Η ανατομή των αποκρίσεων αντισωμάτων εμβολιασμένων ατόμων Gam-COVID-Vac υποδηλώνει συμμετοχή επιτόπων εκτός RBD στην εξουδετέρωση SARS-CoV-2

Αφηρημένη: Εκατομμύρια άνθρωποι έχουν εμβολιαστεί με το Gam-COVID-Vac, αλλά οι λεπτές ειδικότητες των επαγόμενων αντισωμάτων δεν έχουν μελετηθεί πλήρως. Ελήφθη πλάσμα από 12 άτομα που είχαν αναρρώσει από 12 πρωτογενείς και 10 ασθενείς με νόσο του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) πριν και μετά από δύο ανοσοποιήσεις με Gam-COVID-Vac. Η αντιδραστικότητα αντισωμάτων στα δείγματα πλάσματος (n=44) ​​μελετήθηκε σε ένα πάνελ μικροσυστοιχιών ανασυνδυασμένων αναδιπλωμένων και ξεδιπλωμένων πρωτεϊνών του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) και 46 πεπτιδίων που καλύπτουν την ακίδα πρωτεΐνης (S) και με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) υποκατηγορίας ανοσοσφαιρίνης G (IgG). Η ικανότητα των επαγόμενων από το Gam-COVID-Vac αντισωμάτων να αναστέλλουν τη σύνδεση της περιοχής δέσμευσης υποδοχέα (RBD) με το ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης υποδοχέα 2 (ACE2) διερευνήθηκε σε μια δοκιμασία μοριακής αλληλεπίδρασης (MIA). Η ικανότητα εξουδετέρωσης του ιού των αντισωμάτων μελετήθηκε με το τεστ εξουδετέρωσης ιού ψευδοτύπου (pVNT) για το Wuhan-Hu-1 και το Omicron. Βρήκαμε ότι ο εμβολιασμός Gam-COVID-Vac προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις του IgG1 αλλά όχι άλλων υποκατηγοριών IgG έναντι διπλωμένου S, υπομονάδας πρωτεΐνης ακίδας 1 (S1), υπομονάδας πρωτεΐνης ακίδας 2 (S2) και RBD με συγκρίσιμο τρόπο σε πρωτογενή και ανάρρωση μαθήματα. Η εξουδετέρωση του ιού συσχετίστηκε σε μεγάλο βαθμό με τα επαγόμενα από τον εμβολιασμό αντισώματα ειδικά για το διπλωμένο RBD και ένα νέο πεπτίδιο (δηλ. το πεπτίδιο 12). Το πεπτίδιο 12 εντοπίστηκε κοντά στο RBD στο Ν-τερματικό τμήμα του S1 και μπορεί ενδεχομένως να εμπλέκεται στη μετάβαση της διαμόρφωσης πριν από τη σύντηξη της πρωτεΐνης ακίδας. Συνοπτικά, ο εμβολιασμός Gam-COVID-Vac προκάλεσε S-ειδικά αντισώματα IgG1 σε αφελή και ανάρρωση άτομα με συγκρίσιμο τρόπο. Εκτός από τα ειδικά αντισώματα για το RBD, τα αντισώματα που επάγονται κατά ενός πεπτιδίου κοντά στο Ν-άκρο του RBD συνδέθηκαν επίσης με εξουδετέρωση ιού.

Λέξεις-κλειδιά: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; επίτοπος; αντίσωμα; εξουδετέρωση ιών; δοκιμασία μοριακής αλληλεπίδρασης; Ομικρο

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-αύξηση της ανοσίας

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Εισαγωγή

Μετά τα πρώτα κρούσματα μόλυνσης με το Σοβαρό Οξύ Αναπνευστικό Σύνδρομο Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) στα τέλη του 2019 στη Γουχάν της Κίνας, η νέα νόσος του κοροναϊού (COVID-19) εξαπλώθηκε γρήγορα σε τον κόσμο και εξελίχθηκε σε παγκόσμια πανδημία [1–4]. Η ταχεία ανάπτυξη των εμβολίων για τον COVID-19 και η εισαγωγή παγκόσμιων προγραμμάτων εμβολιασμού μαζί με την εμφάνιση λιγότερο παθογόνων παραλλαγών SARS-CoV-2 θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες για τη μείωση των θανάτων που σχετίζονται με τον COVID και τη σοβαρότητα της πανδημίας [1,5]. Τα πρώτα εμβόλια που έγιναν διαθέσιμα ήταν γενετικά εμβόλια που βασίζονταν στη μεταφορά του γονιδίου που κωδικοποιεί την επιφανειακή πρωτεΐνη SARS-CoV-2 με τη μεσολάβηση αδενοϊού [6–8]. Η πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S αποτελείται από την υπομονάδα S1 που περιέχει την περιοχή δέσμευσης υποδοχέα (RBD) που συνδέεται με τον υποδοχέα ACE2 στα ανθρώπινα κύτταρα και την υπομονάδα S2 που διασφαλίζει την προσκόλληση του ιού στη μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή με πρωτεολυτική διάσπαση του πεπτίδιο σύντηξης (FP) κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από τον ιό [9]. Το γονίδιο S που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά γονιδίων σε ορισμένα εμβόλια που βασίζονται σε αδενοϊό (π.χ., το Vaccine Janssen για τον COVID{{25}) μπορεί να τροποποιηθεί για να σταθεροποιήσει την πρωτεΐνη και να επηρεάσει τη διάσπασή της, αλλά αυτό δεν ισχύει για τα άλλα [10]. Τα ανθρώπινα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από αδενοϊούς που περιέχουν το γονίδιο που κωδικοποιεί S παράγουν ποικίλη ποσότητα του αντιγόνου S που απελευθερώνεται και παρουσιάζεται από το κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC) κατηγορίας ΙΙ στα Τ κύτταρα, με αποτέλεσμα τη βοήθεια των CD4+ Τ κυττάρων για την παραγωγή S-ειδικών αντισωμάτων. Η πρωτεΐνη S που εκφράζεται από διαμολυσμένα κύτταρα παρουσιάζεται επίσης από MHC κατηγορίας Ι στην επιφάνεια του μολυσμένου κυττάρου και ενεργοποιεί την ενεργοποίηση των S-ειδικών κυτταροτοξικών CD{31}} Τ κυττάρων, τα οποία μπορούν να αναγνωρίσουν κύτταρα που παράγουν αντιγόνο S και να τα καταστρέψουν. Η αρχή του εμβολιασμού, δηλαδή η εισαγωγή γενετικής πληροφορίας που κωδικοποιεί S στα κύτταρα ξενιστές και η επακόλουθη παραγωγή του αντιγόνου S από τα μολυσμένα κύτταρα, είναι παρόμοια με τα εμβόλια αγγελιαφόρου ριβονουκλεϊκού οξέος (mRNA), αν και η τεχνολογία της μεταφοράς γονιδίου διαφέρει από τον αδενοϊό -βασισμένα εμβόλια. Έτσι, τα «γενετικά εμβόλια» μιμούνται σε κάποιο βαθμό μια φυσική λοίμωξη από SARS-CoV-2. Η αναγνώριση των επιτόπων που αναγνωρίζονται από αντισώματα από εμβολιασμένα άτομα που εμπλέκονται στην εξουδετέρωση του ιού είναι ζωτικής σημασίας όχι μόνο για την κατανόηση του μηχανισμού δράσης των υπαρχόντων εμβολίων αλλά και για την ανάπτυξη εξειδικευμένου ενεργού εμβολιασμού και στρατηγικών παθητικής ανοσοποίησης κατά του COVID-19 [11 ,12]. Τα περισσότερα από τα τρέχοντα εμβόλια επικεντρώνονται στη λήψη μιας ειδικής απόκρισης αντισώματος S με ιδιαίτερη προσοχή στην ειδική για την RBD απόκριση αντισωμάτων, επειδή έχει φανεί ότι τα ειδικά αντισώματα για RBD συσχετίζονται με υψηλή εξουδετερωτική δραστηριότητα έναντι του SARS-CoV-2 [ 13–15]. Ωστόσο, ο αριθμός των μεταλλάξεων που αποκτήθηκαν από κάθε νέα παραλλαγή ανησυχίας (VOC), υποδηλώνει τη σημασία της αναγνώρισης επιτόπων που διατηρούνται μεταξύ των VOC που στοχεύουν εξουδετερωτικά αντισώματα που βρίσκονται όχι μόνο στο RBD αλλά και εκτός του RBD [16]. Στην πραγματικότητα, υπάρχουν μελέτες που υποδεικνύουν την παρουσία εξουδετερωτικών επιτόπων εκτός RBD, οι οποίοι αναγνωρίζονται από τα αντισώματα μετά την ανοσοποίηση [17-20]. Το 2020 το εμβόλιο που βασίζεται σε φορέα Gam-COVID-Vac, που ονομάζεται επίσης Sputnik-V, έγινε διαθέσιμο για χρήση στην κλινική πράξη και επί του παρόντος έχει εγκριθεί για χρήση σε περισσότερες από 70 χώρες (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (πρόσβαση στις 17 Ιανουαρίου 2023)). Σύμφωνα με την πηγή Our World In Data (OWID), 79 εκατομμύρια άνθρωποι στη Ρωσία έλαβαν τουλάχιστον ένα εμβόλιο με το εμβόλιο και 72 εκατομμύρια είναι πλήρως εμβολιασμένοι (https://ourworldindata.org/ covid-vaccinations?country= RUS (πρόσβαση στις 22 Μαρτίου 2022)). Το Gam-COVID-Vac αποτελείται από δύο τύπους εμβολίων, τα οποία βασίζονται σε δύο διαφορετικούς φορείς ανθρώπινου αδενοϊού (hAd26 και hAd5) που φέρουν την εγγενή μορφή της πρωτεΐνης S του στελέχους Wuhan-Hu{-1 SARS-CoV{{{ 73}}. Το Sputnik-V περιλαμβάνει δύο ενέσεις, μια με hAd26 και μια δεύτερη με hAd5 και φως Sputnik, με μόνο hAd26. Οι δύο διαφορετικοί φορείς αδενοϊού χρησιμοποιούνται για την πρώτη και τη δεύτερη ανοσοποίηση για να μειωθεί η πιθανότητα τα εμβολιασμένα άτομα να παράγουν ανοσία στην ανοσία της πρωτεΐνης S έναντι του αδενοϊού. Στην πραγματικότητα, τα ειδικά για τον αδενοϊό αντισώματα θα περιόριζαν την αποτελεσματικότητα των αναμνηστικών εμβολιασμών εξουδετερώνοντας το όχημα φορέα αδενοϊού. Επομένως, την 21η ημέρα μετά τη χορήγηση της πρώτης δόσης ενός εμβολίου με rAd26, πραγματοποιείται επαναλαμβανόμενη χορήγηση αντιγόνου με τον φορέα rAd5 [8,21]. Λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει σε σημαντικό βαθμό τις αποκρίσεις αντισωμάτων ειδικών για S και RBD και τη δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού σε ορούς από εμβόλια Gam-COVID-Vac [10,22,23]. Έχουν αναφερθεί αυξήσεις των ειδικών για το RBD αντισωμάτων IgG τρεις μήνες μετά τη χορήγηση του Gam-COVID-Vac και έχει αποδειχθεί ότι τα αντισώματα διασταυρώνονται με τις ανησυχητικές παραλλαγές Alpha, Beta, Delta και Omicron [24-26]. Το Gam-COVID-Vac έχει επίσης συγκριθεί με πολλά άλλα αδειοδοτημένα εμβόλια κατά του SARS-CoV-2, τα οποία έδειξαν υψηλή εξουδετέρωση από ιούς και υψηλή αποτελεσματικότητα έναντι της θνησιμότητας που σχετίζεται με τον COVID{102}}για το Sputnik-V, αν και ελαφρά κατωτερότητα βρέθηκε σε ορισμένα εμβόλια mRNA σχετικά με την εξουδετέρωση του ιού [24]. Τέλος, έχει αποδειχθεί ότι η ανοσοποίηση θετικών για τον ιό ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV+) με αντιρετροϊκή θεραπεία (που έλαβαν θεραπεία με ART) με Gam-COVID-Vac δείχνει επιδημιολογική αποτελεσματικότητα έναντι του αρχικού άγριου τύπου και της παραλλαγής Delta του SARS-CoV{{ 113}} [27]. Ωστόσο, μέχρι στιγμής δεν έχει πραγματοποιηθεί λεπτομερής ανάλυση της αναγνώρισης επιτόπου από αντισώματα σε εμβολιασμένα με Gam-COVID-Vac άτομα και απαιτούνται δεδομένα για την κατανόηση του ισοτύπου ανοσοσφαιρίνης και των αποκρίσεων της υποκατηγορίας IgG σε άτομα εμβολιασμένα με Gam-COVID-Vac. Εδώ διερευνήσαμε δύο ομάδες ατόμων που είχαν εμβολιαστεί με Gam-COVID-Vac, μία που είχε προηγούμενη λοίμωξη από SARS-CoV-2 και μια άλλη ομάδα ατόμων που δεν είχαν προηγηθεί SARS-CoV-2. Πραγματοποιήσαμε μια σχολαστική ανάλυση της εξειδίκευσης του επιτόπου των επαγόμενων αντισωμάτων χρησιμοποιώντας διπλωμένες και ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες και πεπτίδια προερχόμενα από μικροσυστοιχίες SARS-CoV{127} και πεπτίδια που καλύπτουν την πλήρη πρωτεΐνη S, συμπεριλαμβανομένου του RBD. Επιπλέον, αναλύθηκαν οι αποκρίσεις υποκατηγορίας IgG. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ότι τα άτομα που έχουν εμβολιαστεί με Gam-COVID-Vac τοποθετούν ειδικά αντισώματα RBD ικανά να μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση RBD-ACE2. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι η εξουδετέρωση του ιού συσχετίστηκε επίσης με αντισώματα που στρέφονται εναντίον ενός πεπτιδίου εκτός RBD, το οποίο μπορεί να εμπλέκεται στη μετάβαση της διαμόρφωσης πριν από τη σύντηξη της πρωτεΐνης ακίδας.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

2. Αποτελέσματα

2.1. Τα άτομα που έχουν εμβολιαστεί με Gam-COVID-Συμπεριλαμβάνονται άτομα που δεν έχουν υποστεί COVID-19 και έχουν αναρρώσει

Τα άτομα που αναρρώνουν μολύνθηκαν από το στέλεχος Wuhan-Hu-1 σύμφωνα με τον επιπολασμό του και τα δεδομένα αλληλουχίας που ελήφθησαν τη στιγμή της μόλυνσης στην περιοχή της Μόσχας. Τα αφελή άτομα δεν είχαν συμπτώματα COVID-19 και δεν είχαν ειδικά αντισώματα SARS-CoV-2- τη στιγμή της στρατολόγησης. Τα υποκείμενα της μελέτης περιελάμβαναν 15 γυναίκες και 7 άνδρες με διάμεση ηλικία τα 60 (δηλ. 25–70 έτη) (Πίνακας 1).

Πίνακας 1. Δημογραφικά, κλινικά και ορολογικά χαρακτηριστικά των ατόμων.

Ελήφθη ένα δείγμα πλάσματος από καθένα από τα άτομα στο χρονικό σημείο 0 (δηλαδή, γραμμή βάσης) (Εικόνα 1Α), και στη συνέχεια κάθε άτομο εμβολιάστηκε με Sputnik-V με ένα διάστημα περίπου 21 ημερών μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου ένεση (χρονικά σημεία 1 και 2). Στο χρονικό σημείο 3 ένα δεύτερο δείγμα πλάσματος συλλέχθηκε για να προσδιοριστούν οι επαγόμενες από το εμβόλιο αποκρίσεις αντισωμάτων (Εικόνα 1Α). Τα άτομα παρακολουθήθηκαν για επιπλέον 120 ημέρες. Την ημέρα 110 μετά τον τελικό εμβολιασμό ένα άτομο (δηλαδή, το υποκείμενο 22) είχε COVID-19 ενώ τα άλλα δεν είχαν αναπτύξει συμπτώματα COVID-19 (Πίνακας 1).

Εικόνα 1. Σχεδιασμός μελέτης και ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων SARS-CoV-2- πριν και μετά τον εμβολιασμό με το Sputnik-V. (Α) Σχεδιασμός μελέτης. Ελήφθησαν δείγματα πλάσματος από άτομα που δεν είχαν προηγηθεί COVID-19- και ανάρρωση (n=10) στο χρονικό σημείο 0 (βασική γραμμή), και στη συνέχεια τα άτομα έλαβαν δύο Sputnik-V εμβολιασμοί στα χρονικά σημεία 1 και 2, αντίστοιχα και λήφθηκε δείγμα πλάσματος στο χρονικό σημείο 3 (δηλαδή, ημέρα 80–85 μετά τον πρώτο εμβολιασμό). (Β) Επίπεδα αντισωμάτων IgG ειδικά για νουκλεοκαψίδια (άξονας y: ISU) σε άτομα που δεν έχουν υποβληθεί σε θεραπεία και σε ανάρρωση (άξονας x) κατά την έναρξη. Η οριζόντια γραμμή υποδεικνύει το όριο για τη θετικότητα. (Γ) Επίπεδα αντισωμάτων IgG (άξονες y: ISU) ειδικά για RBD, S, S1 και S2 σε άτομα στο χρονικό σημείο 0 και 3 (χ-άξονες). (D) Από αριστερά προς τα δεξιά επίπεδα αντισωμάτων IgG1 , IgG2 , IgG3 και IgG4 (άξονες y: τιμές OD οπτικής πυκνότητας) έως S (πάνω μέρος) και RBD (κάτω μέρος) στα χρονικά σημεία 0 και 3 ( x-άξονες). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων όπως προσδιορίζονται με τη δοκιμή Wilcoxon υποδεικνύονται: ** p < 0.01, *** p <0,001, **** p < 0,0001, ns—μη σημαντική.

2.2. Ο εμβολιασμός Gam-COVID-Vac προκαλεί ευρείες αποκρίσεις IgG στο S Συμπεριλαμβανομένων των S1, RBD και S2

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-αύξηση της ανοσίας

Πραγματοποιήσαμε μια λεπτομερή ανάλυση των αποκρίσεων αντισωμάτων προς ένα μεγάλο πάνελ μικρο-συστοιχίας διπλωμένων και ξεδιπλωμένων πρωτεϊνών SARS-CoV-2 και πεπτιδίων που καλύπτουν την πρωτεΐνη S σε δείγματα πλάσματος από SARS-CoV-2-αποφάσια και ανάρρωση μετά από μια πλήρη πορεία ανοσοποιήσεων με Gam-COVID-Vac (Εικόνα 1Α,Β, Πίνακας 1). Κατά τη σύγκριση δειγμάτων πλάσματος από το χρονικό σημείο 0 και το χρονικό σημείο 3 μετά τον εμβολιασμό, βρέθηκε σημαντική επαγωγή αποκρίσεων IgG έναντι διπλωμένου αλλά όχι ξεδιπλωμένου RBD, S, S1 και S2 (Εικόνα 1C). Τρεις μήνες μετά τον εμβολιασμό, τα άτομα παρουσίασαν 21-πλάσια αύξηση των ειδικών για το RBD αντισωμάτων IgG (p < 0.{{20}}001) και {{ 18}}πλάσια αύξηση των S-ειδικών αντισωμάτων IgG (δηλαδή, χρονικό σημείο 0: διάμεσος 0,291, χρονικό σημείο 3: διάμεσος 5,778) (p < 0,0001), αντίστοιχα. Τα αντισώματα IgG στο S1 αυξήθηκαν 3.7- φορές (p=0.0023) και τα αντισώματα IgG στο S2 αυξήθηκαν 2.8- φορές (p=0.0094) (Εικόνα 1C ). Ο εμβολιασμός με Gam-COVID-Vac προκάλεσε κυρίως αποκρίσεις IgG σε αναδιπλωμένα S, S1 και RBD συγκρίσιμα σε άτομα που δεν έχουν υποστεί αναρρώσει (Εικόνες 1C, S2 και S3), υποδεικνύοντας ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση του SARS-CoV-2- ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων επίσης σε ανάρρωση άτομα. Σημαντικές αυξήσεις των αντισωμάτων IgG έναντι των RBD, S και S1 παρατηρήθηκαν σε άτομα που δεν είχαν υποβληθεί σε ανάρρωση (Εικόνα S2) και δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές σχετικά με τα επίπεδα IgG σε RBD, S, S1 και S2 σε άτομα που δεν είχαν αναρρώσει και στο χρονικό σημείο 3. (Εικόνα S3).

2.3. Ο εμβολιασμός Gam-COVID-Vac προκαλεί κυρίως μια απόκριση υποκατηγορίας IgG1 στο S και το RBD

Έχει αναφερθεί ότι η ειδική για το αλλεργιογόνο ανοσοθεραπεία (AIT) προκαλεί κυρίως αλλεργιογόνα-ειδικές αποκρίσεις IgG1 και IgG4 που διαφέρουν όχι μόνο ως προς τις δραστικές λειτουργίες τους (το IgG1 μπορεί να μεσολαβήσει στην εξαρτώμενη από το αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC) και στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος, ενώ το IgG4 δεν έχει αυτές τις τελεστικές λειτουργίες) αλλά και όσον αφορά την κινητική τους (IgG1: ταχεία έναρξη και πρώιμη πτώση: IgG4: αργή έναρξη αλλά παρατεταμένα επίπεδα) [28-30]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε τις αποκρίσεις της υποκατηγορίας IgG (δηλαδή, IgG1–IgG4) στο S και το RBD σε άτομα που είχαν εμβολιαστεί με Sputnik-V. Το Σχήμα 1Δ δείχνει ότι ο εμβολιασμός προκάλεσε σχεδόν αποκλειστικά μια απόκριση υποκατηγορίας IgG1 σε S και RBD. Σημαντικές αυξήσεις των επιπέδων IgG1 ειδικά για S και RBD (p=0.0002 και p=0.0071, αντίστοιχα) βρέθηκαν μετά τον εμβολιασμό. Ωστόσο, δεν μπόρεσαν να ανιχνευθούν σχετικές αποκρίσεις υποκατηγορίας IgG2, IgG3 ή IgG4 ειδικές για S και RBD (Εικόνα 1D).

2.4. Επαγωγή αντισωμάτων εξουδετέρωσης ιών και αντισωμάτων που αναστέλλουν την αλληλεπίδραση RBD-ACE2 με εμβολιασμό Gam-COVID-Vac

Για την ανίχνευση αντισωμάτων εξουδετέρωσης του ιού, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμή pVNT, όπου σωματίδια παρόμοια με τον ιό ψευδοτυποποιήθηκαν με πρωτεΐνη S από το αρχικό στέλεχος Wuhan-Hu-1 και το πρόσφατα περιγραφόμενο VOC Omicron. Αντισώματα με εξουδετερωτική δραστηριότητα για το στέλεχος Wuhan Hu-1 βρέθηκαν σε όλα εκτός από ένα (δηλ. το θέμα 22) από τα 22 άτομα (Εικόνα 2Α, Πίνακας 2) ενώ οι τίτλοι εξουδετερωτικών αντισωμάτων για το Omicron ήταν σημαντικά χαμηλότεροι (Εικόνα 2Β) και βρέθηκε μόνο σε 17 από τα 20 άτομα (Εικόνα 2Α, Πίνακας 2). Δεν βρέθηκε σχετική εξουδετέρωση για τα άτομα 6, 7, 10, 11, 15 (Εικόνα 2Α, Πίνακας 2). Οι τίτλοι εξουδετέρωσης ιού για το Omicron ήταν 25 φορές χαμηλότεροι από ό,τι για το WT (διάμεσος 141,9 και 5,7 για το Wuhan-Hu-1 και το Omicron, αντίστοιχα) (Εικόνα 2Β).

Εικόνα 2. Δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού στο πλάσμα 3 μήνες μετά τον εμβολιασμό Sputnik-V και συσχέτιση με αποκρίσεις αντισωμάτων IgG σε πεπτίδια που προέρχονται από RBD και S. (Α) Η εξουδετέρωση του ιού (ID50) (άξονας y) έναντι του στελέχους Wuhan-hu{-1 (πράσινο) και του Omicron (πορτοκαλί) λήφθηκε με πλάσμα από παρθένο (μπλε) και ανάρρωση (κόκκινο) θέματα (χ-άξονες). (Β) Σύγκριση εξουδετέρωσης ιού (άξονας y: ID50 που λήφθηκε για το πλάσμα από τα άτομα που δοκιμάστηκαν, οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν διάμεσους με διατεταρτημόριο εύρος (IQR) Wuhan Hu-1 (πράσινο) και Omicron (πορτοκαλί) Η οριζόντια γραμμή αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με πλάσμα από ένα υγιές, μη μολυσμένο άτομο ελέγχου (υγιής μάρτυρας, HC). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών προσδιορίστηκαν με τη δοκιμή Mann-Whitney: **** p < 0. {{30}}001. (Γ) Εντοπισμός RBD και πεπτιδίων που συσχετίζονται με εξουδετέρωση ιού σε ένα σχήμα S (S1, S2). (Δ) Συσχετίσεις μεταξύ των τίτλων εξουδετέρωσης ιών για το Wuhan-Hu{{19 }} (WT) ή Omicron (άξονες y) και επίπεδα IgG ειδικά για RBD και πεπτίδια που προέρχονται από ακίδα 12, 32 και 46A (άξονες x: ISU). Τα μπλε και τα κόκκινα σύμβολα υποδεικνύουν αφελή και αναρρώμενα άτομα, αντίστοιχα. Αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές συσχετίσεις σύμφωνα με τη μη παραμετρική δοκιμή Spearman, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=μη σημαντική.

Πίνακας 2. Σύγκριση των επιπέδων IgG ειδικών για S, S1, S2 και RBD που μετρήθηκαν με μικροσυστοιχία με αναστολές της δέσμευσης RBD στο ACE2 και τίτλους εξουδετέρωσης ιού (Wuhan-Hu-1, Omicron) που προσδιορίστηκαν για το πλάσμα από το διερευνημένα θέματα. Η αντιστοίχιση θερμότητας πραγματοποιήθηκε για κάθε παράμετρο ξεχωριστά χρησιμοποιώντας το Excel. Το υψηλότερο επίπεδο θεωρήθηκε σκούρο κόκκινο και το χαμηλότερο ήταν το λευκό.

Το γεγονός, ότι σε όλα εκτός από ένα υποκείμενο (δηλ., στο υποκείμενο 22) τα αντισώματα εξουδετέρωσης του ιού αυξήθηκαν μετά τον εμβολιασμό υποδηλώνει ότι προκλήθηκαν από τον εμβολιασμό (Πίνακας 2). Το θέμα 21 έδειξε ήδη υψηλό αποκλεισμό της αλληλεπίδρασης RBD-ACE2 στη ΜΙΑ και υψηλή εξουδετέρωση του ιού κατά την έναρξη (Πίνακας 2). Σημειωτέον, δείγματα πλάσματος από εμβολιασμένα με Gam-COVID-Vac ανάρρωση άτομα που είχαν μέτρια νόσο (#1, 2, 17, 18, 21) είχαν υψηλότερους τίτλους εξουδετέρωσης του ιού από εκείνα από άτομα που είχαν αναρρώσει που είχαν ήπια νόσο (#22) ή καθόλου συμπτώματα (#4, 5, 7, 9) (Πίνακες 1 και 2). Ωστόσο, ένα βασικό εύρημα ήταν ότι η αναστολή της δέσμευσης RBD στο ACE2 και η εξουδετέρωση του ιού δεν συσχετίστηκαν πάντα. Περισσότερο από 25% αναστολή της δέσμευσης του RBD Wuhan Hu-1 στο ACE2 σημειώθηκε μόνο για 6 άτομα που είχαν δείξει επίσης αναστολή στη δοκιμή εξουδετέρωσης του ιού λόγω εμβολιασμού (δηλ. άτομα 1, 2, 3, 17, 18 και 19) (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι η δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού (50% μολυσματική δόση (ID50) > 100) παρατηρήθηκε για 6 άτομα αν και δεν έδειξαν καθόλου ή ανεπαρκή αναστολή της δέσμευσης RBD στο ACE2 (Πίνακας 2: Υποκείμενα 6, 10, 12, 13, 16, 20) .

2.5. Η εξουδετέρωση του ιού σε άτομα που έχουν εμβολιαστεί με Gam-COVID συσχετίζεται ισχυρά με τις αποκρίσεις IgG στο RBD και στο πεπτίδιο 12 που προέρχεται από S

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το πλάσμα από πολλά εμβολιασμένα με Gam-COVID-Vac υποκείμενα (π.χ., στα άτομα 6, 10, 12, 13, 16, 20· Πίνακας 2) έδειξε δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού αλλά δεν ανέστειλε την αλληλεπίδραση RBD-ACE2. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την αντιδραστικότητα αντισώματος IgG στα πεπτίδια που καλύπτουν την πρωτεΐνη S με ανάλυση τσιπ που βασίζεται σε μικροσυστοιχίες [13] (Εικόνα S4 και Εικόνα 2C) και συσχετίσαμε τις ειδικές για το πεπτίδιο αποκρίσεις IgG με την εξουδετέρωση του ιού του Wuhan-Hu{{19} } στέλεχος και Omicron (Εικόνα 2D). Οι αποκρίσεις IgG σε τρία πεπτίδια (δηλ. πεπτίδια 12, 32, 46Α) όπως οι αποκρίσεις IgG σε διπλωμένο RBD συσχετίστηκαν σημαντικά με την εξουδετέρωση του στελέχους Wuhan-Hu-1 (Εικόνα 2C, D). Το πεπτίδιο 12 ξεχώρισε επειδή οι αποκρίσεις αντισωμάτων στο ξεδιπλωμένο πεπτίδιο 12 (Εικόνα S1), αλλά όχι στα ξεδιπλωμένα πεπτίδια 32 και 46Α ενισχύθηκαν σημαντικά από το Gam-COVID Vac σε αφελή άτομα (Εικόνα 3Α) και επίσης συσχετίστηκαν σημαντικά με την εξουδετέρωση του Omicron (Εικόνα 2D ). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική ενίσχυση στα πεπτίδια 12, 32 ή 46Α για άτομα που αναρρώνουν (Εικόνα 3Α). Η αλληλουχία του πεπτιδίου 12 διατηρείται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των στελεχών SARS-CoV-2 (Εικόνα 4) και βρίσκεται στο S1 κοντά στο Ν-άκρο του RBD και ως εκ τούτου υποδηλώνει μια περιοχή που μπορεί να είναι σχετική για τη μετάβαση του προ- στη διαμόρφωση μετά τη σύντηξη της πρωτεΐνης S (Εικόνα 3Β).

Σχήμα 3. Μέσες τιμές αντισωμάτων IgG (άξονες-y: ISU) σε πεπτίδια που προέρχονται από S (P12, P32, P46A) σε εμβολιασμένα άτομα που δεν έχουν υποβληθεί σε ανάρρωση στα χρονικά σημεία 0 και 3 (x-άξονες) (A) . Υποδεικνύονται σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων όπως προσδιορίζονται με τη δοκιμή Wilcoxon: * p < 0.05, ns=μη σημαντικές. (F) (B) Εικόνα 3. Διάμεση επίπεδα αντισωμάτων IgG (άξονες y: ISU) σε πεπτίδια που προέρχονται από S (P12, P32, P46A) σε εμβολιασμένα άτομα που δεν έχουν υποστεί ανάρρωση στα χρονικά σημεία 0 και 3 (x -άξονες) (Α). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων όπως προσδιορίζονται με τη δοκιμή Wilcoxon υποδεικνύονται: * p < 0,05, ns=μη σημαντικό. (Β) Οπτικοποίηση των πεπτιδίων 12, 32 και 46Α στην επιφανειακή αναπαράσταση του τριμερούς πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV{28} (πλάγια όψη, διαμόρφωση πριν από τη σύντηξη) που δημιουργήθηκε με PyMOL. Το πεπτίδιο 12 επισημαίνεται στο μοντέλο S-trimer με κόκκινο, το πεπτίδιο 32 με μπλε και το 46A με πορτοκαλί. Οι υδατάνθρακες εμφανίζονται με ανοιχτό γκρι.

Εικόνα 4. Ευθυγράμμιση αλληλουχίας πρωτεϊνών της πρωτεΐνης S Wuhan-Hu{-1 (επάνω) και Omicron (κάτω) SARS-CoV-2. Το RBD είναι χρωματισμένο σε ανοιχτό κίτρινο και τα πεπτίδια 12, 22, 25, 32, 33, 46A και 47 είναι υπογραμμισμένα. Η αλληλουχία της πρωτεΐνης S της Γουχάν αντιστοιχεί στην απομόνωση WA1 (Αριθμός πρόσβασης GeneBank: BCN86353.1), Η αλληλουχία πρωτεΐνης S Omicron Omicron είναι clade GRA, σειρά B.1.1.529 BA.1 με βάση τη βάση δεδομένων GISAID ( https://www.gisaid.org/ (πρόσβαση στις 15 Μαρτίου 2022)). Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων κωδικοποιούνται με χρώμα σύμφωνα με τις ιδιότητες υδροπάθειας και φορτίου τους (ροζ=υδρόφοβη, πράσινο=ουδέτερο, ανοιχτό μπλε=βασικό υδρόφιλο και ανοιχτό κόκκινο=όξινο υδρόφιλο).

3. Συζήτηση

Το εμβόλιο που βασίζεται σε φορέα Gam-COVID-Vac που ονομάζεται επίσης Sputnik-V, ήταν ένα από τα πρώτα εμβόλια SARS-CoV-2 που έγιναν διαθέσιμα για χρήση στην κλινική πράξη. Ωστόσο, σχετικά λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τις λεπτές εξειδικεύσεις των αποκρίσεων αντισωμάτων σε άτομα που έχουν εμβολιαστεί με COVID-19. Σε αυτήν τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια λεπτομερή ανάλυση των αποκρίσεων αντισωμάτων σε μικροδιατάξεις διπλωμένες και ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες SARS-CoV-2 και πεπτίδια που καλύπτουν την πρωτεΐνη S σε δείγματα πλάσματος από SARS CoV-2-απολαύτως και ανάρρωση ένα πλήρες πρόγραμμα εμβολιασμών με το Gam COVID-Vac. Το Gam-COVID-Vac επήγαγε κυρίως IgG1 αλλά όχι άλλες αποκρίσεις υποκατηγορίας IgG σε αναδιπλωμένα S, S1, S2 και RBD με συγκρίσιμο τρόπο σε άτομα που δεν ήταν σε κατάσταση αναρρόφησης, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση του SARS-CoV-2- ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων επίσης σε ανάρρωση άτομα. Όπως και άλλα γενετικά εμβόλια, η επαγόμενη από το Gam-COVID-Vac απόκριση αντισωμάτων βρισκόταν κυρίως στην υποκατηγορία IgG1 που έχει μικρότερο χρόνο ημιζωής σε σύγκριση με μια απόκριση υποκατηγορίας IgG4 που είναι πιο βιώσιμη. Για παράδειγμα, οι συγκεκριμένες αποκρίσεις υποκατηγορίας IgG4 σχετίζονται με μακροχρόνια προστασία κατά τη διάρκεια της ειδικής για αλλεργιογόνα ανοσοθεραπείας, ενώ οι συγκεκριμένες αποκρίσεις IgG1 συσσωρεύονται γρήγορα αλλά εξασθενούν μετά από μερικούς μήνες [28-30]. Αντίστοιχα, θα χρειαστούν συχνές αναμνηστικές ενέσεις Gam-COVID-Vac και άλλων γενετικών εμβολίων για να διατηρηθούν οι αποκρίσεις εξουδετέρωσης των αντισωμάτων σε υψηλό επίπεδο. Ο εμβολιασμός με Gam-COVID-Vac επάγει μια απόκριση αντισωμάτων που μιμείται σε μεγάλο βαθμό εκείνη που βρέθηκε μετά από φυσική μόλυνση με SARS-CoV-2 [13]. Επιπλέον, οι αποκρίσεις αντισωμάτων μετά από φυσική μόλυνση ανήκουν κυρίως στην υποκατηγορία IgG1 και στρέφονται κατά των διπλωμένων S, S1, S2 και RBD [13]. Το νέο και ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι το πλάσμα από πολλά εμβολιασμένα με Gam-COVID-Vac υποκείμενα (π.χ., στα άτομα 6, 10, 12, 13, 16, 20· Πίνακας 2) έδειξε δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού αλλά δεν ανέστειλε την Αλληλεπίδραση RBD-ACE2. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την αντιδραστικότητα των αντισωμάτων IgG στα πεπτίδια που καλύπτουν την πλήρη πρωτεΐνη S με ανάλυση τσιπ που βασίζεται σε μικροσυστοιχίες [13] (Εικόνες 2D και S4) και συσχετίσαμε τις ειδικές για το πεπτίδιο αποκρίσεις IgG με την εξουδετέρωση του ιού του Wuhan-Hu{{62} } στέλεχος και Omicron BA.1 (Εικόνα 2D). Οι αποκρίσεις IgG σε τρία πεπτίδια (δηλ. πεπτίδια 12, 32, 46Α) όπως οι αποκρίσεις IgG στο RBD συσχετίστηκαν σημαντικά με την εξουδετέρωση του στελέχους Wuhan-Hu-1 (Εικόνα 2C, D). Ωστόσο, το πεπτίδιο 12 ήταν μοναδικό επειδή οι αποκρίσεις αντισωμάτων μόνο στο πεπτίδιο 12, αλλά όχι στα πεπτίδια 32 και 46Α ενισχύθηκαν σημαντικά με τον εμβολιασμό (Εικόνα 3Α) και επίσης συσχετίστηκαν σημαντικά με την εξουδετέρωση του Omicron (Εικόνα 2D). Το μέγεθος της επαγόμενης από το εμβόλιο ενίσχυσης των ανταποκρίσεων IgG στο πεπτίδιο 12 ήταν μέτριο αλλά σημαντικό σε άτομα που δεν ήταν άγνωστα και αρκετά συγκρίσιμο με την ενίσχυση των αντισωμάτων IgG που κατευθύνονται στα S και S1. Ωστόσο, τα αντισώματα IgG έναντι του απομονωμένου ξεδιπλωμένου πεπτιδίου (Σχήμα S1) μπορεί να αντιπροσωπεύουν μόνο ένα τμήμα αντισωμάτων που κατευθύνονται κατά του πεπτιδίου 12 στη διπλωμένη πρωτεΐνη. Επιπλέον, δεν είναι μόνο τα επίπεδα αλλά και η απληστία των αντισωμάτων. Η αλληλουχία των πεπτιδίων 12 διατηρείται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ του στελέχους Wuhan-Hu-1 και του BA.1 Omicron VOC (Εικόνα 4) και προέρχεται από μια περιοχή που μπορεί να είναι σχετική για τη μετάβαση της προ στη μετά τη σύντηξη διαμόρφωση της πρωτεΐνης S (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, η σύγκριση νέων μεταλλαγμένων παραλλαγών του Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), δείχνει ότι το πεπτίδιο 12 (284–313 aa. ) παραμένει αμετάβλητο ως προς την αλληλουχία αμινοξέων, σε αντίθεση, για παράδειγμα, με το πεπτίδιο 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (πρόσβαση στις 28 Νοεμβρίου 2022)). Συγκεκριμένα, έχουν περιγραφεί μονοκλωνικά αντισώματα με ικανότητα εξουδετέρωσης του ιού που στοχεύουν τη Ν-τερματική περιοχή (NTD) της οποίας το πεπτίδιο 12 αποτελεί μέρος [31], και αναφέρθηκε ότι και άλλα εμβόλια μπορούν να προκαλέσουν απόκριση αντισωμάτων που στρέφεται εναντίον αυτής της περιοχής [18-20,32], υποδεικνύοντας ότι η περιοχή που ορίζεται από το πεπτίδιο 12 μπορεί να είναι σημαντική για την επαγωγή εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Επομένως, μπορεί κανείς να υποθέσει ότι τα αντισώματα που προκαλούνται από τον εμβολιασμό Gam-COVID-Vac μπορούν να εξουδετερώσουν τον SARS-CoV-2 με δύο μηχανισμούς, έναν απλώς αναστέλλοντας την αλληλεπίδραση RBD-ACE2 και έναν άλλο στοχεύοντας την περιοχή που περιέχει το πεπτίδιο 12 του S- πρωτεΐνη που μπορεί να εμπλέκεται σε δομικές αλλαγές (δηλαδή, μετάβαση της προ-σύντηξης στη διαμόρφωση σύντηξης του S). Η μελέτη μας έχει περιορισμούς. Για παράδειγμα, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία εξουδετέρωσης που βασίζεται σε ψευδο-τύπου φακοϊούς, αλλά αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιούνται ευρέως και αξιόπιστες [33]. Είναι επίσης ένας περιορισμός της μελέτης μας ότι τα πεπτίδια στη μικροσυστοιχία μας ξεδιπλώθηκαν και επομένως μπορεί να έχουν ταυτοποιήσει μόνο ένα κλάσμα εξουδετερωτικών αντισωμάτων που αναγνώρισαν τα ξεδιπλωμένα πεπτίδια ενώ ένα ακόμη μεγαλύτερο κλάσμα αντισωμάτων μπορεί να έχει συνδεθεί με διαμορφωτικούς επιτόπους στα αναγνωρισμένα περιοχή. Επιπλέον, αποτελεί περιορισμό της μελέτης μας ότι αναλύσαμε μόνο έναν μικρό αριθμό θεμάτων. Ωστόσο, η μελέτη μας δείχνει ξεκάθαρα ότι αντισώματα με διαφορετική ειδικότητα επιτόπου μπορεί να συμβάλλουν στην προστατευτική επίδραση του εμβολιασμού κατά του Gam COVID-Vac. Επιπλέον, η μελέτη δείχνει μια απόκριση σε ένα δυνητικά διατηρημένο πεπτίδιο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ευρέως εξουδετερωτικών αντισωμάτων.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-πώς να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Δήλωση Πληθυσμού Μελέτης και Δεοντολογίας

Υγιή άτομα με (n {{0}}) ή χωρίς (n=12) προηγούμενες λοιμώξεις από SARS-CoV-2 εγγράφηκαν στη μελέτη τον Δεκέμβριο του 2020 στο Εθνικό Ινστιτούτο Ερευνών του Κέντρου Ανοσολογία της Ομοσπονδιακής Ιατρικής Βιολογικής Υπηρεσίας της Ρωσίας (Αριθμός δεοντολογίας: #12-1, 29 Δεκεμβρίου 2020). Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Προηγούμενη λοίμωξη από SARS-CoV-2 είτε επιβεβαιώθηκε από ένα προηγούμενο θετικό τεστ PCR και συμπτώματα COVID-19 είτε από την παρουσία ειδικών αντισωμάτων SARS-CoV-2- κατευθυνόμενων στο αντιγόνο νουκλεοκαψιδίου ή/και Αντιγόνο RBD και/ή S όπως περιγράφεται [13]. Όλα τα άτομα ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά με δύο δόσεις Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moscow, Ρωσία) σε διάστημα τριών εβδομάδων. Δείγματα αίματος ελήφθησαν μία ημέρα πριν από τον πρώτο εμβολιασμό (Τ0, Εικόνα 1Α) και 80 έως 85 ημέρες μετά τον πρώτο εμβολιασμό (Τ3, Εικόνα 1Α).

4.2. Ανίχνευση SARS-CoV-2-Ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων

Η ανταπόκριση στην ανοσοσφαιρίνη των ατόμων που δεν είχαν υποστεί ανάρρωση και του COVID{{{0}} αξιολογήθηκε σε δείγματα πλάσματος πριν και μετά την ανοσοποίηση με Sputnik-V (Εικόνα 1Α). Η ειδική IgG σε μια ολοκληρωμένη ομάδα πρωτεϊνών SARS-CoV-2 και 46 πεπτιδίων (25–30 μερών) που καλύπτουν την πρωτεΐνη S μετρήθηκε σε αραιωμένα δείγματα πλάσματος 1:50 με τεχνολογία microarray-chip όπως προηγουμένως περιγράφεται [13]. Οι αλληλουχίες αμινοξέων, ο αριθμός των αμινοξέων και το μοριακό βάρος για όλα τα συνθετικά πεπτίδια στο μικροδιαταγμένο τσιπ παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Για τα πεπτίδια 12 και 32 και το RBD που εκφράζεται σε Escherichia coli (E. coli) (ξεδιπλωμένο) και στο Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) παρέχονται κύτταρα (αναδιπλωμένα) φάσματα κυκλικής διχρωμίας (CD) (Εικόνα S1). Τα πεπτίδια 12 και 32 δεν αποκάλυψαν καμία ειδική δευτερεύουσα δομή όπως προσδιορίζεται από τον κυκλικό διχρωμισμό (CD) όπως φαίνεται στο Σχήμα S1. Αναλυτικά, γυάλινες πλάκες που περιείχαν μικροσυστοιχίες που περιβάλλονταν από εποξειδικό πλαίσιο (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Γερμανία) ενεργοποιήθηκαν με ένα οργανικό πολυμερές που αντιδρά με αμίνη, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , ΗΠΑ) προκειμένου να διευκολυνθεί η σύνδεση πρωτεϊνών και πεπτιδίων. Τα αντιγόνα/πεπτίδια SARS-CoV-2 εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας συγκέντρωση 0,5–1 mg/mL σε (75 mM Na2HPO4, pH=8.4) εις τριπλούν χρησιμοποιώντας SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Βερολίνο, Γερμανία) [13]. Η έκφραση και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών και η σύνθεση πεπτιδίων περιγράφονται στο [13]. Η αντιδραστικότητα των αντισωμάτων IgG σε μικροσυστοιχία αντιγόνα μετρήθηκε πλένοντας πρώτα τις μικροσυστοιχίες για 5 λεπτά με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά με 0,5% Tween 20 (PBST) και ξήρανση τους με φυγοκέντρηση χρησιμοποιώντας φυγόκεντρο Sigma 2-7 και MTP{{45} ρότορα (και τα δύο Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Γερμανία). Στη συνέχεια προστέθηκαν κλάσματα 35 μL αραιωμένων δειγμάτων πλάσματος 1:50 (αραιωτικό δείγματος, Thermofisher, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 22 ◦C. Μετά από ένα άλλο στάδιο πλύσης, εφαρμόστηκαν 30 μL δευτερογενών αντισωμάτων (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, USA) με επισήμανση anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 22 ◦ C RT. Τα τσιπ στη συνέχεια πλύθηκαν, στέγνωσαν και στη συνέχεια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακό σαρωτή λέιζερ (Tecan, Männedorf, Ελβετία). Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με λογισμικό λήψης και ανάλυσης εικόνας μικροσυστοιχίας MAPIX (Innopsys, Carbonne, Γαλλία) και η μετατροπή των μετρούμενων μονάδων φθορισμού σε τυποποιημένες μονάδες ISAC (ISU) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [13]. Τα συγκεκριμένα επίπεδα αντισωμάτων εκφράζονται σε τυποποιημένες μονάδες ISAC (ISU). Οι αποκρίσεις αντισωμάτων IgG1-4 των ειδικών για το S και RBD μετρήθηκαν σε δείγματα πλάσματος (1:50 αραιωμένο) εις διπλούν με ELISA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13] με μια παραλλαγή του<5% for their average values.

Πίνακας 3. Συνθετικά πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεΐνη SARS-CoV-2 §.

4.3. Φάσματα κυκλικής διχρωμίας μακρινής υπεριώδους ακτινοβολίας (CD).

Για τα πεπτίδια, τα P12 και P32 καθώς και το RBD που εκφράζονται σε κύτταρα E. coli και HEK293 πραγματοποιήθηκε ανάλυση CD χρησιμοποιώντας ένα φασματοπολωόμετρο Jasco J-180 (Japan Spectroscopic Co., Τόκιο, Ιαπωνία) που περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Τα φάσματα CD πεπτιδίων και πρωτεϊνών (Εικόνα S1) μετρήθηκαν σε συγκέντρωση 0,1 mg/mL σε 10 mM NaH2PO4 (ρΗ 8,0), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό των αντιγόνων.

4.4. Δοκιμασία εξουδετέρωσης ιών με βάση ψευδοϊούς (PVT)

Η δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού σε δείγματα πλάσματος προσδιορίστηκε με δοκιμασία εξουδετέρωσης ιού που βασίζεται σε ψευδοϊό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Για την παραγωγή σωματιδίων τύπου ιού SARS-CoV-2 (VLPs), τα κύτταρα HEK293T συν-μορφομετατράπηκαν με 3 πλασμίδια: φακοϊικό πλασμίδιο συσκευασίας pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, UK), pUCHR-GFP και Το πλασμίδιο pCAGGS-S∆19 που κωδικοποιεί την άγριου τύπου πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 (πανομοιότυπη με τις απομονώσεις αναφοράς Wuhan-Hu-1 και WA1) ή το πλασμίδιο pCAGGS-S∆19-Om που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 Omicron spike (ευγενικό δώρο από τον Andrey Gorchakov, Laboratory of Immunogenetics, Institute of Molecular and Cellular Biology, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Ρωσία). Πριν από τη χρήση σε pVNT, τα VLP τιτλοδοτήθηκαν με περιοριστική αραίωση και επωάστηκαν για 4 ημέρες με hACE2-διαμολυσμένα κύτταρα HEK293T. Μια δόση ιικών σωματιδίων που έδωσε 50% θετικά κύτταρα πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) επιλέχθηκε για χρήση στη δοκιμή. Για το pVNT, όλα τα δείγματα πλάσματος απενεργοποιήθηκαν με θερμότητα για 30 λεπτά στους 56 ◦C πριν από τη χρήση. Την 4η ημέρα, τα κύτταρα μετά τη μόλυνση επαναιωρήθηκαν και το ποσοστό των θετικών σε GFP κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές ID50 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια σιγμοειδή καμπύλη (λογισμικό GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), που ανακατασκευάστηκε με το ποσοστό εξουδετέρωσης στις διαφορετικές υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις πλάσματος.

4.5. Δοκιμασία μοριακής αλληλεπίδρασης (MIA)

Για την ανίχνευση της ικανότητας δειγμάτων πλάσματος ασθενών με COVID{{{{0}} που βρίσκονται σε ανάρρωση ή χωρίς θεραπεία (Πίνακας 1), πριν και μετά την ανοσοποίηση Sputnik-V, να αναστέλλουν τη δέσμευση 50 ng/mL RBD-hu-1 στον υποδοχέα ACE2 πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία μοριακής αλληλεπίδρασης (MIA) όπως περιγράφεται [13,36-39]. Αυτή η ανάλυση μπορεί να μετρήσει την αναστολή του σημασμένου RBD στο ACE2 που συνδέεται με την πλάκα ELISA από αντισώματα ή άλλη αναστολή της ένωσης της αλληλεπίδρασης RBD-ACE2 [38]. Εν συντομία, ανασυνδυασμένο ACE-2 (GenScript, Piscataway, NJ, USA) επικαλύφθηκε (2 μg/mL) όλη τη νύκτα σε πλακίδια NUNC Maxisorb 96 φρεατίων (Thermofisher). Στη συνέχεια, διεξήχθησαν τρεις κύκλοι πλύσης με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και στη συνέχεια οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν για 3 ώρες σε ΘΔ με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν 1:2 σε PBS, 0,05% Tween 20, 1% BSA και προεπωάστηκαν για 2 ώρες με 50 ng σημασμένο με His ανασυνδυασμένο RBD (GenScript). Στη συνέχεια τα προεπωασμένα δείγματα ορού προστέθηκαν στις πλάκες που περιείχαν ACE-2 για 3 ώρες και οι πλάκες πλύθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύχτα με ένα αραιωμένο 1:1000 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού anti-His tag (Dianova, Αμβούργο, Γερμανία) . Μετά από 3 βήματα πλύσης, προστέθηκε 1:1000 αραιωμένο αντίσωμα IgG1 ποντικού συνδεδεμένο με HRP (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) για 2 ώρες και η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με ABTS. Οι μέσες τιμές οπτικής πυκνότητας (OD) που αντιστοιχούν σε δεσμευμένο RBD μετρήθηκαν στα 405 nm και 492 nm (αναφορά) σε έναν αναγνώστη TECAN Infinite F5 ELISA με το ενσωματωμένο λογισμικό i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Ελβετία). Ο έλεγχος του ρυθμιστικού διαλύματος (επικάλυψη χωρίς RBD) αφαιρέθηκε από κάθε αποτέλεσμα. Οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως μέσες τιμές με διακύμανση του<5%.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-πώς να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα

4.6. Οπτικοποίηση πεπτιδίων στη δομή της πρωτεΐνης Spike

Η επιφανειακή αναπαράσταση της πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV-2 δημιουργήθηκε σε PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, Έκδοση 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) με βάση στην καταχώρηση ΠΣΠ 6XR8.

4.7. Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (έκδοση 9.2.{2}} GraphPad Software, La Jolla California). Η δοκιμή Wilcoxon (Εικόνες 1C, D και 3A), η δοκιμή Mann-Whitney (Εικόνες 2Β και S3) και η δοκιμή Friedman (Εικόνα S2) χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση μεταξύ δύο ή πολλαπλών ομάδων. p < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό. Η συσχέτιση μεταξύ των δύο ομάδων προσδιορίστηκε με τη δοκιμή κατάταξης Spearman (Εικόνα 2Δ). Πραγματοποιήθηκε μια κανονικοποιημένη μη γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάμεσος ± IQR. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns—μη σημαντικό.

5. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, η μελέτη μας είναι η πρώτη που μελέτησε σε βάθος την εξειδίκευση των αντισωμάτων σε επίτοπο και υποκατηγορία IgG που προκαλείται από το Gam-COVID-Vac και αποκάλυψε διαφορετικούς μηχανισμούς εξουδετέρωσης του ιού που προκαλείται από το Gam-COVID-Vac από αντισώματα. Συγκεκριμένα, λάβαμε στοιχεία ότι τα αντισώματα που κατευθύνονται σε ένα πεπτίδιο (δηλαδή, το πεπτίδιο 12) που βρίσκεται κοντά αλλά έξω από το RBD στο Ν-τερματικό τμήμα του S1 σχετίζονται με την εξουδετέρωση του ιού. Η πιθανή δραστηριότητα εξουδετέρωσης του ιού των πεπτιδικών 12-ειδικών αντισωμάτων μπορεί να οφείλεται στην ικανότητά τους να παρεμβαίνουν στη μετάβαση της διαμόρφωσης πριν από τη σύντηξη της πρωτεΐνης ακίδας. Προτείνουμε να ληφθεί υπόψη η συμπερίληψη της περιοχής που ορίζεται από το πεπτίδιο 12 σε μια ανοσογονική μορφή σε εμβόλια για την επαγωγή αντισωμάτων έναντι αυτής της περιοχής επιτόπου και για τη δοκιμή αντισωμάτων που προκαλούνται από τέτοια εμβόλια για εξουδετέρωση ιού. Σε περίπτωση που μπορεί να ενισχυθεί η εξουδετέρωση του ιού των εμβολίων, η συμπερίληψη ενός ανοσογονικού πεπτιδίου 12 επιτόπων μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των εμβολίων για τον COVID-19. Επιπλέον, μπορεί κανείς να εξετάσει την ανάπτυξη αντισωμάτων κατά του επίτοπου που ορίζεται με το πεπτίδιο 12- για παθητική ανοσοποίηση. Επειδή ο 12-καθορισμένος επίτοπος πεπτιδίου διατηρείται σε γνωστές επί του παρόντος γνωστές παραλλαγές SARS-CoV-2, τα εμβόλια και τα αντισώματα που απευθύνονται στο πεπτίδιο 12 μπορούν να προστατεύουν διασταυρούμενα έναντι των παραλλαγών SARS-CoV{-2. Έτσι, παρέχουμε νέες γνώσεις που μπορεί να είναι χρήσιμες για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών ενεργητικού και παθητικού εμβολιασμού για τον COVID-19.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Rodriguez-Coira, J.; Sokolowska, M. SARS-CoV-2 υποψήφια εμβόλια—Σύνθεση, μηχανισμοί δράσης και στάδια κλινικής ανάπτυξης. Allergy 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]

2. Sharma, Α.; Ahmad, FI; Lal, SK COVID-19: Ανασκόπηση σχετικά με την εξέλιξη, τη μετάδοση, τον εντοπισμό, τον έλεγχο και την πρόληψη της νέας νόσου του κορωνοϊού. Ιοί 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]

3. Arshad, Β.; Iqbal, Τ.; Bhatti, KP Review-Insights into Off-Label θεραπευτικές στρατηγικές κατά της ήπιας και σοβαρής λοίμωξης COVID-19. Pak. J. Pharm. Sci. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]

4. Zaman, W.; Saqib, S.; Ullah, F. COVID-19: Οι φυλογενετικές προσεγγίσεις μπορεί να βοηθήσουν στην εύρεση πόρων για μια φυσική θεραπεία. Phytother. Res. 2020, 34, 2783–2785. [CrossRef]

5. Rubio-Casillas, A.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 Διαλείπουσα λοιμογόνος δύναμη ως αποτέλεσμα φυσικής επιλογής. COVID 2022, 2, 1089–1101. [CrossRef]

6. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Zubkova, OV Ασφάλεια και ανοσογονικότητα ενός ετερόλογου εμβολίου για COVID-19 βασισμένο σε φορείς rAd26 και rAd5 σε δύο σκευάσματα: Δύο ανοιχτές, μη τυχαιοποιημένες μελέτες φάσης 1/2 από τη Ρωσία. Lancet 2020, 396, 887–897, Correction in Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]

7. Folegatti, PM; Ewer, KJ; Aley, PK Ασφάλεια και ανοσογονικότητα του εμβολίου ChAdOx1 nCoV-19 κατά του SARS-CoV-2: Μια προκαταρκτική αναφορά μιας φάσης 1/2, μονο-τυφλής, τυχαιοποιημένης ελεγχόμενης δοκιμής. Lancet 2020, 396, 467–478, Correction in Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]

8. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV Ασφάλεια και αποτελεσματικότητα ενός ετερόλογου εμβολίου COVID-19 βασισμένο σε φορείς rAd26 και rAd5: Μια ενδιάμεση ανάλυση μιας τυχαιοποιημένης ελεγχόμενης δοκιμής φάσης 3 στη Ρωσία. Lancet 2021, 397, 671–681, Correction in Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]

9. Jackson, CB; Farzan, Μ.; Chen, Β.; Choe, H. Μηχανισμοί εισόδου του SARS-CoV-2 στα κύτταρα. Nat. Rev. ΜοΙ. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

10. Heinz, FX; Stiasny, K. Διακριτικά χαρακτηριστικά των τρεχόντων εμβολίων COVID-19: Γνωστά και άγνωστα για την παρουσίαση αντιγόνου και τους τρόπους δράσης. NPJ Vaccines 2021, 6, 104. [CrossRef]

11. Lim, HX; Masomian, Μ.; Khalid, Κ.; Kumar, AU; MacAry, PA; Poh, CL Αναγνώριση επιτόπων Β-κυττάρων για την εξουδετέρωση αντισωμάτων κατά του SARS-CoV-2 Spike Protein μέσω της βιοπληροφορικής και της στόχευσης μονοκλωνικών αντισωμάτων. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2022, 23, 4341. [CrossRef]

12. Moroy, G.; Tuffery, P. Στρατηγικές που βασίζονται σε πεπτίδια κατά της επίθεσης SARS-CoV-2: An Updated In Silico Perspective. Εμπρός. Φάρμακο. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]

13. Gattinger, Ρ.; Niespodziana, Κ.; Stiasny, K. Η εξουδετέρωση του SARS-CoV-2 απαιτεί αντισώματα έναντι των επιτόπων της περιοχής δέσμευσης διαμορφωτικού υποδοχέα. Allergy 2022, 77, 230–242. [CrossRef]

14. Niu, L.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC Ένα δομικό τοπίο εξουδετερωτικών αντισωμάτων κατά του τομέα δέσμευσης υποδοχέων SARS-CoV-2. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 647934. [CrossRef]

15. Shan, S.; Mok, CK; Zhang, S. Ένα ισχυρό και προστατευτικό ανθρώπινο εξουδετερωτικό αντίσωμα κατά των παραλλαγών του SARS-CoV-2. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 766821. [CrossRef]

16. Bajpai, Ρ.; Singh, V.; Chandele, A. Αντισώματα γενικής εξουδετέρωσης κατά του SARS-CoV-2 Παρέχετε νέες πληροφορίες για την εξουδετέρωση παραλλαγών και άλλων ανθρώπινων κορονοϊών. Εμπρός. Κύτταρο. Μολύνω. Microbiol. 2022, 12, 928279. [CrossRef]

17. Vishwakarma, Ρ.; Yadav, Ν.; Rizvi, ZA Σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο Κορωνοϊός 2 Νέοι επίτοποι που βασίζονται σε πρωτεΐνες ακίδας προκαλούν ισχυρές ανοσολογικές αποκρίσεις in vivo και αναστέλλουν την αναπαραγωγή του ιού in vitro. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 613045. [CrossRef]

18. Garrett, ME; Galloway, JG; Wolf, C. Ο αναλυτικός χαρακτηρισμός των αποκρίσεων αντισωμάτων στον SARS-CoV-2 Η πρωτεΐνη Spike βρίσκει επιπλέον επιτόπους που προκαλούνται από εμβόλια πέρα ​​από αυτούς για ήπια μόλυνση. eLife 2022, 11, e73490. [CrossRef]

19. Peng, Μ.; Dou, Χ.; Zhang, X. Προστατευτικοί αντιγονικοί επίτοποι που αποκαλύφθηκαν με ανοσουπογραφές μετά από τρεις δόσεις απενεργοποιημένου εμβολίου SARS-CoV-2. Εμπρός. Immunol. 2022, 13, 938378. [CrossRef]

20. Polvere, Ι.; Parrella, Α.; Zerillo, L. Ποικιλομορφία της Humoral Immune Response Different Covid-19 Vaccines: Implications for the "Green Pass". Εμπρός. Immunol. 2022, 13, 833085. [CrossRef]

21. Tukhvatulin, AI; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV Μια ανοιχτή, μη τυχαιοποιημένη δοκιμή φάσης 1/2 σχετικά με την ασφάλεια, την ανεκτικότητα και την ανοσογονικότητα του εμβολίου μίας δόσης "Sputnik Light" για την πρόληψη της μόλυνσης από κορωνοϊό σε υγιείς ενήλικες. Lancet Reg. Υγείας Ευρ. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]

22. Gonzalez, S.; Olszevicki, S.; Salazar, M. Αποτελεσματικότητα του πρώτου συστατικού του Gam-COVID-Vac (Sputnik V) στη μείωση του SARS-CoV-2 επιβεβαιωμένων λοιμώξεων, νοσηλειών και θνησιμότητας σε ασθενείς ηλικίας 60–79 ετών: Μια αναδρομική μελέτη κοόρτης στην Αργεντινή. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]

23. Gushchin, VA; Dolzhikova, IV; Shchetinin, AM Neutralizing Activity of Sera από Sputnik V-εμβολιασμένα άτομα κατά των παραλλαγών ανησυχίας (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) και το ενδημικό SARS της Μόσχας -Παραλλαγές CoV-2. Vaccines 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]

24. Voko, Z.; Kiss, Ζ.; Surjan, G. Πανεθνική αποτελεσματικότητα πέντε εμβολίων SARS-CoV-2 στην Ουγγαρία-η μελέτη HUN-VE. Clin. Microbiol. Μολύνω. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]

25. Jeewandara, C.; Fernando, S.; Pushpakumara, PD Ανοσοποιητικές αποκρίσεις μετά την πρώτη δόση του Sputnik V (Gam-COVID-Vac). Sci. Rep. 2022, 12, 1727. [CrossRef]

26. Ikegame, S.; Siddiquey, MNA; Εξουδετερωτική δραστηριότητα CT των ορών εμβολίου Sputnik V κατά των παραλλαγών του SARS-CoV-2. Nat. Commun. 2021, 12, 4598. [CrossRef]

27. Gushchin, VA; Tsyganova, EV; Ogarkova, DA Sputnik V προστασία από τον COVID-19 σε άτομα που ζουν με HIV υπό αντιρετροϊκή θεραπεία. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]

28. Shamji, ΜΗ; Valenta, R.; Jardetzky, Τ. ​​Ο ρόλος των ειδικών για αλλεργιογόνα IgE, IgG και IgA στην αλλεργική νόσο. Allergy 2021, 76, 3627–3641. [CrossRef]

29. Eckl-Dorna, J.; Weber, Μ.; Stanek, V. Δύο χρόνια θεραπείας με το ανασυνδυασμένο εμβόλιο αλλεργίας γύρης χόρτου BM32 επάγει μια συνεχώς αυξανόμενη ειδική για το αλλεργιογόνο απόκριση IgG4. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [CrossRef]

30. Shamji, ΜΗ; Kappen, JH; Akdis, M. Βιοδείκτες για την παρακολούθηση της κλινικής αποτελεσματικότητας της ανοσοθεραπείας με αλλεργιογόνα για την αλλεργική ρινοεπιπεφυκίτιδα και το αλλεργικό άσθμα: An EAACI Position Paper. Allergy 2017, 72, 1156–1173. [CrossRef]

31. Tortorici, MA; Beltramello, Μ.; Τα υπερδύναμα ανθρώπινα αντισώματα Lempp, FA προστατεύουν από την πρόκληση SARS-CoV-2 μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Science 2020, 370, 950–957. [CrossRef]

32. Cia, G.; Pucci, F.; Rooman, M. Analysis of the Neutralizing Activity of Antibodies Targeting Open or Closed SARS-CoV-2 Spike Protein Conformations. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2022, 23, 2078. [CrossRef]

33. Meng, Β.; Datir, R.; Choi, J. SARS-CoV-2 ο Ν-τερματικός τομέας της ακίδας ρυθμίζει την εξαρτώμενη από το TMPRSS2-εισόδου και συντηκογένεση του ιού. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]

34. Resch, Υ.; Weghofer, Μ.; Seiberler, S. Molecular χαρακτηρισμός του Der p 10: Ένας διαγνωστικός δείκτης για ευρεία ευαισθητοποίηση στην αλλεργία στα ακάρεα της οικιακής σκόνης. Clin. Exp. Allergy 2011, 41, 1468–1477. [CrossRef]

35. Byazrova, Μ.; Yusubalieva, G.; Spiridonova, A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-ειδική έκκριση αντισωμάτων και δημιουργία Β-κυττάρων μνήμης σε ασθενείς με οξύ COVID-19. Clin. Μετάφρ. Immunol. 2021, 10, e1245. [CrossRef]

36. Gattinger, Ρ.; Borochova, Κ.; Dorofeeva, Y. Τα αντισώματα στον ορό ασθενών σε ανάρρωση μετά από ήπιο COVID-19 δεν αποτρέπουν πάντα τη δέσμευση ιού-υποδοχέα. Allergy 2021, 76, 878–883. [CrossRef]

37. Gattinger, Ρ.; Tulaeva, Ι.; Borochova, K. Omicron: Μια παραλλαγή SARS-CoV-2 που προκαλεί πραγματική ανησυχία. Allergy 2022, 77, 1616–1620. [CrossRef]

38. Gattinger, Ρ.; Ohradanova-Repic, A.; Valenta, R. Σημασία, Εφαρμογές και Χαρακτηριστικά των Δοκιμασιών Μέτρησης του SARS-CoV-2 Εξουδετερωτικών Αντισωμάτων. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2023, 24, 5352. [CrossRef]

39. Gattinger, Ρ.; Kratzer, Β.; Tulaeva, Ι.; Niespodziana, Κ.; Ohradanova-Repic, A.; Gebetsberger, L.; Borochova, Κ.; Garner-Spitzer, Ε.; Trapin, D.; Hofer, G.; et al. Ένα εμβόλιο που βασίζεται σε αναδιπλωμένη πρωτεΐνη σύντηξης τομέα δέσμευσης υποδοχέα-PreS με δυνατότητα πρόκλησης αποστείρωσης ανοσίας σε παραλλαγές SARS-CoV-2. Allergy 2022, 77, 2431–2445. [CrossRef]