Οι διχοτομικές αποκρίσεις στη χρόνια εμβρυϊκή υποξία οδηγούν σε έναν προκαθορισμένο φαινότυπο γήρανσης Ⅱ
Nov 29, 2023
Υποξικά
Εμβρυϊκά Νεφρά
Εμφάνιση προφίλ έκφρασης απορυθμισμένης πρωτεΐνης Για να διαλευκανθούν οι μοριακές οδοί που βρίσκονται κάτω από την υποξία IUGR, πρόσφατα απομονωμένοι νεφροί από υποξικά ή φυσιολογικά έμβρυα E18.5 υποβλήθηκαν σε προφίλ πρωτεϊνών από κάτω προς τα πάνω χρησιμοποιώντας ένα σύστημα νανο-LC (Dionex UltiMate 3{{9 }}00 RSLC) συζευγμένο με ένα φασματόμετρο μάζας τροχιακού υψηλής ανάλυσης (Thermo QExactive). Η ανάλυση του κύριου συστατικού έδειξε εντυπωσιακές διαφορές μεταξύ των υποξικών και των νορμοξικών νεφρών (Εικ. 2Α). Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 6307 πρωτεΐνες (FDR < 0,01, συμπληρωματικός Πίνακας S2) από τις οποίες οι 436 απορυθμίστηκαν σημαντικά (FDR < 0,05). 284 με αυξημένη αφθονία και 152 με μειωμένη αφθονία. Η ομαδοποίηση λειτουργικών σχολιασμών με τη χρήση γονιδιακής οντολογίας (18-20) αποκάλυψε εμπλουτισμό συγκεκριμένων μιτοχονδριακών, λυσοσωμικών, δεσμευτικών πρωτεϊνών RNA και DNA, καθώς και πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε συγκεκριμένες μεταβολικές διεργασίες ή έμφυτες ανοσοαποκρίσεις (Εικ. 2, B-D) . Κατηγοριοποιήσαμε αυτές τις πρωτεΐνες σε σχέση με (1) σχηματισμό νεφρώνων, (2) μεταβολική προσαρμογή και (3) επιταχυνόμενη γήρανση, όπως παρουσιάζεται και συζητείται στις ακόλουθες παραγράφους.
Η κατασταλμένη αντιγραφή DNA και η πρωτεϊνοσύνθεση συμβάλλουν στον περιορισμένο σχηματισμό νέων νεφρώνων στη χρόνια υποξία
Ανεπιθύμητες ενέργειες κατά την ανάπτυξη, όπως η χρόνια εμβρυϊκή υποξία, έχουν συχνά αποδειχθεί ότι σχετίζονται με μειωμένο αριθμό νεφρώνων (27, 29-32). Ωστόσο, ένας υποκείμενος μηχανισμός που εξηγεί πειστικά αυτό το εύρημα σπάνια θα μπορούσε να αποδειχθεί. Η ομαδοποίηση και των 64 απορυθμισμένων πρωτεϊνών που ανήκουν στους όρους GO "DNA-binding" και "RNA-binding" (ένας θερμικός χάρτης φαίνεται στο συμπληρωματικό Σχήμα S2) χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων STRING (22) αποκάλυψε πολλαπλά υποδίκτυα, όπως επιδιόρθωση DNA, αντιγραφή DNA, Συναρμογή mRNA και ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Εικ. 3Α). Μια πιο ολοκληρωμένη λίστα εμπλουτισμένων διεργασιών ή μονοπατιών φαίνεται στο Σχήμα 3Β (FDR < 0.05). Από αυτά τα "ριβόσωμα" και η "αντιγραφή DNA" ήταν μεταξύ των κορυφαίων όρων καταπιεσμένων πρωτεϊνών, ενώ το μάτισμα του mRNA και η "αποδόμηση RNA" ήταν μεταξύ των κορυφαίων όρων των επαγόμενων πρωτεϊνών. Οι διαδικασίες επιδιόρθωσης του DNA έδειξαν ένα διμερές πρότυπο έκφρασης. Εδώ, οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην εκτομή νουκλεοτιδίων ή στην επιδιόρθωση της αναντιστοιχίας καταστέλλονταν, αλλά προκλήθηκαν εκείνες που μεσολαβούσαν στην "επισκευή εκτομής βάσης". Επιπλέον, το επίπεδο αφθονίας του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p27Kip1 ήταν διπλάσιο (Εικ. 3C) και αυτό του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 ήταν 3.{18}}φορές μειωμένο (Εικ. 3D), το οποίο μαζί υποδηλώνει επιβράδυνση του κυττάρου διαδικασία διαίρεσης. Συγκεκριμένα, το επίπεδο έκφρασης mRNA του Mki67, του γονιδίου που κωδικοποιεί για το Ki67, καταστέλλεται σημαντικά σε πρωτεύοντα εγγύς σωληναριακά κύτταρα ποντικού που καλλιεργήθηκαν υπό υποξικές συνθήκες (Εικ. 3Ε). Αυτή η καταστολή προκλήθηκε μέσω υπερμεθυλίωσης της περιοχής προαγωγέα Mki67 σε υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς (Εικ. 3F). Έτσι, στους εμβρυϊκούς υποξικούς νεφρούς, η σύνθεση DNA, η μετάφραση του mRNA και οι περισσότερες διαδικασίες επιδιόρθωσης του DNA φαίνεται να απορρίπτονται, μειώνοντας την ικανότητα των κυττάρων να αναπτύσσονται και να πολλαπλασιάζονται. Συγκεντρωτικά εδώ, για πρώτη φορά, τα δεδομένα προφίλ πρωτεϊνών παρέχουν μοριακά στοιχεία που πιθανώς εξηγούν τον μειωμένο σχηματισμό νεφρώνων.
Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα και το οξειδωτικό στρες ενεργοποιούνται σε χρόνιες υποξικές καταστάσεις
Ένας από τους πιο εμπλουτισμένους όρους που εμφανίζονται στην ανάλυση λειτουργικού σχολιασμού και των 436 πρωτεϊνών και ο κορυφαίος για τις επαγόμενες πρωτεΐνες ήταν η "αποκοκκίωση ουδετερόφιλων" (Εικ. 2, Β και Γ), υποδεικνύοντας μια συνεχιζόμενη ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος σευποξικοί εμβρυϊκοί νεφροί. Από τις 34 σχετιζόμενες πρωτεΐνες, οι 29 προκλήθηκαν και οι πέντε καταπιέστηκαν (ροζ στο Σχ. 4Α). Μεταξύ των επαγόμενων πρωτεϊνών ήταν πολλά γλυκολυτικά και σχετιζόμενα με το λυσόσωμα ένζυμα, αρκετά μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών S100A, ο ανασταλτικός παράγοντας μετανάστευσης μακροφάγων της φλεγμονώδους κυτοκίνης (MIF), καθώς και οι πρωτεύουσες και δευτερογενείς πρωτεΐνες κοκκίων ουδετερόφιλη κοκκώδης πρωτεΐνη (NGP), μυελοϋπεροξειδάση (MPO) , Καθελικιδίνη (CAMP), πρωτεΐνη αναγνώρισης πεπτιδογλυκάνης 1 (PGLYRP1) και λακτοφερρίνη (LTF). Για την επαλήθευση της αναμενόμενης εισβολής ουδετερόφιλων σε υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς και για την αποκάλυψη της θέσης τους εντός του ιστού, νεφρικές τομές χρωματίστηκαν για MPO. MPO-θετικά κύτταρα σχημάτισαν συστάδες στη νεφρογόνο ζώνη του νεφρικού φλοιού, στην εγγύτητα των αιμοφόρων αγγείων, δίπλα στο εγγύς σωληνάριο και περιστασιακά μπορούσαν να βρεθούν σε μυελικές περιοχές υποξικών δειγμάτων (Εικ. 4D και συμπληρωματικό Σχήμα S3, A -ΝΤΟ). Αντίθετα, οι νορμοξικοί εμβρυϊκοί νεφροί δεν παρουσίασαν διήθηση ή συσσώρευση ουδετερόφιλων (Εικ. 4C). Η Caveolin-1 (CAV1) αποδείχθηκε ότι ενισχύει τη διακυτταρική μετανάστευση των ανοσοκυττάρων (33). Συνεπώς, ο CAV1 προκλήθηκε σε υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς (συμπληρωματικό Σχήμα S3D), δείχνοντας ενισχυμένη χρώση των νεφρικών αιμοφόρων αγγείων συμπεριλαμβανομένων εκείνων που διασχίζουν τη φλοιώδη περιοχή του εμβρυϊκού νεφρού (Εικ. 4, Ε και ΣΤ). Η αποκοκκίωση των ουδετερόφιλων παράγει μια τοπική έκρηξη αντιδραστικών ειδών οξυγόνου που οδηγεί σε αυξημένο οξειδωτικό στρες και βλάβη των ιστών, συμπεριλαμβανομένης της οξείδωσης του DNA. Ένας σημαντικός δείκτης οξείδωσης του DNA είναι η 8-υδροξυ-2′-δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG), η οποία ενισχύθηκε στα εγγύς σωληνάρια και στη νεφρογόνο ζώνη των υποξικών εμβρυϊκών νεφρών (Εικ. 4, G και H), κοντά στην ομαδοποίηση ουδετερόφιλων. Αυτή η αύξηση στο 8-ΟΗdG κατεστραμμένο DNA συνέβη παρά την ταυτόχρονη επαγωγή των MGMT και OGG1 (Εικ. 4, I και J), δύο ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την απομάκρυνση του 8-OHdG. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μια συνεχή ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος στον αναπτυσσόμενο νεφρό, το οποίο προκαλεί ακόμη μεγαλύτερη βλάβη στους ιστούς εκτός από το υποξικό στρες. Μαζί με την αναποτελεσματική αποκατάσταση αυτών των ιστικών βλαβών, μπορεί να ξεκινήσει ένας φαύλος κύκλος που εξασθενεί περαιτέρω τη νεφρογένεση.
ΣΥΚΟ. 2. Το πρωτεομικό προφίλ αποκαλύπτει πολλαπλές αλλαγές που σχετίζονται με την υποξία. Α, η ανάλυση του κύριου συστατικού των πρωτεομικών δεδομένων έδειξε έναν σαφή διαχωρισμό μεταξύ νορμοξικών και υποξικών εμβρυϊκών νεφρών. B–D, ομαδοποίηση λειτουργικών σχολιασμών όλων των σημαντικά απορυθμισμένων πρωτεϊνών (Β), επαγόμενων πρωτεϊνών (C) και μειωμένων πρωτεϊνών (D) Το σημαντικά αλλαγμένο κλάσμα μιας οδού (άξονας x) σχεδιάζεται σε συνάρτηση με τη σημασία του εμπλουτισμού (y- άξονας). Το μέγεθος κάθε σημείου κωδικοποιεί τον συνολικό αριθμό των μελών σε αυτό το μονοπάτι. Οι επαγόμενες πρωτεΐνες έδειξαν εμπλουτισμό μεταβολικών διεργασιών (γλυκόλυση), μιτοχονδριακών ή λυσοσωμικών πρωτεϊνών και πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος (αποκοκκίωση ουδετερόφιλων), ενώ οι μειωμένες πρωτεΐνες εμπλουτίζονται για μονοπάτια δέσμευσης DNA και RNA (δομικό συστατικό του ριβοσώματος).
(PGLYRP1) και λακτοφερρίνη (LTF). Για την επαλήθευση της αναμενόμενης εισβολής ουδετερόφιλων σε υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς και για την αποκάλυψη της θέσης τους εντός του ιστού, νεφρικές τομές χρωματίστηκαν για MPO. MPO-θετικά κύτταρα σχημάτισαν συστάδες στη νεφρογόνο ζώνη του νεφρικού φλοιού, στην εγγύτητα των αιμοφόρων αγγείων, δίπλα στο εγγύς σωληνάριο και περιστασιακά μπορούσαν να βρεθούν σε μυελικές περιοχές υποξικών δειγμάτων (Εικ. 4D και συμπληρωματικό Σχήμα S3, A -ΝΤΟ). Αντίθετα, οι νορμοξικοί εμβρυϊκοί νεφροί δεν παρουσίασαν διήθηση ή συσσώρευση ουδετερόφιλων (Εικ. 4C). Η Caveolin-1 (CAV1) αποδείχθηκε ότι ενισχύει τη διακυτταρική μετανάστευση των ανοσοκυττάρων (33). Συνεπώς, ο CAV1 προκλήθηκε σε υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς (συμπληρωματικό Σχήμα S3D), δείχνοντας ενισχυμένη χρώση των νεφρικών αιμοφόρων αγγείων συμπεριλαμβανομένων εκείνων που διασχίζουν τη φλοιώδη περιοχή του εμβρυϊκού νεφρού (Εικ. 4, Ε και ΣΤ). Η αποκοκκίωση των ουδετερόφιλων παράγει μια τοπική έκρηξη αντιδραστικών ειδών οξυγόνου που οδηγεί σε αυξημένο οξειδωτικό στρες και βλάβη των ιστών, συμπεριλαμβανομένης της οξείδωσης του DNA. Ένας σημαντικός δείκτης οξείδωσης του DNA είναι η 8-υδροξυ-2'-δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG), η οποία ενισχύθηκε στα εγγύς σωληνάρια και στη νεφρογόνο ζώνη των υποξικών εμβρυϊκών νεφρών (Εικ. 4, G και H), κοντά στην ομαδοποίηση ουδετερόφιλων. Αυτή η αύξηση στο 8-ΟΗdG κατεστραμμένο DNA συνέβη παρά την ταυτόχρονη επαγωγή του MGMT και του OGG1 (Εικ. 4, I και J), δύο ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την απομάκρυνση του 8-OHdG. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν μια συνεχή ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος στον αναπτυσσόμενο νεφρό, το οποίο προκαλεί ακόμη μεγαλύτερη βλάβη στους ιστούς εκτός από το υποξικό στρες. Μαζί με την αναποτελεσματική αποκατάσταση αυτών των ιστικών βλαβών, μπορεί να ξεκινήσει ένας φαύλος κύκλος που εξασθενεί περαιτέρω τη νεφρογένεση.
Οι μεταβολικές προσαρμογές στην υποξία έχουν ως αποτέλεσμα έντονη γλυκόλυση στον εμβρυϊκό νεφρό
Η χρόνια υποξία είναι μια σοβαρή κατάσταση στην οποία τα κύτταρα πρέπει να προσαρμοστούν μέσω μεταβολικών αλλαγών για να επιβιώσουν. Πρωτίστως σε αυτό είναι η διατήρηση της κυτταρικής παραγωγής ΑΤΡ που ελλείψει επαρκούς οξυγόνωσης απαιτεί μια μετατόπιση από την οξειδωτική φωσφορυλίωση στη γλυκόλυση. Από όλους τους όρους που προέκυψαν από τον λειτουργικό σχολιασμό, η "γλυκολυτική διεργασία" ήταν ο πιο σημαντικός (Εικ. 2Β). Και τα δέκα ένζυμα (κόκκινο ①–⑩ στο Σχ. 5Α) που απαιτούνται για τη μετατροπή της γλυκόζης σε πυροσταφυλικό προκλήθηκαν σεεμβρυϊκοί υποξικοί νεφροίσε σύγκριση με τους νορμοξικούς μάρτυρες (ένας χάρτης θερμότητας φαίνεται στο Σχ. 5Γ). Επιπλέον, οι εκφράσεις του μεταφορέα γλυκόζης 1 (SLC2A1, πορτοκαλί στο Σχήμα 4Α) και της γαλακτικής αφυδρογονάσης Α (LDHA, σκούρο κόκκινο στο Σχήμα 5Α) ενισχύθηκαν επίσης, γεγονός που θα διευκολύνει την αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης στο κύτταρο και την αυξημένη μείωση της πυροσταφυλικό προς γαλακτικό, αντίστοιχα. Η εναλλακτική χρήση του πυροσταφυλικού στον κύκλο του κιτρικού οξέος φάνηκε να παρεμποδίζεται (1) από την ενισχυμένη έκφραση της πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης κινάσης 1 (PDK1, σκούρο κόκκινο στο Σχ. 5Α), η οποία απενεργοποιεί το σύμπλεγμα πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης στα μιτοχόνδρια και επομένως την οξείδωση του πυροσταφυλικού σε ακετυλο-CoA; και (2) με μειωμένα επίπεδα πυροσταφυλικής καρβοξυλάσης (PC), η οποία καταλύει τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε οξαλοξικό. Από την άλλη πλευρά, η φρουκτόζη-1,6-διφωσφατάση 1 (FBP1, μπλε στο Σχ. 5Α) μειώθηκε, αυξάνοντας περαιτέρω τη δυνητική ροή γλυκόζης προς το πυροσταφυλικό. Όλες αυτές οι ενζυματικές αλλαγές ευνοούν την παραγωγή γαλακτικού και πράγματι, η συγκέντρωση γαλακτικού οξέος αυξήθηκε στους υποξικούς εμβρυϊκούς νεφρούς (Εικ. 5Β). Η ενισχυμένη παραγωγή γαλακτικού μπορεί να οδηγήσει σε δυσμενή οξίνιση. Ωστόσο, βρήκαμε μεταξύ των εμπλουτισμένων πρωτεϊνών τους μονοκαρβοξυλικούς μεταφορείς SLC16A3 και SLC5A8 (πορτοκαλί στο Σχ. 5Α), οι οποίοι είναι γνωστό ότι εκκρίνουν γαλακτικό στον εξωκυτταρικό χώρο για να αποφύγουν τις τοξικές επιδράσεις της κυτταροπλασματικής οξίνισης. Έτσι, το μοντέλο μας καταδεικνύει την αξιοσημείωτη ικανότητα των εμβρυϊκών νεφρών να προσαρμόζονται στη χρόνια υποξία αυξάνοντας τη γλυκολυτική δραστηριότητα,
ΣΥΚΟ. 3. Ο σχηματισμός νέων νεφρώνων στην υποξία σχετίζεται με κατασταλμένη αντιγραφή DNA και πρωτεϊνική σύνθεση. Α, το δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών σημαντικώς αλλαγμένων πρωτεϊνών που δεσμεύουν DNA και RNA που προέρχονται από τη βάση δεδομένων STRING εμφανίζει αρκετές συστάδες πρωτεϊνών: ριβοσωμικές πρωτεΐνες (μπλε), πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA (πράσινο), επιδιόρθωση DNA (μωβ) και μάτισμα mRNA ( το κόκκινο). Ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki67 (Mki67) σημειώνεται με μαύρο χρώμα, υπογραμμίζοντας τη στενή σχέση του με την επιδιόρθωση του DNA και την αντιγραφή του DNA. Β, μια επιλογή μονοπατιών σημαντικώς αλλαγμένων πρωτεϊνών δέσμευσης DNA και RNA από βάσεις δεδομένων KEGG και Reactome που εμφάνισαν τις πιο εμφανείς μεταβολές σευποξικοί νεφροί, απεικονίζεται με φθίνουσα σειρά σημασίας. Οι διεργασίες ματίσματος και αποικοδόμησης RNA εμπλουτίστηκαν (κόκκινο), ενώ οι οδοί μετάφρασης, αντιγραφής DNA και επιδιόρθωσης RNA κατεστάλησαν (μπλε). Διεργασίες μόνο με FDR<0.05 are shown. C and D, the cell cycle inhibitor p27Kip1 was enhanced (unpaired two-tailed t test, Welch's correction, p = 0.0095), whereas the expression of the proliferation marker Ki67 was reduced (unpaired two-tailed t test, Welch's correction, p = 0.0078) in hypoxic fetal kidneys. E, hypoxia reduced the mRNA expression level of Mki67 in mouse primary proximal tubular cells (unpaired two-tailed t test, p < 0.0001). F, this reduction was mediated by hypermethylation of the Mki67 promoter in hypoxic fetal kidneys. Open circle unmethylated, black circle methylated (Fisher's exact test, p = 0.0016; Mann–Whitney U-test, p = 0.0431)
ΣΥΚΟ. 4. Οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη φλεγμονώδη απόκριση και το οξειδωτικό στρες εμπλουτίζονται σε νεοσχηματιζόμενους νεφρώνες υπό υποξία. Α, απεικόνιση και των 34 σημαντικά αλλαγμένων πρωτεϊνών για τον σχολιασμό που ονομάζεται αποκοκκίωση ουδετερόφιλων (ροζ κύκλοι) μεταξύ όλων των σημαντικών (μεγαλύτεροι γκρίζοι κύκλοι) και των μη σημαντικών (μικρότεροι γκρίζοι κύκλοι) πρωτεϊνών του συνόλου δεδομένων μας. 29 είχαν υψηλότερο επίπεδο αφθονίας, ενώ πέντε μειώθηκαν. Β, ένας θερμικός χάρτης που δείχνει όλες τις ροζ πρωτεΐνες στο (Α) και την επαγωγή ή την καταστολή τους στην υποξία, που απεικονίζεται με φθίνουσα σειρά αφθονίας πρωτεΐνης. C–H, αντιπροσωπευτικές ανοσοϊστοχημικές εικόνες του E18.5 normoxic ήυποξικοί νεφροίπου δείχνει τη διείσδυση ουδετερόφιλων και το οξειδωτικό στρες. C και D, η ανοσοϊστοχημεία για τον δείκτη ουδετερόφιλων μυελοϋπεροξειδάση (MPO) αποκάλυψε συσσώρευση αυτών των κυττάρων κοντά στους νεοσχηματιζόμενους νεφρώνες (αστερίσκος) και δίπλα στα νεφρικά αιμοφόρα αγγεία (ακίδα βέλους) των υποξικών εμβρυϊκών νεφρών (D). Σε νορμοξικούς μάρτυρες (C), σπάνια υπήρχαν κύτταρα θετικά για ΜΡΟ. (Ράβδοι κλίμακας 100 μm). E και F, ανοσοϊστοχημεία που απεικονίζει ενισχυμένη έκφραση της καβεολίνης-1 (CAV1) στα νεφρικά αιμοφόρα αγγεία των υποξικών εμβρυϊκών νεφρών (F) σε σύγκριση με τους ελέγχους (Ε) (Ράβδοι κλίμακας 200 μm). G και H, 8-υδροξυ-2'-δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG), ένας δείκτης για οξειδωτική βλάβη του DNA, ενισχύθηκε σημαντικά στους νεοσχηματιζόμενους νεφρώνες (αστερίσκος) στον νεφρικό φλοιό και στο κύτταρα των εγγύς σωληναρίων (βέλος) των υποξικών νεφρών (H), ενώ μόνο λίγα κύτταρα χρωματίστηκαν σε νορμοξικό ιστό (G) (Ράβδοι κλίμακας 200 μm). I και J, αυτή η αύξηση στη βλάβη του DNA συνέβη παρά την ταυτόχρονη αύξηση της μεθυλτρανσφεράσης Ο{10}}μεθυλγουανίνης-DNA (MGMT, μη ζευγαρωμένη δοκιμή δύο ουρών, p=0.0002) (I) και {{ 15}}γλυκοζυλάση οξογουανίνης (OGG1; μη ζευγαρωμένη δοκιμή δύο ουρών t-test, p=0.0063) (J), δύο ένζυμα που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του οξειδωμένου DNA.
που εξασφαλίζει επαρκή παραγωγή ATP και επιβίωση κάτω από αυτή τη δυσμενή κατάσταση.
Η εμβρυϊκή υποξία προάγει την αντισταθμιστική εισαγωγή μιτοχονδριακών πρωτεϊνών και τη διάταξη αναπνευστικής αλυσίδας
Εκτός από την ενισχυμένη γλυκόλυση, βρήκαμε πολλαπλές αλλαγές στα επίπεδα αφθονίας μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (ένας θερμικός χάρτης φαίνεται στο συμπληρωματικό Σχήμα S4). Η δημιουργία πρωτεϊνικών δικτύων χρησιμοποιώντας το STRING αποκάλυψε αρκετές ομάδες που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μετατόπιση πρωτεϊνών σε μιτοχόνδρια, οξειδωτική φωσφορυλίωση και μιτοχονδριακές ριβοσωμικές πρωτεΐνες (Εικ. 5, D και E). Αξίζει να σημειωθεί ότι προκλήθηκαν πολλαπλές πρωτεΐνες που συνδέονται με την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, τη θέση όπου λαμβάνει χώρα η οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS). Το OXPHOS περιλαμβάνει πέντε πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα διατεταγμένα κατά μήκος της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Μεταξύ των επαγόμενων πρωτεϊνών ήταν συστατικά των συμπλεγμάτων OXPHOS (NDUSF6), III (UQCR10), IV (COX6B1, COXC και COX7A2) και V (ATP5J, MTATP8), αλλά και UQCC3 και SCO2, τα οποία απαιτούνται για τη σωστή συναρμολόγηση και λειτουργία συμπλόκου και IV, αντίστοιχα (Εικ. 5D και συμπληρωματικό Σχ. S4). Οι SDHC και SDHD, υπομονάδες του μιγαδικού ll, ήταν επίσης ρυθμισμένες (1.{15}} και 2.{17}}φορές, αντίστοιχα), αλλά δεν έφτασαν τη στατιστική σημασία. Επιπλέον, όχι μόνο συστατικά της αναπνευστικής αλυσίδας εμπλουτίστηκαν στο έμβρυουποξικοί νεφροί, αλλά και πλήθος πρωτεϊνών που μεσολαβούν στην εισαγωγή τους στα μιτοχόνδρια. Αυτό περιελάμβανε μέλη της εξωτερικής μεμβράνης translocase (TOM - TOMM22) και του συμπλέγματος translocase εσωτερικής μεμβράνης TIM22 (TIMM22, TIMM9 και TIMM10 και του συσχετισμένου συμπλέγματος TIMM8-TIMM13- (Εικ. 5D και συμπληρωματικό Σχήμα Μεταξύ των 21 μιτοχονδριακών πρωτεϊνών με μειωμένη αφθονία ήταν τέσσερις μιτοχονδριακές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, καθώς και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον καταβολισμό αμινοξέων, στη βιοσύνθεση βιταμινών ή στη βήτα-οξείδωση λιπαρών οξέων (Εικ. 5, D και E, και συμπληρωματικό Σχήμα. S4) Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν πιθανή μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και προφανείς προσπάθειες για την αναγέννηση κατεστραμμένων πρωτεϊνών (34), παρά την ενισχυμένη γλυκόλυση και τη συνολική μειωμένη πρωτεϊνοσύνθεση.
Η λυσοσωμική βιογένεση και η αυτοφαγία ενισχύονται σεΥποξικοί εμβρυϊκοί νεφροίΤο λυσόσωμα ήταν το δεύτερο οργανίδιο που φαίνεται να εμπλουτίζεται υπό συνθήκες υποξίας. Ωστόσο, σε σύγκριση με τα μιτοχόνδρια, όπου το 36% των πρωτεϊνών ήταν μειωμένα, σχεδόν όλες οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το λυσόσωμα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Εικ. 6, Α και Β). Μεταξύ αυτών ήταν εννέα υδρολάσες λυσοσωμικού οξέος, που αντιπροσωπεύουν σχεδόν το 20% των υδρολασών λυσοσωμικού οξέος που σχολιάζονται στο μονοπάτι KEGG για τα λυσοσώματα: τέσσερις πρωτεϊσόνες (CTSA, CTSF, CTSZ, TPP1), τρεις γλυκοσιδάσες (GAA, NAGA, NEU1U1), όξινη φωσφατάση 2 (ACP2), και η λυσοσωμική όξινη λιπάση Α (LIPA). Επιπλέον, βρήκαμε στοιχεία για αυξημένη βιογένεση λυσοσωμάτων και σχετικών οργανιδίων. Τρία από τα οκτώ συστατικά του BLOC1 (βιογένεση των οργανιδίων που σχετίζονται με το λυσόσωμα σύμπλεγμα 1) προκλήθηκαν σημαντικά (Εικ. 6, C–E), καθώς και ο μεταφορέας ανταλλαγής H/Cl 5 (CLCN5), ο οποίος είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην οξίνιση των ενδοσωμάτων (Εικ. 6F). Αξίζει να σημειωθεί ότι το Snapin (BLOC1 υπομονάδα 7) παίζει επίσης ρόλο στην οξίνιση των λυσοσωμάτων και στην ωρίμανση και λειτουργία του αυτοφαγοσώματος. Άλλες επαγόμενες πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στην αυτοφαγία ήταν οι Atg7 και Bnip3 (Εικ. 6, G και H). Μια άλλη απαίτηση για αυτοφαγική ροή είναι η περιπυρηνική ομαδοποίηση των λυσοσωμάτων, με τη μεσολάβηση του συμπλέγματος λυσοσωμικού Ρυθμιστή (35, 36) και δύο αντίθετων οικογενειών κινητήρων πρωτεϊνών. Εντυπωσιακά, τέσσερα από τα πέντε μέλη των υπομονάδων σκαλωσιάς του Ρυθμιστή (LAMTOR1, 2, 3 και 5) προκλήθηκαν σημαντικά (Εικ. 6, Α και Β). Το LAMTOR4 προκλήθηκε επίσης κατά 1.{29}}φορές, αλλά δεν είχε στατιστική σημασία. Επιπλέον, οι κινεσίνες, οι οποίες μεσολαβούν στην κίνηση των οργανιδίων προς τα έξω, έδειξαν μια τάση καταστολής, ενώ τα μέλη της οικογένειας dynein που διευκολύνουν την κίνηση προς τα μέσα προκλήθηκαν, αν και όχι στατιστικά σημαντικά (συμπληρωματικό Σχ. S5). Συλλογικά αυτά τα ευρήματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η οικιακή λειτουργία των λυσοσωμάτων ενισχύεται σεεμβρυϊκοί υποξικοί νεφροί, πλήρως συμβατό με την αναμενόμενη ανάγκη για ανανέωση κατεστραμμένων μιτοχονδρίων.
Πρόωρος
Η γήρανση αποτελεί παράδειγμα των πτυχών της υποξικής προσαρμογής που αντιμετωπίζει ο Ιανός Σε αντίθεση με τους αντισταθμιστικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης και αναζωογόνησης, βρήκαμε 15 από τις απορυθμισμένες πρωτεΐνες που ανήκουν στον όρο GO "Γήρανση" (Εικ. 7Α), που αντιπροσωπεύουν την τρίτη κατηγορία υποξικών προσαρμογών: επιταχυνόμενη γήρανση . Ενώ οι περισσότερες από αυτές τις πρωτεΐνες παίζουν ρόλο σε μια από τις διαδικασίες που περιγράφηκαν παραπάνω αποκοκκίωση ουδετερόφιλων και λυσοσώματα (MIF, MPO, PSEN1), μιτοχόνδρια (NDUFS6, FADS1, MTCO1, CYP27B1), γλυκόλυση (ALDOC) και επιδιόρθωση DNA (OGG1) ; Ορισμένα έχουν περιγραφεί ότι επηρεάζουν άμεσα τη διάρκεια ζωής των ποντικών. Συγκεκριμένα, η αφθονία πρωτεϊνών τόσο της klotho όσο και της sirtuin 6 μειώθηκε στην υποξική E18.5εμβρυϊκά νεφρά(Εικ. 7, Β και Γ). Το Sirtuin 6 είναι ένα ένζυμο που εκφράζεται παντού με δραστηριότητα πρωτεϊνικής αποακετυλάσης και μονο-ADP ριβοσυλ τρανσφεράσης που εμπλέκονται στη ρύθμιση αρκετών κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής, της γλυκόλυσης και της επιδιόρθωσης του DNA. Το νοκ-άουτ του οδηγεί σε σοβαρή προγηρία σε ποντίκια με μειωμένη διάρκεια ζωής από 1 έως 3 μήνες (37, 38). Ο νεφρός είναι η κύρια θέση σύνθεσης klotho (δηλαδή, το περιφερικό σωληνάριο - το DCT συνεισφέρει στην πλειονότητα της πρωτεΐνης με πρόσθετη σύνθεση στα εγγύς σπειροειδή σωληνάρια), όπου δρα τοπικά ως βήτα-γλυκουρονιδάση που συνδέεται με τη μεμβράνη. Η μειωμένη αφθονία του klotho φαίνεται να είναι μια συγκεκριμένη διαδικασία αφού άλλες πρωτεΐνες του DCT συμπεριλαμβανομένου του CALB1 δεν αλλοιώθηκαν. Το Klotho εκκρίνεται επίσης στην κυκλοφορία είτε με διάσπαση του εξωκυτταρικού τμήματος της συνδεδεμένης με μεμβράνη μορφής είτε με μετάφραση μιας εναλλακτικής παραλλαγής ματίσματος. Το επίπεδο της κυκλοφορούσας klotho (sKL) μειώνεται με την ηλικία (39, 40), γεγονός που μας ώθησε να αξιολογήσουμε τη συγκέντρωσή της και αυτή της sirtuin 6 στο αίμα του κορμού υποξικών ή νορμοξικών εμβρύων E18.5. Πράγματι, οι συγκεντρώσεις του sKL και της sirtuin 6 μειώθηκαν σημαντικά σε υποξικά έμβρυα E18.5 (Εικ. 7, D και E). Επιπλέον και είναι σημαντικό, τα επίπεδα του klotho και της sirtuin 6 στον ορό ήταν επίσης σημαντικά μειωμένα σε ηλικιωμένα ποντίκια (Εικ. 7, F και G), υποδεικνύοντας μια μόνιμη μείωση αυτών των δύο πρωτεϊνών καθ 'όλη τη διάρκεια της ζωής. Για το Klotho, αυτό φαίνεται να οφείλεται σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης mRNA στους νεφρούς 15-μηνών υποξικών απογόνων (Εικ. 7Η). Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης νεφρικού mRNA της σιρτουΐνης 6 παρέμειναν αμετάβλητα μεταξύ ηλικιωμένων νορμοξικών και υποξικών ποντικών (Εικ. 7Ι). Επιπλέον, οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA έχουν αποδειχθεί ότι είναι ένας από τους πιο σημαντικούς μηχανισμούς όχι μόνο για την ανανέωση και τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων του νεφρώνα (41), αλλά και για την έκφραση του klotho (42, 43). Ωστόσο, σε αντίθεση με την υπερμεθυλίωση του Mki67 (Εικ. 3F), ο προαγωγέας klotho υπομεθυλιώθηκε κατά τη διάρκεια χρόνιας υποξίας (συμπληρωματικό Σχήμα S6). Το σχέδιο μεθυλίωσης του Sirt6 δεν ήταν δυνατό να προσδιοριστεί. Από όσο γνωρίζουμε, το μοντέλο IUGR είναι το πρώτο που σκιαγραφεί έναν μηχανισμό που οδηγεί σε φαινότυπο πρόωρης γήρανσης, μέσω συνέργειας φλεγμονωδών βλαβών, αναποτελεσματικής επισκευής, αλλοιωμένου μεταβολισμού και μειωμένης αφθονίας πρωτεϊνών κατά της γήρανσης που λαμβάνει χώρα ήδη κατά τη γέννηση.
Η μείωση των πρωτεϊνών κατά της γήρανσης ως απάντηση στη χρόνια υποξία διατηρείται μεταξύ ποντικών και ανδρών Σε μια τελευταία σειρά πειραμάτων, ρωτήσαμε εάν η αλληλεπίδραση μεταξύ της χρόνιας υποξίας και των μειωμένων επιπέδων αντιγηραντικών πρωτεϊνών στον ορό είναι ένα εξελικτικά διατηρημένο φαινόμενο. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα ορού από μια ελεγχόμενη μελέτη (10) εννέα υγιών εθελοντών (οκτώ άρρενες, μία γυναίκα) 2 εβδομάδες πριν (στάθμη της θάλασσας, SL), σε τρία σημεία κατά τη διάρκεια μιας αδιάκοπης 28-ημέρας Η παραμονή στα 3454 m (μεγάλο υψόμετρο, HA3, HA9, HA28) και 1, 7 και 14 ημέρες μετά την επιστροφή τους στο SL (RSL1, RSL7, RSL14) αναλύθηκαν για sKL και SIRT6 (Εικ. 8). Τα δείγματα που ελήφθησαν στο SL χρησίμευσαν ως έλεγχοι για κάθε συμμετέχοντα. Τα επίπεδα ορού sKL και SIRT6 μειώθηκαν σε μεγάλα υψόμετρα και και τα δύο έφτασαν σε στατιστική συνάφεια στο H28. Μετά την επιστροφή στο επίπεδο της θάλασσας, το sKL αυξήθηκε σε επίπεδα υψηλότερα από ό,τι πριν από την παραμονή σε μεγάλο υψόμετρο στο RSL7 και επέστρεψε στο φυσιολογικό στο RSL14 (Εικ. 8Α). Από την άλλη πλευρά, το SIRT6 συνέχισε να μειώνεται κατά την επιστροφή στο επίπεδο της θάλασσας και άρχισε να κλίνει ξανά στο RSL14 (Εικ. 8Β), υποδηλώνοντας διαφορική ρύθμιση αυτών των δύο πρωτεϊνών κατά της γήρανσης. Συνοπτικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα μειωμένα επίπεδα klotho και sirtuin 6 στον ορό μπορεί γενικά να απαιτούν έκθεση σε χρόνιες υποξικές καταστάσεις και μπορεί επομένως να αντιπροσωπεύουν μια εξελικτική διαδικασία εξαιρετικά συντηρημένη.
Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:
Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
