Ανίχνευση παραλλαγών MUC1 σε ασθενείς που έχουν κλινικοπαθολογικά διαγνωσθεί με αυτοσωμική επικρατούσα σωληναριακή διάμεση νεφρική νόσο

Εισαγωγή

Η αυτοσωματική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος (ADTKD)-MUC1 προκαλείται κυρίως από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου λόγω εισαγωγής μιας βάσης στην περιοχή διαδοχικής επανάληψης μεταβλητού αριθμού (VNTR) στο MUC1. Λόγω της πολυπλοκότητας της παραλλαγής hotspot, η αναγνώριση με χρήση ακολουθιών σύντομης ανάγνωσης (SRS) είναι δύσκολη. Αν και πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει τη χρησιμότητα των μακροχρόνιων αναγνωστών sequencers (LRS), ο επιπολασμός των παραλλαγών MUC1 σε ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD παραμένει άγνωστος. Στόχος μας ήταν να διευκρινίσουμε αυτόν τον επιπολασμό και τα γενετικά χαρακτηριστικά και τις κλινικές εκδηλώσεις του ADTKD-MUC1 σε έναν ιαπωνικό πληθυσμό χρησιμοποιώντας ένα SRS και ένα LRS.

Μέθοδοι

Από τον Ιανουάριο του 2015 έως τον Δεκέμβριο του 2019, πραγματοποιήθηκε γενετική ανάλυση με χρήση SRS σε 48 ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD. Πραγματοποιήθηκαν πρόσθετες αναλύσεις χρησιμοποιώντας ένα LRS σε ασθενείς με αρνητικά αποτελέσματα SRS.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα σύντομης ανάγνωσης αλληλουχίας αποκάλυψαν παραλλαγές MUC1 σε 1 ασθενή που φιλοξενούσε μια εισαγωγή κυτοσίνης στη δεύτερη μονάδα επανάληψης της περιοχής VNTR. Ωστόσο, οι βαθύτερες περιοχές VNTR δεν μπορούσαν να διαβαστούν από το SRS. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μακροχρόνια ανάλυση αλληλουχίας 39 περιπτώσεων και εντοπίσαμε παραλλαγές MUC1 VNTR σε 8 ασθενείς (συνολικά, 9 ασθενείς από μη συγγενείς οικογένειες). Με τη συμπερίληψη των ασθενών που επηρεάστηκαν από την οικογένεια (n ¼ 31), η διάμεση ηλικία στην ανάπτυξη νεφρικής νόσου τελικού σταδίου (ESKD) ήταν 45 έτη (95 τοις εκατό CI: 40–40 έτη).

συμπέρασμα

Στην Ιαπωνία, το ποσοστό ανίχνευσης των παραλλαγών MUC1 σε ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD ήταν 18,8 τοις εκατό. Περισσότερο από το 20 τοις εκατό των ασθενών με αρνητικά αποτελέσματα SRS είχαν παραλλαγές MUC1 που εντοπίστηκαν από ένα LRS.

Λέξεις-κλειδιά

ADTKD; ADTKD-MUC1; μακροχρόνια ανάγνωση αλληλουχίας? MCKD; NGS; Αλληλουχία SMRT.

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετεΟφέλη Cistanche

Η ADTKD είναι μια ομάδα κληρονομικών νεφρικών παθήσεων που χαρακτηρίζονται από προοδευτική σωληναρισιακή διάμεση ίνωση και σωληναριακή ατροφία που οδηγεί σε ESKD. Η ADTKD μπορεί να χωριστεί σε υποτύπους με βάση τα υποκείμενα γενετικά ελαττώματα, συμπεριλαμβανομένων των ανωμαλιών στα UMOD, MUC1, REN, HNF1B και SEC61A1. Δεδομένης της μη εξειδίκευσης των κοινών ενοποιητικών χαρακτηριστικών της ADTKD, συμπεριλαμβανομένων των ήπιων ανωμαλιών του ιζήματος των ούρων και της ήπιας έως αρνητικής πρωτεϊνουρίας, η ADTKD θεωρείται ότι είναι εξαιρετικά υποδιαγνωσμένη.

Η MUC1 είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στην κορυφαία μεμβράνη του παχύ ανιόντος άκρου του βρόχου του Henle, στα απομακρυσμένα σπειροειδή σωληνάρια και στους αγωγούς συλλογής. Η πιο κοινή γενετική αιτία του ADTKD-MUC1 είναι μια παραλλαγή μετατόπισης πλαισίου που προκαλείται από την εισαγωγή μιας μοναδικής βάσης στον πολυμορφισμό VNTR του MUC1 (OMIM 158340; 1q22) στο εξόνιο 2.5 Αυτή η μετάλλαξη τερματίζει τη σύνθεση της πρωτεΐνης MUC1 μετά την περιοχή VNTR και δημιουργεί μια νέα συντομευμένη πρωτεΐνη (MUC1fs) που στερείται C-τερματικής περιοχής (Εικόνα 1α). Στη συνέχεια, το MUC1fs συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα λόγω της ανώμαλης ενδοκυτταρικής μεταφοράς πρωτεΐνης. Η περιοχή VNTR παρουσιάζει σημαντική διακύμανση μεταξύ των ατόμων επειδή αποτελείται από 60-μονάδες νουκλεοτιδίων που επαναλαμβάνονται 20 έως 125 φορές, με κάθε αλληλόμορφο να έχει μοναδικές επαναλήψεις (Εικόνα 1β). Ως εκ τούτου, η ανίχνευση παραλλαγών γονιδίων χρησιμοποιώντας SRSs ήταν δύσκολη λόγω της πολυπλοκότητας της παραλλαγής hotspot.

Προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει εναλλακτικές μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης της φασματομετρίας μάζας και της επέκτασης ανιχνευτή, όπως λέγεται, για την ανίχνευση αιτιολογικών παραλλαγών. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι είναι τεχνικά απαιτητικές. Πρόσφατες μελέτες έχουν βρει τη χρησιμότητα των LRS, τα οποία χρησιμοποιούν μια μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας ενός μορίου σε πραγματικό χρόνο (SMRT) για τον εντοπισμό παραλλαγών MUC1 VNTR. Ωστόσο, οι παραλλαγές MUC1 VNTR δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί στον ιαπωνικό πληθυσμό. Επιπλέον, ο επιπολασμός των παραλλαγών MUC1 σε ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD παραμένει άγνωστος. Ως εκ τούτου, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινιστεί αυτός ο επιπολασμός, συμπεριλαμβανομένων των γενετικών χαρακτηριστικών και των κλινικών εκδηλώσεων, του ADTKD-MUC1 στον ιαπωνικό πληθυσμό. Εδώ, διαγνώσαμε 9 ασθενείς με ADTKD-MUC1 που είχαν ανιχνευθεί παραλλαγές VNTR χρησιμοποιώντας είτε SRS (n ¼ 1) είτε LRS (n ¼ 8) μεταξύ 48 κλινικά ύποπτων περιπτώσεων ADTKD.

Μέθοδοι

1. Συμμετέχοντες

Μεταξύ Ιανουαρίου 2015 και Δεκεμβρίου 2019, πραγματοποιήσαμε γενετική ανάλυση σε 48 ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD. Οι συμμετέχοντες είχαν νεφρική δυσλειτουργία από άγνωστες αιτίες, με ήπιες έως αρνητικές ανωμαλίες του ουροποιητικού. Οι ασθενείς διαγνώστηκαν κλινικά με ADTKD εάν είχαν θετικό οικογενειακό ιστορικό χρόνιας νεφρικής νόσου και/ή υπερουριχαιμία ή εάν παθολογικά ευρήματα στη βιοψία νεφρού αποκάλυψαν είτε μυελική κυστική νεφρική νόσο (ο προηγούμενος όρος για ADTKD-MUC1 και ADTKD-UMOD), σωληναριδική νεφρίτιδα ή χρόνια διάμεση βλάβη. Αποκλείσαμε ασθενείς με νεφρικές δυσπλασίες και/ή εξωνεφρικά συμπτώματα. Τα δείγματα DNA αναλύθηκαν αρχικά χρησιμοποιώντας SRS. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω έρευνες σε ασθενείς με αρνητικά αποτελέσματα SRS (n ¼ 39) χρησιμοποιώντας ένα LRS. Όλα τα δείγματα και οι κλινικές πληροφορίες ελήφθησαν από νοσοκομεία παραπομπής της Ιαπωνίας. Πραγματοποιήθηκαν γενετικές αναλύσεις μετά τη λήψη γραπτής ενημερωμένης συγκατάθεσης από τους ασθενείς ή/και τους κηδεμόνες τους εάν ο ασθενής ήταν ανήλικος. Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Κόμπε (αριθμός έγκρισης 301).

2. Σύντομη ανάγνωση αλληλουχίας

Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes using the QuickGene Mini 80 system (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan). For targeted sequencing using an SRS, samples were prepared using HaloPlex (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) according to the manufacturer's instructions. Paired-end sequencing was performed on the MiSeq platform (Illumina, San Diego, CA). HaloPlex was used for targeted sequencing of 128 genes (version 2, Supplementary Table S1), 172 genes (version 4, Supplementary Table S2), 159 genes (version 5, Supplementary Table S3), 164 genes (version 6, Supplementary Table S4), 181 genes (version 7, Supplementary Table S5), and 183 genes (version 8, Supplementary Table S6) associated with congenital anomalies of the kidney and urinary tract, cystic kidneys, ADTKD, and nephronophthisis. The HaloPlex version used for each patient is found in Supplementary Table S7. Reads were aligned to the reference human genome (GRCh37/Hg19) using SureCall 4.0, which is a desktop application combining algorithms for end-to-end next-generation sequencing data analysis from alignment to categorization of mutations (Agilent Technologies). We excluded called variants with minor allele frequencies >1 τοις εκατό σε δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων ανθρώπινων παραλλαγών, όπως οι ακόλουθες: Βάση δεδομένων ανθρώπινης γενετικής παραλλαγής (http:// www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/), gnomAD (https://gnomad.broadinstitute .org/), και βάσεις δεδομένων 1000 Genomes Project (1000G) (https://www. internationalgenome.org/data). Οι υποψήφιες παραλλαγές επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό υπολογιστικής πρόβλεψης, SIFT (https://sift.bii.astar.edu.sg/), PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) , Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/) και CADD (https://cadd.gs.washington.edu/snv) και στη συνέχεια ταξινομούνται ως παθογόνοι, πιθανώς παθογόνοι ή αβέβαιες σημασίας, σύμφωνα με κατευθυντήριες οδηγίες του Αμερικανικού Κολλεγίου Ιατρικής Γενετικής και Γονιδιωματικής.9

3. Προετοιμασία βιβλιοθήκης και μακροχρόνια ανάγνωση ακολουθίας (SMRT Sequencing)

Τα αμπλικόνια συγκεντρώθηκαν σε ισομοριακές αναλογίες και προετοιμάστηκαν για βιβλιοθήκες ακολουθιών SMRTbell χρησιμοποιώντας ένα κιτ προετοιμασίας προτύπου SMRTbell Express 2.0 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε ένα πρότυπο αλληλουχίας με προσάρτηση του εκκινητή αλληλουχίας έκδοσης 2 και DNA πολυμεράσης στους προσαρμογείς και στα δύο άκρα της βιβλιοθήκης αλληλουχιών, και το πρότυπο φορτώθηκε σε ένα κύτταρο SMRT. Η αλληλουχία SMRT πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα PacBio Sequel II με το κιτ αλληλουχίας Sequel II 2.0. Τα δεδομένα της αλληλουχίας αναλύθηκαν με την έκδοση 9 του SMRT Link.0.0 και ελήφθησαν συναινετικές αλληλουχίες υψηλής ακρίβειας. Στη συνέχεια, η ομαδοποίηση ακολουθιών διεξήχθη χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης "pbaa", το οποίο είναι κατάλληλο για την ανάλυση επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης, ο προσδιορισμός αλληλουχίας και οι βιοπληροφορικές αναλύσεις της αλληλουχίας SMRT διεξήχθησαν από την Takara Bio (Kusatsu, Shiga, Ιαπωνία). Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων, ο αριθμός των αναγνώσεων και η συχνότητα των αλληλίων συγκεντρώθηκαν σε ένα αρχείο Excel για κάθε ασθενή (τα δεδομένα δεν αποκαλύφθηκαν). Για κάθε προσδιορισμένη αλληλουχία, ανακατασκευάσαμε χειροκίνητα την αλληλουχία κάθε 60 βάσεις ανά γραμμή, όπως περιγράφεται από τους Kirby et al.5 (Εικόνα 1β). Λόγω πιθανών σφαλμάτων PCR στη σύνθετη αλληλουχία VNTR, ανιχνεύθηκαν πολλαπλές αλληλουχίες σε κάθε ασθενή. Οι σωστές αλληλουχίες ταυτοποιήθηκαν συγκρίνοντας τα αποτελέσματα του LRS με ηλεκτροφερογράμματα των αμπλικονίων που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή (Συμπληρωματικός Πίνακας S8). Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι 2 κορυφαίες ακολουθίες με τον μεγαλύτερο αριθμό αναγνώσεων προσδιορίστηκαν ως σωστές. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ωστόσο, οι αλληλουχίες με τον τρίτο ή χαμηλότερο αριθμό αναγνώσεων προσδιορίστηκαν ως σωστές εάν τα μεγέθη τους αντιστοιχούσαν στις κορυφές ηλεκτροφόρησης που ανιχνεύθηκαν από τον βιοαναλυτή (SC449, SC511, SC534, SC560, SC566, SC593, SC616, και SC639) λόγω της αναποτελεσματικότητας της ενίσχυσης PCR μακρών αλληλόμορφων όταν το μέγεθος της περιοχής VNTR των 2 αλληλόμορφων ήταν σημαντικά διαφορετικό.

Σκόνη Cistanche και εκχύλισμα Cistanche

Συζήτηση

Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά γενετικής ανάλυσης παραλλαγών MUC1 VNTR που ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συνδυασμό SRS και LRS σε μια ιαπωνική κοόρτη. Εντοπίσαμε μεταλλάξεις MUC1 VNTR σε 9 ασθενείς από μη συγγενείς οικογένειες. Επιπλέον, το ποσοστό ανίχνευσης των παραλλαγών MUC1 μεταξύ ασθενών με κλινικά ύποπτη ADTKD ήταν 18,8 τοις εκατό.

Λόγω της πολυπλοκότητας της παραλλαγής hotspot, η ανίχνευση παραλλαγών MUC1 VNTR με τη συνήθη γενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα SRS είναι πρόκληση και άλλες μέθοδοι, όπως η μέθοδος στιγμιότυπου ή η φασματομετρία μάζας, απαιτούνται τυπικά. Δυστυχώς, αυτές οι μέθοδοι είναι τεχνικά απαιτητικές και εκτελούνται μόνο σε λίγα εργαστήρια παγκοσμίως.5,6 Οι Wenzel et al.7 διεξήγαγαν αλληλουχία SMRT και επιβεβαίωσαν όλες τις διαγνώσεις σε Ευρωπαίους συμμετέχοντες από 9 οικογένειες με προηγουμένως ανιχνευμένες παραλλαγές MUC1 VNTR χρησιμοποιώντας τη μέθοδο στιγμιότυπου. Ο Wang et al.8 αποκάλυψε επίσης τη χρησιμότητα της αλληλουχίας SMRT για την ανίχνευση μεταλλάξεων MUC1 VNTR σε μια μεγάλη κινεζική οικογένεια. Ωστόσο, λόγω του σχεδιασμού της μελέτης τους, αυτές οι 2 μελέτες δεν προσδιόρισαν το ποσοστό ανίχνευσης των παραλλαγών MUC1 VNTR σε ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD. Σε αυτή τη μελέτη, διευκρινίσαμε ότι το διαγνωστικό ποσοστό των παραλλαγών MUC1 σε ασθενείς με κλινικά ύποπτη ADTKD ήταν 18,8 τοις εκατό, γεγονός που μπορεί να διευκολύνει πιο ακριβείς πιθανότητες, ειδικά κατά τη διάρκεια της γενετικής συμβουλευτικής.

Τα δεδομένα σχετικά με τον επιπολασμό της ADTKD-MUC1 είναι περιορισμένα, αν και προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει επικράτηση 0.7 έως 4 ανά εκατομμύριο στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ιρλανδία.3,13 Μια μελέτη στην Αγγλία αποκάλυψε έναν εκτιμώμενο επιπολασμό της ADTKD -UMOD 9 ανά εκατομμύριο, υποδηλώνοντας ότι η ADTKD-UMOD είναι η πιο συχνή μη πολυκυστική νόσος των νεφρών.14 Στη μελέτη μας, 9 ασθενείς είχαν παραλλαγές MUC1, ενώ 6 είχαν παραλλαγές UMOD, υποδηλώνοντας ότι η ADTKD-MUC1 θα μπορούσε να είναι 1 από τους πιο κοινούς υποτύπους ασθενειών ADTKD.

Παρά τη δομική πολυπλοκότητα της περιοχής MUC1 VNTR, το SRS μπορούσε να ανιχνεύσει παραλλαγές σε 3 ασθενείς, οι οποίοι είχαν όλοι την ίδια μετάλλαξη: μια κυτοσίνη που εισήχθη σε 7 διαδοχικές κυτοσίνες στο τέλος της 60-μονάδας νουκλεοτιδίων στη δεύτερη επανάληψη του το VNTR. Θεωρήθηκε ότι οι παραλλαγές στο ρηχό τμήμα του MUC1 VNTR (μέχρι την τρίτη επανάληψη του VNTR) θα ήταν ανιχνεύσιμες ακόμα κι αν το DNA ήταν κατακερματισμένο (100–200 ζεύγη βάσεων ανά ανάγνωση) ως μέρος της προετοιμασίας του δείγματος για ανάλυση SRS. Οι Yamamoto et al.15 αναγνώρισαν μια άλλη μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου που βρίσκεται πριν από την περιοχή MUC1 VNTR χρησιμοποιώντας μια SRS (ολόκληρη αλληλουχία εξώματος). Αυτή η μετάλλαξη δημιουργεί επίσης μια ασυνήθιστα κολοβωμένη πρωτεΐνη με τον ίδιο τρόπο όπως η μετάλλαξη που βρίσκεται εντός του VNTR.15 Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ανάλυση SRS μπορεί να είναι χρήσιμη για την ανίχνευση παραλλαγών που βρίσκονται πριν ή εντός της ρηχής περιοχής του VNTR.

Στη μελέτη μας, 7 από τους 9 ασθενείς με παραλλαγές MUC1 VNTR είχαν την ίδια 60-αλληλουχία μονάδας νουκλεοτιδίων που περιείχε την εισαγόμενη κυτοσίνη (Πίνακας 2). Σε προηγούμενες μελέτες στις οποίες διεξήχθη μακροχρόνια γενετική ανάλυση αλληλουχίας για το MUC1 VNTR, η ίδια παραλλαγή ανιχνεύθηκε σε 9 οικογένειες σε μια ευρωπαϊκή κοόρτη7 και σε μια μεγάλη κινεζική οικογένεια.8 Επιπλέον, αυτή η μετάλλαξη έχει ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο στιγμιότυπου και ορίζεται ως "27dupC."12 Οι Olinger et al.16 ανέφεραν ότι ο επιπολασμός της παραλλαγής 27dupC ήταν 93,5 τοις εκατό σε 2 μητρώα ADTKD στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες. Με αυτά τα ευρήματα, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η παραλλαγή 27dupC ήταν η πιο κοινή μετάλλαξη MUC1 σε μια ιαπωνική κοόρτη.

Συμπληρώματα Cistanche

Ο αριθμός των επαναλήψεων VNTR έχει αναφερθεί ότι είναι 20 έως 253. Ωστόσο, στη μελέτη μας, ο αριθμός επαναλήψεων VNTR κυμαινόταν από 30 έως 82, με το 80 τοις εκατό των αλληλόμορφων να έχουν 30 έως 36 επαναλήψεις. Μια προηγούμενη μελέτη στην Ευρώπη ανέφερε ότι το ποσοστό των αλληλόμορφων με 30 έως 36 επαναλήψεις ήταν 39 τοις εκατό, το οποίο μπορεί να υποστηρίζεται από την εθνική ομοιογένεια του ιαπωνικού πληθυσμού. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι η διάμεση ηλικία στην ανάπτυξη ESKD ήταν 45 έτη (95 τοις εκατό CI: 40–50 έτη) σε ασθενείς με ADTKD-MUC1, συμπεριλαμβανομένων των οικογενών ασθενών σε μια ιαπωνική κοόρτη (9 οικογένειες, n ¼ 31). Μια προηγούμενη μελέτη αξιολόγησε 147 άτομα, συμπεριλαμβανομένων ασθενών με μεταλλάξεις MUC1 και των προσβεβλημένων μελών της οικογένειάς τους, και αποκάλυψε ότι η μέση ηλικία στην ανάπτυξη ESKD ήταν 44,9 15,4 έτη.17 Αντίθετα, πρόσφατη έρευνα που χρησιμοποιεί διαφορετικές κοόρτες έδειξε ότι ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των νεφρών 104 ασθενείς με ADTKD-MUC1 ήταν 36 ετών (διατεταρτημόριο: 30–46 ετών), γεγονός που μπορεί να εξηγηθεί από τον αποκλεισμό των προσβεβλημένων μελών της οικογένειας που δεν υποβλήθηκαν σε γενετική ανάλυση.16 Επιπλέον, έχουν αναφερθεί διαοικογενειακές και ενδοοικογενειακές παραλλαγές σε ασθενείς με παραλλαγές MUC1,8,17,18 αν και η ύπαρξη τροποποιητών γονιδίων ή άλλων παραγόντων παραμένει άγνωστη. Την ίδια περίοδο μελέτης, εντοπίσαμε επίσης μεταλλάξεις στο HNF1B, ένα αιτιολογικό γονίδιο για το ADTKD, σε 19 ασθενείς. Ωστόσο, ασθενείς με κλινικά ύποπτες μεταλλάξεις HNF1B αποκλείστηκαν από τη μελέτη μας κατά την εγγραφή, επειδή οι περισσότεροι από αυτούς τους ασθενείς ήταν κλινικά διακριτοί από εκείνους με ADTKD-MUC1 λόγω μορφολογικών ανωμαλιών στο νεφρικό ουροποιητικό σύστημα ή/και αυτοσωμικού επικρατούς οικογενειακού ιστορικού πρώιμης έναρξης διαβήτη και/ή υπομαγνησιαιμία, και έχουμε αναφέρει προηγουμένως για αυτόν τον πληθυσμό ασθενών.19 Πράγματι, μια αναφορά συναίνεσης για τη νεφρική νόσο: βελτίωση των παγκόσμιων αποτελεσμάτων και η πρόσφατη ανασκόπηση του ADTKD πρότειναν ότι ο όρος ADTKD-HNF1B θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο για τις περιπτώσεις ποια σωληναρισιακή διάμεση ίνωση των νεφρών είναι η κύρια εκδήλωση, επειδή μόνο λίγες περιπτώσεις παρουσιάζουν μόνο σωληναρισμενική νόσο.1,20 Η παιδική αναιμία, η ήπια υπόταση και η ήπια υπερκαλιαιμία πιστεύεται ότι είναι ειδικά χαρακτηριστικά της ADTKD-REN. Ωστόσο, μια πρόσφατη διεθνής μελέτη κοόρτης για κλινικά χαρακτηριστικά 111 ασθενών με ADTKD-REN ανέφερε ότι περίπου το 70 τοις εκατό των ασθενών προσήλθαν σε ιατρικά ιδρύματα για χρόνια νεφρική νόσο ή ουρική αρθρίτιδα.21 Σύμφωνα με αυτήν την αναφορά, η παιδική αναιμία ήταν παρούσα στο 75,8 τοις εκατό των ασθενών. ασθενείς αλλά η σοβαρότητά του ήταν σχετικά ήπια. Τα μέσα επίπεδα αιμοσφαιρίνης ήταν 9,6, 10,1 και 10,5 g/dl για ηλικίες<10 years, 10 to <15 years, and 15 to <20 years, respectively.21 Although hypotension was not reported in the article, the severity of hyperkalemia was mild and the mean serum potassium level in patients who were not taking fludrocortisone was 4.8 mEq/l.21 Childhood anemia, hypotension, or hyperkalemia may often be overlooked, and they are not always specific to ADRKD-REN; thus, we did not exclude participants with these findings. ADTKD-SEC61A1 is much rare than other ADTKD subtypes, with 6 families reported as of date.22 Patients harboring SEC61A1 mutation present with specific features, such as intrauterine growth retardation, cleft palate, congenital anemia, neutropenia, and immunodeficiency.3,22 Although the clinical manifestations of ADTKD-REN have not been completely clarified owing to the small number of reported cases, patients presenting with these specific features can be clearly distinguished from those with ADTKD-MUC1.

Cistanche tubulosa

Πρόσφατες μελέτες σχετικά με τους μοριακούς και κυτταρικούς μηχανισμούς του ADTKD-MUC1 έχουν αποκαλύψει ότι αυτή η κατάσταση είναι μια τοξική πρωτεϊνοπάθεια που προκαλείται από την ενδοκυτταρική συσσώρευση κακώς διπλωμένης πρωτεΐνης MUC1.11,23 Οι Dvela-Levitt et al.24 ανέφεραν τη χρήση ενός μικρού μορίου, του BRD4780 , για να επαναδρομολογηθεί η εκκριτική οδός προς τα λυσοσώματα, τα αποκαλυπτικά MUC1fs εξαλείφθηκαν σε ποντίκια και οργανοειδή ασθενών και υπογραμμίζοντας τις θεραπευτικές δυνατότητες του BRD4780. Συνεπώς, μια ακριβής διάγνωση των παραλλαγών MUC1 μπορεί να είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών παραγόντων. Η μελέτη μας είχε αρκετούς περιορισμούς. Πρώτον, όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη μας ήταν Ιάπωνες και το μέγεθος του δείγματός μας ήταν μικρό λόγω της μικρής διάρκειας της μελέτης. Δεδομένης της αναδρομικής φύσης αυτής της μελέτης, δεν μπορέσαμε επίσης να λάβουμε διαχρονικές κλινικές πληροφορίες, όπως η νεφρική πρόγνωση. Δεύτερον, παρεμβολές μονής βάσης παρατηρήθηκαν ακόμη και σε αλληλόμορφα χωρίς μεταλλάξεις. Λόγω του υψηλού ποσοστού σφάλματος, ήταν δύσκολο να επιτευχθεί συναρμολόγηση υψηλής ποιότητας για την ανίχνευση παραλλαγών ενός νουκλεοτιδίου ή indels χρησιμοποιώντας ένα LRS. Ήταν απαραίτητος ο συνδυασμός τεχνολογιών αλληλούχισης για την ανίχνευση όλων των διαφορετικών τύπων γενετικών παραλλαγών, γεγονός που αυξάνει το κόστος και την πολυπλοκότητα των έργων. Έτσι, η PacBio επινόησε ένα νέο σύστημα αλληλούχισης, που ονομάζεται κυκλική συναινετική αλληλουχία. Η κυκλική συναινετική αλληλουχία παράγει αναγνώσεις υψηλής πιστότητας με ακρίβεια 99,8 τοις εκατό και μέσο μήκος 13,5 kilobase, γεγονός που μειώνει δραστικά το ποσοστό σφάλματος αλληλουχίας.25 Αυτή η μέθοδος αλληλουχίας εφαρμόστηκε επίσης στη μελέτη μας. Ως εκ τούτου, λαμβάνοντας υπόψη βελτιώσεις στην ακρίβεια προσδιορισμού αλληλουχίας, οι εισαγωγές μίας βάσης πιθανόν να προκλήθηκαν από σφάλμα PCR. Παρόλο που η πολυμεράση KOD Hot Start DNA έχει βελτιστοποιηθεί για την ενίσχυση των πιο δύσκολων στόχων,26 άλλες πολυμεράσες DNA, η πιστότητα των οποίων είναι υψηλότερη από αυτή του KOD (π.χ. Phusion), μπορεί να συμβάλλουν στη μείωση του ποσοστού σφάλματος PCR.27 Πρόσφατα μελέτες έχουν βρει ένα πρωτόκολλο χωρίς ενίσχυση για στοχευμένο εμπλουτισμό χρησιμοποιώντας το ομαδοποιημένο τακτικά ενδιάμεσο σύστημα σύντομων παλινδρομικών επαναλήψεων/Cas9.28,29 Αυτή η νέα μέθοδος πιθανότατα θα παρείχε καλύτερα αποτελέσματα. Τρίτον, δεν έχουμε επικυρώσει μια εναλλακτική μέθοδο που θα μπορούσε να διευκολύνει τη διάγνωση, όπως η ανοσοχρώση δειγμάτων νεφρών ή κυττάρων που προέρχονται από ούρα. Οι Kirby et al., 5 που ανέφεραν πρώτοι την αιτιολογική μετάλλαξη για το ADTKD-MUC1, πραγματοποίησαν ανοσοϊστοχημική ανάλυση δειγμάτων νεφρού από ασθενείς με μεταλλάξεις MUC1. Ανέφεραν ότι, αν και η ανοσοχρώση σε κανονικούς ελέγχους οδήγησε σε μη ειδική χρώση, οι ασθενείς με μεταλλάξεις MUC1 εμφάνισαν ένα συγκεκριμένο μοτίβο ενδοκυτταρικής χρώσης στον βρόχο του Henle, στα άπω σωληνάρια και στους συλλεκτικούς αγωγούς.5 Παρόμοιες αναλύσεις ανοσοχρώσης της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης MUC1 έχουν αναφερθεί. 11,13,18,30 Οι Yamamoto et al.15 ανίχνευσαν μεταλλαγμένη πρωτεΐνη MUC1 σε εξωσώματα ούρων. Αν και οι κλινικές εκδηλώσεις του ADTKD-MUC1 είναι μη ειδικές, αυτές οι μη γενετικές αναλύσεις μπορεί να υποστηρίξουν την κλινική διάγνωση. Επομένως, είναι απαραίτητο να επαληθεύσουμε τη χρησιμότητα αυτών των μη γενετικών αναλύσεων σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της μελέτης μας. Συμπερασματικά, η μελέτη μας αποκαλύπτει ότι η συνδυαστική γενετική ανάλυση με SRS και LRS είναι χρήσιμη για την ανίχνευση παραλλαγών MUC1 VNTR σε μια ιαπωνική κοόρτη και ότι ο επιπολασμός της ADTKD-MUC1 μπορεί να είναι υψηλός σε αυτόν τον πληθυσμό. Η συνδυαστική γενετική ανάλυση με χρήση SRS και LRS είναι πιθανό να βελτιώσει το ποσοστό διάγνωσης της ADTKD-MUC1 και μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη βέλτιστων θεραπευτικών προσεγγίσεων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Eckardt KU, Alper SL, Antignac C, et al. Αυτοσωμική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος: διάγνωση, ταξινόμηση και διαχείριση - μια συναινετική αναφορά KDIGO. Kidney Int. 2015; 88:676-683. https://doi.org/10. 1038/κι.28.2015

2. Bolar NA, Golzio C, Zivná M, et al. Οι ετερόζυγες μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας SEC61A1 προκαλούν αυτοσωματική επικρατούσα σωληναριακή διάμεση και σπειραματοκυστική νεφρική νόσο με αναιμία. Am J Hum Genet. 2016; 99:174–187. https://doi.org/ 10.1016/j.ajhg.2016.05.028

3. Devuyst Ο, Olinger Ε, Weber S, et αϊ. Αυτοσωμική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος. Nat Rev Dis Primers. 2019; 5: 60. https://doi.org/10.1038/s41572-019-0109-9

4. Patton S, Gendler SJ, Spicer AP. Η επιθηλιακή βλεννίνη, MUC1, του γάλακτος, του μαστικού αδένα και άλλων ιστών. Biochim Biophys Acta. 1995, 1241:407-423. https://doi.org/10.1016/0304-4157 (95)00014-3

5. Kirby Α, Gnirke Α, Jaffe DB, et αϊ. Οι μεταλλάξεις που προκαλούν μυελική κυστική νεφρική νόσο τύπου 1 βρίσκονται σε ένα μεγάλο VNTR στο MUC1 που χάνεται από μαζικά παράλληλη αλληλουχία. Nat Genet. 2013, 45: 299–303. https://doi.org/10.1038/ng.2543

6. Ekici ΑΒ, Hackenbeck Τ, Morinière V, et αϊ. Η νεφρική ίνωση είναι το κοινό χαρακτηριστικό των αυτοσωμικών κυρίαρχων σωληναρισιακών νεφρικών παθήσεων που προκαλούνται από μεταλλάξεις στη βλεννίνη 1 ή την ουρομοντουλίνη. Kidney Int. 2014;86:589–599. https://doi.org/10.1038/ki. 2014.72

7. Wenzel Α, Altmueller J, Ekici ΑΒ, et αϊ. Η αλληλουχία ενός μορίου σε πραγματικό χρόνο στο ADTKD-MUC1 επιτρέπει την πλήρη συναρμολόγηση του VNTR και την ακριβή τοποθέτηση των αιτιολογικών μεταλλάξεων. Sci Rep. 2018; 8:4170. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22428-0

8. Wang GQ, Rui HL, Dong HR, et al. Η αλληλουχία SMRT αποκαλύφθηκε ότι είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τη διάγνωση ADTKD-MUC1 μέσω ανάλυσης παρακολούθησης μιας κινεζικής οικογένειας. Sci Rep. 2020;10:8616. https://doi.org/10.1038/s41598-020-65491-2

9. Richards S, Aziz Ν, Bale S, et al. Πρότυπα και οδηγίες για την ερμηνεία των παραλλαγών αλληλουχίας: μια κοινή συναινετική σύσταση του Αμερικανικού Κολλεγίου Ιατρικής Γενετικής και Γονιδιωματικής και της Ένωσης Μοριακής Παθολογίας. Genet Med. 2015; 17:405–424. https://doi.org/10.1038/ gim.30.2015

10. Kanda Y. Διερεύνηση του ελεύθερα διαθέσιμου εύχρηστου λογισμικού «EZR» για ιατρικές στατιστικές. Μεταμόσχευση μυελού των οστών. 2013; 48:452-458. https://doi.org/10.1038/bmt.2012.244

11. Robinson JT, Thorvaldsdóttir Η, Winckler W, et al. Ενσωματωμένο πρόγραμμα προβολής γονιδιωματικών. Nat Biotechnol. 2011; 29:24–26. https://doi. org/10.1038/nbt.1754

12. Zivná M, Kidd K, P ristoupilová A, et al. Μη επεμβατική ανοσοϊστοχημική διάγνωση και νέες μεταλλάξεις MUC1 που προκαλούν αυτοσωμική κυρίαρχη σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσο [η δημοσιευμένη διόρθωση εμφανίζεται στο J Am Soc Nephrol. 2020; 31: 892]. J Am Soc Nephrol. 2018; 29:2418–2431. https://doi.org/ 10.1681/ASN.2018020180

13. Cormican S, Connaughton DM, Kennedy C, et αϊ. Αυτοσωμική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος (ADTKD) στην Ιρλανδία. Ρεν Φάιλ. 2019; 41:832–841. https://doi.org/10.1080/ 0886022X.2019.1655452

14. Gast C, Marinaki A, Arenas-Hernandez M, et al. Η αυτοσωμική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος - το UMOD είναι η πιο συχνή μη πολυκυστική γενετική νεφρική νόσος. BMC Nephrol. 2018; 19:301. https://doi.org/10.1186/s12882-018- 1107-y

15. Yamamoto S, Kaimori JY, Yoshimura Τ, et al. Η ανάλυση μιας οικογένειας ADTKD με μια νέα μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου στο MUC1 αποκαλύπτει χαρακτηριστικά γνωρίσματα της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης MUC1. Μεταμόσχευση Nephrol Dial. 2017; 32:2010–2017. https://doi.org/10. 1093/ndt/gfx083

16. Olinger Ε, Hofmann Ρ, Kidd Κ, et αϊ. Κλινικά και γενετικά φάσματα αυτοσωμικής επικρατούσας σωληναριδικής διάμεσης νεφρικής νόσου λόγω μεταλλάξεων σε UMOD και MUC1. Kidney Int. 2020; 98:717-731. https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.04.038

17. Bleyer AJ, Kmoch S, Antignac C, et αϊ. Μεταβλητή κλινική παρουσίαση μιας μετάλλαξης MUC1 που προκαλεί μυελική κυστική νεφρική νόσο τύπου 1. Clin J Am Soc Nephrol. 2014; 9:527– 535. https://doi.org/10.2215/CJN.06380613

18. Ayasreh Ν, Bullich G, Miquel R, et αϊ. Αυτοσωμική επικρατούσα σωληναρισιακή διάμεση νεφρική νόσος: κλινική παρουσίαση ασθενών με ADTKD-UMOD και ADTKD-MUC1. Am J Kidney Dis. 2018; 72:411–418. https://doi.org/10.1053/j.ajkd.2018.03. 019

Eri Okada1,2 , Naoya Morisada1,3 , Tomoko Horinouchi1 , Hideki Fujii4 , Takayuki Tsuji5 , Masayoshi Miura6 , Hideyuki Katori7 , Masashi Kitagawa8 , Kunio Morozumi9 , Takanobu Toriyamayukamuri10,10, 1 , Atsushi Kondo1 , Yuya Aoto1 , Shinya Ishiko1, Rini Rossanti1, Nana Sakakibara1, China Nagano1, Tomohiko Yamamura1, Shingo Ishimori1, Joichi Usui2, Kunihiro Yamagata2, Kazumoto Iijima13,14, Toshiyuki Imasawa11 και Kandai