Το συζυγές δενδριμερές-τεσαγλιταζάρ προκαλεί μετατόπιση φαινοτύπου της μικρογλοίας και ενισχύει την αμυλοειδική φαγοκυττάρωση† Μέρος 1

Η αλλαγή της μικρογλοίας από μια κατάσταση επιδείνωσης της νόσου, «προφλεγμονώδη» σε νευροπροστατευτικό, «αντιφλεγμονώδες» φαινότυπο είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την αντιμετώπιση πολλαπλών νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Τα μικρογλοία είναι ένας τύπος κυττάρου στο κεντρικό νευρικό σύστημα που είναι κυρίως υπεύθυνος για τη διατήρηση της υγείας και της λειτουργίας των νευρώνων. Μπορούν να εκκρίνουν μια ποικιλία αυξητικών παραγόντων και νευροτροφικών παραγόντων και μπορούν να διατηρήσουν τη φυσιολογική μεταβολική δραστηριότητα των νευρώνων καθαρίζοντας τα άχρηστα υλικά γύρω από τους νευρώνες. Μελέτες τα τελευταία χρόνια έχουν δείξει ότι η μικρογλοία σχετίζεται στενά με τη μνήμη. Ας το ρίξουμε μια ματιά μαζί.

Πρώτον, η μικρογλοία μπορεί να διεγείρει τους νευρώνες και να προάγει την ενεργοποίηση των νευρώνων, ενισχύοντας έτσι τη μνήμη. Με την απελευθέρωση μιας σειράς νευροδιαβιβαστών, όπως το γλουταμικό και η αλανίνη, η μικρογλοία μπορεί να προωθήσει τη μετάδοση σήματος μεταξύ των νευρώνων και μπορεί να ενισχύσει τον συντονισμό σήματος νευρογλοίας μεταξύ των προσυναπτικών μεμβρανών, προωθώντας περαιτέρω τη νευρωνική διεγερσιμότητα και το σχηματισμό μνήμης.

Δεύτερον, η μικρογλοία μπορεί επίσης να καθαρίσει τα απόβλητα γύρω από τους νευρώνες, να διατηρήσει τη φυσιολογική μεταβολική δραστηριότητα των νευρώνων και να μειώσει τη θνησιμότητα των νευρώνων, προάγοντας έτσι τη βελτίωση της μνήμης. Όταν συσσωρεύονται πάρα πολλά σκουπίδια γύρω από τους νευρώνες, θα επηρεάσει τη φυσιολογική μεταβολική δραστηριότητα των νευρώνων, οδηγώντας σε νευρωνικό θάνατο και εξασθενημένη λειτουργία, μειώνοντας έτσι την απόδοση της μνήμης. Η μικρογλοία μπορεί να διατηρήσει το φυσιολογικό μεταβολικό περιβάλλον των νευρώνων και να μειώσει τη θνησιμότητα των νευρώνων καταπίνοντας και αποσυνθέτοντας τα γύρω απόβλητα, βελτιώνοντας έτσι τη μνήμη.

Συνοπτικά, τα μικρογλοία σχετίζονται στενά με τη μνήμη. Προάγοντας τη διέγερση των νευρώνων και καθαρίζοντας τα γύρω απόβλητα, η μικρογλοία μπορεί να βελτιώσει περαιτέρω τη μνήμη και να διατηρήσει τον εγκέφαλό μας υγιή και ενεργό. Θα πρέπει να δώσουμε προσοχή στην προστασία της υγείας των μικρογλοίων για να πετύχουμε καλύτερη μνήμη. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Τα προφλεγμονώδη μικρογλοία συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου απελευθερώνοντας νευροτοξικές ουσίες και επιταχύνοντας τη συσσώρευση παθογόνων πρωτεϊνών. Αμφότεροι οι αγωνιστές PPAR και PPAR έχουν αποδειχθεί ότι μετατοπίζουν τη μικρογλοία από έναν προφλεγμονώδη («Μ1-όμοιο») σε έναν εναλλακτικά ενεργοποιημένο («Μ2-όμοιο») φαινότυπο. Τέτοιες στρατηγικές έχουν διερευνηθεί σε κλινικές δοκιμές για νευρολογικές ασθένειες, όπως το Αλτσχάιμερ και η νόσος του Πάρκινσον, αλλά πιθανότατα έχουν αποτύχει λόγω της κακής διείσδυσής τους στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB).

Δενδριμερή πολυαμιδοαμίνης με τερματικά υδροξυλικά (χωρίς την προσκόλληση οποιουδήποτε συνδετήρα στόχευσης) έχει αποδειχθεί ότι διασχίζουν το εξασθενημένο BBB στο σημείο της νευροφλεγμονής και συσσωρεύονται σε ενεργοποιημένα μικρογλοία.

Επομένως, η σύζευξη δενδριμερούς ενός PPAR/διπλού αγωνιστή μπορεί να επιτρέψει τη στοχευμένη εναλλαγή φαινοτύπου της ενεργοποιημένης μικρογλοίας. Εδώ παρουσιάζουμε τη σύνθεση και τον χαρακτηρισμό ενός νέου συζυγούς δενδριμερούς-PPAR / διπλού αγωνιστή (D-tesaglitazar).

In vitro, το D-tesaglitazar επάγει μια μετατόπιση φαινοτύπου «Μ1 σε Μ2», μειώνει την έκκριση δραστικών ειδών οξυγόνου, αυξάνει την έκφραση των γονιδίων για φαγοκυττάρωση και ενζυματική αποικοδόμηση παθογόνων πρωτεϊνών (π.χ. -αμυλοειδές, -συνουκλεΐνη) και αυξάνει την -αμυλοειδική φαγοκυττάρωση.

Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την περαιτέρω ανάπτυξη του D-tesaglitazar προς μετάφραση για πολλαπλές νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ιδιαίτερα για τη νόσο του Αλτσχάιμερ και τη νόσο του Πάρκινσον.

Εισαγωγή

Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, υπάρχουν επί του παρόντος πάνω από 5,3 εκατομμύρια άτομα με νόσο του Αλτσχάιμερ (AD) και 1 εκατομμύριο άτομα με νόσο του Πάρκινσον (PD). θα συνεχίσει να αυξάνεται καθώς ο πληθυσμός συνεχίζει να μεγαλώνει.

Επιπλέον, η έλλειψη πρόσφατης επιτυχίας στην ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τη θεραπεία αυτών των ασθενειών έχει υπογραμμίσει την ανάγκη για ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών.2,3 Αυτές οι κλινικές αποτυχίες υπογραμμίζουν τις δυσκολίες στην ανάπτυξη ενός φαρμάκου, συμπεριλαμβανομένης της παροχής υψηλής συγκέντρωσης του φαρμάκου στον εγκέφαλο για αποτελεσματικότητα χωρίς προκαλώντας δυσμενείς παρενέργειες.

Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η AD και η PD μοιράζονται τρία κύρια νευροπαθολογικά συστατικά: νευροφλεγμονή, συσσώρευση παθογόνων πρωτεϊνών και νευρωνικό θάνατο.4–7 Οι ανθυγιεινοί άνθρωποι, το έμφυτο ανοσοποιητικό κύτταρο του εγκεφάλου (themicroglia) φαγοκυτταρώνει συνεχώς τις λανθασμένες πρωτεΐνες (π.χ. αμυλοειδές, -synucleoid ) που προκαλούν νευρωνικό θάνατο καθώς παράγονται, γεγονός που εμποδίζει τον σχηματισμό των συσσωματωμάτων χαρακτηριστικών.

Ωστόσο, σε άτομα που τελικά αναπτύσσουν νευροεκφυλιστικές ασθένειες, η μικρογλοία δεν αφαιρεί πλέον αποτελεσματικά αυτές τις πρωτεΐνες και μετατοπίζεται σε έναν προφλεγμονώδη φαινότυπο που επιδεινώνει τη νόσο (που χαρακτηρίζεται συνήθως ως Μ1).

Ενώ η κατά κύριο λόγο προφλεγμονώδης/αντιφλεγμονώδης ταξινόμηση (M1/M2) της μικρογλοιακής ενεργοποίησης είναι μια υπεραπλούστευση του φάσματος της πόλωσης των μακροφάγων, εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ως ευρεία ονοματολογία για να περιγράψει τον κυρίαρχο φαινότυπο της μικρογλοίας στη θεραπεία νευροφλεγμονής και απόκρισης.

Μ1-όπως τα μικρογλοία απελευθερώνουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου και άλλους φλεγμονώδεις μεσολαβητές που προκαλούν νευρωνικό θάνατο και επιδεινώνουν την παθολογία της νόσου αυξάνοντας την παραγωγή παθογόνων πρωτεϊνών (π.χ. -αμυλοειδές, -συνουκλεΐνη).

Επιπλέον, οι κύριοι γενετικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη AD (TREM2 και APOE) εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη μικρογλοία και η οδός TREM2/APOE έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί μετατόπιση του μικρογλοιακού φαινοτύπου στην AD, την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (ALS) και τη σκλήρυνση κατά πλάκας ζωικά μοντέλα.8

Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν περαιτέρω το ρόλο της μικρογλοίας στην παθολογία πολλαπλών ανθρώπινων νευροεκφυλιστικών νόσων. Μια προσέγγιση για τη χειραγώγηση του φαινοτύπου της μικρογλοίας θα επέτρεπε στους ερευνητές να κατανοήσουν τον ρόλο τους στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες, εκτός από το ότι είναι δυνητικά αποτελεσματικό θεραπευτικό.

Η αλλαγή μικρογλοίας από Μ1 σε αντιφλεγμονώδη και νευροπροστατευτικό (Μ2) φαινότυπο έχει προταθεί ως θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία πολλαπλών νευροεκφυλιστικών ασθενειών.5,6 Δύο επί του παρόντος εγκεκριμένοι από την FDA αγωνιστές PPAR, φάρμακα τύπου ΙΙ για διαβήτη η ροσιγλιταζόνη και η πιογλιταζόνη, έχουν αποδειχθεί ότι προκαλούν Μετατόπιση φαινοτύπου Μ1 σε Μ2 σε μακροφάγα και μικρογλοία in vitro και in vivo.

9,10 αγωνιστές PPAR έχουν αποδειχθεί ότι μειώνουν την επαγόμενη από το LPS έκκριση αντιδραστικών ειδών οξυγόνου μειώνοντας τη δραστηριότητα του NF-κB προκαλώντας αποικοδόμηση και εξαγωγή του NF-κB από τον πυρήνα, καθώς και εξαρτώμενη από συνδέτη μετακαταστολή.11

Επιπλέον, επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με διαβήτη που λαμβάνουν ροσιγλιταζόνη ή πιογλιταζόνη διατρέχουν μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης AD και PD.12 Στη συνέχεια, η ροσιγλιταζόνη και η πιογλιταζόνη διερευνήθηκαν μέσω κλινικών δοκιμών φάσης ΙΙΙ για AD, αλλά απέτυχαν.13

Μια πιθανή εξήγηση για την αποτυχία των προαναφερθέντων κλινικών δοκιμών είναι η κακή μεταφορά αυτών των φαρμάκων μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB), περιορίζοντας έτσι τον αριθμό των φαρμάκων που έφτασαν στον εγκέφαλο των ασθενών που συμμετείχαν σε αυτές τις κλινικές δοκιμές.14

Πράγματι, εκτιμάται ότι το BBB εμποδίζει περίπου το 98% όλων των μικρομορίων φαρμάκων να φτάσουν στον εγκέφαλο, και μόνο ένα κλάσμα του φαρμάκου που εισέρχεται στον εγκέφαλο φτάνει στη μικρογλοία.15

Επιπλέον, ο PPAR είναι ένας άλλος πυρηνικός υποδοχέας στην οικογένεια PPAR.16 Επιδεικνύει ρόλο στην ομοιόσταση των λιπιδίων και στη ρύθμιση της φλεγμονής και οι αγωνιστές PPAR έχουν επίσης αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα στη μικρογλοία.

Κλινικές μελέτες που χρησιμοποιούν νευροαπεικόνιση, μεταθανάτια ανάλυση ιστών και βιοδείκτες ΕΝΥ έχουν παράσχει στοιχεία ότι το BBB είναι εξασθενημένο σε AD και PD, καθώς και σε άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες.

17 Δενδριμερή πολυαμιδοαμίνης (G4-PAMAM-OH) γενιάς-4 με τερματισμό υδροξυλίου (G4-PAMAM-OH) έχει αποδειχθεί ότι παρακάμπτουν εγγενώς την εξασθενημένη ΒΒΒ και συσσωρεύονται σε ενεργοποιημένα μικρογλοία χωρίς την ανάγκη στόχευσης προσδέματα, μετά από συστηματική χορήγηση σε πολλαπλά διαφορετικά μοντέλα νευροφλεγμονών. , συμπεριλαμβανομένων σε τρωκτικά, κουνέλια, σκύλους και μη ανθρώπινα πρωτεύοντα.18–28 Σημαντικά, το G4-PAMAM-OH μπορεί να χορηγηθεί συστηματικά και να διασχίσει το BBB σε μοντέλα ασθενειών με ήπια διαταραχή του BBB όπως το σύνδρομο Rett.29

Επιπλέον, ο βαθμός πρόσληψης του G4-PAMAM-OH στον εγκέφαλο είναι ευθέως ανάλογος με τη σοβαρότητα της νόσου σε ένα μοντέλο κουνελιού εγκεφαλικής παράλυσης. το κρανίο που απαιτείται σε προηγούμενες μελέτες με άλλα νανοσωματίδια όπως πολυ-εκαπρολακτόνη και PEG, αρνητικά φορτισμένα δενδριμερή PAMAM, κβαντικές κουκκίδες και νανοσκευάσματα που αποτελούνται από πολυαιθυλενοϊμίνη (PEI) και θειική δεξτράνη.31–35

Επιπλέον, αυτά τα υδροξυλικά δενδριμερή PAMAM είναι ιδανικά τοποθετημένα για μετάφραση λόγω της επεκτασιμότητας τους και είναι καλά ανεκτά in vivo προφίλ ασφαλείας.36–38 Λόγω των θετικών προκλινικών δεδομένων αποτελεσματικότητας, ένα (G4-PAM-OH)-N- Το σύζευγμα ακετυλοκυστεΐνης αξιολογείται επί του παρόντος σε πρώιμες κλινικές δοκιμές για την παιδική εγκεφαλική αδρενολευκοδυστροφία (NCT03500627) και τη σοβαρή φλεγμονή που σχετίζεται με τη νόσο του κορωνοϊού 2019 (COVID{-19) (NCT04458298).

Μελετήσαμε ένα συζυγές δενδριμερούς-φαρμάκου του tesaglitazar(Tesa) συνδεδεμένο με την παραγωγή-4 με τερματικό υδροξυλικό PAMAM δενδριμερές. Το Tesaglitazar είναι ένας ισχυρός PPAR/διπλός αγωνιστής που συνδυάζει τις ευεργετικές επιδράσεις των αγωνιστών PPAR και PPAR. Περιέχει μια λειτουργική ομάδα καρβοξυλικού οξέος για ομοιοπολική σύζευξη με το δενδριμερές και για επακόλουθη απελευθέρωση.

Πρόσθετες κιθάρες έχουν αναπτυχθεί και δοκιμαστεί κλινικά, αλλά η Tesa επιλέχθηκε λόγω της μεγαλύτερης αναλογίας δραστηριότητας PPAR προς PPAR, της σχετικά απλής χημικής δομής και του προφίλ ασφαλείας.39–43

Το Tesa είχε προηγουμένως φτάσει σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙΙ για διαβήτη τύπου 2 στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, αλλά απέτυχε λόγω δοσοεξαρτώμενης τοξικότητας, η οποία μπορεί να αποφευχθεί με τη μείωση της απαραίτητης δόσης χορήγησης από την ελεγχόμενη χορήγηση δενδριμερών.39,40,44Δεδομένου ότι το Tesa είναι PPAR / διπλός αγωνιστής, η στοχευμένη παροχή του σε ενεργοποιημένη μικρογλοία στο σημείο της νευροφλεγμονής θα μπορούσε να είναι εξαιρετικά ευεργετική.

Εδώ, δείχνουμε τη σύνθεση και τον χαρακτηρισμό ενός συζυγούς δενδριμερούς-τεσαγλιταζάρ (D-Tesa) και επιδεικνύουμε την ικανότητα αυτής της ένωσης να προκαλεί μια μετατόπιση φαινοτύπου «M1 toM2» στη μικρογλοία και να ενισχύει τη φαγοκυττάρωση με φθορισμό επισημασμένο αμυλοειδές.

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

1-[3-(Διμεθυλαμινο)προπυλ]-3-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο μεθειοδίδιο(EDC), 4(διμεθυλαμινο)πυριδίνη (DMAP), CuSO4·5H2O, ασκορβικό νάτριο, εξυνοϊκό οξύ και αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich ΗΠΑ και χρησιμοποιήθηκαν ως παραληφθέντες (St Louis, MO).

Το Tesaglitazar ελήφθη από την AstaTech Inc. (Bristol, ΡΑ). Δενδριμερές PAMAM με πυρήνα αιθυλενοδιαμίνης (γενιά 4 με 64 τελικές ομάδες υδροξυλίου) ελήφθη από την Dendritech Inc. (Midland, ΜΙ) ως διάλυμα σε μεθανόλη.

Το δενδριμερές αποθηκεύτηκε σε μεθανόλη στους 4 βαθμούς και η μεθανόλη εξατμίστηκε πριν από τη χρήση. Μια μεμβράνη αιμοκάθαρσης με αποκοπή μοριακού βάρους (MWCO) 1 kDa αγοράστηκε από την Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Όλοι οι άλλοι διαλύτες χρησιμοποιήθηκαν όπως ελήφθησαν στην άνυδρη μορφή τους. Όλες οι αντιδράσεις, εκτός από τις αντιδράσεις κλικ με καταλυόμενη κυκλοπροσθήκη αλκυνοαζιδίου (CuAAC) χαλκού(Ι), διεξήχθησαν υπό άνυδρες συνθήκες σε οργανικό μέσο με γυάλινα σκεύη αποξηραμένα σε φούρνο υπό αδρανές άζωτο ατμόσφαιρα.

Για κυτταρική καλλιέργεια: Το Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ο εμβρυϊκός ορός βοοειδών (FBS), η πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (P/S), η 0.05% τρυψίνη-EDTA και το αντιδραστήριο MTT ελήφθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA , ΗΠΑ).

Το αντιδραστήριο Griess ελήφθη από την Promega (Madison, WI) και το TNF-ELISA ελήφθη από την R&D Systems (Minneapolis, MN). Μεθανόλη αναλυτικής ποιότητας αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich. Το μπλε τρυπανίου ελήφθη από την Corning (Manassas, VA, ΗΠΑ).

Διαδικασίες σύνθεσης συζυγών D-Tesa
Το μονοαζίδιο της τετρααιθυλενογλυκόλης (2) συντέθηκε χρησιμοποιώντας πρωτόκολλο που είχε δημοσιευθεί προηγουμένως.45

Σύνθεση και καθαρισμός Tesa-TEG-αζιδίου (3).
Το Tesa (950 mg, 2,32 mmol) διαλύθηκε σε 10 ml διμεθυλοφορμαμιδίου (DMF). Σε αυτό το αναδευόμενο διάλυμα, προστέθηκε στάγδην μονοαζίδιο τετραμεθυλενογλυκόλης (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) σε DMF (1 ml). Στη συνέχεια προστέθηκαν DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) και EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) στο μίγμα της αντίδρασης και η αντίδραση αναδεύτηκε υπό καθαρισμό αζώτου σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες.

Η αντίδραση παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία λεπτής στιβάδας και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Το μίγμα της αντίδρασης αραιώθηκε με 100 ml διχλωρομεθανίου (DCM) και το ακατέργαστο μίγμα αντίδρασης μεταφέρθηκε σε διαχωριστική χοάνη και η οργανική στιβάδα στη συνέχεια πλύθηκε τρεις φορές με κορεσμένο διάλυμα διττανθρακικού νατρίου, ακολουθούμενο από κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου αμμωνίου και τέλος με άλμη.

Η οργανική στιβάδα στη συνέχεια ξηράνθηκε με άνυδρο θειικό νάτριο. Ο διαλύτης στην οργανική στιβάδα στη συνέχεια απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστήρα και το διάλυμα επαναδιαλύθηκε σε 3 ml DCM και απορροφήθηκε σε πυριτική πηκτή για να καθαριστεί με σύστημα χρωματογραφίας CombiFlash® χρησιμοποιώντας μια μέθοδο βαθμίδωσης με οξικό αιθυλεστέρα/εξάνιο ως διαλύτες για να παραχθεί 3 ως διαυγές -κίτρινο λάδι.

Το επιθυμητό, ​​καθαρό προϊόν εκλούεται σε περίπου 30–40% οξικό αιθυλεστέρα. (Απόδοση: 70%) 1Η NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J=8.6 Hz, 2Η), 7.15 (d, J=1.9 Hz, 2Η), 7.08 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.73 (d, J=8.6 Hz, 2H), 4.25–4.14 (m, 2H), 4.07 (t, J {{ 33}}.8 Hz, 2H), 3.94 (dd, J =7.8, 5.2 Hz, 1H), 3.67–3.47 (m, 14H), 3.30 (dd, J=8.7 , 3.8 Hz, 2H), 3.06 (s, 3H), 3.02 (t, J=6.7 Hz, 2H), 2.91–2.84 (m, 2H), 1.08 (t, J=7 0,0 Hz, 3Η).ESI-MS: θεωρητικό C28H39N3O10S: 609,24, ληφθέν (Μ + 1):610,13.

Σύνθεση και καθαρισμός D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) προστέθηκαν σε ένα αναδευόμενο διάλυμα G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) σε 20 ml άνυδρου DMF. Σε αυτό το μίγμα, προστέθηκαν DMAP (430 mg, 3,52 mmol) και EDC (1 g, 5,28 mmol).

Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε με καθαρισμό αζώτου για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρθηκε σε σωλήνα αιμοκάθαρσης 1000 MWCO Διεξήχθη διαπίδυση DMF για 24 ώρες και το DMF άλλαζε περίπου κάθε έξι ώρες.

Στη συνέχεια διεξήχθη αιμοκάθαρση με απιονισμένο νερό (DI) για 24 ώρες, με το νερό να αλλάζει περίπου κάθε έξι ώρες. Τέλος, τα προκύπτοντα περιεχόμενα του σωλήνα αιμοκάθαρσης λυοφιλοποιήθηκαν για 48 ώρες, αποδίδοντας μια λευκή, αφράτη σκόνη. (Απόδοση: 61%). επιφάνεια δενδριμερούς ΟΗ), 4,01 (t, εστέρας –CH2), 3,32 (m, δενδριμερές –CH2), 3,06 (m, δενδριμερές και συνδετήρας –CH2), 2,85–2,58 (m, δενδριμερές –CH2), 2,56–1,89 (m, δενδριμερές και συνδέτης –CH2), 1,78–1,61 (m, συνδετήρας –CH2). Σύνθεση και καθαρισμός του D-Tesa (6).

Tesa-TEG-αζίδιο (3.177,8 mg, 0.3{{1{0}}3 mmol) προστέθηκε σε ένα αναδευόμενο μίγμα D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) σε 5 ml ενός μίγματος 1: 1 τετραϋδροφουρανίου (THF) και νερού με 0,5 ml DMF σε φιαλίδιο 20 ml ασφαλές για αντιδραστήρες μικροκυμάτων. Για την αντίδραση κλικ CuAAC, πενταένυδρος θειικός χαλκός (11,6 mg, 0,0467 mmol) και (+)-λασκορβικό νάτριο (9,3 mg, 0,0467 mmol) προστέθηκαν στο μίγμα αντίδρασης.

Το φιαλίδιο σφραγίστηκε και το δοχείο αντίδρασης στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε έναν αντιδραστήρα μικροκυμάτων Biotage® Initiator και αντέδρασε υπό ακτινοβολία μικροκυμάτων 20 W με ανάδευση για 8 ώρες στους 50 βαθμούς. Το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα αιμοκάθαρσης 1000 MWCO και διεξήχθη διαπίδυση με DMF για 24 ώρες, με το DMF να αντικαθίσταται από φρέσκο ​​διαλύτη περίπου κάθε 4 ώρες.

Στη συνέχεια, τα περιεχόμενα του σωλήνα αιμοκάθαρσης μεταφέρθηκαν σε σωλήνα afalcon και προστέθηκε ισοδύναμη ποσότητα DI νερού. Επιπλέον, 200 μl διαλύματος δινάτριου άλατος αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος προστέθηκαν στα περιεχόμενα του σωλήνα Falcon.

Αυτό το μίγμα στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε ένα νέο σωληνάριο αιμοκάθαρσης 1000 MWCO και διεξήχθη αιμοκάθαρση για 12 ώρες σε 1000 ml DI νερού με προσθήκη διαλύματος EDTA ακολουθούμενη από αιμοκάθαρση για 12 ώρες.

Το μίγμα στη συνέχεια λυοφιλοποιήθηκε για 48 ώρες και κατέληξε σε μια λευκή, αφράτη σκόνη. (απόδοση: 64%) (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, συνδετήρας Η), 3,96 (dd, Tesa και συνδετήρας Η), 3,70 (m, Tesa και συνδετήρας Η) ,3,58–3,14 (m, δενδριμερές –CH2), 3,14–2.86 (m, δενδριμερές–CH2), 2,87–2,49 (m, δενδριμερές και συνδέτης –CH2), 2,25 (m, δενδριμερές –CH2) , 1,82-1,67 (m, συνδετήρας –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Τεχνικές χαρακτηρισμού

Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (NMR). Τα φάσματα NMR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker 500 MHz σε θερμοκρασία δωματίου. Οι χημικές μετατοπίσεις πρωτονίων (δ) αναφέρονται σε ppm.

Το 1H NMR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του αριθμού των μορίων Tesa που είναι συνδεδεμένα σε κάθε μόριο του D-Tesa με τη μέθοδο ολοκλήρωσης πρωτονίων, συγκρίνοντας τις κορυφές των εσωτερικών αμιδικών πρωτονίων του δενδριμερούς σε δ 7,6–8,2 ppm με αρωματικά πρωτόνια Tesa σε δ 7,36–6,76 methyl protons ανά άτομο Tesa στην αλειφατική περιοχή. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC).

Χρησιμοποιήθηκε HPLC (Waters Corporation, Milford, Μασαχουσέτη) εξοπλισμένη με δυαδική αντλία 1525, AF απαερίου In-Line, αυτόματο δειγματολήπτη 717 plus, ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου 2998 και ανιχνευτή πολλαπλών λφθορισμού 2475 σε διασύνδεση με το λογισμικό Waters Empower.

Χρησιμοποιήθηκε στήλη αντίστροφης φάσης Symmetry C18 (Tosoh, Ιαπωνία) με μέγεθος σωματιδίων 5 μm, μήκος 25 cm και εσωτερική διάμετρο 4,6 mm. Οι ενώσεις παρακολουθήθηκαν στα 210 nm και 254 nm χρησιμοποιώντας τους ανιχνευτές PDA.

Ο διαλύτης Α ήταν νερό ποιότητας HPLC με 0.1% τριφθοροξικό οξύ (TFA) και ο διαλύτης Β ήταν ακετονιτρίλιο (ACN) με 5% νερό και 0.1% TFA. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ξεκίνησε στο 1{ {7}}0 : 0 (ACN: νερό), μειώθηκε σε 10: 90 (νερό: ACN) σε 5 λεπτά, παρέμεινε σε αυτήν την πολικότητα για 15 λεπτά και επέστρεψε στο 100: 0 (ACN: νερό) σε 5 λεπτά. Ο ρυθμός ροής διατηρήθηκε στο 1 ml min−1. Φασματοσκοπία μάζας.

Το ESI-MS πραγματοποιήθηκε σε φασματόμετρο μάζας BrukermicroTOF-II χρησιμοποιώντας ακετονιτρίλιο/νερό (9:1) ως σύστημα διαλύτη. Τα μοριακά ιόντα ως πρωτονιωμένες κορυφές [M + nH]n+ ή προϊόντα προσθήκης [M + nX]n+ (X=Na, K ή NH4) χρησιμοποιήθηκαν για την επιβεβαίωση του εμπειρικού τύπου.

Δυναμική σκέδαση φωτός και ζ-δυναμικό. Ένας Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, UK) εξοπλισμένος με λέιζερ 50 mW He–Ne (633 nm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μεγέθους των σωματιδίων και της κατανομής ζ-δυναμικού. Το D-Tesa διαλύθηκε σε DI νερό σε συγκέντρωση 0.2 mg ml-1 για το DLS και σε 10 mM χλωριούχο νάτριο σε συγκέντρωση 0,1 mg ml-1 δυναμικό για ζ.

Οι μετρήσεις έγιναν στις 25 μοίρες, χρησιμοποιώντας γωνία σκέδασης 173 μοιρών όπως περιγράφηκε προηγουμένως.27,46Μελέτη απελευθέρωσης φαρμάκων. Το D-Tesa διαλύθηκε σε συγκέντρωση 1 mg ml−1 είτε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH 7,4) τομιμικές συνθήκες πλάσματος είτε σε διάλυμα κιτρικού νατρίου (pH 5,5) για να μιμηθούν λυσοσωμικές συνθήκες.

Εστεράσες από συκώτι χοίρου (από Sigma Aldrich) προστέθηκαν στο διάλυμα κιτρικού νατρίου στην αρχή της μελέτης απελευθέρωσης και ανανεώθηκαν περίπου κάθε 3 ημέρες κατά τη διάρκεια της μελέτης.

Κάθε φιαλίδιο περιείχε δείγμα 15 ml και ανακινούνταν συνεχώς στους 37 βαθμούς κατά τη διάρκεια του πειράματος. Σε διαφορετικά χρονικά σημεία, συλλέχθηκαν διπλά δείγματα 200 μΐ από κάθε ρΗ και η δραστικότητα εστεράσης στη συνέχεια σβήστηκε με την προσθήκη 200 μΙ μεθανόλης. Ως έλεγχος χρησίμευσαν δείγματα χρονικού σημείου μηδενικής ώρας.

Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς για να αποφευχθεί περαιτέρω οποιαδήποτε υδρόλυση. Τα δείγματα αναλύθηκαν περαιτέρω με HPLC και υπολογίστηκε το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (στα 210 nm) για την κορυφή ελεύθερου φαρμάκου. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη συσχετίστηκε με την ποσότητα του φαρμάκου που απελευθερώθηκε χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης όπου γνωστές συγκεντρώσεις ελεύθερης Tesa εκτελέστηκαν στην HPLC στα 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com