Μια νέα ομόζυγη μετάλλαξη KLHL3 ως αιτία αυτοσωμικού υπολειπόμενου ψευδουποαλδοστερονισμού Τύπου ΙΙ που διαγνώστηκε αργά στη ζωή
Nov 02, 2023
Περίληψη Εισαγωγή:
Ο ψευδουποαλδοστερονισμός τύπου II (PHA II) είναι μια μεντελιανή διαταραχή, που χαρακτηρίζεται από υπερκαλιαιμική οξέωση και χαμηλά επίπεδα ρενίνης στο πλάσμα, που συνήθως σχετίζονται με υπέρταση. Οι μεταλλάξεις στα WNK1, WNK4, CUL3 και KLHL3 προκαλούν PHA II, με κυρίαρχες μεταλλάξεις στα WNK1, WNK4 και CUL3 και είτε κυρίαρχες είτε υπολειπόμενες μεταλλάξεις στο KLHL3. Έχουν αναφερθεί δεκατέσσερις οικογένειες με υπολειπόμενες μεταλλάξεις KLHL3, με διάγνωση σε ηλικία 3 μηνών έως 56 ετών, τυπικά σε άτομα με φυσιολογική νεφρική λειτουργία.
Μέθοδοι: Πραγματοποιήσαμε κλινικές και γενετικές έρευνες σε ασθενή με υπερκαλιαιμική υπέρταση και χρησιμοποιήσαμε προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής, ετερόλογη έκφραση σε κύτταρα COS7 και Western blotting για να διερευνήσουμε την επίδραση μιας μετάλλαξης υποψήφιας νόσου KLHL3 στην έκφραση της πρωτεΐνης WNK4.
ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΛΑΒΕΤΕ ΦΥΤΙΚΟ ΣΥΝΘΕΣΗ CISTANCHE ΓΙΑ ΤΑ ΝΕΦΡΑ
Αποτελέσματα: Η ασθενής, μια 58-χρονη γυναίκα από συγγενική οικογένεια, εμφάνισε υπέρταση, επίμονη υπερκαλιαιμική οξέωση που σχετίζεται με έντονο μυϊκό πόνο, νεφρολιθίαση, χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ) και στεφανιαία νόσο. Η θεραπεία με υδροχλωροθειαζίδη διόρθωσε την υπερκαλιαιμία, την υπέρταση και τον μυϊκό πόνο. Η γενετική ανάλυση αποκάλυψε μια ομόζυγη μετάλλαξη p.Arg431Trp σε μια εξαιρετικά διατηρημένη θέση KLHL3. Οι προσομοιώσεις πρότειναν μειωμένη σταθερότητα της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης, η οποία επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western. Σε σύγκριση με το άγριου τύπου KLHL3, η συνεπιμόλυνση του p.Arg- 431Trp KLHL3 οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης WNK4, που συμπεραίνεται ότι προκαλεί αυξημένη επαναρρόφηση NaCl μέσω του ευαίσθητου σε θειαζίδη φορέα και του PHA II.
Συμπεράσματα: Ακόμη και σε ασθενείς που παρουσιάζονται αργά στη ζωή και παρουσία ΧΝΝ, το PHA II θα πρέπει να υποπτευόμαστε εάν τα επίπεδα ρενίνης είναι χαμηλά και η υπερκαλιαιμική οξέωση και η υπέρταση είναι ανεπαρκείς για το στάδιο της ΧΝΝ, ιδιαίτερα με την παρουσία ύποπτου οικογενειακού ιστορικού.
Εισαγωγή
Η συστηματική αρτηριακή υπέρταση επηρεάζει περισσότερους από 1,1 δισεκατομμύρια ενήλικες παγκοσμίως [1] και θεωρείται ο πιο σημαντικός τροποποιήσιμος παράγοντας κινδύνου για νοσηρότητα και θνησιμότητα όλων των αιτιών παγκοσμίως [2]. Περίπου το 90% των ενηλίκων ασθενών έχουν τη λεγόμενη πρωτοπαθή ή ιδιοπαθή υπέρταση με πολυπαραγοντική γονιδιακή-περιβαλλοντική αιτιολογία [2], ενώ μια υποκείμενη αιτία υπέρτασης μπορεί να εντοπιστεί στους υπόλοιπους. Συνήθεις αιτίες δευτεροπαθούς υπέρτασης είναι ο πρωτοπαθής αλδοστερονισμός, η αποφρακτική άπνοια ύπνου, η παρεγχυματική νεφρική νόσος και η στένωση της νεφρικής αρτηρίας [3]. Σε σπάνιες περιπτώσεις, η υπέρταση κληρονομείται ως μονογονιδιακό χαρακτηριστικό. Οι προσβεβλημένοι ασθενείς συνήθως παρουσιάζουν χαμηλά επίπεδα ρενίνης στο πλάσμα, ενώ τα επίπεδα αλδοστερόνης και ηλεκτρολυτών ποικίλλουν ανάλογα με την υποκείμενη αιτιολογία [4]. Οι Μεντελικές μορφές υπέρτασης εκδηλώνονται συχνά στην παιδική ή νεανική ηλικία. Οι ενήλικες σπάνια διερευνώνται για μονογονιδιακή υπέρταση. Συνεπώς, ο επιπολασμός του στον γενικό πληθυσμό παραμένει άγνωστος. Σε μια επιλεγμένη κοόρτη (κριτήρια συμπερίληψης τουλάχιστον ένα από: ηλικία έναρξης Μικρότερη ή ίση με 35 έτη, ανθεκτική υπέρταση, υπέρταση με ηλεκτρολυτικές ανωμαλίες, ορμονικές ανωμαλίες, μη φυσιολογικά αποτελέσματα απεικόνισης ή υποδηλωτικά κλινικά σημεία), εξετάστηκαν 37 υποψήφια γονίδια, και παθογόνες ή πιθανές παθογόνες παραλλαγές εντοπίστηκαν σε 33 από τις 1.179 περιπτώσεις (2,8%) [5].
Αυτή η μελέτη εστιάζει στον ψευδουποαλδοστερονισμό τύπου II (PHA II), μια μορφή Μεντελικής υπέρτασης που παρουσιάζει υπερκαλιαιμική οξέωση και χαμηλά επίπεδα ρενίνης στο πλάσμα [6]. Το PHA II είναι επίσης γνωστό ως οικογενής υπερκαλιαιμική υπέρταση. Περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1964 από τους Paver και Pauline σε νεαρό άνδρα με σοβαρή υπέρταση και υπερκαλιαιμία παρά την κατά τα άλλα φυσιολογική νεφρική λειτουργία [7] που χαρακτηρίστηκε περαιτέρω από τους Stokes και συνεργάτες [8] και Arnold και Healy [9] και αποδείχθηκε ότι είχε χαμηλή ρενίνη πλάσματος. Μετά την αναφορά ενός 10-χρονου κοριτσιού με κοντό ανάστημα, υπέρταση, σοβαρή υπερκαλιαιμία, ήπια οξέωση, περιοδική παράλυση και κατασταλμένη ρενίνη το 1970 από τους Gordon et al. [10], το σύνδρομο έχει επίσης περιστασιακά αναφερθεί ως σύνδρομο Gordon.
Το 2001, μεταλλάξεις στα γονίδια κινάσης σερίνης-θρεονίνης WNK1 και WNK4 χωρίς-λυσίνη (WNK) αναγνωρίστηκαν ως αίτια του PHA II [11] και περαιτέρω μεταλλάξεις στο KLHL3 (που κωδικοποιεί το kelch-like 3) και το CUL3 (κωδικοποιεί γονίδια cullin 3) περιγράφηκαν το 2012 [12, 13]. Οι υπομορφές PHA II που προκαλούνται από μεταλλάξεις στα WNK1, WNK4 και CUL3 είναι αυτοσωμικές επικρατούσες διαταραχές, ενώ οι μεταλλάξεις KLHL3 μπορούν να κληρονομηθούν είτε με αυτοσωμικό επικρατές είτε με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο [12]. Το KLHL3 διαθέτει μια Ν-τερματική περιοχή BTB, ακολουθούμενη από μια περιοχή BACK και μια δομή C-τερματικής έλικας έξι λεπίδων που αποτελείται από τις λεγόμενες επαναλήψεις που μοιάζουν με kelch (φαίνεται στο Σχ. 1d,2a). Οι κυρίαρχες μεταλλάξεις KLHL3 συγκεντρώνονται μέσα ή μεταξύ των πτερυγίων της έλικας, ενώ οι υπολειπόμενες μεταλλάξεις κατανέμονται σε όλη την πρωτεΐνη [12]. Οι υπολειπόμενες περιπτώσεις είναι λιγότερο συχνές από τις κυρίαρχες περιπτώσεις. Συνολικά, έχουν δημοσιευτεί 21 ασθενείς από 14 οικογένειες με υπολειπόμενες μεταλλάξεις KLHL3 [12-15] (Πίνακας 1).
Η υποκείμενη παθοφυσιολογία της υπέρτασης στο PHA II είναι η αυξημένη επαναρρόφηση NaCl μέσω του ευαίσθητου σε θειαζιδικό φορέα (συνμεταφορέας Na-Cl, NCCT) στο περιφερικό σπειροειδές σωληνάριο του νεφρού και η θεραπεία με θειαζίδες διορθώνει τόσο την υπέρταση όσο και τις ανωμαλίες ηλεκτρολυτών σε ασθενείς με PHA II [16]. Εν ολίγοις, τα WNK1 και WNK4 φωσφορυλιώνουν το OSR1 (γονίδιο 1 που ανταποκρίνεται στο οξειδωτικό στρες) και το SPAK (σχετιζόμενη με Ste{8}}κινάση πλούσια σε προλίνη-αλανίνη), τα οποία στη συνέχεια φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν το NCCT [17, 18]. Το KLHL3 είναι ένας προσαρμογέας υποστρώματος της λιγάσης ουβικιτίνης CUL3. το σύμπλεγμα KLHL3-CUL3 ουβικουιτινυλώνει τις κινάσες WNK και έτσι προάγει την αποδόμησή τους [19]. Η απώλεια της λειτουργίας της λιγκάσης της ουβικιτίνης ή η διαταραχή της δέσμευσης με τις κινάσες WNK προκαλεί αυξημένη αφθονία WNK, αυξημένη φωσφορυλίωση NCCT [18] και αυξημένη απορρόφηση NaCl στο περιφερικό σπειροειδές σωληνάριο. Σε μεταγενέστερα τμήματα του νεφρώνα, η επαναρρόφηση NaCl μέσω ENaC (επιθηλιακό κανάλι νατρίου) και η έκκριση K+ μέσω ROMK (νεφρικός εξωτερικός μυελικός δίαυλος καλίου) μειώνονται [20, 21]. Τα ποντίκια νοκ-άουτ KLHL3 εμφανίζουν υποπλασία του περιφερικού σπειροειδούς σωληναρίου, έντονα αυξημένα επίπεδα WNK1 και WNK4 και αυξημένη φωσφορυλίωση OSR1, SPAK και NCC στον νεφρό. Επιπλέον, εμφανίζουν υπερκαλιαιμία, υπερχλωραιμία και μεταβολική οξέωση [22]. Εδώ, αναφέρουμε έναν ασθενή με αυτοσωμικό υπολειπόμενο PHA II και χαρακτηρίζουμε την υποκείμενη γενετική μετάλλαξη και την παθοφυσιολογία
Υλικά και μέθοδοι
Παρασκευή DNA και προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger Το DNA παρασκευάστηκε από δείγμα περιφερικού φλεβικού αίματος χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η τυπική PCR και η άμεση αμφίδρομη αλληλουχία Sanger του γονιδιωματικού DNA πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δημοσιευμένους εκκινητές για KLHL3 [13], WNK1 και WNK4 [11] και το CUL3_9F (5'-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3') και CUL3_9R (5'-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3') εκκινητές για CUL3. Η αλληλουχία Sanger πραγματοποιήθηκε στην Eurofins Genomics.
Στοίχιση ακολουθίας
Οι ομόλογες πρωτεϊνικές αλληλουχίες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) και τη βάση δεδομένων eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Οι ακολουθίες που εμφανίζονται περιλαμβάνουν το ανθρώπινο KLHL3 και τα ορθόλογά του: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) και Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Τα ανθρώπινα παράλογα αναγνωρίστηκαν από βιβλιογραφική έρευνα και περιλαμβάνουν το KLHL1 έως το KLHL42 όπως φαίνεται στον διαδικτυακό συμπληρωματικό Πίνακα 1 (για όλο το διαδικτυακό υλικό, βλ. www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Οι ακολουθίες ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας Jalview έκδοση 2.10.5 [24]. Η δομή του τομέα προήλθε από το UniProt (Q9UH77, πρόσβαση στις 13 Απριλίου 2021) και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το DOG [25].
Πλασμίδια και Τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξιγένεση
Τα πλασμίδια pTRE2hyg WNK4 και pFN21A KLHL3 ήταν ευγενικά δώρα του Δρ. Shinichi Uchida (Ιατρικό και Οδοντιατρικό Πανεπιστήμιο του Τόκιο). Για την εισαγωγή της μετάλλαξης p.R431W, σχεδιάστηκαν εκκινητές χρησιμοποιώντας Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) και 5′- CCACACCTGCTCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Τα υπολείμματα μεταλλαγμάτων εμφανίζονται με έντονους χαρακτήρες. Η κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit με πολυμεράση DNA υψηλής πιστότητας PfuUltra (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA αναλύθηκε με Sanger στην Eurofins Genomics. Τα πλασμίδια παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ QIAGEN Plasmid Plus Maxi.
Καλλιέργεια Ιστού, Παροδική Επιμόλυνση και Κηλίδα Western
Τα κύτταρα COS7 καλλιεργήθηκαν σε DMEM + L-γλουταμίνη, 10% FBS και 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (όλα τα Gibco, Thermo Fisher). Για τις επιμολύνσεις, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίου σε πυκνότητα 1,9 × 105 κύτταρα/φρεάτιο και αναπτύχθηκαν σε πυκνότητα περίπου 90%. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μg pTRE2hyg WNK4 και 2 μg pFN21A (κενός φορέας ή KLHL3 άγριου τύπου [WT]) ή KLHL3 R431W cDNA χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο ανεξάρτητοι κλώνοι ο καθένας χρησιμοποιήθηκαν για επιμόλυνση. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και λύθηκαν σε 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA και 1% ΝΡ40 που περιέχει πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Merck). Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στους 20,000 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς και το υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν εις διπλούν (στάνταρ) ή εις τριπλούν (δείγματα) με την ανάλυση BCA (Pierce, Thermo Fisher) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Περίπου 20 μg συνολικής πρωτεΐνης κλασματοποιήθηκαν με SDSPAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (1,5 ώρα, 100 V). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 2% ξηρό γάλα σε TBST. Το Western blot διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό κουνέλι anti-HaloTag (Promega #G9281, 1:500, 4 βαθμοί όλη τη νύχτα), ακολουθούμενο από πλύση και επώαση με IgG αντι-κουνελιού γαϊδουριού IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου), πλύση και βελτιωμένη ανίχνευση χημειοφωταύγειας (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Οι κηλίδες αφαιρέθηκαν χρησιμοποιώντας ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), μπλοκαρίστηκαν σε 2% ξηρό γάλα σε TBST όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς και επωάστηκαν με μονοκλωνικό ποντίκι anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{69} }, 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου), ακολουθούμενη από IgG αντι-ποντικού γαϊδουριού IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 ώρα στο δωμάτιο θερμοκρασία), ανίχνευση ECL, απογύμνωση και μπλοκάρισμα όπως παραπάνω. Οι κηλίδες στη συνέχεια επωάστηκαν με μονοκλωνική αντι- -ακτίνη ποντικού (Sigma-Aldrich # Α2228, Merck, 1:5,000, 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) και IgG αντι-ποντικού IgG γαϊδουριού, και πάλι ανίχνευση ECL. Οι ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image Lab σε ένα ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Οι εντάσεις των ζωνών που ανιχνεύθηκαν από το αντίσωμα anti-HaloTag και το αντίσωμα αντι-FLAG M2, αντίστοιχα, διαιρέθηκαν με τις αντίστοιχες εντάσεις των ζωνών που ανιχνεύθηκαν από τα αντισώματα κατά της ακτίνης. Για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του KLHL3, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως παραπάνω, ωστόσο χρησιμοποιώντας 0 μg, 0,5 μg, 1 μg, 2 μg, 4 μg και 8 μg pFN21A KLHL3 WT ή R431W. Η ηλεκτροφόρηση γέλης και η αποτύπωση έγιναν όπως παραπάνω. Για τον προσδιορισμό καταδίωξης κυκλοεξιμιδίου, τα κύτταρα σπάρθηκαν όπως παραπάνω και επιμολύνθηκαν όπως παραπάνω, ωστόσο με 2 μg pFN21A KLHL3 WT ή 4 μg KLHL3 R431W. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη διαμόλυνση, προστέθηκαν 100 μΜ κυκλοεξιμιδίου και τα κύτταρα λύθηκαν μετά τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα περαιτέρω βήματα ανάλυσης ήταν όπως παραπάνω.
Εικ. 2. Προσομοιώσεις MD των περιοχών WT και p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. μια όψη από πάνω προς τα κάτω του τομέα Kelch (PDBID: 4CH9), χρωματισμένη από λεπίδες προπέλας (K1–K6). Η θέση μετάλλαξης υποδεικνύεται με ένα κίτρινο αστέρι και η περιοχή ενδιαφέροντος είναι χρωματισμένη γκρι (υπολείμματα 425-465) και το πεπτίδιο WNK4 (δεν περιλαμβάνεται στις προσομοιώσεις) είναι διαφανές και χρωματισμένο σε γκρι. β Διαφορά στους ΓΧΣ της περιοχής Kelch που απεικονίζεται στον πρωτεϊνικό κορμό. Η θέση μετάλλαξης υποδεικνύεται με ένα κίτρινο αστέρι. Το κόκκινο χρώμα υποδηλώνει πιο δυναμικά (λιγότερο σταθερά) μέρη της πρωτεΐνης. c RMSD ολόκληρης της πρωτεΐνης (επάνω), τα υπολείμματα 425–465 (μέση) και η τσέπη σύνδεσης WNK4- (κάτω) από την κρυσταλλική δομή για τρία ανεξάρτητα αντίγραφα προσομοίωσης (έντονες γραμμές, μέσοι όροι λειτουργίας). d Διαγράμματα βιολιού hbonds (αριστερά) και απόσταση COM (μέση) μεταξύ K3 (υπολείμματα 425–441) και K4 (442–465) - πτερύγια έλικας και ηλεκτροστατική τσέπη δεσίματος (δεξιά). e Δομική επικάλυψη της διεπαφής K3–K4 από το τελικό πλαίσιο (1,1 μs) κάθε αντίγραφου (WT, μπλε, R431W, γκρι) με τα πειραματικά/αρχικά μοντέλα (μαύρο). Η ραχοκοκαλιά πρωτεΐνης εμφανίζεται ως καρτούν, με το υπόλειμμα 431 να εμφανίζεται ως ραβδιά. ΓΧΣ, μέση τετραγωνική διακύμανση.
Προσομοίωση Μοριακής Δυναμικής
Το μοντέλο WT βασίστηκε στην κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ (PDBID: 4CH9) της ανθρώπινης περιοχής Kelch σε σύμπλοκο με το πεπτιδικό θραύσμα WNK4 [26]. Τα άτομα που λείπουν και τα τερματικά καλύμματα προστέθηκαν χρησιμοποιώντας το βοηθητικό πρόγραμμα psfgen στην έκδοση 1.9.3 της οπτικής μοριακής δυναμικής [27]. Το μεταλλαγμένο (R431W) μοντέλο KLHL3 δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας την έκδοση Modeller 9.18 [28]. Το τελικό εύρος υπολειμμάτων για κάθε σύστημα ήταν 300–585. Τα Ν- και C-άκρα των μοντέλων WT και R431W εξουδετερώθηκαν με ακετυλίωση και Ν-μεθυλαμιδίωση, αντίστοιχα. Οι προεπιλεγμένες καταστάσεις πρωτονίωσης εκχωρήθηκαν σε κάθε τιτλοδοτήσιμο υπόλειμμα σύμφωνα με την ανάλυση με PROPKA έκδοση 3.0 [29]. Το πεπτίδιο WNK4 αφαιρέθηκε από τις προσομοιώσεις παραγωγής λόγω διάστασης από το KLHL3 μετά από αρχικές προσομοιώσεις εξισορρόπησης.
Όλες οι προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού GROMACS έκδοση 2021 [30]. Οι παράμετροι πεδίου δύναμης CHARMM36m χρησιμοποιήθηκαν για άτομα πρωτεΐνης [31]. Τα ιόντα περιγράφηκαν χρησιμοποιώντας προεπιλεγμένες παραμέτρους CHARMM και το μοντέλο TIP3P χρησιμοποιήθηκε για τα νερά [32]. Ένα χρονικό βήμα ολοκλήρωσης 1 fs χρησιμοποιήθηκε για το αρχικό βήμα εξισορρόπησης, με 2 fs να χρησιμοποιούνται για όλες τις επόμενες προσομοιώσεις. Όλοι οι δεσμοί που περιλαμβάνουν υδρογόνο περιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το LINCS [33]. Οι μη δεσμευμένες αλληλεπιδράσεις Van der Waals υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το δυναμικό Lennard-Jones με ακτίνα αποκοπής 1,2 nm. οι δυνάμεις απενεργοποιήθηκαν ομαλά στην περιοχή 1,2–1,0 nm. Όλα τα ηλεκτροστατικά υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Ewald [34] με εξομάλυνση σωματιδίων με απόσταση αποκοπής σε πραγματικό χώρο 1,2 nm. Μετά από μια αρχική προσομοίωση στο ισοχορικό-ισοθερμικό σύνολο (NVT), όλες οι επόμενες προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν στο ισοβαρικό-ισοθερμικό σύνολο (NPT) σε θερμοκρασία 310,15 K χρησιμοποιώντας τον θερμοστάτη επανακλιμάκωσης ταχύτητας [35] με σταθερά χρόνου 0,5 ps. Ο θερμοστάτης εφαρμόστηκε χωριστά στην πρωτεΐνη και τον διαλύτη (δηλ. νερό και ιόντα). Οι ίδιες ομάδες χρησιμοποιήθηκαν για την αφαίρεση της κίνησης του κέντρου μάζας (COM). Επιβλήθηκε πίεση 1 bar χρησιμοποιώντας είτε βαροστάτη Berendsen [36] είτε Parrinello-Rahman [37] με ισότροπο τρόπο με χρονική σταθερά 5 ps.
Τα μοντέλα WT και R431W διαλύθηκαν σε κυβικό κουτί με αρχικές διαστάσεις 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Κάθε σύστημα εξουδετερώθηκε με 150 mM NaCl. Μετά από μια αρχική ελαχιστοποίηση της ενέργειας απότομης καθόδου, κάθε σύστημα εξισορροπήθηκε στο σύνολο NVT για 5 ns με περιορισμούς θέσης σε όλα τα άτομα πρωτεΐνης. Ένα επόμενο βήμα εξισορρόπησης πραγματοποιήθηκε στο σύνολο NPT για 5 ns με τους ίδιους περιορισμούς όπως στο προηγούμενο βήμα. Οι περιορισμοί θέσης αφαιρέθηκαν από όλες τις πλευρικές αλυσίδες για την τελική προσομοίωση εξισορρόπησης 5-ns. Τρεις αρχικές δομές δημιουργήθηκαν από το τελικό στάδιο της εξισορρόπησης για ανεξάρτητες προσομοιώσεις παραγωγής των συστημάτων WT και R431W με αφαιρέσεις όλους τους περιορισμούς θέσης. Κάθε αντίγραφο παραγωγής προσομοιώθηκε για 1,1 μs. τα πρώτα 0,1 μs αφαιρέθηκαν από την ανάλυση.
Για την αξιολόγηση της δομικής σταθερότητας κατά τη διάρκεια των προσομοιώσεων, υπολογίστηκαν οι αποκλίσεις του μέσου τετραγώνου της ρίζας (RMSD) από την κρυσταλλική δομή για τα άτομα C ολόκληρης της πρωτεΐνης, καθώς και για τη διεπιφάνεια K3-K4 (υπολείμματα 425-465) και το Θήκη βιβλιοδεσίας WNK4- (υπολείμματα 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 και 577). Οι τρέχοντες μέσοι όροι των ιχνών RMSD υπολογίστηκαν και επικαλύφθηκαν με τα ακατέργαστα δεδομένα.
Η επίδραση της μετάλλαξης στη δομική σταθερότητα οπτικοποιήθηκε με τον υπολογισμό της διαφοράς στις μέσες τετραγωνικές διακυμάνσεις των ατόμων πρωτεΐνης C, που υπολογίζονται κατά μέσο όρο σε πλαίσια και αντίγραφα και χαρτογραφώντας τη δομή της πρωτεΐνης WT. Όλες οι απεικονίσεις πρωτεΐνης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας ChimeraX [38]. Η επίδραση της μετάλλαξης R431W στη διεπιφάνεια Κ3 (υπολείμματα 425-441) προς Κ4 (υπολείμματα 442-465) χαρακτηρίστηκε από ανάλυση δεσμού υδρογόνου (δεσμός Η) και απόσταση COM μεταξύ των δύο ομάδων. Οι δεσμοί H αξιολογήθηκαν σε κάθε πλαίσιο χρησιμοποιώντας το εργαλείο GROMACS gmx hbond, με αποκοπές απόστασης και γωνίας 3,5 Α και 30 μοιρών, αντίστοιχα. Οι αποστάσεις COM αξιολογήθηκαν με παρόμοιο τρόπο σε κάθε καρέ - οι κατανομές τόσο των αποστάσεων Hbonds όσο και COM απεικονίστηκαν ως πλοκές βιολιού. Οι μέσοι όροι υπολογίστηκαν σε τροχιές και αντίγραφα.
Η ηλεκτροστατική του θύλακα σύνδεσης WNK4-υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας g_elpot [39]. Η χρονική πορεία του ηλεκτροστατικού δυναμικού στον θύλακα σύνδεσης αξιολογήθηκε ορίζοντας έναν σφαιρικό όγκο με ακτίνα 8 Α, με κέντρο το γεωμετρικό κέντρο των υπολειμμάτων που αποτελούν τον θύλακα σύνδεσης. Για να αξιολογηθεί η διακύμανση στα ηλεκτροστατικά, υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι μπλοκ 50-ns. Η κατανομή του ηλεκτροστατικού δυναμικού εντός του θύλακα σύνδεσης για το μετάλλαγμα WT και R431W οπτικοποιήθηκε ως διαγράμματα βιολιού, με μέσους όρους υπολογισμένους σε μπλοκ και τροχιές 50-ns.
Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:
Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
