονιδίου και γλοιακή απόκριση σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου της φυσικής τρομώδους νόσου Μέρος 3

Ερευνήσαμε τις πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των νευροπαθολογικών χαρακτηριστικών της νόσου του πριόν και της έκφρασης του γονιδίου TLR σε τέσσερις διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου προβάτων που έχουν μολυνθεί φυσικά με τρομώδη νόσο. Και στις τέσσερις περιοχές του εγκεφάλου, παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στην εναπόθεση PrPSc, τη σπογγίωση, την αστρογλοίωση και τη μικρογλίωση στα φυσικά μολυσμένα πρόβατα έναντι των προβάτων ελέγχου.

Η ασθένεια Prion, επίσης γνωστή ως ασθένεια του ναού, ασθένεια που τρώει κερί, κ.λπ., είναι μια οξεία ιογενής λοίμωξη που προκαλείται από πριόν. Η ασθένεια μεταδίδεται κυρίως με την κατανάλωση άψητων τροφίμων που περιέχουν πριόν. Μόλις μολυνθεί με πριόν, μπορεί να προκαλέσει φλεγμονή του εγκεφάλου και βλάβη του νευρικού συστήματος και μπορεί να εμφανιστούν συμπτώματα όπως πονοκέφαλος, έμετος και πυρετός.

Ωστόσο, όταν αντιμετωπίζουμε μια τέτοια κατάσταση, δεν μπορούμε να χάσουμε την εμπιστοσύνη στη μνήμη μας λόγω της ύπαρξης της νόσου του πριόν. Τα περισσότερα μολυσμένα άτομα μπορούν να αναρρώσουν και να αποκαταστήσουν τη μνήμη τους μετά τη θεραπεία.

Φυσικά, από προληπτική άποψη, μπορούμε να προσπαθήσουμε να τρώμε περισσότερο μαγειρεμένο φαγητό για να αποφύγουμε τη μόλυνση από πριόν. Ταυτόχρονα, εάν αισθανθείτε συμπτώματα, θα πρέπει επίσης να επισκεφθείτε έναν γιατρό το συντομότερο δυνατό για να αποτρέψετε την επιδείνωση της νόσου.

Στην καθημερινή ζωή, μπορούμε να δοκιμάσουμε κάποια απλή εκπαίδευση μνήμης, όπως ανάγνωση, σύνταξη λιστών, οργάνωση εκδηλώσεων και πληροφοριών κ.λπ. για να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Αυτές οι προπονήσεις δεν απαιτούν πολύ χρόνο και ενέργεια, αλλά είναι πολύ σημαντικές για τη διατήρηση ενός υγιούς εγκεφάλου και την αποτελεσματική λειτουργία της μνήμης.

Εν ολίγοις, όταν αντιμετωπίζουμε ασθένειες όπως η ασθένεια πριόν, θα πρέπει να την αντιμετωπίζουμε θετικά, να αναζητούμε επαγγελματική ιατρική θεραπεία και προληπτικά μέτρα και να δίνουμε προσοχή στις καθημερινές ασκήσεις μνήμης για να διασφαλίσουμε τη σωματική μας υγεία και την αποτελεσματική εργασία. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων, που είναι πολύ σημαντικοί για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος αποκτά επαρκή διατροφή και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Αυτές οι διαφορές ήταν πιο εμφανείς στον προμήκη μυελό, το πιο ουραίο. Αντίθετα, οι πιο ήπιες βλάβες παρατηρήθηκαν στον μετωπιαίο φλοιό, την πιο ροστραλαρεία. Αυτό το διαδοχικό μοτίβο συμφωνεί με την οδό της νευροεισβολής και της διάδοσης του πριόν σε όλο το ΚΝΣ, ξεκινώντας από τις θέσεις εισόδου στον νωτιαίο μυελό και στο οξείδιο του νωτιαίου μυελού και τελικά φτάνοντας στον μετωπιαίο φλοιό [1,5,51].

Απροσδόκητα, λαμβάνοντας υπόψη την ανατομική τους εγγύτητα, παρατηρήσαμε δραστική μείωση της εναπόθεσης και κενοτοπίωσής του PrPSc και σημαντική μείωση της αστρογλοίωσης, όταν μετακινούμαστε από τον θάλαμο στον ιππόκαμπο, χωρίς να ακολουθούμε τη σταδιακή ουραίο-ροστρική εξέλιξη της παθολογίας.

Μια συγκεκριμένη μικρογλοαμορφολογία γνωστή ως μικρογλοία ράβδου παρατηρήθηκε στην εγγύτητα των πυραμιδικών κυτταρικών νευρώνων στο CA3, αλλά απουσίαζε από όλες τις άλλες νευροανατομικές περιοχές που μελετήθηκαν.

Σύμφωνα με τις γνώσεις μας, αυτό το μικρογλοιακό προφίλ δεν έχει συσχετιστεί με νευροφλεγμονή που προκαλείται από πριόν μέχρι σήμερα, αν και μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε την παρουσία μικρογλοίας σε σχήμα ράβδου στην παρεγκεφαλίδα ανθρώπων ασθενών με CJD [52].

Αν και ελάχιστα μελετήθηκαν από τις πρώτες περιγραφές στη δεκαετία του 1900, η ​​μικρογλοία της ράβδου έχει πρόσφατα αναφερθεί σε νευρολογικές διαταραχές όπως η επιληψία, η άνοια του σώματος Lewy, η νόσος του Huntington και η AD, ειδικά σε μέτρια κατεστραμμένες περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού και του ιππόκαμπου [40,41,53]. Η φαινοτυπική έκφραση και οι λειτουργίες της μικρογλοίας της ράβδου δεν είναι ακόμη σαφείς.

Ωστόσο, το γεγονός ότι αυτό το μορφολογικό χαρακτηριστικό συμπίπτει τυπικά με την παρουσία νευρωνικών στοιχείων που είναι κατεστραμμένα ή ευάλωτα σε βλάβη υποδηλώνει νευροπροστατευτικό ρόλο [42,54,55].

Η μικρογλοία της ράβδου δεν θεωρείται ότι σχετίζεται με σοβαρές βλάβες, καθώς η εξέλιξη προς την αμεβοειδή μορφολογία αναμένεται σε αυτές τις καταστάσεις [56]. Η παρουσία rodmicroglia στον ιππόκαμπο προβάτων που έχουν μολυνθεί από τρομώδη νόσο, αλλά όχι σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου, μπορεί να είναι ενδεικτική ενός νευροπροστατευτικού περιβάλλοντος, σε καλή συμφωνία με την περιορισμένη νευρωνική απώλεια που παρατηρείται σε αυτή την περιοχή.

Η ανάλυσή μας της έκφρασης του TLR αποκαλύπτει μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της σοβαρότητας της βλάβης και της υπερέκφρασης του γονιδίου TLR που συμπίπτει με την προαναφερθείσα ουραία-ροστρική εξέλιξη της νευροπαθολογίας του πριόν.

Αντίθετα, ο TLR4 υπερεκφραζόταν ομοίως σε όλες τις περιοχές, ανεξάρτητα από τη σοβαρότητα της βλάβης. Η υπερέκφραση του TLR4 σε περιοχές ηπιότερης νευρωνικής βλάβης (δηλαδή, ο ιππόκαμπος και ο μετωπιαίος φλοιός) μπορεί να αντανακλά τον νευροπροστατευτικό ρόλο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τα φαγοκυτταρικά κύτταρα όπως τα μακροφάγα και τα μικρογλοία [23,57]. Η ανοδική ρύθμιση του TLR7 έχει αναφερθεί προηγουμένως σε μοντέλα ποντικών πριονόσους και ανθρώπους ασθενείς [22,26,31].

Παρατηρήσαμε μόνο την ανοδική ρύθμιση του TLR7 στον προμήκη μυελό, την πιο κατεστραμμένη περιοχή στην οποία ανιχνεύθηκαν τα υψηλότερα επίπεδα σπογγίωσης και εναπόθεσης PrPSc.

Ο νευρωνικός θάνατος μέσω απόπτωσης έχει συσχετιστεί παλαιότερα με τη διέγερση του TLR7 [58,59] και η υπερέκφρασή του στον προμήκη μυελό μπορεί να σχετίζεται με αυτόν τον μηχανισμό [60]. Αν και ο ρόλος του TLR1 σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες δεν είναι ακόμη σαφής, η συμμετοχή του TLR2 στην ενεργοποίηση των μικρογλοίων έχει αποδειχθεί όλο και περισσότερο στην αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, τη σκλήρυνση κατά πλάκας και την AD [61,62].

Ενώ ο ρόλος των ασθενειών πριόν TLR2 δεν είναι πλήρως κατανοητός, έχουν προταθεί ευεργετικά αποτελέσματα: ο χρόνος επιβίωσης μειώνεται σε ποντίκια που δεν εκφράζουν TLR2 μετά από ενδοεγκεφαλικό ενοφθαλμισμό με τρομώδη νόσο [22].

Η υπερέκφραση TLR2 και MyD88 μπορεί επίσης να είναι ενδεικτική ενός φαινοτύπου προφλεγμονώδους μικρογλοίας, που θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση του TNF- και της IL-6 που παρατηρήσαμε στον θάλαμο [8,63].

Είναι ενδιαφέρον ότι τα πειράματα που χρησιμοποιούν κύτταρα EOC 13.31, μια απαθανατισμένη κυτταρική σειρά ποντικού που μοιάζει με μικρογλοία, έδειξαν μια δυσρύθμιση της οδού απόκρισης φλεγμονής ως απόκριση στην ενεργοποίηση του TLR2 και πρότειναν μια σύνδεση μεταξύ της έκφρασης του TLR2 και της συσσώρευσης μικρογλοίας σε μια κατάσταση μη βέλτιστη για φαγοκυττάρωση [26] .

Επομένως, η υπερέκφραση του TLR2 στον προμήκη μυελό και στον θάλαμο, τις πιο κατεστραμμένες περιοχές στις οποίες ανιχνεύθηκαν επίσης υπερβολικά επίπεδα φαγοκυτταρικής μικρογλοίας, υποδηλώνει ότι η δυσλειτουργική κάθαρση του PrPSc μπορεί να οδηγήσει σε παρατεταμένη συσσώρευση PrPSc και νευρική βλάβη [9,17].

Τα ευρήματά μας στον ιππόκαμπο προβάτων που έχουν μολυνθεί από τρομώδη νόσο αποκαλύπτουν ένα αντίθετο μοτίβο σε σύγκριση με άλλες περιοχές του εγκεφάλου που αναλύθηκαν, με μείωση της ρύθμισης των TLR1, TLR2 και MyD88 και χωρίς αλλοιώσεις στην κυτοκίνη.

Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι τα μικρογλοία ανταποκρίνονται διαφορετικά στον ιππόκαμπο. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι η ανεπάρκεια TLR2 σε καλλιέργειες πρωτογενών μικρογλοιακών κυττάρων, από νεογνά ποντίκια (ηλικίας 0–3 ημερών) και διεγερμένη με νευροτοξικό πεπτίδιο PrP106-126, μετατοπίζει τη μικρογλοιακή ενεργοποίηση από νευροτοξικό σε νευροπροστατευτικό φαινότυπο [63 ].

Ωστόσο, η συνάφεια του πεπτιδίου PrP106-126 στην παθολογία των πριόν έχει αμφισβητηθεί [64]. Το CD36 είναι ένας διαφορετικός τύπος υποδοχέα αναγνώρισης προτύπων, ικανός να αναγνωρίζει ενδογενώς προερχόμενους συνδέτες όπως πεπτίδια που σχηματίζουν αμυλοειδές, που έχει καθιερώσει ρόλο στην ενδοκυτταρική πρόσληψη αυτών των συστατικών [65,66]. Αυτός ο υποδοχέας έχει συσχετιστεί με μια προφλεγμονώδη μικρογλοιακή κατάσταση [67].

In vitro, η διέγερση των κυττάρων BV-2, ενός τύπου αθανατοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων, με PrP106-126 έχει ως αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση του CD36, αυξάνοντας τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και την παραγωγή iNOS και NO [68,69].

Επιπλέον, η αναγνώριση του πεπτιδίου -αμυλοειδούς από το CD36 πυροδοτεί τη συγκρότηση ενός νέου ετεροτριμερούς συμπλόκου CD36-TLR4-TLR6 που ενεργοποιεί την έμφυτη ανοσοαπόκριση [70,71].

Στη μελέτη μας, όλες οι περιοχές εμφάνισαν σημαντική ανοδική ρύθμιση του CD36 εκτός από τον ιππόκαμπο. Η ανοδική ρύθμιση των CD36, TLR4 και TLR6 στις πιο κατεστραμμένες περιοχές, τον προμήκη μυελό και το obex, υποδηλώνει τη συμμετοχή αυτής της τριάδας στην πυροδότηση μιας προφλεγμονώδους απόκρισης μικρογλοιακής κατάστασης στη μόλυνση με πριόν.

Αντίστροφα, η απουσία υπερέκφρασης CD36 και TLR6 στον ιππόκαμπο υποδηλώνει ότι αυτό το ετεροτριμερές δεν σχηματίζεται, ενδεικτικό και πάλι του νευροπροστατευτικού περιβάλλοντος σε αυτή την περιοχή του εγκεφάλου.

Μένει να εξηγηθεί γιατί τα μικρογλοία ανταποκρίνονται διαφορετικά σε αυτή την περιοχή του εγκεφάλου. Ενώ ο τροπισμός των κυττάρων που είναι ειδικός για το στέλεχος πριόν θα μπορούσε να καθορίσει το μοτίβο της μικρογλοίωσης και της αστρογλοίωσης, πρόσφατα ευρήματα υποδηλώνουν ότι και οι δύο αντιδράσεις επηρεάζονται κυρίως από την εγκεφαλική περιοχή [18,72].

Ούτε η μικρογλοία ούτε η αστρογλοία ανταποκρίνονται ομοιόμορφα σε όλο το ΚΝΣ και αυτή η ειδική για την περιοχή απόκριση θα μπορούσε να οδηγήσει στην εκλεκτική ευπάθεια ορισμένων περιοχών του εγκεφάλου σε ασθένειες πριόν [16,18].

Από αυτή την άποψη, έχει υποτεθεί ότι η φλεγμονώδης απόκριση της μικρογλοίας στη μόλυνση με πριόν ρυθμίζεται από τη σιαλυλίωση του PrPSc [14,73-75] και ότι η σιαλυλίωση του PrPSc εξαρτάται από την περιοχή του εγκεφάλου [18]. Συγκεκριμένα, υψηλότερο επίπεδο σιαλυλίωσης του PrPSc βρίσκεται στον ιππόκαμπο και τον φλοιό από ό,τι στον θάλαμο και το εγκεφαλικό στέλεχος, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο στην επιλεκτική ευπάθεια αυτών των περιοχών του εγκεφάλου [18,73,75].

Το υψηλό επίπεδο σιαλυλίωσης PrPSc στον ιππόκαμπο μπορεί να συσχετιστεί με επιβράδυνση της αντιγραφής του πριονίου, οδηγώντας στη χαρακτηριστική μικρογλοιακή ενεργοποίηση που προκαλείται από πριόν σε αυτήν την περιοχή, σύμφωνα με τη μειωμένη ευαισθησία αυτής της περιοχής που υπονοείται από τα ευρήματά μας.

Είναι ενδιαφέρον ότι τα προηγούμενα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο ιππόκαμπος μπορεί να προστατεύεται από τη νευροτοξικότητα του πριόν σε φυσική λοίμωξη από CJD [76,77] και λεπτομερείς νευροπαθολογικές μελέτες περιπτώσεων CJD έχουν αναφέρει ηπιότερες βλάβες στον ιππόκαμπο από ό,τι σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου [76].

Συγκεκριμένα, ο αρχιφλοιός, ο οποίος αποτελείται κυρίως από τον ιππόκαμπο, φαίνεται να είναι σχετικά διατηρημένος σε σύγκριση με άλλες φλοιώδεις περιοχές στο CJD [77]. Αυτή η ήπια προσβολή του ιππόκαμπου που περιγράφεται στη φυσική CJD συμφωνεί με τα παρόντα ευρήματα σε πρόβατα που έχουν φυσικά μολυνθεί από τρομώδη νόσο.

Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η μερική προστασία από τουλάχιστον δύο φυσικές ασθένειες πριόν εμφανίζεται στον ιππόκαμπο, ο οποίος είναι φυλογενετικά η παλαιότερη περιοχή του εγκεφαλικού φλοιού και αποτελείται από τον πιο βασικό τύπο φλοιώδους ιστού.

Θα απαιτηθούν περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση της συνάφειας αυτής της συσχέτισης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ιδιαίτερα ήπια νευροπαθολογία στον ιππόκαμπο προβάτων που έχουν μολυνθεί από φυσική τρομώδη νόσο, που χαρακτηρίζεται από χαμηλότερα επίπεδα σπογγώσεως, PrPScαπόθεσης και αστρογλοίωσης από τα αναμενόμενα, δεδομένης της ουράς -ροστρική εξάπλωση των σκληροπυρηνικών αλλοιώσεων.

Επιπλέον, η παρουσία στον ιππόκαμπο μιας αποκλειστικής μικρογλοιακής μορφολογίας, μικρογλοίας ράβδου, η οποία μπορεί να παίζει νευροπροστατευτικό ρόλο [54], μαζί με ένα διακριτό προφίλ γονιδιακής έκφρασης υποδοχέα αναγνώρισης προτύπων (γονίδια TLR και CD36), διαφοροποιούν περαιτέρω αυτήν την περιοχή του εγκεφάλου από την άλλη νευροανατομική περιοχές σε φυσικά πρόβατα μολυσμένα από τρομώδη νόσο.

Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν έναν βαθμό νευροπροστασίας έναντι της φυσικής μόλυνσης από πριόν στον ιππόκαμπο που αξίζει περαιτέρω διερεύνηση. Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες που προκαλούνται από κακή αναδίπλωση πρωτεΐνης περιλαμβάνουν έναν φαύλο κύκλο φλεγμονής που αποτελείται από κακή συσσώρευση πρωτεΐνης, ενεργοποίηση γλοιακών φλεγμονών και απελευθέρωση γλοιακών φλεγμονωδών μεσολαβητών, που επιδεινώνουν την εναπόθεση πρωτεΐνης και νευροφλεγμονή.

Η διακοπή αυτού του φαύλου κύκλου στοχεύοντας την ενεργοποίηση μικρογλοίας χρησιμοποιώντας ειδικούς αναστολείς TLR σε ένα συγκεκριμένο στάδιο της νόσου μπορεί να αποτελέσει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τον περιορισμό περαιτέρω νευροφλεγμονής. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τη μείωση της ρύθμισης του TLR2 ως δυνητικό στόχο για μια τέτοια προσέγγιση, καθώς αυτό μπορεί να προκαλέσει μια μετατόπιση της μικρογλοίας από έναν νευροτοξικό σε έναν νευροπροστατευτικό φαινότυπο [63].

Τέλος, ενώ έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στον χαρακτηρισμό της ποικιλομορφίας των γλοιοφαινότυπου χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικών νευροεκφυλιστικών ασθενειών, το εάν τα μοντέλα ποντικών αντικατοπτρίζουν πιστά βασικές πτυχές των ασθενειών πριόν είναι θέμα συζήτησης [78,79].

Τα αποτελέσματά μας στο διαγονιδιακό μοντέλο tg338 αναπαρήγαγαν τα κοινά παθολογικά σημάδια μόλυνσης από πριόν, συμπεριλαμβανομένης της έντονης εναπόθεσης PrPSc, της σπογγώδους νευροπυλικής, της αστρογλοίωσης και της μικρογλοιώσεως.

Ωστόσο, τα μολυσμένα ποντίκια εμφάνισαν σημαντική υπερέκφραση των TLR1 και TLR2 και τάση για υπερέκφραση TLR7. Ενώ η ανοδική ρύθμιση αυτών των γονιδίων έχει περιγραφεί στο παρελθόν σε άλλα μοντέλα ποντικών που έχουν μολυνθεί από τρομώδη νόσο [22,26], αυτό το πρότυπο έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματά μας στον εγκέφαλο προβάτων. Είναι αξιοσημείωτο ότι στον εγκέφαλο του ποντικού, δεν παρατηρήσαμε αλλαγές στην έκφραση του TLR4, του γονιδίου για το οποίο παρατηρήθηκαν οι μεγαλύτερες αλλαγές στην έκφραση στα δείγματα προβάτων.

Αυτά τα αντικρουόμενα ευρήματα μπορεί να είναι συνέπεια των διαφορετικών οδών μόλυνσης και/ή των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης πριόν σε ποντικούς tg338 [80,81]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας τελικά υποδεικνύουν ότι ο ενδοεγκεφαλικός ενοφθαλμισμός της τρομώδους νόσου σε υπερμεγέθη ποντίκια tg338 δεν αναπαράγει την ανοσολογική απόκριση που παρατηρείται στη φυσική μόλυνση από τρομώδη νόσο.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Πρόβατα μολυσμένα με τρομώδη νόσο και έλεγχος

Είκοσι ένα θηλυκό πρόβατο Rasa Aragonesa (ηλικίας 2-6 ετών) συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Όλα είχαν γονότυπο για πολυμορφισμούς PRNP, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [82], και βρέθηκε ότι εμφανίζουν έναν γονότυπο ARQ/ARQ. Τα ζώα ελέγχου (n=8) επιλέχθηκαν από ένα σμήνος στο οποίο δεν είχαν αναφερθεί περιπτώσεις τρομώδους νόσου.

Τα μολυσμένα από τρομώδη νόσο ζώα(n=13) ελήφθησαν από κοπάδια που είχαν προσβληθεί από τρομώδη νόσο και είχαν διαγνωστεί με ανοσοϊστοχημεία (IHC) βιοψιών βλεννογόνου του ορθού. Η μόλυνση επιβεβαιώθηκε με μεταθανάτια ανοσοανίχνευση του PrPSc στο obex σύμφωνα με δημοσιευμένα κριτήρια [83].

Τα ζώα υπέστησαν ευθανασία με ενδοφλέβια υπερβολική δόση βαρβιτουρικών και αφαίμαξη.

Κατά τη στιγμή της ευθανασίας, όλα τα μολυσμένα με τρομώδη νόσο πρόβατα εμφάνισαν κλινικά σημεία διαφορετικής σοβαρότητας: ορισμένα ζώα εμφάνισαν αρχικά σημεία όπως κνησμό της πλάτης και των πλευρών μετά από ψηφιακή διέγερση και ήπια μείωση της κατάστασης του σώματος, ενώ άλλα εμφάνισαν προχωρημένα κλινικά σημεία όπως αυθόρμητο ξύσιμο του Ρίζα της ουράς, οσφυϊκή περιοχή και άκρα, νευρολογικά σημεία που περιλαμβάνουν αταξία και τρόμο της κεφαλής και τρίξιμο των δοντιών, απώλεια μαλλιού και έντονη απώλεια βάρους [84].

4.2. Λοίμωξη ποντικιού Tg338

Για να αξιολογηθούν οι εκφράσεις του γονιδίου TLR στον εγκέφαλο ενός μοντέλου ποντικού τρομώδους νόσου, ηλικίας δέκα εβδομάδων ποντικών tg338 (n=8) (που υπερεκφράζουν το VRQ/VRQ PrPC του προβάτου 8- στο 10-διπλάσιο [ 85]) εμβολιάστηκαν με μια δεξαμενή εγκεφάλου από ένα φυσικό πρόβατο Rasa Aragonesa μολυσμένο με τρομώδη νόσο που θυσιάστηκε στο κλινικό στάδιο.

Τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με 20 uL του εμβολίου τρομώδους νόσου (αραιωμένο 2% w/v σε PBS) στο δεξιό εγκεφαλικό ημισφαίριο υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο. Οι ενδοεγκεφαλικές ενέσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια σύριγγα 50 μL και μια βελόνα 25G. Μετά τον εμβολιασμό, χορηγήθηκε υποδόρια ένεση βουπρενορφίνης (0,3 mg/kg) για την πρόκληση αναλγησίας.

Ως μάρτυρες, τα ποντίκια tg338 (n=8) εμβολιάστηκαν με ομογενοποίηση εγκεφάλου από πρόβατο αρνητικό για τρομώδη νόσο ακολουθώντας την ίδια διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για την ανάπτυξη κλινικών σημείων και υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας όταν εμφανίστηκαν τελικά σημεία ασθένειας όπως σοβαρή αταξία και αδυναμία σίτισης.

Τα ποντίκια που είχαν μολυνθεί με το εμβόλιο θετικό για τρομώδη νόσο εμφάνισαν μέσο χρόνο επιβίωσης 187 ± 26 dpi.

4.3. Συλλογή Ιστών

Δείγματα από το ΚΝΣ συλλέχθηκαν και χωρίστηκαν οβελιαία σε δύο μισά. Το ένα στερεώθηκε σε φορμαλίνη ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος 10% για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση, και το άλλο καταψύχθηκε απευθείας και διατηρήθηκε στους -80 ◦C για ανάλυση πρωτεΐνης ή σταθεροποιήθηκε σε διάλυμα RNAlaterTM (InvitrogenTM, Waltham, MA, ΗΠΑ) για εκχύλιση RNA και στη συνέχεια καταψύχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ◦C.

4.4. Αλληλουχία PRNP

Το DNA εξήχθη από δείγματα αίματος με το κιτ εξαγωγής ιστού DNA της Speedtools (Biotools, Μαδρίτη, Ισπανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ενίσχυση και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας PCR έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [82].

4.5. Ανοσοϊστοχημεία

Οι σταθεροποιημένοι με φορμαλίνη ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τυπικές ιστοπαθολογικές διαδικασίες. Οι τομές ιστού ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, κόπηκαν σε τομές πάχους 4 μm και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (ΗΕ) για την αξιολόγηση της κενώσεως και της σπογγώσεως των νευροπυλών.

Το IHC για την ανίχνευση PrPSc πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό πρωτεύον αντίσωμα ποντικούL42 σε πρόβατα (αραίωση 1:500 σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά) (R-Biopharm, Darmstadt, Γερμανία) και το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού R486 σε ποντίκια (1: 8000 αραίωση, όλη τη νύχτα στους 4 ◦C) (R. Jackman, αδημοσίευτο) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [86,87].

Οι τομές υποβλήθηκαν επίσης σε συμβατική ανοσοχρώση για τη γλοιακή ινώδη όξινη πρωτεΐνη δείκτη αστροκυττάρων (GFAP) (1:500· Dako, Glostrup, Δανία) και τον δείκτη μικρογλοίας ιονισμένο μόριο προσαρμογέα ασβεστίου δέσμευσης ασβεστίου 1 (Iba1) (1:1000; , VA, USA), σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα [88]. Όλες οι ιστολογικές αξιολογήσεις και οι αξιολογήσεις IHC πραγματοποιήθηκαν από δύο κτηνιάτρους παθολόγους τυφλούς ως προς τα κλινικά δεδομένα.

Οι αξιολογήσεις της σπογγώσεως και της έντασης χρώσης PrPSc πραγματοποιήθηκαν ημι-ποσοτικά και προσαρμόστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφηκαν σε προηγούμενες μελέτες: η κενοτοπίωση της νευροπίλης και της περικάρυας βαθμολογήθηκε από 0 (απουσία) έως 5 (πολύ πολυάριθμη και συρρέουσα) [51], το σήμα PrPSc ποσοτικοποιήθηκε με βάση την έκταση της ανοσοχρώσης από 0 (χωρίς επισήμανση) έως 5 (έντονη ομοιόμορφη επισήμανση) όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [89], και η έκταση της ανοσοσήμανσης GFAP και Iba1 βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα που κυμαίνεται από {{ 8}} έως 5 (0=ασθενής χρώση, 5=ουσιαστική ανοσοσήμανση σε όλη την περιοχή) όπως περιγράφεται [88]. Αξιολογήθηκαν τέσσερις περιοχές του εγκεφάλου: μετωπιαίος φλοιός (Fc) θάλαμος (Th), σχηματισμός ιππόκαμπου (Hc) και προμήκης μυελός (Mo), και κάθε περιοχή αναλύθηκε συνολικά για τη βαθμολόγηση και παριστάνεται γραφικά ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα.

4.6. Δυτική Κηλίδα

100 mg εγκεφαλικού ιστού κάθε περιοχής του εγκεφάλου (Fc, Th, Hc, και Mo) από 13 πρόβατα μολυσμένα με τρομώδη νόσο, 8 με προχωρημένα κλινικά σημεία και 5 με αρχικά κλινικά σημεία, ομογενοποιήθηκαν σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης.

Οι ημιεγκεφαλώνες των 8 μολυσμένων και 8 ποντικών ελέγχου ομογενοποιήθηκαν σε 10% (β/ο) σε ρυθμιστικό λύσης. Τα δείγματα ιστών ήταν ομογενοποιημένοι σωλήνες άλεσης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ PierceTM BCA Protein Assay (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για την ανάλυση PrPres, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από ομογενοποιήματα ιστού επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37 ◦C με διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [90].

Τα δείγματα που προέκυψαν υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 12% CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF που μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα με 2% ξηρό γάλα χωρίς λιπαρά σε TBST (Tris- ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween20).

Για την ανοσοστύπωση, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ◦C με πρωτεύον αντίσωμα Sha31 (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Γαλλία) σε συγκέντρωση 1 μg/mL και ακολούθησε επώαση 1 ώρας σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με υπεροξειδάση χρένου- συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα κατά IgG ποντικού (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Γερμανία). Η έκφραση της πρωτεΐνης TLR4 αναλύθηκε από τα ομογενοποιήματα ιστού αναμεμειγμένα με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 2×Laemmli (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή .

Σαράντα μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά φρεάτιο, χρησιμοποιήθηκαν σε 7,5% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, οι οποίες στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν για 2 ώρες με 4% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) (Merck, Darmstadt, Γερμανία) στο TBST στο RT. Οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ◦C με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού anti-TLR4 (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) σε συγκέντρωση 0,5 μg/mL, και στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με IgG κατσίκας κατά κουνελιού ( H + L) δευτερογενές αντίσωμα HRP (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ΗΠΑ) στο 1:20,000 για 1 ώρα σε RT.

Οι κηλίδες εμφανίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες αφαιρέθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RestoreTM Western Blot Stripping (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) για 15 λεπτά στους 37 ◦C, πλύθηκαν και μπλοκαρίστηκαν ξανά.

Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ◦C με πρωτογενές αντίσωμα μονοκλωνικής ακτίνης ποντικού (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) στο 1:1000, πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα m-IgGκBP-HRP CRP (Santa Biotechnology, Dallas, TX, USA) για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο, τα στυπώματα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Οι πυκνομετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με λογισμικό ImageJ και οι τιμές κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας -ακτίνη. Οι κανονικοποιημένες τιμές αντιπροσωπεύτηκαν με το GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

Οι στατιστικές αναλύσεις για τη σύγκριση των μολυσμένων ομάδων και των ομάδων ελέγχου πραγματοποιήθηκαν με Student's t-test και η ισότητα των διακυμάνσεων προσδιορίστηκε με Levene'stest χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, ΗΠΑ). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές στο * p<0.05.

4.7. Εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA και έκφραση γονιδίου

Το συνολικό RNA προβάτου εξήχθη από 90 mg δειγμάτων ιστού από τον μετωπιαίο φλοιό, τον θάλαμο, τον ιππόκαμπο και τον προμήκη μυελό. Οι εγκέφαλοι ποντικών διαιρέθηκαν στη μέση γραμμή και εξήχθη το συνολικό RNA από<90 mg obtained from the thalamic area. 

Οι ιστοί ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή TeSeEPrecess 48TM (Bio-Rad) με RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σε συνδυασμό με TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA) για την αφαίρεση πιθανής μόλυνσης από γονιδιωματικό DNA. Η συγκέντρωση RNA προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά με ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) και για κάθε δείγμα, αναλύθηκαν αναλογίες 260/280 και 260/230 για να επαληθευτεί η καθαρότητα του δείγματος.

Ένα μικρογραμμάριο συμπληρωματικού DNA (cDNA) συντέθηκε χρησιμοποιώντας qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα της θεραπείας με DNase αξιολογήθηκε σε δείγματα αρνητικά σε RT. Μετά την αντίστροφη μεταγραφή, η ίδια παρτίδα αραιωμένου cDNA υποβλήθηκε σε qPCR για ενίσχυση των TLR.

Δύο ευρέως χρησιμοποιούμενα γονίδια housekeeping (HK) επιλέχθηκαν για να ομαλοποιήσουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων: γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) και ακτίνη-βήτα (ACT) [91]. Η σταθερότητα αυτού του γονιδίου HK επαληθεύτηκε υπό τις πειραματικές μας συνθήκες. Η έκφραση αγγελιαφόρου RNA (mRNA) προσδιορίστηκε με qPCR για 1 έως 10 γονίδια TLR προβάτου, 1 έως 9 γονίδια TLR ποντικού και το γονίδιο MyD88 και για τα δύο είδη.

Δύο προφλεγμονώδεις (TNF- και IL-6) και δύο αντιφλεγμονώδεις (IL-10 και TGF-) κυτοκίνες μελετήθηκαν επίσης στον θάλαμο και τον ιππόκαμπο προβάτου. Οι αλληλουχίες εκκινητών και οι αποδόσεις είχαν προηγουμένως δημοσιευτεί ή είχαν σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας το εργαλείο Primer3Plus [92] (Πίνακας 2).

Επαληθεύσαμε την αποτελεσματικότητα κάθε γονιδίου που δημιουργεί μια τυπική καμπύλη ενισχύοντας σειριακές αραιώσεις 1:2 του cDNA ελέγχου και στη συνέχεια ελέγχοντας για γραμμικότητα μεταξύ της αρχικής συγκέντρωσης του προτύπου και των τιμών του ορίου κύκλου (Ct). Όλα τα γονίδια έδειξαν συντελεστή συσχέτισης μεταξύ 0.9 και 0.99, με τιμή κλίσης των τυπικών καμπυλών στο εύρος -3,2 έως -3,5 και απόδοση qPCR 90-110%.

Οι αντιδράσεις qPCR εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-καλά με καθολικές συνθήκες ενίσχυσης: ένα στάδιο αρχικής ενεργοποίησης και μετουσίωσης cDNA 10 λεπτών στους 95 ◦C, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 3 δευτερολέπτων στους 95 ◦ και 30 καθ. 60 ◦C.

Για να αναγνωρίσουμε την παρουσία μη ειδικών αμπλικονίων PCR ή υψηλών επιπέδων εκκινητών, πραγματοποιήσαμε ένα πρωτόκολλο καμπύλης διάστασης μετά από κάθε αντίδραση qPCR. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν σε συνολικό όγκο αντίδρασης 10 μL, που αποτελείται από 15 ng cDNA, 5 μL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) και την απαιτούμενη ποσότητα εμπρός και αντίστροφης αστάρια (Πίνακας 2).

Νερό χωρίς νουκλεάση προστέθηκε σε τελικό όγκο 10 μL. Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύτηκαν ως αναδίπλωση και οι διαφορές γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με το μέσο επίπεδο της ομάδας ελέγχου κλιμακώθηκαν στο 1.

4.8. Ανάλυση Δεδομένων και Στατιστική

Όλα τα ποσοτικά δεδομένα που συλλέχθηκαν δοκιμάστηκαν για κανονικότητα με το Shapiro-Wilk Wtest. Οι ιστολογικές και ανοσοϊστοχημικές διαφορές μεταξύ της μολυσμένης ομάδας και της ομάδας ελέγχου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Student's t-test ή Mann-Whitney U test ανάλογα με την παραμετρική ή μη παραμετρική κατανομή δεδομένων.

Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των τεσσάρων διαφορετικών περιοχών του εγκεφάλου σε πρόβατα μολυσμένα με τρομώδη νόσο προσδιορίστηκαν με χρήση ανάλυσης διακύμανσης ενός τρόπου (ANOVA) που ακολουθείται από μια δοκιμασία Bonferroni post hoc ή τη δοκιμή Kruskal–Wallis, ανάλογα με την παραμετρική ή μη παραμετρική κατανομή δεδομένων. Διεξήχθησαν στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων qPCR από τις μέσες τιμές ΔCt για κάθε γονίδιο.

Για τη στατιστική σύγκριση των μολυσμένων ομάδων και των ομάδων ελέγχου, διεξήχθη τεστ t Student ή Mann-Whitney U, ανάλογα με την κανονική κατανομή κάθε γονιδίου και οι ισότιμες διακυμάνσεις προσδιορίστηκαν με τη δοκιμή Levene. Οι διαφορές στην έκφραση θεωρήθηκαν σημαντικές στο p < 0.05.

Οι παρακάτω συμβολισμοί χρησιμοποιήθηκαν για να υποδηλώσουν τιμές p στα σχήματα: * p < 0.05; ** p Μικρότερο ή ίσο με 0.01; # p < 0.1. Για τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε λογισμικό SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA). Τα γραφήματα δημιουργήθηκαν με το GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, USA) και τα δεδομένα που φαίνονται στα σχήματα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (μέσος όρος ± SEM).

5. Συμπεράσματα

Από ό,τι γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που περιγράφει τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων TLR σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου φυσικών προβάτων μολυσμένων από τρομώδη νόσο και υπερμεγέθους ποντικών tg338 πειραματικά μολυσμένων με τρομώδη νόσο.

Η μελέτη μας δείχνει ξεκάθαρα ότι οι TLRs, και ιδιαίτερα οι TLR4 στα πρόβατα και οι TLR1 και TLR2 σε ποντίκια, εμπλέκονται στην παθογένεση της τρομώδους νόσου. Επιπλέον, σε αντίθεση με όλες τις άλλες περιοχές που μελετήθηκαν, το διακριτικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του TLR, μαζί με τη μοναδική μικρογλοιακή μορφολογία και η ήπια νευροπαθολογία που παρατηρήθηκε στον ιππόκαμπο, υποδηλώνει μια ειδική ανοσολογική απόκριση για την περιοχή του εγκεφάλου σε λοίμωξη από φυσική τρομώδη νόσο.

Ωστόσο, θα χρειαστούν περαιτέρω μελέτες για τον χαρακτηρισμό της έκφρασης του TLR στη μικρογλοία, την αστρογλοία και τους νευρώνες στη μόλυνση από τρομώδη νόσο για να κατανοηθεί η ακριβής συμβολή κάθε τύπου κυττάρου στη νευροφλεγμονή. Επιπλέον, δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί εάν η ενεργοποίηση του TLR είναι μια άμεση απόκριση στην τοξικότητα των πριόν ή εμφανίζεται δευτεροπαθώς σε άλλους φλεγμονώδεις μηχανισμούς.

Τα TLR αποτελούν έναν πολλά υποσχόμενο στόχο για τις θεραπευτικές προσεγγίσεις για τις ασθένειες του τοπριονίου και επομένως θα χρειαστεί καλύτερη κατανόηση των νευροφλεγμονωδών αποκρίσεων που ρυθμίζονται από το TLR για να διασφαλιστεί η περαιτέρω πρόοδος σε αυτόν τον τομέα.

Συμπληρωματικά Υλικά: Τα παρακάτω είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο στη διεύθυνσηhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Συνεισφορές συγγραφέα: Εννοιολόγηση, έρευνα και επιμέλεια δεδομένων, MCG και LMC. προετοιμασία γραφής-πρωτότυπου σχεδίου, MG-M., MCG και LMC. πειραματική μεθοδολογία, MG-M., συγγραφή-κριτική και επιμέλεια, MG-M., MCG, LMC και AO. in vivo μεθοδολογία, MB; χρηματοδοτική απόκτηση, RB και JJB. molecular methodology, BS-P.; εποπτεία, MCG και JJB Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση: Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Κυβέρνηση της Αραγονίας) μέσω του έργου "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Δήλωση θεσμικού συμβουλίου αναθεώρησης: Όλες οι διαδικασίες που αφορούν ζώα συμμορφώνονται με τις οδηγίες που περιλαμβάνονται στον Ισπανικό Νόμο για την Προστασία των Ζώων RD53/2013 και στην Οδηγία 2010/63 της Ευρωπαϊκής Ένωσης για την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς σκοπούς. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραμάτων σε Ζώα του Πανεπιστημίου της Σαραγόσα (Αριθμός Άδειας: PI38/159 Οκτωβρίου 2015 και PI19/14 11 Απρίλιος 2014).

Δήλωση συγκατάθεσης μετά από ενημέρωση: Δεν ισχύει.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων: Τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτήν τη μελέτη είναι διαθέσιμα στο κείμενο του άρθρου, τα σχήματα και το συμπληρωματικό υλικό.

Ευχαριστίες: Ευχαριστούμε τον Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) και τον VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) για την ευγενική προσφορά των ποντικών tg338 που χρησιμοποιήθηκαν για αυτά τα πειράματα.

Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων. Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης. στη συλλογή, αναλύσεις ή ερμηνεία δεδομένων· στη συγγραφή του χειρογράφου ή στην απόφαση δημοσίευσης των αποτελεσμάτων. Οι εικόνες και οι εικόνες σε αυτό το χειρόγραφο είναι πρωτότυπα δεδομένα.

Αναφορές

1. Andreoletti, Ο.; Berthon, Ρ.; Marc, D.; Sarradin, Ρ.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Πρώιμη συσσώρευση PrP(Sc) σε λεμφοειδείς και νευρικούς ιστούς που σχετίζονται με το έντερο ευπαθών προβάτων από ένα κοπάδι Romanov με φυσική τρομώδη νόσο. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, ασθένειες SB Prion και κρίση ΣΕΒ. Science 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, Μ.; Bruce, Μ.; Diringer, Η.; Kretzschmar, ΗΑ; Beekes, M. Η πρώιμη εξάπλωση της τρομώδους νόσου από τη γαστρεντερική οδό στο κεντρικό νευρικό σύστημα περιλαμβάνει αυτόνομες ίνες των σπλαχνικών και πνευμονογαστρικών νεύρων.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions και το θανατηφόρο ταξίδι τους στον εγκέφαλο. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, Α.; Wemheuer, WE; Brenig, Β.; Bratberg, Β.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc διασποράς μοτίβων στον εγκέφαλο προβάτων που συνδέονται με διαφορετικούς τύπους πριόν. Κτηνίατρος. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Αποδεικτικά στοιχεία για μια πρώιμη φλεγμονώδη απόκριση στο κεντρικό νευρικό σύστημα ποντικών με scrapie. Neuroscience 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, Η.; Sharps, Β.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, Α.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; et al. Η νευροπαθολογία του πριόν ακολουθεί τη συσσώρευση εναλλακτικών ισομορφών πρωτεΐνης πριόν μετά την κορύφωση του μολυσματικού τίτλου. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, Κ.; McColl, BW; Cancellotti, Ε.; Freeman, TC; Manson, JC Καθορισμός της μικρογλοίας που ανταποκρίνεται στη χρονική πορεία του χρόνιου νευροεκφυλισμού. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, Α.; Zhu, C. Microglia σε ασθένειες πριόν. J. Clin. Ερευνήστε. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, Ε.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. The Role of Microglia in Prion Diseases: A Paradigm of Functional Diversity.Front. Γηράσκοντα Νευροσκί. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, Ρ.; Gordon, S. Ετερογένεια στην κατανομή και τη μορφολογία της μικρογλοίας στον φυσιολογικό εγκέφαλο ενηλίκου ποντικού. Neuroscience 1990, 39, 151-170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res. Αναθ. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com