Διασταυρούμενη αντιδραστική, Φυσική IgG Αναγνώριση L. Major Προωθεί την εσωτερίκευση παρασίτων από δενδριτικά κύτταρα και προάγει την προστατευτική ανοσία

Αφηρημένη

Μηνύματα-κλειδιά

• Χρησιμοποιώντας διαφορετικά γενετικά τροποποιημένα ποντίκια, διαπιστώσαμε ότι αυτά τα αντισώματα μπορεί να είναι IgG, όχι μόνο IgM.

Λέξεις-κλειδιά

Leishmania major · Δενδριτικό κύτταρο · Β κύτταρο · Φυσικό IgG

Εισαγωγή

Λοιμώξεις από Leishmania spp. αποτελούν σημαντικό βάρος στις ενδημικές χώρες. Η εκδήλωση της νόσου κυμαίνεται από αυτοπεριοριζόμενη δερματική λεϊσμανίαση έως διάχυτη, υποτροπιάζουσα, βλεννογονοδερματική και σπλαχνική νόσο. Χωρίς θεραπεία, η σπλαχνική λεϊσμανίαση αποτελεί σοβαρή απειλή για τη ζωή του ξενιστή. Εμβόλιο δεν υπάρχει ακόμα. Θεραπευτικό και ισόβιοασυλία, ανοσίαέναντι αυτού του σημαντικού ενδοκυτταρικού παθογόνου εξαρτώνται από την ανάπτυξη κυττάρων Th1/Tc1 που παράγουν IFN, ενώ η επιμονή του παρασίτου και η εξέλιξη της νόσου σχετίζεται με κυριαρχία των κυττάρων Th2, ρυθμιστικά Τ κύτταρα και/ή Th17 αποκρίσεις. Η απελευθέρωση IFN οδηγεί σε παραγωγή ΝΟ που εξαλείφει τα παράσιτα.Προστατευτική ανοσίαεπάγεται από μολυσμένα δενδριτικά κύτταρα (DC). Μετά τον ενοφθαλμισμό της μείζονος Leishmania στο δέρμα από την αμμόμυγα, οι μορφές ζωής των παρασίτων του προμαστιγώτη καταπίνονται από μακροφάγα που κατοικούν στο δέρμα (MΦ) και ουδετερόφιλα. Εντός του MΦ, τα παράσιτα μεταμορφώνονται σε μη μαστιγωμένες μορφές ζωής μαστιγωτών και αναπαράγονται. Αργότερα, οι απελευθερωμένοι μαστιγώτες προσλαμβάνονται από άλλα κύτταρα-ξενιστές, όπως το DC. Τα μολυσμένα DC επεξεργάζονται παρασιτικά αντιγόνα και μεταναστεύουν σε λεμφαδένες αποστράγγισης και πρωταρχικά Τ κύτταρα. Η απελευθέρωση της IL-12, καθώς και άλλων κυτοκινών από μολυσμένο DC, κατευθύνει την εκπαίδευση Th1/Tc1 των ειδικών για παράσιτο Τ κυττάρων.

Ενώ το MΦ χρησιμοποιεί τον υποδοχέα συμπληρώματος (CR)3 για την πρόσληψη παρασίτων, στο DC, το Fc RI/III είναι υπεύθυνο γιαπαράσιτοεσωτερίκευση. Είναι ενδιαφέρον ότι νωρίς, η σχετιζόμενη με CR3-πρόσληψη παρασίτου οδηγεί σε σίγαση του μολυσμένου MΦ, ενώ σε καθιερωμένες λοιμώξεις, η Fc Rμεσολαβούμενη πρόσληψη μαστιγοτών από το MΦ προκαλεί αντιφλεγμονώδη παραγωγή IL-10 προάγοντας την ανάπτυξη Th2/Treg και παρασιτική επιμονή. Αντίθετα, η πρόσληψη παρασίτου που προκαλείται από Fc R σε DC, επάγει την ενεργοποίηση των κυττάρων, την εκκίνηση των CD4 Τ κυττάρων και επίσης διασταυρούμενη παρουσίαση αντιγόνου. Επομένως, η πρόσληψη παρασίτου που προκαλείται από αντισώματα από το DC είναι σημαντική για την ανάπτυξη προστασίας έναντι του παρασίτου. Η παραγωγή IgG κατά της Leishmania είναι επομένως προϋπόθεση για την αποτελεσματική (διασταυρούμενη) εκκίνηση των κυττάρων Th1/Tc1 που είναι ειδικά για τη Leishmania. Συνακόλουθα, απουσία Β κυττάρων, η ανάπτυξη της νόσου ήταν πιο σοβαρή με μεγαλύτερους όγκους αλλοιώσεων, υψηλότερα φορτία παρασίτων, καθυστερημένη εκκίνηση των Τ κυττάρων και μειωμένη παραγωγή IFNΓ. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η ειδική για τη Λεϊσμανία IgG ήταν παρούσα στους ορούς τη στιγμή της συσσώρευσης DC στις βλάβες.

Παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα πώς αναπτύσσεται η αρχική απόκριση των Β κυττάρων στο ίδιο το παράσιτο απουσία εκκίνησης των Β κυττάρων από μολυσμένο DC. Τα λεγόμενα φυσικά αντισώματα που αναγνωρίζουν το Leishmania spp. μπορεί να διευκολύνει νωρίςεσωτερίκευση παρασίτωναπό την DC. Επιπλέον, δεδομένου ότι οι μεμβράνες των παρασίτων περιέχουν φωσφατιδυλοσερίνη παρόμοια με αποπτωτικά σώματα,διασταυρούμενης αντίδρασηςτα αντισώματα μπορεί να παίζουν κάποιο ρόλο. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε εάν τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα που δημιουργούνται, π.χ. κατά τον υπερβολικό κυτταρικό θάνατο ή η φυσική IgG που αναγνωρίζει τη Λεϊσμανία που υπάρχει σε μη άνοσα ζώα, συμβάλλουν στη λήψη DC από παράσιτο για την προώθηση της εκκίνησης των Β κυττάρων και των Τ κυττάρων. Βρήκαμε ότι τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα από ορό ποντικού ή ανθρώπου καθώς και η «φυσική IgG» σε φυσιολογικό ορό ποντικού (NMS) συνδέονται με παράσιτα Leishmania, κάτι που επαρκεί για τηνπαράσιτοεσωτερίκευσηαπό το DC και προωθεί καλύτερα αποτελέσματα της νόσου in vivo.

Υλικό και μέθοδοι

Των ζώων

Ποντίκια C57BL/6 ηλικίας έξι έως οκτώ εβδομάδων αγοράστηκαν από την Janvier. Τα ποντίκια μMT με ανεπάρκεια Β κυττάρων παρασχέθηκαν γενναιόδωρα από τον Hansjörg Schild, Institute of Immunology, University Medical Center Mainz. Τα ποντίκια IgGi και IgMi (και τα δύο σε φόντο C57BL/6) περιγράφηκαν προηγουμένως. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα (SPF) στο Translational Animal Research Center (TARC) του Πανεπιστημίου Johannes Gutenberg, Mainz. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με εγκεκριμένη άδεια από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων της Περιφέρειας Rheinland-Pfalz.

Σύμφωνα με μελέτες με βότανα, έχει αποδειχθεί ότι το cistanche είναι ένα είδος μύκητα που χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική εδώ και αιώνες. Φτιάχνεται από τους αποξηραμένους μίσχους και τους μίσχους του μύκητα, ο οποίος αναπτύσσεται σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές της Ασίας. Συνήθως χρησιμοποιείται για ναβελτίωση της ανοσίας, ανακουφίζει από την κούραση και αντιμετωπίζει το κρυολόγημα και άλλες λοιμώξεις.

Έρευνες το έχουν δείξεικιστανάκιμπορεί να αυξήσει την παραγωγή αντισωμάτων, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν το σώμα να καταπολεμήσει ξένους εισβολείς όπως ιούς και βακτήρια. Έχει βρεθεί ότι αυξάνει τον αριθμό και τη δραστηριότητα των Τ κυττάρων, ενός τύπου λευκών αιμοσφαιρίων που είναι υπεύθυνοι για να βοηθούν το σώμα να αναγνωρίσει και να καταπολεμήσει τους επιβλαβείς εισβολείς.

Επιπρόσθετα, μελέτες έχουν δείξει ότι το κιστάνι μπορεί να μειώσει τη σοβαρότητα του κρυολογήματος, της γρίπης και άλλων ιογενών λοιμώξεων. Έχει βρεθεί ότι μειώνει τον χρόνο που χρειάζεται για να αναρρώσει το σώμα από ιογενείς ή βακτηριακές λοιμώξεις. Το cistanche μπορεί επίσης να μειώσει τη διάρκεια του πυρετού που προκαλείται από ορισμένους ιούς, καθώς και να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης δευτερογενών λοιμώξεων.

Επί πλέον,κιστανάκιείναι γνωστό ότι έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, οι οποίες μπορούν να μειώσουν τη φλεγμονή που σχετίζεται με ορισμένες ασθένειες. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι το δενδρόβιο μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της αποτελεσματικότητας ορισμένων αντιβιοτικών.

Κάντε κλικ στο Organic Cistanche Sold Near Me

Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστε μαζί μας στη διεύθυνση:david.deng@wecistanche.com

Συνολικά, η έρευνα υποδηλώνει ότι το κιστάνι μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπείαβελτίωσηασυλία, ανοσίακαι την καταπολέμηση διαφόρων λοιμώξεων. Μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της φυσικής άμυνας του οργανισμού, στη μείωση της σοβαρότητας και της διάρκειας των ασθενειών και μπορεί ακόμη και να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης δευτερογενών λοιμώξεων.

Παράσιτα και λοιμώξεις 

Αμαστιγώτες ή μετακυκλικοί προμαστιγώτες του L. major κλώνου VI (MHOM/IL/Friedlin) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αμαστιγώτες απομονώθηκαν από μολυσμένα αυτιά μΜΤ ποντικών με ανεπάρκεια BALB/c ή Β κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα απομονωμένα παράσιτα οψωνοποιήθηκαν με 5 τοις εκατό NMS, IMS ή αντι-PL για 10 λεπτά στους 37 βαθμούς και πλύθηκαν πριν από in vitro ή in vivo μολύνσεις.

Προσδιορισμός ορού, εμπλουτισμού IgG και δέσμευσης παρασίτων

Φυσιολογικός ορός ποντικού (NMS) δημιουργήθηκε από παρελθόντα ποντίκια C57BL/6, ενώ ο ανοσοποιητικός ορός (IS) λήφθηκε από θεραπευμένα ποντίκια που είχαν μολυνθεί με 2 × 10Ε5 μετακυκλικούς προμαστιγώτες της L. major για μεγαλύτερο ή ίσο έως 6 εβδομάδες. Οροί αντιφωσφολιπιδικού αντισώματος (PL) δημιουργήθηκαν με επαναλαμβανόμενη ανοσοποίηση με αποπτωτικά θυμοκύτταρα. Πριν από τη συλλογή του ορού, η επιτυχία της ανοσοποίησης επαληθεύτηκε με αξιολόγηση της ειδικής δέσμευσης IgG σε αποπτωτικά κύτταρα μέσω κυτταρομετρίας ροής ή σε ειδική για γλυκοπρωτεΐνη ELISA. Ομάδες ποντικών C57BL/6 ανοσοποιήθηκαν με ανασυνδυασμένη 2-γλυκοπρωτεΐνη (2G) παρουσία ανοσοενισχυτικού Freud (FA). ορός που περιέχει anti{12}}G συλλέχτηκε μετά από 4 εβδομάδες. Anti-Leishmania IgG Μεγαλύτερο ή ίσο με 5–6-εβδομάδα ποντίκια BALB/c μολυσμένα με L. major, IgG ειδική για PL ή b2G, παρασκευάστηκαν από συγκεντρωμένους ορούς χρησιμοποιώντας στήλες πρωτεΐνης G (Pierce Chemical Co.) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι οροί αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς πριν από τον καθαρισμό IgG. Η καθαρισμένη IgG αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς (0,8 mg/mL) σε PBS πριν από τη χρήση.

Ο φυσιολογικός ανθρώπινος ορός (NHS) προήλθε από υγιή άτομα ελέγχου και ορός που περιείχε αντισώματα κατά της Λεϊσμανίας ελήφθη από ασθενείς με δερματική λεϊσμανίαση (LM) από το Μαρόκο. Χρησιμοποιήθηκε επίσης ορός από ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (PL).

Τα παράσιτα (προμαστιγώτες ή μαστιγώτες) χρωματίστηκαν για Ig σχετιζόμενη με την επιφάνεια χρησιμοποιώντας ισότυπου-ειδικά δευτερογενή αντισώματα που αντιδρούν με Ig ποντικού: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1) και αντι-IgG2a/b ( R2-40, όλα από την BD Biosciences). Μετά τη χρώση, τα παράσιτα πλύθηκαν με PBS/2 τοις εκατό BSA, σταθεροποιήθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Διέγερση in vitro

Το DC που προέρχεται από μυελό των οστών δημιουργήθηκε σε μέσο RPMI/5 τοις εκατό FCS συμπληρωμένο με IL-4 (10 μg/mL) και GM-CSF (10 μg/mL) για 6 ημέρες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν την ημέρα 6 ως ανώριμο DC. 2 × 105 DC συγκαλλιεργήθηκαν με οψωνισμένους μαστιγώτες από μολυσμένους ποντικούς BALB/c ή μMT ή καλλιεργήθηκαν με οψονισμένους μετακυκλικούς προμαστιγώτες (MOI 1:5) για 18 ώρες. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν κύτταρα και δημιουργήθηκαν κυτοσπίνες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα που χρωματίστηκαν με DifQuick αναλύθηκαν για την παρουσία ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών παρασίτων. Τουλάχιστον 200 κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα.

In vivo λοιμώξεις

Οι όγκοι των βλαβών μετρήθηκαν εβδομαδιαία σε τρεις διαστάσεις και αναφέρονται ως ελλειψοειδή [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Τα παράσιτα που υπάρχουν στον ιστό της βλάβης απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Για τη μέτρηση της ειδικής για το αντιγόνο παραγωγής κυτοκίνης, αποστραγγιζόμενα κύτταρα LN μολυσμένων ποντικών C57BL/6 ανακτήθηκαν και παρασκευάστηκαν εναιωρήματα μονοκυττάρου. Ένα εκατομμύριο κύτταρα LN/200 μL πλήρες RPMI 1640 (Biochrome) προστέθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου παρουσία 25 ug/mL SLA. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη διέγερση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA ειδικά για IFNΓ (R&D Systems), καθώς και IL{10}} και IL-10 (BD).

Μυελοειδής ανθρώπινος DC μολυσμένος με οψωνισμένα παράσιτα

Το μυελοειδές ανθρώπινο CD1c συν DC (hDC) απομονώθηκε από το περιφερικό αίμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απομόνωσης μαγνητικών κυττάρων και το κιτ απομόνωσης BDCA-1 ανθρώπινου DC (Miltenyi, Γερμανία). 1,5 χ 107 κύτταρα επιστρώθηκαν σε 2,5 mL RPMI 1640/2 τοις εκατό αυτόλογου πλάσματος. Για να εμπλουτιστεί η καθαρότητα, τα κύτταρα πλύθηκαν με θερμό PBS και τελικά καλλιεργήθηκαν με X-VIVO 15/πλάσμα (1 τοις εκατό) συμπληρωμένο με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-4 (150 U/mL) και GM-CSF (400 U/mL) . Τα ανώριμα hDC συλλέχθηκαν την ημέρα 6. 2 χ 105 hDC συγκαλλιεργήθηκαν με οψωνισμένους μαστιγώτες από μολυσμένους μΜΤ ποντικούς ή καλλιεργήθηκαν με οψονισμένους μετακυκλικούς προμαστιγώτες (ΜΟΙ 1:5) για 18 ώρες. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν κύτταρα και δημιουργήθηκαν κυτοσπίνες όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα κύτταρα που χρωματίστηκαν με DifQuick αναλύθηκαν για την παρουσία ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών παρασίτων. Τουλάχιστον 200 κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό StatView και το μη ζευγαρωμένο Student's t-test.

Αποτελέσματα

Ο ορός που περιέχει αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα συνδέεται με το L. major

Δεδομένου ότι τα παράσιτα μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα ξενιστές μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται «αποπτωτική μίμηση» και επειδή οι μορφές ζωής L. major εκφράζουν φωσφολιπίδια στην επιφάνειά τους, δημιουργήσαμε ορό που περιέχει αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (PL) χρησιμοποιώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα. Για το σκοπό αυτό, ομάδες ποντικών C57BL/6 μολύνθηκαν με L. major, σε ανοσοποιημένα με αποπτωτικά θυμοκύτταρα παρουσία ανοσοενισχυτικού Freud (FA). Καθώς η 2-γλυκοπρωτεΐνη (2G) είναι το κύριο αντιγόνο στο αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APS), ανοσοποιήσαμε επίσης ποντίκια με 2G παρουσία FA για να λάβουμε ορό που περιέχει αντισώματα αντι- 2G. Ως μάρτυρες, χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικός ορός ποντικού (NMS) από μη μολυσμένα ποντίκια C57BL/6 και ανοσοορός (IS) από μολυσμένα με L. major ποντίκια.

Για να ελέγξουμε εάν αυτοί οι διαφορετικοί οροί ποντικιών από παρελθόντα ή ανοσοποιημένα ποντίκια περιέχουν αντισώματα που συνδέονται με το L. major, αξιολογήσαμε πρώτα τη σύνδεση αντισώματος στο αντιγόνο του παρασίτου με ELISA, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα λύμα L. major promastigote freeze-thaw (διαλυτό αντιγόνο Leishmania, SLA). (Εικ. 1Α, μαύρες στήλες). Ως στάνταρ, χρησιμοποιήσαμε IgG που απομονώθηκε από τους ορούς ποντικών μολυσμένων με L. major. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ορός IS καθώς και ο ορός PL περιείχαν συγκρίσιμα επίπεδα δέσμευσης αντισωμάτων στο λύμα Leishmania, το οποίο ήταν 3-4 φορές υψηλότερο σε σύγκριση με τη δέσμευση που παρατηρήθηκε με NMS ή ορούς από ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν μόνο με ανοσοενισχυτικό. Επιπλέον, ορός που περιέχει αντισώματα 2G είναι επίσης συνδεδεμένος με SLA. Χρησιμοποιώντας μια ειδική ELISA για 2G (λευκές στήλες), εντοπίσαμε υψηλά επίπεδα 2G-IgG στον ορό, ενώ τα επίπεδα 2G IgG σε όλους τους άλλους ορούς ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης.

Σύκο. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 εβδομάδες με 2× 105 L. major (ανοσοποιητικός ορός, IS). Μια άλλη ομάδα ανοσοποιήθηκε επανειλημμένα με αποπτωτικά θυμοκύτταρα (αντι-φωσφολιπιδικό Ab, a-PL) ή ανασυνδυασμένη 2-γλυκοπρωτεΐνη (a- 2G) παρουσία ατελούς ανοσοενισχυτικού Freuds (FA), το FA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Ένας ορός δοκιμάστηκε για αντιδραστικότητα σε ELISA χρησιμοποιώντας προϊόν λύσης L. major ως υπόστρωμα ή 2-γλυκοπρωτεΐνη. Η ELISA αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας αντι-ποντικίσια IgG. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος (±SEM, n Μεγαλύτερο ή ίσο με 1). Β Μετακυκλικοί προμαστιγώτες του L. major ελήφθησαν από καλλιέργειες στατικής φάσης (n{{10}}). C Οι αμαστιγώτες παρασκευάστηκαν από βλάβες μΜΤ ποντικών με ανεπάρκεια Β κυττάρων (n=3). Παρασκευάσματα παρασίτων Β και Γ οψωνοποιήθηκαν με διαφορετικούς ορούς (5 τοις εκατό, 10 λεπτό, 37 βαθμοί). Η δέσμευση αντισωμάτων αξιολογήθηκε με FACS με δευτερεύοντα αντισώματα κατά ποντικού. Η δέσμευση της Ig υπολογίστηκε σχετικά με τα βασικά επίπεδα των μη οψωνοποιημένων παρασίτων (*p Λιγότερο ή ίσο με 0,05,**p Μικρότερο ή ίσο με 0,005 και ***p Μικρότερο ή ίσο με 0,002)

Στη συνέχεια, επωάσαμε μετακυκλικούς προμαστιγώτες μολυσματικού σταδίου L. major με διαφορετικές συγκεντρώσεις IgG εμπλουτισμένες από ορούς IS, PL ή 2G. Παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη δέσμευση IgG που προέρχεται από IS και 2G με μέγιστο στα 100 ng/mL (Εικ. 1Β). Η δέσμευση της IgG που προέρχεται από PL σε προμαστιγώτες της L. major δεν ανιχνεύθηκε.

Επιπλέον, επωάσαμε L. major amastigotes που απομονώθηκαν από βλάβες ποντικών μMT με ανεπάρκεια Β κυττάρων με τους διαφορετικούς ορούς για 10 λεπτά. Τα παράσιτα στη συνέχεια πλύθηκαν εκτενώς και στη συνέχεια, το επιφανειακά δεσμευμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από επισήμανση με συζευγμένο με ΡΕ αντι-IgG1, antiIgG2a/b ή αντι-IgM (Εικ. 1C). Όπως αναμενόταν, το IS περιείχε IgM, IgG1 και IgG2a/b ειδικά για τη Leishmania. Επιβεβαιώνουμε επίσης προηγούμενη εργασία, καθώς εντοπίσαμε IgM ειδική για τη Leishmania στη δεξαμενή του λεγόμενου "φυσικού Ab". Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε επίσης IgG και IgM στον ορό PL τόσο έντοναδιασταυρώθηκεμε την επιφάνεια του L. major amastigotes. Τα αντισώματα αντι- 2που περιείχαν G IgG δεν δεσμεύτηκαν στη Leishmania, αλλά ο ορός 2G περιείχε IgMδιασταυρούμενης αντίδρασηςμε μαστιγοτέ επιφάνειες.

Τα διασταυρούμενα αντιδρώντα αντισώματα μεσολαβούν στην εσωτερίκευση παρασίτων από DC

Στη συνέχεια σκοπεύαμε να αξιολογήσουμε εάν τα διαφορετικά αντισώματα IgG που μπορούν να δεσμευτούν στην επιφάνεια των L. major amastigotes είναι λειτουργικά ενεργά. Έτσι, δημιουργήσαμε DC χρησιμοποιώντας καλλιέργειες κυττάρων μυελού των οστών (BM) συμπληρωμένων με GMCSF και IL-4. Τα BM-DC συλλέχθηκαν ως ανώριμα κύτταρα την ημέρα 6 και απλώθηκαν σε 2 χ 105 κύτταρα/mL. Παρασιτικοί μαστιγώτες που προέρχονται από μολυσμένα πέλματα ποντικών μMT άγριου τύπου BALB/c ή με ανεπάρκεια Β κυττάρων οψονίστηκαν με διαφορετικούς ορούς (5 κατ' όγκο τοις εκατό), πλύθηκαν εκτενώς και στη συνέχεια προστέθηκαν σε DC σε αναλογία παράσιτου/κυττάρου 5:1. Μετά από 18 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και κυτοσπίν.

Παράσιτοεσωτερίκευσηπροσδιορίστηκε σε διαφάνειες DifQuickstained στα 100× (Εικ. 2). Όπως περιγράφηκε, η πρόσληψη παρασίτων που απομονώθηκαν από μΜΤ ποντίκια ήταν σημαντικά μειωμένη. Η προ-επώαση με NMS αύξησε ελαφρώς την πρόσληψη παρασίτων, ενώ η επώαση με IS οδήγησε στην "κανονικοποίηση" των ποσοστών μόλυνσης από DC σε επίπεδα που παρατηρήθηκαν με τους μαστιγώτες που προέρχονται από BALB/c. Αξίζει να σημειωθεί ότι η οψωνοποίηση παρασίτων με PL βελτίωσε επίσης σημαντικά και σαφώς τα ποσοστά μόλυνσης από DC κατά ~ 100 τοις εκατό. Σε συμφωνία με τα χαμηλότερα επίπεδα οψωνοποίησης IgG των μαστιγωτών με ορό που περιέχει b2G (συγκρίνετε Εικ. 1C), αυτό ενίσχυσε επίσης τα ποσοστά μόλυνσης του DC, αλλά σε μικρότερο βαθμό.

Εικ. 2Η οψωνοποίηση της L. major με αντισώματα διασταυρούμενης αντίδρασης οδηγεί σε ενισχυμένη πρόσληψη παρασίτων από DC. Ανώριμα C57BL/6 BMDC(2×105) συγκαλλιεργήθηκαν με μαστιγώτες από ποντικούς μΜΤ με ανεπάρκεια BALB/c ή Β κυττάρων (1:3). Πριν από τη συνεπώαση, οι μαστιγώτες οψωνίστηκαν με φυσιολογικό ορό ποντικού (NMS), ανοσοορό (IS), ορό που περιέχει αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα που ελήφθησαν με επαναλαμβανόμενη ανοσοποίηση με αποπτωτικά θυμοκύτταρα (aPL) ή ορό που περιέχει αντι{11} γλυκοπρωτεΐνη αντισώματα (2G). Μετά από 18 ώρες, τα ποσοστά μόλυνσης προσδιορίστηκαν στα κυτοσπίνια με μικροσκοπία φωτός (n=3, *p Μικρότερο ή ίσο με 0.05,**p Μικρότερο ή ίσο με 0,005, και ***p Λιγότερο από ή ίσο με 0,002 σε σύγκριση με μη εξατομικευμένους ελέγχους)

Τα διασταυρούμενα αντιδραστικά αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα βελτιώνουν τα αποτελέσματα της νόσου στη δερματική λεϊσμανίαση

Σε επόμενα πειράματα, θέλαμε να αξιολογήσουμε εάν η οψωνοποίηση παρασίτων μεδιασταυρούμενης αντίδρασηςτα αντισώματα αλλάζουν τα αποτελέσματα της νόσου in vivo. Για το σκοπό αυτό, μετακυκλικοί προμαστιγώτες που απομονώθηκαν και εμπλουτίστηκαν από καλλιέργειες παρασίτων οψωνίστηκαν με διαφορετικούς ορούς όπως περιγράφεται παραπάνω. Παράσιτο οψωνισμένο με NMS χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά από εκτεταμένη πλύση με παράσιτο, ομάδες πέντε ποντικών C57BL/6 μολύνθηκαν ενδοδερμικά με 103 L. major. Η ανάπτυξη της βλάβης παρακολουθήθηκε για περίπου 4 μήνες. Σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα, τα παράσιτα οψωνισμένα με IS προκάλεσαν μικρότερες βλάβες στο αυτί σε ευθυγράμμιση με αυξημένη συχνότητα μολυσμένου DC δέρματος σε πρώιμα χρονικά σημεία (Εικ. 3). Παραδόξως, τα παράσιτα οψωνισμένα με PL ή 2G προήγαγαν παρόμοια βελτιωμένα αποτελέσματα της νόσου όπως προσδιορίστηκαν από 50 τοις εκατό μειωμένους όγκους βλαβών μεταξύ της 5ης και της 8ης εβδομάδας μετά τη μόλυνση.

Τα διασταυρούμενα αντιδραστικά αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα βελτιώνουν τα αποτελέσματα της νόσου στη δερματική λεϊσμανίαση

Σε επόμενα πειράματα, θέλαμε να αξιολογήσουμε εάν η οψωνοποίηση παρασίτων μεδιασταυρούμενης αντίδρασηςτα αντισώματα αλλάζουν τα αποτελέσματα της νόσου in vivo. Για το σκοπό αυτό, μετακυκλικοί προμαστιγώτες που απομονώθηκαν και εμπλουτίστηκαν από καλλιέργειες παρασίτων οψωνίστηκαν με διαφορετικούς ορούς όπως περιγράφεται παραπάνω. Παράσιτο οψωνισμένο με NMS χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά από εκτεταμένη πλύση με παράσιτο, ομάδες πέντε ποντικών C57BL/6 μολύνθηκαν ενδοδερμικά με 103 L. major. Η ανάπτυξη της βλάβης παρακολουθήθηκε για περίπου 4 μήνες. Σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα, τα παράσιτα οψωνισμένα με IS προκάλεσαν μικρότερες βλάβες στο αυτί σε ευθυγράμμιση με αυξημένη συχνότητα μολυσμένου DC δέρματος σε πρώιμα χρονικά σημεία (Εικ. 3). Παραδόξως, τα παράσιτα οψωνισμένα με PL ή 2G προήγαγαν παρόμοια βελτιωμένα αποτελέσματα της νόσου όπως προσδιορίστηκαν από 50 τοις εκατό μειωμένους όγκους βλαβών μεταξύ της 5ης και της 8ης εβδομάδας μετά τη μόλυνση.

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε μΜΤ μαστιγώτες επωασμένους με 100 μg IgG εμπλουτισμένου από NMS, IS ή PL (Εικ. 4). Και πάλι, παρατηρήσαμε ότι και τα δύο IgG από IS ή PL οδήγησαν σε ηπιότερη νόσο με μικρότερες βλάβες, σε σύγκριση με μη οψωνοποιημένα παράσιτα (Εικ. 4Α). Στη σειρά, το φορτίο παρασίτου του αλλοιωτικού ιστού, όπως προσδιορίστηκε την εβδομάδα 6 μετά τη μόλυνση, αποκάλυψε (σημαντικά) μικρότερα φορτία παρασίτων σε λοιμώξεις που ξεκίνησαν παρουσία αντισωμάτων που δεσμεύουν τα παράσιτα (Εικ. 4Β). Η αντιγονοειδική επαναδιέγερση των αποστραγγιζόντων λεμφαδένων κυττάρων με SLA αποκάλυψε αμετάβλητα επίπεδα IFN, ενώ χαμηλότερα επίπεδα IL-4 και IL-10 βρέθηκαν σε αυτά τα ποντίκια που είχαν μολυνθεί με παράσιτα οψωνισμένα με IgG (Εικ. 4C) . Αυτό είναι σύμφωνο με τα μειωμένα μεγέθη αλλοιώσεων, καθώς προηγούμενες εργασίες έδειξαν ότι η εξάλειψη των παρασίτων σε ποντίκια εξαρτάται από την ενεργοποίηση του μολυσμένου MΦ από αλλοιωμένη IFN, η οποία εξουδετερώνεται από την IL-4 και — πολύ σημαντικό — την IL-10 . Ως εκ τούτου, οι επιδράσεις της IL-10 στο μολυσμένο MΦ οδήγησαν σε επιμονή παρασίτου. Έτσι, η αναλογία μεταξύ IFN από τη μία πλευρά και κυτοκινών που σχετίζονται με Th2/Treg όπως η IL-4 και η IL-10 φαίνεται να είναι πιο σημαντική για την έκβαση της νόσου.

Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ότι σε αυτή τη ρύθμιση, παρατηρήθηκαν επίσης μικρότεροι όγκοι αλλοιώσεων, όταν χρησιμοποιήθηκε IgG από το NMS για οψωνισμό, υποδεικνύοντας την παρουσίαδιασταυρούμενης αντίδρασηςφυσικά αντισώματα στον ορό αφελών ποντικών επίσης.

Τόσο τα ειδικά για τη Leishmania όσο και τα διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα μπορούν να υποκαταστήσουν τη γενετική έλλειψη IgG

Για να αναλύσουμε καλύτερα τη συγκεκριμένη συμβολή των υποτύπων ανοσοσφαιρίνης στην απόκριση στη Λεϊσμανία, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια IgMi και IgG1i που δημιουργήσαμε προηγουμένως. Τα ποντίκια IgMi είναι ποντίκια όπου όλα τα Β κύτταρα εκφράζουν IgM, αλλά δεν μπορούν να αλλάξουν τάξη ούτε να εκκρίνουν αντισώματα. Στα ποντίκια IgG1i, όλα τα Β κύτταρα αναπτύσσονται χρησιμοποιώντας το IgG1 ως υποδοχέα Β-κυττάρων τους, αλλά αυτά τα κύτταρα επίσης δεν μπορούν να αλλάξουν κατηγορία αλλά είναι σε θέση να εκκρίνουν αντισώματα IgG1. Μολύναμε ποντίκια IgMi και IgG1i σε γενετικό υπόβαθρο C57BL/6 με 103 L. major. Βρήκαμε ότι η παρουσία του IgG1 στους ορούς ήταν αρκετή για τα ποντίκια να εμφανίσουν μια πλήρη απόκριση στο παράσιτο, παρόμοια με τα ζώα άγριου τύπου (Εικ. 5Α). Αντίθετα, η απουσία εκκρινόμενων αντισωμάτων όπως φαίνεται στους ποντικούς IgMi ήταν αρκετή για να καθυστερήσει την ανάκτηση των ποντικών (Εικ. 5Α).

Στη συνέχεια, ανασυστάσαμε τα ποντίκια IgMi ή τους μάρτυρες άγριου τύπου είτε με NMS είτε με IS και στη συνέχεια τα μολύνουμε με L. major προμαστιγώτες. Όπως αναμενόταν, και στα δύο στελέχη ποντικών, η ανασύσταση του IS προκάλεσε σημαντικά μικρότερες βλάβες in vivo, επιβεβαιώνοντας ότι η επιταχυνόμενη πρόσληψη παρασίτων με τη μεσολάβηση IgG από το DC προάγει βελτιωμένη κατά της Λεϊσμανίαςασυλία, ανοσία(Εικ. 5Β). Τέλος, αξιολογήσαμε την έκβαση της νόσου μετά τη χρήση οψωνοποιημένων παρασίτων. Πριν από τη μόλυνση ποντικών IgMi, τα παράσιτα οψωνίστηκαν με IgG εμπλουτισμένο από ορό NMS, IS ή PL (Εικ. 5C). Σε συμφωνία με το πείραμα που φαίνεται στο Σχ. 5Β, τα IS-οψονισμένα παράσιτα διευκόλυναν την ενισχυμένη άμυνα των παρασίτων. Και πάλι, τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα μπόρεσαν να υποκαταστήσουν την ειδική για τη Leishmania IgG από το IS, καθώς και τα δύο αντισώματα IgG που δεσμεύτηκαν σε L. major προμαστιγώτες πριν από τη μόλυνση προώθησαν καλύτερα αποτελέσματα της νόσου σε ποντίκια IgMi. Τα παράσιτα οψωνισμένα με IS και PL προκάλεσαν σημαντικά μικρότερους όγκους βλαβών και πρώιμη επούλωση σε σύγκριση με τα μη οψωνισμένα παράσιτα.

Είναι σημαντικό ότι η χορήγηση NMS σε ποντικούς IgMi "κανονικοποίησε" τον φαινότυπο τους σε σχέση με την έκβαση της νόσου που παρατηρήθηκε σε ποντικούς C57BL/6 (Εικ. 5Β). Αυτά τα ευρήματα συνάδουν με τα δεδομένα μας που παρουσιάζονται παραπάνω υποδηλώνοντας ότι το NMS περιέχει επίσης αδιασταυρούμενης αντίδρασηςισότυπο αντισώματος IgG που είναι ικανό να δεσμεύεται με παράσιτα με επακόλουθες λειτουργικές συνέπειες in vitro και in vivo. Περαιτέρω επιβεβαίωση προέρχεται από ποντίκια IgMi που είχαν μολυνθεί με παράσιτα επικαλυμμένα με NMS, τα οποία ήταν επίσης σε θέση να ελέγξουν καλύτερα τη μόλυνση (Εικ. 5C).

Σύκο. 4Τα παράσιτα οψωνισμένα με αντισώματα επάγουν αποτελεσματική ανοσία σε μΜΤ με ανεπάρκεια Β κυττάρων. Τα παράσιτα οψωνίστηκαν με φυσιολογικό ορό ποντικού (NMS), ανοσοποιητικό ορό (IS), ορό που περιέχει αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (a-PL) ή — ποντίκια C57BL/6 μόνο — ορό που περιέχει αντισώματα κατά της γλυκοπρωτεΐνης (2G) στο παρουσία ανοσοενισχυτικού Freud (FA). Ομάδες ποντικών Μεγαλύτερο ή ίσο με 5 μMT μολύνθηκαν με 103 οψωνοποιημένους μετακυκλικούς προμαστιγώτες του L. major. Η ανάπτυξη της βλάβης αξιολογήθηκε εβδομαδιαία. Β Την εβδομάδα 6, τα φορτία αλλοιωμένων παρασίτων μολυσμένων μΜΤ ποντικών προσδιορίστηκαν με δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης. Εμφανίζονται μεμονωμένοι αριθμοί παρασίτων. μπάρες εξπρές μέσα. C Τα προφίλ κυτοκίνης των αποστραγγιζόμενων κυττάρων μMT LN προσδιορίστηκαν με επαναδιέγερση με διαλυτό αντιγόνο Leishmania (SLA). Η απελευθέρωση IFNΓ, IL{{{0}} και IL-10 σε 48-h υπερκείμενα αξιολογήθηκε με ELISA (μέσος όρος±SEM, n=15 ποντίκια/ομάδα από ανεξάρτητο 3 πειράματα, *p Μικρότερο ή ίσο με 0,05, **p Μικρότερο ή ίσο με 0,005 και ***p Μικρότερο ή ίσο με 0,002 σε σύγκριση με ποντίκια που έχουν μολυνθεί με μη οψωνοποιημένα παράσιτα)

Ο ανθρώπινος ορός περιέχει τα λειτουργικά ενεργά, παράσιτα διασταυρούμενα αντιδρώντα αντισώματα

Για να ελεγχθεί η συνάφεια των ευρημάτων μας για ανθρώπους, προμαστιγώτες ή μαστιγώτες που απομονώθηκαν από ποντίκια μMT με ανεπάρκεια Β κυττάρων υποβλήθηκαν σε οψωνισμό με φυσιολογικό ανθρώπινο ορό (NHS), ορό από ασθενείς με L. μείζονα μόλυνση (LM) ή ορό από ασθενείς με APS (APS). ). Η δεσμευμένη στην επιφάνεια IgG σε παράσιτα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ορός LM συνδέθηκε ασθενώς στις επιφάνειες των προμαστιγωτών, αλλά ισχυρά με τους μαστιγώτες. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ορός APS περιείχε παρόμοια επίπεδα IgGδιασταυρούμενης αντίδρασηςμε επιφάνειες παρασίτων (Εικ. 6Α).

Στη συνέχεια, η IgG εμπλουτίστηκε από ορούς LM χρησιμοποιώντας στήλες πρωτεΐνης Α (Εικ. 6Β). Αυτή και διαφορετικές συγκεντρώσεις ενδοφλεβίων ανοσοσφαιρινών (IVIG) που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία διαφόρων (άνοσων) διαταραχών ασθενών χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για οψωνισμό παρασίτων πριν από την κυτταρομετρία ροής. Το Leishmania IgG συνδέεται σημαντικά με τους προμαστιγώτες και τους μαστιγώτες της L. major. Είναι ενδιαφέρον ότι το εμπορικά διαθέσιμο IVIG περιείχε IgG πουδιασταυρώθηκετόσο με σκευάσματα προμαστιγώτη όσο και με παρασιτικά σκευάσματα μαστιγώτη.

Τέλος, το CD1c συν το πρωτογενές μυελοειδές ανθρώπινο DC από φλοιώδεις επικαλύψεις επωάστηκαν με μΜΤ μαστιγώτες της L. major επωασμένες με ορό LM ή ορό από ασθενείς με APS ή IVIG (MOI 3, Σχ. 7). Επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα ποντικού μας χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κύτταρα, παρατηρήσαμε ότι η παρουσία IgG (διασταυρούμενης αντίδρασηςή ειδική για τη Leishmania) σε επιφάνειες Leishmania είναι επαρκής για την προώθηση ενισχυμένηςπαράσιτοεσωτερίκευσηαπό την DC. Ο ορός APS αύξησε το ποσοστό του μολυσμένου DC κατά σχεδόν 100 τοις εκατό, ενώ ο ορός LM και το IVIG αύξησαν την πρόσληψη παρασίτων κατά 30 τοις εκατό σε σύγκριση με τα μη οψωνισμένα παράσιτα. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ορός NMS περιείχε επίσης IgG που προάγει τα παράσιταπαράσιτοεσωτερίκευση.

Σύκο. 5 Τα ποντίκια C57BL/6, IgMi και IgGi που ανασυστάθηκαν με διαφορετικούς ορούς ή μολύνθηκαν με διαφορετικά καθαρισμένα IgG οψωνισμένα L. major παρουσιάζουν βελτιωμένα αποτελέσματα της νόσου. Μια Ομάδα Μεγαλύτερης ή ίσης με 5 ποντίκια C57BL/6, C57BL/6 IgMi ή IgGi μολύνθηκαν με φυσιολογικά εμβόλια χαμηλής δόσης L. major (103 μετακυκλικοί προμαστιγώτες). B Μία εβδομάδα πριν από τη μόλυνση, τα ποντίκια C57BL/6 και B6 IgMi ανασυστάθηκαν ip δύο φορές με 100 μL είτε φυσιολογικού ορού ποντικού (NMS) είτε ανοσοποιητικού ορού (IS). C Πριν από τη μόλυνση ποντικών IgMi, τα παράσιτα οψωνοποιήθηκαν με IgG εμπλουτισμένο από ορούς με δέσμευση σε στήλες πρωτεΐνης Α [κανονικός ορός ποντικού (NMS), ανοσοποιητικός ορός (IS) ή ορός που περιέχει αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα (a-PL)]. Η ανάπτυξη αλλοιώσεων A-C αξιολογήθηκε εβδομαδιαία (μέση ± SEM, n=10 ποντίκια/ομάδα από ανεξάρτητα 2 πειράματα, *p Μικρότερο ή ίσο με 0,05, **p Μικρότερο ή ίσο με 0,005 και *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,002 σε σύγκριση με C57BL/6 [A], C57BL/6 ή IgMi [B], ή κανένα [C])

Σύκο. 6Τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα στους ανθρώπινους ορούς αντιδρούν διασταυρούμενα με τα κύρια επιφανειακά μόρια του L.. Μετακυκλικοί προμαστιγώτες από καλλιέργειες στάσιμης φάσης ή αλλοιωτικοί μαστιγώτες του L. major που απομονώθηκαν από μΜΤ ποντίκια οψωνίστηκαν με διαφορετικούς τύπους ανθρώπινου ορού (5 τοις εκατό) ή καθαρισμένου IgG. Λήφθηκαν φυσιολογικοί ανθρώπινοι οροί (NHS) από υγιή άτομα ελέγχου. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης οροί από ασθενείς με αποδεδειγμένη δερματική λεϊσμανίαση (LM, που αποκτήθηκε στο Μαρόκο, n=4) και από ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (PL, n=3). Το B IgG εμπλουτίστηκε από ορούς LM χρησιμοποιώντας στήλες πρωτεΐνης Α (n=3). Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις ενδοφλεβίων ανοσοσφαιρινών (IVIG, n=2) (μg/mL). Τα παράσιτα Α και Β αναλύθηκαν για επιφανειακή δέσμευση ολικής ανθρώπινης Ig χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η δέσμευση της Ig υπολογίστηκε σε σχέση με τα βασικά επίπεδα μη οψωνοποιημένων παρασίτων (μέσος όρος±SEM, *p Λιγότερο ή ίσο με 0.05, **p Μικρότερο ή ίσο με {{10} }}.005 και ***p Μικρότερο ή ίσο με 0,002)

Συζήτηση

Η επούλωση από τη δερματική λεϊσμανίαση απαιτεί αποτελεσματική εκκίνηση των Τ κυττάρων και απελευθέρωση IFN, τα οποία εξαρτώνται από το μολυσμένο DC για την παρουσίαση αντιγόνων σε παρθένα Τ κύτταρα. Σε αντίθεση με την CR3-εξαρτώμενη φαγοκυττάρωση από MΦ, το έχουμε δείξειπαράσιτοεσωτερίκευσηαπό το DC συμβαίνει μέσω των Fc RI και Fc RIII, τα οποία μπορούν να υποκαταστήσουν το ένα το άλλο. Ως εκ τούτου, τα ποντίκια με ανεπάρκεια Fc-, Fc RI/ Fc RIII και μMT ποντίκια με ανεπάρκεια Β κυττάρων (όλα στο υπόβαθρο C57BL/6) ανέπτυξαν μεγαλύτερες βλάβες και καθυστερημένη επούλωση, σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου, λόγω εξασθενημένου DC- εξαρτημένη εκκίνηση των Τ κυττάρων. Η παρούσα μελέτη μας επιβεβαιώνει αυτήν την προηγούμενη παρατήρηση, αλλά επιπλέον, τα δεδομένα μας χρησιμοποιώντας ποντικούς IgMi και IgGi υποδηλώνουν επίσης ότι τα εκκρινόμενα αντισώματα και όχι η απλή παρουσία Β κυττάρων, είναι κρίσιμα για την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής απόκρισης στο παράσιτο. Ως εκ τούτου, παρόμοια με τα ποντίκια με ανεπάρκεια Β κυττάρων, τα ποντίκια IgMi με Β κύτταρα ανίκανα να παράγουν IgG εμφάνισαν μεγαλύτερα μεγέθη αλλοιώσεων σε σύγκριση με τα ποντίκια IgGi ή τα ποντίκια άγριου τύπου.

Επειδή τόσο οι μαστιγώτες με NMS όσο και οι οψωνισμένοι με IS ελήφθησαν σε παρόμοιους βαθμούς και οι οψωνισμένοι με NMS προμαστιγώτες δεν φαγοκυτταρώθηκαν από DCs (με αποτελεσματική σύνδεση του IgM στην επιφάνειά τους), καταλήξαμε προηγουμένως ότι το IgM δεν απαιτείται για την πρόσληψη παρασίτου. Στην παρούσα μελέτη, μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε αυτά τα ευρήματα χρησιμοποιώντας φυσιολογικούς ορούς ποντικών σε ποντίκια που είτε στερούνται εντελώς Β κύτταρα είτε εκκρίνουν μόνο αντισώματα. Περαιτέρω, μπορέσαμε να δείξουμε ότι οι οροί που περιέχουν IgG1-μπορούσαν να ενισχύσουν την είσοδο των μαστιγωτών στο DC τόσο του ανθρώπου όσο και του ποντικού.

Παρέμεινε άλυτο πώς αναπτύσσεται η αρχική απόκριση των Β κυττάρων απουσία μολυσμένου DC. Μια πιθανότητα ήταν ότι στη δεξαμενή των «φυσικών» IgG,διασταυρούμενης αντίδρασηςτα αντισώματα μπορεί να είναι σε θέση να αναγνωρίσουν τα παράσιτα και να χρησιμεύσουν ως υποκατάστατα για τα ειδικά για τη Leishmania αντισώματα που αναπτύσσονται αργότερα (αυξάνονται μεταξύ της εβδομάδας 4 και της εβδομάδας 6 μετά τη μόλυνση). Εκτός από τα ειδικά αντιγόνα αντισώματα, τα λεγόμενα φυσικά αντισώματα παράγονται από Β-1 κύτταρα τόσο σε ποντίκια όσο και σε ανθρώπους μετά τη γέννηση. Μερικοί έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν αυτο-αντιγόνα. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, πιστεύεται ότι δεν έχουν ειδικότητα για ξένα αντιγόνα. Αργότερα, τα δεδομένα παρείχαν στοιχεία για τη φυσική IgM που αναγνωρίζει διάφορα μικροβιακά αντιγόνα και συμβάλλει στην εξάλειψη των παθογόνων. Πρόσφατα, ωστόσο, αρκετές μελέτες αποκάλυψαν ότι η φυσική IgG παίζει ρόλοέμφυτος ασυλία, ανοσίαεπισης. Αποδείχθηκε ότι αλληλεπιδρά με λεκτίνες που σχετίζονται με παθογόνο (π.χ. MBL) και σχηματίζει ανοσοσυμπλέγματα για την εκκαθάριση των παθογόνων. Η συνδεδεμένη σε παθογόνο φυσική IgG αναμένεται επίσης να αλληλεπιδράσει με άλλα PRRs, όπως το C1q, για να ενεργοποιήσει την κλασική οδό συμπληρώματος. Αποδείχθηκε ότι η φυσική IgG συνεργάζεται ειδικά με λεκτίνες που σχετίζονται με παθογόνο για να προκαλέσει αποτελεσματική αντιμικροβιακή δράση έναντι της ευκαιριακής λοίμωξης Pseudomonas aeruginosa και Staphylococcus aureus.

Κατά τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, παρατηρείται έκθεση σε φωσφατιδυλοσερίνη (PS) σε αποπτωτικά σώματα. Η αναγνώριση του ξενιστή του PS στην επιφάνεια των νεκρών ή των νεκρών κυττάρων μέσω αντισωμάτων είναι ένα σημαντικό βήμα για την κάθαρσή τους. Σε μια διαδικασία που ονομάζεται «αποπτωτική μίμηση», τα παράσιτα Leishmania είναι γνωστό ότι εκθέτουν επίσης το PS στην επιφάνειά τους που χρησιμεύει ως σήμα "eat-me" για τα φαγοκυτταρικά κύτταρα, παρόμοιο με αυτό που φαίνεται από τα αποπτωτικά κύτταρα. Επιπλέον, μερικοί από τους προμαστιγώτες μολυσματικού σταδίου πεθαίνουν (χωρίς τη συμμετοχή κασπασών) και εκθέτουν τους ίδιους το PS. Ωστόσο, οι υποχρεωτικές μορφές ζωής των ενδοκυτταρικών μαστιγωτών εκθέτουν το PS στην επιφάνειά τους επιτρέποντάς τους να εισέλθουν αποτελεσματικά στα κύτταρα ξενιστές. Τώρα αξιολογήσαμε εάν τα τεχνητά επαγόμενα αντισώματα PL είναι ικανά να αναγνωρίζουν παράσιτα Leishmania και εάν αυτά είναι λειτουργικά ενεργά για να διευκολύνουν την είσοδο παρασίτων στα σχετικά κύτταρα ξενιστές. Παρατηρήσαμε ότι τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα ποντικού και ανθρώπου δεσμεύουν τις μορφές ζωής της Leishmania. Χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις, προσδιορίσαμεδιασταυρούμενης αντίδρασηςαντισώματα στον ορό PL που φαίνεται να δεσμεύονται κατά προτίμηση με τα επιφανειακά φωσφολιπίδια της L. major. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόλο που τα παράσιτα προμαστιγώτων εκφράζουν επίσης αυτά τα φωσφολιπίδια όπως αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας διαλυτό παρασιτικό αντιγόνο από αυτή τη μορφή ζωής παρασίτου σε μια ELISA, τα επιφανειακά φωσφολιπίδια φαίνεται να είναι πιο έντονα εκτεθειμένα στους μαστιγώτες. Επιπλέον, δείξαμε ότι αυτή η οψωνοποίηση IgG ήταν επαρκής για την προώθηση της πρόσληψης παρασίτων από το DC. Είναι σημαντικό ότι in vivo, τα παράσιτα με οψωνισμό με PL προκάλεσαν βελτιωμένη έκβαση της νόσου με μικρότερους όγκους βλαβών και νωρίτερη ανάλυση της βλάβης. Έτσι, σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις από την ομάδα μας, λόγω ενισχυμένης μόλυνσης DC παρουσία(διασταυρούμενη αντίδραση)IgG στα παράσιτα, προκλήθηκε προτιμησιακή επαγωγή κυττάρων Th1/Tc1 που σχετίζεται με μειωμένο αριθμό κυττάρων Th2 και Treg, και επομένως καλύτερη έκβαση της νόσου.

Εικ. 7Το πρωτογενές μυελοειδές DC από ανθρώπινο αίμα εσωτερικεύει κατά προτίμηση τα παράσιτα μεδιασταυρούμενης αντίδρασηςαντιφωσφολιπιδικό IgG δεσμευμένο στην επιφάνειά τους. Το CD1a συν μυελοειδές ανθρώπινο DC απομονώθηκε από φλοιώδεις επικαλύψεις χρησιμοποιώντας σφαιρίδια MACS και επιστρώθηκε σε 2×105 κύτταρα/mL. Οι αμαστιγώτες που απομονώθηκαν από μΜΤ ποντίκια επωάστηκαν με 5 τοις εκατό ορό ή 10 μg/mL IVIG πριν από την ταυτόχρονη επώαση με DC (1:3). Μετά από 18 ώρες, τα ποσοστά μόλυνσης προσδιορίστηκαν στα κυτοσπίνια με μικροσκόπιο φωτός (n=3, *p Λιγότερο ή ίσο με 0,05 και ***p Λιγότερο ή ίσο με 0,002 σε σύγκριση με μάρτυρες χωρίς οψωνισμό)

Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι τα παράσιτα οψωνισμένα με NMS προήγαγαν καλύτερα αποτελέσματα της νόσου σε σύγκριση με τα μη οψωνισμένα παράσιτα, υποδεικνύοντας την παρουσία φυσικού IgG στο NMS που είναι σε θέση να αναγνωρίσει τη Λεϊσμανία. Αυτό ήταν καλύτερα ορατό στο IgMi (χωρίς Β κύτταρα ικανά να παράγουν οποιοδήποτε IgG) υποκατεστημένο με NMS. Εδώ, τα σαφώς μεγαλύτερα μεγέθη αλλοιώσεων των ποντικών IgMi μειώθηκαν σε αυτά των ποντικών C57BL/6 άγριου τύπου (Εικ. 5). Ωστόσο, η παρουσία της φυσικής, Leishmaniaδιασταυρούμενης αντίδρασηςΗ IgG παρατηρήθηκε επίσης σε ποντίκια άγριου τύπου μολυσμένα με παράσιτα οψωνισμένα με NMS σε σύγκριση με μη οψωνισμένα παράσιτα. Η εξειδίκευση αυτών των φυσικών IgG σε ορό ποντικού και ανθρώπου είναι ασαφής μέχρι σήμερα. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι αυτά είναι επίσης αντισώματα που αναγνωρίζουν το PS σε επιφάνειες παρασίτων, καθώς δεσμεύονται κατά προτίμηση με αμαστιγώτες με γνωστή υψηλότερη έκθεση σε PS σε σύγκριση με τους προμαστιγώτες επίσης.

Βρήκαμε ότι ο ορός υγιών ανθρώπινων ατόμων ελέγχου (από μια περιοχή όπου η λεϊσμανίαση αναφέρεται μόνο ως ασθένεια ταξιδιού και χωρίς ιστορικό προηγούμενης λοίμωξης) περιείχε επίσης IgG ικανή να δεσμεύεται σε L. major amastigotes και να προάγει την ενισχυμένη πρόσληψη παρασίτων από το DC. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το IVIG που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη μας παρασκευάζεται στη Γερμανία (μη ενδημικό για τη λεϊσμανίαση). Είναι ενδιαφέρον ότι η εμπλουτισμένη ανθρώπινη IgG από IVIG από αρνητικά στη Leishmania άτομα περιείχε έτσι IgG που ήταν ικανή να δεσμεύει τόσο προμαστιγώτες όσο και (πιθανώς λόγω υψηλότερης έκθεσης σε PS) L. major amastigotes. Στη σειρά, ο ορός των ασθενών με APS με υψηλά επίπεδα αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων περιείχε IgG που δεσμευόταν κατά προτίμηση στους αμαστιγώτες και λιγότερο στους προμαστιγώτες. Τόσο η IgG από τον ορό APS όσο και η IgG από τον ορό IVIG προώθησαν την ενισχυμένη πρόσληψη παρασίτων από την πρωτογενή ανθρώπινη DC σε βαθμό συγκρίσιμο (ή ακόμα καλύτερο στην περίπτωση των ορών APS που περιέχουν PL) με την ανοσοπροερχόμενη από ορό IgG από ασθενείς με λεϊσμανίαση.

Συνοπτικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι φυσιολογικοί οροί ποντικού καθώς και ανθρώπινοι οροί, ακόμη και από άτομα που δεν εκτέθηκαν ποτέ στη Λεϊσμανία, περιέχουν αντισώματα IgG που είναι ικανά να δεσμευτούν σε αυτό το παράσιτο, διευκολύνοντας την καταπόνησή του από DC και ενισχύοντας την προστατευτική ανοσοαπόκριση του πλήθος. Παρόλο που το αντιγόνο Leishmania που αναγνωρίζεται δεν είναι πλήρως σαφές, μέρος της αντιδραστικότητας μπορεί να κατευθύνεται έναντι φωσφολιπιδίων που είναι πιο άφθονα στον μαστιγώτη, σε σύγκριση με τις επιφάνειες του προμαστιγώτη. Τα ευρήματά μας μπορεί να ανοίξουν το δρόμο για τον σχεδιασμό καλύτερης θεραπείας για αυτό το παράσιτο και μπορούν ακόμη και να χρησιμεύσουν ως προφύλαξη πρώτης γραμμής για άτομα που ταξιδεύουν σε περιοχές μολυσμένες από τη Λεϊσμανία.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστούν ειλικρινά τους Mark C. Udey και Philipp von Landenberg για τις χρήσιμες συζητήσεις και για την παροχή δειγμάτων ασθενών.

Συνεισφορά συγγραφέα 

Οι FD, SLK και ST πραγματοποίησαν τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο. Οι ST, AW και EvS εξασφάλισαν τη χρηματοδότηση του έργου και επέβλεψαν τις εργασίες. Ο AW και ο EvS έγραψαν το χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση

Η χρηματοδότηση ανοιχτής πρόσβασης ενεργοποιήθηκε και οργανώθηκε από το Projekt DEAL. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από κονδύλια από το DFG (SFB 490 προς EvS και AW και SFB 1292 προς EvS, AW και ST) και από το Κέντρο Μοριακής Ιατρικής (CMMC) της Κολωνίας προς το EvS.

Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών 

Δεν εφαρμόζεται.

Δηλώσεις

Έγκριση δεοντολογίας και συναίνεση συμμετοχής

Όλα τα πειράματα με ποντίκια έγιναν σύμφωνα με την καθοδήγηση της πολιτείας Ρηνανίας Pfalz.

Συγκατάθεση για δημοσίευση

Όλοι οι συγγραφείς συναινούν για δημοσίευση.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δεν δηλώνουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Ανοιχτή πρόσβαση Αυτό το άρθρο αδειοδοτείται με άδεια Creative Commons Attribution 4.0 Διεθνής Άδεια, η οποία επιτρέπει τη χρήση, την κοινή χρήση, την προσαρμογή, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο ή μορφή, αρκεί να αποδώσετε τα κατάλληλα εύσημα στον αρχικό συγγραφέα (s) και την πηγή, παρέχουν έναν σύνδεσμο προς την άδεια Creative Commons και υποδεικνύουν εάν έγιναν αλλαγές. Οι εικόνες ή άλλο υλικό τρίτων σε αυτό το άρθρο περιλαμβάνονται στην άδεια Creative Commons του άρθρου, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά σε ένα πιστωτικό όριο για το υλικό. Εάν το υλικό δεν περιλαμβάνεται στην άδεια Creative Commons του άρθρου και η χρήση για την οποία προορίζεται δεν επιτρέπεται από νομοθετική ρύθμιση ή υπερβαίνει την επιτρεπόμενη χρήση, θα χρειαστεί να λάβετε άδεια απευθείας από τον κάτοχο των πνευματικών δικαιωμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1.Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392:951–970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Δερματική λεϊσμανίαση: διακριτές λειτουργίες των δενδριτικών κυττάρων και των μακροφάγων στην αλληλεπίδραση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή με τη Leishmania major. Int J Med Microbiol 308:206-214.

3. Sacks D, Noben-Trauth N (2002) Η ανοσολογία της ευαισθησίας και της αντοχής σε Leishmania major σε ποντίκια. Nat Rev Immunol 2:845-858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Αποκάλυψη του ρόλου των σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού στη λεϊσμανίαση. Front Immunol 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) Σε πειραματική λεϊσμανίαση η ανεπάρκεια του CD18 οδηγεί σε διάδοση παρασίτου που σχετίζεται με αλλοιωμένες λειτουργίες μακροφάγων και ατελή απόκριση κυττάρων Th1.Eur J: Immunol30 . 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC, et al (2006) Η πρόσληψη της κύριας Leishmania από δενδριτικά κύτταρα προκαλείται από υποδοχείς Fcgamma και διευκολύνει την απόκτηση προστατευτικής ανοσίας. J Exp Med 203:177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Τα φυσικά αυτοαντισώματα IgG είναι άφθονα και πανταχού παρόντα στους ανθρώπινους ορούς και ο αριθμός τους επηρεάζεται από το φύλο της ηλικίας και την ασθένεια. PLoS ONE 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Φυσικά απαντώμενα αυτοαντισώματα στην ομοιόσταση και την ασθένεια. Trends Immunol 30:43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Απόπτωση και αποπτωτική μίμηση: η σύνδεση Leishmania. Cell ΜοΙ Life Sci 67:1653–1659.

10. Waisman A, Croxford AL, Demircik F (2008) Νέα εργαλεία για τη μελέτη του ρόλου των Β κυττάρων σε λοιμώξεις από κυτταρομεγαλοϊό. Med Microbiol Immunol 197:145-149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Η Interleukin 1alpha προάγει τη διαφοροποίηση Th1 και αναστέλλει την εξέλιξη της νόσου σε ποντίκια BALB/c μείζονος ευαισθησίας στη Leishmania. J Exp Med 198:191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Η ανοσοποίηση με μια αποπτωτική πρωτεΐνη που δεσμεύει τα κύτταρα ανακεφαλαιώνει τη νεφρίτιδα και την εμφάνιση διαδοχικών αυτοαντισωμάτων του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου. J Immunol 177:6504-6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020) Αποπτωτική μίμηση ως στρατηγική για την εγκαθίδρυση παρασιτικών λοιμώξεων: φωσφατιδυλοσερίνη που προέρχεται από παράσιτο και ξενιστή ως βασικό μόριο. Cell Commun Signal 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) Ο ρόλος της βήτα-2-γλυκοπρωτεΐνης Ι στη δομή που συσχετίζει την υγεία και τη δομή με τη λειτουργία : περισσότερα από απλά APS. Blood Rev 39:100610.

15. Dominguez M, Torano A (1999) Οψονοφαγοκυττάρωση με μεσολάβηση ανοσολογικής προσκόλλησης: ο μηχανισμός της μόλυνσης από Leishmania. J Exp Med 189:25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Ο ρόλος της ιντερλευκίνης (IL)-10 στην επιμονή της μείζονος Λεϊσμανίας στο δέρμα μετά την επούλωση και την θεραπευτικό δυναμικό αντισώματος υποδοχέα αντι-IL-10 για στείρα θεραπεία. J Εχρ Med 194:1497–1506.

17. Waisman A, Kraus M, Seagal J, Ghosh S, Melamed D, Song J, Sasaki Y, Classen S, Lutz C, Brombacher F et al (2007) Η σηματοδότηση του υποδοχέα των κυττάρων IgG1 B αναστέλλεται από το CD22 και προάγει την ανάπτυξη Β κύτταρα των οποίων η επιβίωση εξαρτάται λιγότερο από την Ig{alpha}/{beta}. J Exp Med 204:747-758

18. Panda S, Ding JL (2015) Τα φυσικά αντισώματα γεφυρώνουν την έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία. J Immunol 194:13-20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Προστασία από φυσικό IgG: μια γλυκιά συνεργασία με διαλυτές λεκτίνες κάνει το κόλπο! EMBO J 32:2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) The binding site for C1q on IgG. Nature 332:738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Τα φυσικά αντισώματα IgG παρέχουν έμφυτη προστασία ενάντια στα βακτήρια που προκαλούνται από κόλον. EMBO J 32:2905–2919.

22. El-Hani C, Borges V, Wanderley JL, Barcinski M (2012) Απόπτωση και αποπτωτική μίμηση στη Λεϊσμανία: μια εξελικτική προοπτική. Front Cell Infect Microbiol 2:96.

Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστε μαζί μας στο:david.deng@wecistanche.com τηλ:0013632399501