Διαφορική λιπιδομική κυττάρων HK-2 και εξωσωμάτων υπό διέγερση υψηλής γλυκόζης

Αφηρημένη

Ο μη φυσιολογικός κυτταρικός μεταβολισμός των λιπιδίων είναι πολύ σημαντικός για την εμφάνιση και την εξέλιξη της διαβητικής νεφρικής νόσου (DKD). Ωστόσο, η λιπιδική σύνθεση και η διαφορική έκφραση με διέγερση υψηλής γλυκόζης των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων και των εξωσωμάτων τους, που είναι ζωτικό μέρος της ανάπτυξης της DKD, είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστα. Σε αυτή τη μελέτη, με βάση τη στοχευμένη ανάλυση λιπιδίων με σήμανση ισοτόπων και διαδοχική φασματομετρία μάζας, ποσοτικοποιήθηκαν συνολικά 421 και 218 είδη λιπιδίων σε κύτταρα HK-2 και εξωσώματα, αντίστοιχα. Το πιο σημαντικό, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0, GM3 d18:1/22:1 αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ LPE18:1, LPE, CL66:4 (16:1), BMP36:3, CL70:7 (16:1), CL74:8 (16 :1) μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα HK{{4{{90}}}} που διεγείρονται με υψηλή γλυκόζη. Επίσης, PG36:1, FFA22:5, PC38:3, SM d18:1/16:1, CE-16:1, CE-18:3, CE-20:5, και το CE-22:6 αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ τα GM3 d18:1/24:1, GM3 μειώθηκαν σημαντικά στα εξωσώματα που εκκρίνονται από κύτταρα HK{-2 που διεγείρονται από υψηλή γλυκόζη. Επιπλέον, τα TAG, PC και CL μειώθηκαν σημαντικά στα εξωσώματα σε σύγκριση με τα κύτταρα HK-2 και τα LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16:1, GM3 d18:1/18:1 , GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:0/20:0, PC40:6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE{{101 }}:5, CE-20:4, CE{-22:6 βρέθηκαν μόνο σε εξωσώματα. Επιπλέον, η έκφραση του PI4P σε κύτταρα HK{108}} μειώθηκε σε κατάσταση υψηλής γλυκόζης. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να είναι χρήσιμα για την παροχή νέων στόχων για την εξερεύνηση των μηχανισμών του DKD.

Λέξεις-κλειδιά

Στοχευμένη λιπιδομική; Νεφρικά σωληνάρια; Εξωσώματα; Διαβητική νεφρική νόσο.

Κάντε κλικ εδώ για να αγοράσετε συμπλήρωμα Cistanche για την προστασία του νεφρού

Εισαγωγή

Οι μεταβολικές διαταραχές των λιπιδίων συμμετέχουν στην εμφάνιση και ανάπτυξη της διαβητικής νεφρικής νόσου (DKD) [1, 2]. Οι αλλαγές στη σύνθεση των κυτταρικών λιπιδίων στον νεφρό υπό κατάσταση υψηλής γλυκόζης μπορεί να προκαλέσουν αύξηση της παραγωγής ενεργού οξυγόνου, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και ακόμη και να προκαλέσουν απόπτωση [3, 4, 5, 6]. Αν και πολλοί ερευνητές έχουν αναγνωρίσει τον σημαντικό ρόλο των νεφρικών σωληναρίων στην ανάπτυξη και εξέλιξη της DKD, λίγες μελέτες έχουν ασχοληθεί με τη συνολική έκφραση λιπιδίων στα νεφρικά σωληνάρια ή τις αλλαγές υπό διέγερση υψηλής γλυκόζης [7, 8]. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να λαμβάνουμε ολοκληρωμένες πληροφορίες για τα λιπίδια στα νεφρικά σωληνάρια, διευκρινίζοντας έτσι περαιτέρω τον ρόλο των λιπιδίων στην παθογένεση της DKD.

Τα τελευταία χρόνια, ο ρόλος των εξωσωμάτων στην ανάπτυξη της DKD έχει προσελκύσει αυξανόμενη προσοχή. Τα εξωσώματα που μπορούν να συνεργαστούν με την οδό αυτοφαγίας-λυσοσώματος για την ανακούφιση του ενδοκυτταρικού στρες έχουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης [9, 10]. Εν τω μεταξύ, λειτουργούν ως φορείς για τη μεταφορά υλικού και την επικοινωνία πληροφοριών μεταξύ των κυττάρων [11]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η διασταύρωση μεταξύ των σωληναριακών κυττάρων και άλλων τύπων νεφρικών κυττάρων στον νεφρώνα μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου [12, 13]. Αν και η λιπιδική σύνθεση των εξωσωμάτων μπορεί να επηρεάσει τις ιδιότητές τους, έχει μελετηθεί σε μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με την προσοχή της πρωτεΐνης και του RNA [14]. Δεδομένου ότι τα εξωσώματα που εκκρίνονται από διαφορετικά κύτταρα ποικίλλουν ως προς τους τύπους, τα περιεχόμενα και τις λειτουργίες λιπιδίων, η αποσαφήνιση της λιπιδικής σύνθεσης και της διαφορικής έκφρασης των εξωσωμάτων που εκκρίνονται από τα νεφρικά σωληνάρια σε κατάσταση υψηλής γλυκόζης θα παρείχε μια θεωρητική βάση για την αποσαφήνιση του μηχανισμού εξωσωματικής επικοινωνίας σχετικά με τα νεφρικά σωληνάρια. .

Εδώ, παρουσιάσαμε μια διαφορική λιπιδομική ανάλυση των νεφρικών σωληναρίων και των εξωσωμάτων τους υπό διέγερση υψηλής γλυκόζης και ανιχνεύσαμε διαφορετικά εκφραζόμενα είδη λιπιδίων καρδιολιπίνης (CL), μονοσιαλοδιεξοσυλ γαγγλιοσίδης (GM3) και χοληστερυλεστέρα (CE). Επίσης, αρχικά διερευνήσαμε τον ρόλο των φωσφοϊνοσιτιδίων (PIPs) στην εξωσωματική παραγωγή και παρατηρήσαμε την πρόσληψη σωληναριακών εξωσωμάτων από σπειραματικά μεσαγγειακά κύτταρα (GMCs).

Συμπλήρωμα Cistanche

Μέθοδοι

1. Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη νεφρική εγγύς σωληναριακή επιθηλιακή κυτταρική σειρά HK-2 αγοράστηκε από το Κέντρο Κυτταρικών Πόρων του Ινστιτούτου Βιολογικών Επιστημών της Σαγκάης. Τα κύτταρα HK-2 καλλιεργήθηκαν σε κανονική γλυκόζη Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) που συμπληρώθηκε με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, FSP500, ExCell). Η κανονική γλυκόζη DMEM/F-12 ήταν ένα μείγμα 1:1 DMEM (11966025, Gibco) και Ham's F-12 (11765054, Gibco) που περιείχε 5,56 mmol/L γλυκόζης. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα 5 τοις εκατό CO2. Μόλις επιτεύχθηκε συρροή 80 τοις εκατό, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας την τυπική διαδικασία πέψης θρυψίνης και ανακαλύφθηκαν σε αναλογία διαχωρισμού 1:2. Τα κύτταρα διέλευσης καλλιεργήθηκαν με FBS χωρίς εξώσωμα (CMS101.03, Cellmax) σε 5,5 mmol·L-1 γλυκόζης ως τυφλή ομάδα ελέγχου (NG) και 30 mmol·L-1 γλυκόζη ως υψηλή γλυκόζη ομάδα (HG) για 48 ώρες.

2. Απομόνωση εξωσωμάτων

Χρησιμοποιήθηκε διαφορική υπερφυγοκέντρηση για την εξαγωγή εξωσωμάτων από τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας HK{{0}}. Εν συντομία, τα υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων HK-2 συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν διαδοχικά στους 2000×g, στους 4 βαθμούς για 10 λεπτά και στη συνέχεια στους 10,000×g, στους 4 βαθμούς για 30 λεπτά για την αφαίρεση κυττάρων, κυτταρικών υπολειμμάτων και μεγάλων κυστιδίων. Τα υπερκείμενα κλάσματα διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρα μεγέθους πόρων 0,{10}}μm. Τα φιλτραρισμένα δείγματα υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε υπερφυγοκέντρηση στα 110.000 × g για 75 λεπτά, δύο φορές στους 4 βαθμούς για να σφαιροποιηθούν τα εξωσώματα. Τα προκύπτοντα εξωσώματα επαναιωρήθηκαν σε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS) και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό.

3. Ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA)

Τα εξωσώματα αποψύχθηκαν σε λουτρό νερού 25 μοιρών και τοποθετήθηκαν σε πάγο, μετά από το οποίο αραιώθηκαν απευθείας με 1×PBS για ανίχνευση με συντονισμένη αντίσταση ανίχνευσης παλμών (TRPS). Οι αναλύσεις της κατανομής μεγέθους και της συγκέντρωσης των εξωσωμάτων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας qNano Gold με Izon Control Suite 3.3.2 από την Izon Science.

4. Προσδιορισμός πρωτεΐνης και western blotting

Περίπου 100 μΙ προαναμεμειγμένου διαλύματος πυρόλυσης (διάλυμα πυρόλυσης RIPA και αναστολέας PMSF 1 τοις εκατό) προστέθηκαν στα δείγματα κυττάρου και εξωσώματος χωριστά. Μετά από ρωγμές για 30 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν στους 12,{4}}×g, 4 βαθμούς για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο λήφθηκε και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης δικινχονικού οξέος (BCA; Beyotime) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ως τυπική πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε αλβουμίνη βόειου ορού.

Δείγματα πρωτεΐνης κλασματοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου νατρίου-δωδεκυλ-θειικού (SDS-PAGE). Αφού μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore), επωάστηκαν με διάφορα πρωτεύοντα αντισώματα, αντι-CD63 (EXOAB-CD63A-1, SBI; 1:1000), αντι-ALIX (YT6283, Immunoway; 1:1000 ), αντι-Calnexin (YT0613, Immunoway; 1:1000), anti-P62 (P0067, Sigma; 1:1000) και anti-LC3 (L7543, Sigma; 1:1000), ακολουθούμενα από κατσικίσιο αντικουνέλι ή ποντίκια Δευτερεύοντα αντισώματα Ig (180202-001, SBI; 1:5000). Ανιχνεύθηκαν ειδικές ζώνες χρησιμοποιώντας ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (ECL, Beyotime). -ακτίνη (BM0627, Boster) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η σχετική ένταση της ζώνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

5. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM)

Δείγμα 5 λίτρων έπεσε στο χάλκινο δίχτυ και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Μια σταγόνα 2 τοις εκατό οξικού υπεροξειδίου του ουρανίου προστέθηκε στο χάλκινο δίχτυ και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό. Στη συνέχεια στέγνωσε για περίπου 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και παρατηρήθηκε κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο νανο-μετάδοσης (Tecnai G2 Spirit BioTwin, FEI).

Εκχύλισμα Cistanche

6. Στοχευμένα λιπιδομικά

Τα λιπίδια εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη έκδοση της μεθόδου Bligh και Dyer [15]. Όλες οι λιπιδομικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης Exion (UPLC) σε συνδυασμό με σύστημα SCIEX QTRAP 6500 PLUS. Οι αναλύσεις UPLC-MS/MS πραγματοποιήθηκαν σε λειτουργία ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI), με τις ακόλουθες συνθήκες: αέριο κουρτίνας=20, τάση ψεκασμού ιόντων=5, 500 V , θερμοκρασία=400 βαθμός, αέριο πηγής ιόντων 1=35 και αέριο πηγής ιόντων 2=35. Τα πολικά λιπίδια διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας στήλη Phenomenex Luna 3 μm στήλης πυριτίου (εσωτερική διάμετρος 150 × 2.0 mm) με δύο κινητές φάσεις: κινητή φάση Α (χλωροφόρμιο: μεθανόλη: υδροξείδιο του αμμωνίου, 89,5: 10: 0.5) και κινητή φάση Β (χλωροφόρμιο: μεθανόλη: υδροξείδιο αμμωνίου: νερό, 55: 39: 0.5: 5.5). Ο διαχωρισμός κλίσης διεξήχθη ως εξής: η κλίση διατηρήθηκε με 95 τοις εκατό Α για 5 λεπτά και στη συνέχεια μειώθηκε γραμμικά στο 60 τοις εκατό σε 7 λεπτά και διατηρήθηκε για 4 λεπτά, μετά τα οποία μειώθηκε στο 30 τοις εκατό και στη συνέχεια κρατήθηκε για 15 λεπτά. Τέλος, εφαρμόστηκε η αρχική κλίση και διατηρήθηκε για 5 λεπτά. Η φασματομετρική παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων μάζας (MRM) καθιερώθηκε για την ταυτοποίηση διαφόρων λιπιδίων και την ποσοτική ανάλυση [16, 17]. Μεμονωμένα είδη πολικών λιπιδίων ποσοτικοποιήθηκαν με αναφορά σε αιχμηρά εσωτερικά πρότυπα της ίδιας κατηγορίας λιπιδίων συμπεριλαμβανομένων των PE-d31(16:0/18:1), DMPE. PG-d31(16:0/18:1), DMPG; PI-d31(16:0/18:1), di-C8- PI; PS-d31(16:0/18:1), DMPS; PA-d31(16:{{1{{1{{110}}8}}4}}/18:1), PA(17:0/17:0); BMP-(14:0/14:0); LPE-17:1; LPI{79}}:1; LPS{81}}:1; LPA{83}}:0; GM3 d18:1/18:0-d3; d31-16:0, d8-20:4; PC-d31(16:0/18:1), DMPC; SM d18:1/ d31-16:0, SM d18:1/12:0; LPC{109}}:0; Cer d18:1-d7/15:0; Sph-d18:1/17:0; CL 22:1(3)-14:1.

Τα λιπίδια γλυκερόλης, συμπεριλαμβανομένων των διακυλογλυκερολών (DAGs) και των τριακυλογλυκερολών (TAGs), ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη έκδοση HPLC/MS/MS ανάστροφης φάσης. Ο διαχωρισμός των ουδέτερων λιπιδίων επιτεύχθηκε σε στήλη Phenomenex Kinetex-C18 2.6 μm (id 4,6x100 mm) χρησιμοποιώντας μια κινητή φάση που περιέχει χλωροφόρμιο: μεθανόλη: {{19} }.1 M οξικό αμμώνιο (100:100:4), με ταχύτητα ροής 160 μl/min. d5-TAG (16:0)3; d5-TAG (14:0)3; d5-TAG (18:0)3 χρησιμοποιήθηκαν για μεμονωμένα TAG. d5-DAG (1,3-17:0); d5-DAG (1,3-18:1) χρησιμοποιήθηκαν για την αύξηση μεμονωμένων DAG με βάση την τεχνολογία Neutral miss MS/MS.

Οι ελεύθερες χοληστερόλες, οι στερόλες και οι εστέρες τους αναλύθηκαν με HPLC-MS/MS, που διεξήχθη σε λειτουργία χημικού ιονισμού ατμοσφαιρικής πίεσης (APCI), με Cholesteryl-2,2,3,4,4,6-d6 Octadeconate; Χοληστερόλη-26,26,26,27,27,27-d6 ως εσωτερικά πρότυπα.

Χλωροφόρμιο: μεθανόλη: (1:1), υδροχλωρικό οξύ 2,4 Μ και 0,25 Μ EDTA προστέθηκαν στο δείγμα, ακολουθούμενο από άλεση σε χαμηλές θερμοκρασίες. Το δείγμα φυγοκεντρήθηκε μετά από επώαση για 3 ώρες στους 4 βαθμούς, μετά την οποία εκχυλίστηκε η κατώτερη οργανική φάση. Προστέθηκε χλωροφόρμιο για τη δεύτερη εκχύλιση, ακολουθούμενο από έκπλυση της οργανικής φάσης χρησιμοποιώντας 1Ν υδροχλωρικό οξύ: μεθανόλη (1:1). Η οργανική φάση ξηράνθηκε σε περιστροφικό συμπυκνωτή κενού. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, 40 τοις εκατό μεθυλαμίνη: νερό: κ-βουτανόλη: μεθανόλη (36:8:9:47) χρησιμοποιήθηκε για αποακυλίωση και αναλύθηκε με ιοντική χρωματογραφία Thermo ICS-5000. Τα PI4P, PI3P, PI4P, PI(3, 4)P2, PI(3, 5)P2, PI(4, 5)P2 και PI(3, 4,5) P3 χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία μιας εξωτερικής καμπύλης βαθμονόμησης για ποσοτικές ανάλυση. Η ανάλυση υποστηρίχθηκε από τη Lipidall Technologies Company Limited.

7. Μικροσκόπιο φθορισμού

Για να οπτικοποιηθεί η πρόσληψη εξωσωμάτων σε GMCs (Sicencell), ίση ποσότητα εξωσωμάτων που εκκρίνονται από κύτταρα HK-2 με ή χωρίς διέγερση υψηλής γλυκόζης επισημάνθηκαν και τα δύο με PKH67 (mini67, Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επισημασμένα εξωσώματα καλλιεργήθηκαν με GMCs για 24 ώρες. Τα συρρέοντα GMC πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, και στη συνέχεια τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και διατηρήθηκαν μακριά από το φως για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και χρωματίστηκαν με DAPI (28718903, Solarbio) για 4-6λεπτά. Μετά από τρεις φορές πλύσιμο, τα συρρέοντα GMCs φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο Nikon C2.

8. Στατιστική ανάλυση

Το GraphPad 7.0 εφαρμόστηκε για στατιστική ανάλυση και χαρτογράφηση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Χρησιμοποιήθηκε το t-test Student για σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων. Μια τιμή P < 0.05 θεωρήθηκε ως στατιστική σημαντική.

Κάψουλες Cistanche

Συζήτηση

Η μελέτη μας παρέχει τα διαφορετικά εκφραζόμενα είδη λιπιδίων των κυττάρων HK{{0}} και των εξωσωμάτων υπό διέγερση υψηλής γλυκόζης, τα οποία δεν είχαν αναφερθεί προηγουμένως. Είναι ενδιαφέρον ότι είδη GM3, όπως GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0 , το GM3 d18:1/22:1 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα HK-2 που διεγείρονται από υψηλή γλυκόζη και τα GM3 d18:1/24:1, GM3 μειώθηκαν σημαντικά στα εξωσώματά τους. Επιπλέον, το GM3 d18:1 /18:1, GM3 d18:1/20:1 και GM3 d18:0/2{0:0 βρέθηκαν μόνο σε εξωσώματα. Το GM3 είναι ο πιο διαδεδομένος γαγγλιοσίδης στο σώμα, που αποτελείται από γλυκόζη, γαλακτόζη και σιαλικό οξύ που χαρακτηρίζεται από σιαλικές ομάδες που σχετίζονται με τη δομή του σκελετού του κεραμιδίου [18]. Συμμετέχει στη ρύθμιση μιας ποικιλίας κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της μεταγωγής σήματος, του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, η συγκέντρωση του GM3 στον ορό είναι υψηλότερη σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, υπερλιπιδαιμία και παχύσαρκους ασθενείς, ενώ το GM3 μπορεί να προάγει την απομάκρυνση των υποδοχέων ινσουλίνης και να μειώσει τη σηματοδότηση της ινσουλίνης [19]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν αυξημένα επίπεδα όλων των ειδών GM3 με διαφορική έκφραση σε κύτταρα HK-2 υπό διέγερση υψηλής γλυκόζης, ειδικά η αύξηση του GM3 με πλευρική αλυσίδα (22: 0) που ήταν η πιο εμφανής. Οι Zhang et al. [20] παρατήρησε επίσης αυξημένη έκφραση GM3 d18:1/22:0 στον φλοιό των νεφρών ποντικών με διαβητική νεφροπάθεια, η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματά μας. Η μελέτη αρουραίων διαβήτη τύπου 2 που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη που διεξήχθη από τους Anela et al. [21] βρήκε αμετάβλητο GM3 στα σπειράματα, αλλά αύξησε σημαντικά την έκφραση του GM3 στα νεφρικά σωληνάρια, κάτι που είναι σύμφωνο με το εύρημα των αλλαγών του GM3 στα νεφρικά σωληνάρια. Kwak et al. [22] βρήκε μείωση του GM3 στο σπειραματικό περιεχόμενο διαβητικών αρουραίων που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη, ακολουθούμενη από απώλεια του φραγμού επιλεκτικής διήθησης στα σπειράματα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ο ρόλος του GM3 στα σπειράματα και στα νεφρικά σωληνάρια μπορεί να ποικίλλει. Το GM3 είναι επίσης ένα σημαντικό μέρος της λιπιδικής σχεδίας [23]. Οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του GM3 σε λιπιδικές σχεδίες αλλάζουν τις δραστηριότητες του συμμεταφορέα Na συν -γλυκόζης τύπου 2 (SGLT2) και του νεφρικού Na plus /K plus /Cl- συμμεταφορέα, οι οποίοι και οι δύο εξαρτώνται από τη σχεδία λιπιδίων [24]. Μερικοί ερευνητές υπέθεσαν ότι μια υψηλότερη συγκέντρωση GM3 αυξάνει τις δραστηριότητες συμμεταφορέα SGLT2 και Na συν /Κ συν /Cl, οδηγώντας σε αυξημένη σωληναριακή επαναρρόφηση και υδροστατική πίεση του απαγωγού αρτηριολίου και στη συνέχεια προκαλώντας βλάβη στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα καταστρέφοντας τη σωληναριακή ισορροπία. Kumari et al. [25] διαπίστωσε ότι το GM3 σε εξωσώματα ούρων ασθενών εμφάνισε σημαντική διαφορά μεταξύ DKD και σακχαρώδους διαβήτη. Συνολικά, ο ρόλος της αυξημένης έκφρασης του GM3 υπό υψηλή γλυκόζη στα νεφρικά σωληνάρια θα πρέπει να αντιμετωπιστεί από μελλοντική έρευνα.

Είναι σημαντικό ότι τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι ορισμένα είδη CL, συμπεριλαμβανομένων των CL66:4(16:1), CL70:7(16:1) και CL74:8(16:1) μειώθηκαν σημαντικά σε HK που διεγείρεται από υψηλή γλυκόζη{ {13}} κελιά. Σε σύγκριση με τα κύτταρα HK-2, το CL μειώθηκε σημαντικά στα εξωσώματα. Το CL εντοπίζεται σχεδόν εξ ολοκλήρου στην μιτοχονδριακή εσωτερική μεμβράνη και αποτελεί σημαντικό μέρος της διατήρησης της μιτοχονδριακής δομής. Έχει σημαντικό ρόλο στην αγωγιμότητα των ηλεκτρονίων, στην παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης, στον ενεργειακό μεταβολισμό και στην απόπτωση [26, 27]. Στον διαβήτη, οι μιτοχονδριακές μορφολογικές αλλαγές και η δυσλειτουργία συνοδεύονται συχνά από παθολογική αλλαγή CL [28,29]. Τα εγγύς νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα απαιτούν αρκετό ATP για να διατηρήσουν την ενεργό μεταφορά και επαναρρόφηση διαφόρων ουσιών. Ως κύτταρα υψηλής κατανάλωσης ενέργειας, τα εγγύς νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα είναι πλούσια σε μιτοχόνδρια [30]. Μιτοχονδριακός κατακερματισμός έχει παρατηρηθεί σε εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στον πρώιμο διαβήτη. Οι Zhang et al. [31] διαπίστωσε ότι η CL ήταν απαραίτητη για τη διατήρηση της σωληναριακής μιτοχονδριακής λειτουργίας σε ποντίκια με διαβήτη τύπου 1. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να παρέχουν μια νέα θεωρητική βάση για τη μελέτη του μηχανισμού μιτοχονδριακής βλάβης της DKD.

Τα εξωσώματα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης συνεργαζόμενα με την οδό αυτοφαγίας-λυσοσώματος. Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των PIPs θα μπορούσαν να επηρεάσουν τόσο την έκκριση των εξωσωμάτων όσο και την κυτταρική αυτοφαγία ρυθμίζοντας τον μετασχηματισμό των MVBs [32, 33, 34]. Nina et al. [35] διαπίστωσε ότι στα κύτταρα PC-3, η αναστολή του PIKfyve, το οποίο υπόστρωμα είναι το PI3P, αύξησε την έκκριση των εξωσωμάτων και προκάλεσε εκκριτική αυτοφαγία, δείχνοντας έτσι ότι αυτές οι οδοί συνδέονται στενά με PIP. Με βάση τα προαναφερθέντα, παρατηρήσαμε τις αλλαγές στα PIPs, την εξωσωματική παραγωγή και την αυτοφαγία σε κύτταρα HK-2 που διεγείρονται από υψηλή γλυκόζη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υψηλή γλυκόζη διέγειρε τόσο την έκκριση των εξωσωμάτων όσο και την ενεργοποίηση της αυτοφαγίας στα κύτταρα HK{11}}, ενώ βρέθηκε σημαντική μείωση στην έκφραση του PI4P. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση του ρυθμιστικού μηχανισμού εξωσώματος-αυτοφαγίας των PIP που εμπλέκονται στη διέγερση με υψηλή γλυκόζη.

Ως αγγελιοφόροι, τα εξωσώματα έχουν σημαντικό ρόλο στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση και στις λειτουργικές αλλαγές στην ανάπτυξη της DKD [36, 37, 38]. Επισημάναμε με φθορισμό εξωσώματα που απελευθερώθηκαν από κύτταρα HK-2 και δείξαμε την παρακρινή πρόσληψή τους από τα GMC. Σε σύγκριση με τα μητρικά τους κύτταρα, τα εξωσώματα έχουν μια ειδική σύνθεση, η οποία τα καθιστά πιο σταθερά και λειτουργικά λόγω της πλούσιας χοληστερόλης, σφιγγολιπιδίων, κορεσμένων φωσφολιπιδίων και λιπιδικών τομέων [39]. Ακόμη και μικρές αλλαγές στη λιπιδική σύνθεση μπορούν να επηρεάσουν τις ιδιότητες της μεμβράνης, έχοντας έτσι μεγάλη επίδραση στη λειτουργία της. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα TAG, PC και CL μειώθηκαν σημαντικά στα εξωσώματα σε σύγκριση με τα μητρικά κύτταρα HK-2, ενώ 13 είδη λιπιδίων συμπεριλαμβανομένων των LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16: 1, GM3 d18:1/18:1, GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:{{30}}/20:0, PC40: 6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE-20:5, CE-20:4, CE-22:6 εντοπίστηκαν μόνο σε εξωσώματα. Η εργασία που παρουσιάζεται εδώ παρέχει μια βάση για περαιτέρω ανάλυση των παρακρινών ρόλων των εξωσωμάτων που απελευθερώνονται από σωληνοειδή κύτταρα.

Σκόνη κιστάνς

συμπεράσματα

Συμπερασματικά, η μελέτη μας έδειξε τη σημασία της λιπιδομικής ανάλυσης στην παροχή νέων στόχων για τη διερεύνηση της παθογένειας της DKD. Περαιτέρω μελέτες σχετικά με τη λειτουργία των διαφορικά εκφραζόμενων λιπιδίων καθώς και οι ολοκληρωμένες μελέτες λιπιδίων σε άλλα κύτταρα στον νεφρώνα και στα εξωσώματά τους μπορεί να παρέχουν μια νέα προοπτική που θα διευκρινίσει περαιτέρω τον μηχανισμό της DKD.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Stephanie Eid, Kelli M. Sas, Steven F. Abcouwer, Eva L. Feldman, Thomas W. Gardner, Subramaniam Pennathur. et al. Νέες γνώσεις για τους μηχανισμούς των διαβητικών επιπλοκών: ο ρόλος των λιπιδίων και ο μεταβολισμός των λιπιδίων. Διαβητολογία. 2019; 62(9): 1539-49.

2. Krisztian Stadler, Ira J. Goldberg, Katalin Susztak. Η εξελισσόμενη κατανόηση της συμβολής του μεταβολισμού των λιπιδίων στη διαβητική νεφρική νόσο. Curr Diab Rep. 2015; 15(7): 40.

3. Michal Herman-Edelstein, Pnina Scherzer, Ana Tobar, Moshe Levi, Uzi Gafter. Αλλοιωμένος μεταβολισμός νεφρικών λιπιδίων και νεφρική συσσώρευση λιπιδίων στην ανθρώπινη διαβητική νεφροπάθεια. J Lipid Res. 2014; 55(3): 561-72.

4. G Michelle Ducasa, Alla Mitrofanova, Alessia Fornoni. Διαφωνία μεταξύ λιπιδίων και μιτοχονδρίων στη διαβητική νεφρική νόσο. Curr Diabetes Rep. 2019; 19: 144.

5. Kerri J. Grove, Paul A. Voziyan, Jeffrey M. Spraggins, Suwan Wang, Paisit Paueksakon, Raymond C. Harris. et al. Η διαβητική νεφροπάθεια προκαλεί αλλοιώσεις στο προφίλ των σπειραμάτων και των σωληναριακών λιπιδίων. J Lipid Res. 2014; 55(7): 1375-85.

6. Kelli M. Sas, Jiahe Lin, Thekkelnaycke M. Rajendiran, Tanu Soni, Viji Nair, Lucy M. Hinder. et al. Κοινές και διακριτές αλληλεπιδράσεις λιπιδίου-λιπιδίου στο πλάσμα και τους προσβεβλημένους ιστούς σε ένα μοντέλο διαβητικού ποντικού. J Lipid Res. 2018; 59(2): 173-83.

7. Joseph V. Bonventre. Μπορούμε να στοχεύσουμε τη σωληναριακή βλάβη για να αποτρέψουμε την πτώση της νεφρικής λειτουργίας στον διαβήτη; Semin Nephrol. 2012; 32(5): 452-62.

8. Bi-Cheng Liu, Tao-Tao Tang, Lin-Li Lv, Hui-Yao Lan. Τραυματισμός νεφρικού σωληνίσκου: κινητήρια δύναμη προς τη χρόνια νεφρική νόσο. Kidney International. 2018; 93(3): 568-79.

9. Nina Pettersen Hessvik, Alicia Llorente. Σύγχρονες γνώσεις για τη βιογένεση και την απελευθέρωση των εξωσωμάτων. Cell ΜοΙ Life Sci. 2018; 75(2): 193-208.

10. Leila Salimi, Ali Akbari, Nassrollah Jabbari, Behnam Mojarad, Ali Vahhabi, Sławomir Szafert. et al. Συνέργειες σε εξωσώματα και μονοπάτια αυτοφαγίας για κυτταρική ομοιόσταση και μετάσταση κυττάρων όγκου. Cell Biosci. 2020; 10: 64.

11. Suresh Mathivanan, Hong Ji, Richard J. Simpson. Εξωσώματα: εξωκυτταρικά οργανίδια σημαντικά στη διακυτταρική επικοινωνία. J Proteomics. 2010; 73(10): 1907-20.

12. Maja Kosanović, Alicia Llorente, Sofija Glamočlija, José M. Valdivielso, Milica Bozic. Εξωκυτταρικά κυστίδια και νεφρική ίνωση: μια οδύσσεια προς μια νέα θεραπευτική προσέγγιση. Int J Mol Sci. 2021; 22(8): 3887.

13. Lin-Li Lv, Ye Feng, Min Wu, Bin Wang, Zuo-Lin Li, Xin Zhong. et al. Το εξωσωματικό miRNA-19b-3p των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων προάγει την ενεργοποίηση των μακροφάγων Μ1 σε νεφρική βλάβη. Διαφέρει ο κυτταρικός θάνατος. 2020; 27(1): 210-26.

14. Raghu Kalluri, Valerie S. LeBleu. Η βιολογία, η λειτουργία και οι βιοϊατρικές εφαρμογές των εξωσωμάτων. Επιστήμη. 2020; 367(6478): eaau6977.

15. Jieli Lu, Sin Man Lam, Qin Wan, Lixin Shi, Yanan Huo, Lulu Chen. et al. Τα στοχευμένα λιπιδομικά υψηλής κάλυψης αποκαλύπτουν νέους προγνωστικούς παράγοντες λιπιδίων ορού και απορρύθμιση της λιπιδικής οδού που προηγούνται της εμφάνισης διαβήτη τύπου 2 σε ενήλικες με νορμογλυκαιμία Κινέζους. Φροντίδα Διαβήτη. 2019; 42(11): 2117-26.

16. Sin Man Lam, Raoxu Wang, Huan Miao, Bowen Li, Guanghou Shui. Μια ολοκληρωμένη μέθοδος για την άμεση εξέταση της ομοιόστασης των σφιγγολιπιδίων στην καρδιά και τους εγκεφαλικούς ιστούς των ποντικών μέσω της μεταγεννητικής ανάπτυξης έως την αναπαραγωγική γήρανση. Anal Chim Acta. 2018; 1037: 152-58.

17. Sin Man Lam, Zehua Wang, Jie Li, Xun Huang, Guanghou Shui. Η δέσμευση πολυακόρεστων λιπαρών οξέων σε μεμβρανικά φωσφολιπίδια της προνύμφης Caenorhabditis elegans dauer εξασθενεί τη βιοσύνθεση εικοσανοειδών για παρατεταμένη επιβίωση. Redox Biol. 2017; 12: 967-77.

18. Masako Nishikawa, Makoto Kurano, Takahiro Nitta, Hirotaka Kanoh, Jin-ichi Inokuchi, Yutaka Yatomi. Τα επίπεδα GM3(d18:1-16:0) και GM3(d18:1-24:1) στον ορό μπορεί να σχετίζονται με λέμφωμα: Μια διερευνητική μελέτη με αιματολογικές ασθένειες. Sci Rep. 2019; 9: 6308.

19. Takashige Sato, Yutaka Nihei, Masakazu Nagafuku, Seiichi Tagami, Rina Chin, Mitsunobu Kawamura. et al. Κυκλοφορούντα επίπεδα γαγγλιοσίδης GM3 στο μεταβολικό σύνδρομο: Πιλοτική μελέτη. Obes Res Clin Pract. 2008; 2(4): 231-38.

20. Biyu Hou, Ping He, Peng Ma, Xinyu Yang, Chunyang Xu, Sin Man Lam. et al. Ολοκληρωμένο προφίλ λιπιδίου του νεφρού σε διαβητική νεφροπάθεια πρώιμου σταδίου. Μπροστινή Ενδοκρινόλη (Λωζάνη). 2020; 11: 359.

21. Anela Novak, Nikolina Režić Mužinić, Vedrana Cikeš Čulić, Joško Božić, Tina Tičinović Kurir, Lejla Ferhatovic. et al. Νεφρική κατανομή της γαγγλιοσίδης GM3 σε μοντέλα αρουραίων διαβήτη τύπου 1 και 2. J Physiol Biochem. 2013; 69: 727-35.

22. Dong Hoon Kwak, Young Il Rho, Oh Deog Kwon, Seon Ho Ahan, Ju Hung Song, Young Kug Choo. et al. Μειώσεις της γαγγλιοσίδης GM3 σε διαβητικά σπειράματα αρουραίων που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη. Life Sci. 2003; 72(17): 1997-2006.

23. Yong Chen, Jie Qin, Zheng W. Chen. Το τοπογραφικό NSOM με φθορισμό απεικονίζει άμεσα τις πολικότητες κορυφής-κοιλάδας σχεδίων GM1/GM3 στις διακυμάνσεις της κυτταρικής μεμβράνης. J Lipid Res. 2008; 49(10): 2268-75.

24. Pia Welker, Alexandra Böhlick, Kerim Mutig, Michele Salanova, Thomas Kahl, Hartmut Schlüter. et al. Η δραστηριότητα συμμεταφορέα του νεφρικού Na συν -Κ συν -Cl- - και η επαγόμενη από αγγειοπιεσίνη διακίνηση εξαρτώνται από τα λιπίδια. Am J Physiol Renal Physiol. 2008; 295(3): F789-F802.

25. Sangeeta Kumari, Ajeet Singh. Η εξωσωματική λιπιδομική των ούρων αποκαλύπτει δείκτες για τη διαβητική νεφροπάθεια. Τρέχουσα Μεταβολομική. 2018; 6: 131-39.

26. Alexander V. Panov, Sergey I. Dikalov. Καρδιολιπίνη, ρίζες ανά υδροξυλίου και υπεροξείδωση λιπιδίων σε μιτοχονδριακές δυσλειτουργίες και γήρανση. Oxid Med Cell Longev. 2020; 2020: 1323028.

27. Giuseppe Paradies, Valeria Paradies, Francesca M. Ruggiero, Giuseppe Petrosillo. Ο ρόλος της καρδιολιπίνης στη μιτοχονδριακή λειτουργία και δυναμική στην υγεία και την ασθένεια: μοριακές και φαρμακολογικές πτυχές. Κύτταρα. 2019; 8(7): 728.

28. Edgard M Mejia, Hieu Nguyen, Grant M Hatch. Βιοσύνθεση καρδιολιπίνης θηλαστικών. Chem Phys Lipids. 2014; 179: 11-6.

29. G. Michelle Ducasa, Alla Mitrofanova, Shamroop K. Mallela, Xiaochen Liu, Judith Molina, Alexis Sloan. et al. Η ανεπάρκεια Α1 κασέτας δέσμευσης ATP προκαλεί μιτοχονδριακή δυσλειτουργία που οφείλεται στις καρδιολιπίνες στα ποδοκύτταρα. J Clin Invest. 2019; 129(8): 3387–400.

30. Alejandra Guillermina Miranda-Díaz, Ernesto Germán Cardona-Muñoz, Fermín Paul Pacheco-Moisés. Ο ρόλος της καρδιολιπίνης και της μιτοχονδριακής βλάβης στη μεταμόσχευση νεφρού. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 3836186.

31. Guanshi Zhang, Jialing Zhang, Rachel J. DeHoog, Subramaniam Pennathur, Christopher R. Anderton, Manjeri A. Venkatachalam. et al. Το DESI-MSI και το METASPACE υποδεικνύουν ανωμαλίες λιπιδίων και αλλοιωμένα συστατικά της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε διαβητικούς νεφρικούς εγγύς σωληνίσκους. Μεταβολομική. 2020; 16(1): 11.

32. Johan-Owen De Craene, Dimitri L. Bertazzi, Séverine Bär, Sylvie Friant. Οι φωσφοϊνοσιτίδες είναι κύριοι παράγοντες στη διακίνηση μεμβρανών και στις οδούς σηματοδότησης λιπιδίων. Int J Mol Sci. 2017; 18(3): 634.

33. Kay O. Schink, Kia-Wee Tan, Harald Stenmark. Οι φωσφοϊνοσιτίδες στον έλεγχο της δυναμικής της μεμβράνης. Annu Rev Cell Dev Biol. 2016; 32: 143-71.

34. Tore Skotland, Nina P. Hessvik, Kirsten Sandvig, Alicia Llorente. Σύνθεση εξωσωματικών λιπιδίων και ο ρόλος των αιθερικών λιπιδίων και των φωσφοϊνοσιτιδίων στη βιολογία των εξωσωμάτων. J Lipid Res. 2019; 60(1): 9-18.

35. Nina Pettersen Hessvik, Anders Øverbye, Andreas Brech, Maria Lyngaas Torgersen, Ida Seim Jakobsen, Kirsten Sandvig. et al. Η αναστολή του PIKfyve αυξάνει την απελευθέρωση των εξωσωμάτων και προκαλεί εκκριτική αυτοφαγία. Cell ΜοΙ Life Sci. 2016; 73: 4717-37.

36. Margherita AC Pomatto, Chiara Gai, Benedetta Bussolati, Giovanni Camussi. Εξωκυτταρικά κυστίδια στην παθοφυσιολογία των νεφρών. Εμπρός Mol Biosci. 2017; 4: 37.

37. Xiaoming Wu, Yanbin Gao, Liping Xu, Wanyu Dang, Huimin Yan, Dawei Zou. et al. Εξωσώματα από σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με υψηλή γλυκόζη πυροδοτούν την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση και δυσλειτουργία των ποδοκυττάρων. Sci Rep. 2017; 7: 9371.

38. Xiao-ming Wu, Yan-bin Gao, Fang-qiang Cui, Na Zhang. Εξωσώματα από σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με υψηλή γλυκόζη ενεργοποιούν τα μεσαγγειακά κύτταρα για την προώθηση της νεφρικής ίνωσης. Biol Open. 2016; 5(4): 484-91.

39. Tore Skotland, Kirsten Sandvig, Alicia Llorente. Λιπίδια σε εξωσώματα: Η τρέχουσα γνώση και η πορεία προς τα εμπρός. Prog Lipid Res. 2017; 66: 30-41.

Weidong Wang, Tingting Li, Zhijie Li, Hongmiao Wang, Xiaodan Liu

Τμήμα Νεφρολογίας, The First Affiliated Hospital of China Medical University, 155 North Nanjing Street, Shenyang, Liaoning, PR China, 110001