Η συνδυασμένη πανγονιδιωματική και μεταγραφική αποκαλύπτει διεργασίες πυρήνα και περιττές λοιμογόνους παράγοντες σε ένα ταχέως εξελισσόμενο παθογόνο μυκητιακών φυτών
Dec 05, 2023
Αφηρημένη
Ιστορικό
Η μελέτη της γονιδιωματικής παραλλαγής σε ταχέως εξελισσόμενα παθογόνα δυνητικά επιτρέπει την ταυτοποίηση γονιδίων που υποστηρίζουν τη «βιολογία του πυρήνα» τους, που είναι παρόντα, λειτουργικά και εκφράζονται από όλα τα στελέχη ή την «ευέλικτη βιολογία», που ποικίλλουν μεταξύ των στελεχών. Τα γονίδια που υποστηρίζουν την ευέλικτη βιολογία μπορεί να θεωρηθούν ως «αξεσουάρ», ενώ το σύνολο γονιδίων «πυρήνας» είναι πιθανό να είναι σημαντικό για κοινά χαρακτηριστικά της βιολογίας ενός είδους παθογόνου, συμπεριλαμβανομένης της λοιμογόνου δράσης σε όλους τους γονότυπους ξενιστή. Ο παθογόνος μύκητας του σιταριού Zymoseptoria tritici αντιπροσωπεύει μια από τις πιο ταχέως εξελισσόμενες απειλές για την παγκόσμια επισιτιστική ασφάλεια και ήταν το επίκεντρο αυτής της μελέτης.
Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Αποτελέσματα
Κατασκευάσαμε ένα πανγονιδίωμα 18 ευρωπαϊκών απομονώσεων πεδίου, με 12 να υποβλήθηκαν επίσης σε προφίλ μεταγραφής RNAseq κατά τη διάρκεια της μόλυνσης. Συνδυάζοντας αυτά τα δεδομένα, προβλέψαμε ένα σύνολο γονιδίων "πυρήνα" που περιλαμβάνει 9807 αλληλουχίες οι οποίες ήταν (1) παρούσες σε όλα τα στελέχη απομόνωσης, (2) δεν είχαν αδρανοποιητικούς πολυμορφισμούς και (3) εκφραζόταν από όλα τα στελέχη. Ορίστηκε επίσης ένα μεγάλο βοηθητικό γονιδίωμα, αποτελούμενο από το 45% των συνολικών γονιδίων. Ταξινομήσαμε τον γενετικό και τον γονιδιωματικό πολυμορφισμό τόσο σε χρωμοσωμικές όσο και σε μεμονωμένες γονιδιακές κλίμακες. Οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για βασικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της λοιμογόνου δράσης είχαν χαμηλότερη από το μέσο όρο μεταβλητότητα αλληλουχίας μεταξύ των γονιδίων του πυρήνα. Τόσο το πυρήνα όσο και το βοηθητικό γονιδίωμα κωδικοποίησαν πολλές μικρές, εκκρινόμενες υποψήφιες τελεστικές πρωτεΐνες που πιθανώς αλληλεπιδρούν με την ανοσία των φυτών. Παροδική μεσολαβούμενη από ιικό φορέα σε υπερέκφραση φυτών 88 υποψηφίων απέτυχε να προσδιορίσει κανένα που προκάλεσε νέκρωση των φύλλων χαρακτηριστική της νόσου. Ωστόσο, η λειτουργική συμπλήρωση ενός μη παθογόνου μεταλλάγματος διαγραφής που δεν είχε πέντε βασικά γονίδια έδειξε ότι η πλήρης λοιμογόνος δύναμη αποκαταστάθηκε με την εκ νέου εισαγωγή του μοναδικού γονιδίου που παρουσίαζε τον πολυμορφισμό της ελάχιστης αλληλουχίας και την υψηλότερη έκφραση.
συμπεράσματα
Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη συνδυασμένη χρήση της πανγενωμικής και της μεταγραφτομικής για τον καθορισμό γονιδίων που αντιπροσωπεύουν τις βασικές και δυνητικά εκμεταλλεύσιμες αδυναμίες στα ταχέως εξελισσόμενα παθογόνα.
Λέξεις-κλειδιά
Ιός του μωσαϊκού της αλεπούδας, Septoria tritici, Νεκροτροφικός τελεστής, Βασικά γονίδια, Βοηθητικά χρωμοσώματα, Δωθηδεομύκητες,Χρωμοσωμική αστάθεια, Mycosphaerella spp
Ιστορικό
Ο βιώσιμος έλεγχος των μολυσματικών ασθενειών που επηρεάζουν τα ζώα και τα φυτά αμφισβητείται από την εξέλιξη των αιτιολογικών μικροοργανισμών [1, 2]. Οι πιο δύσκολα ελεγχόμενες ασθένειες είναι αυτές που προκαλούνται από τα πιο ταχέως εξελισσόμενα είδη, τα οποία μπορούν να ανταποκριθούν γρήγορα σε επιλεκτικές πιέσεις, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής ανοσίας του ξενιστή, δυσμενών περιβαλλοντικών συνθηκών ή/και αντιμολυσματικών φαρμάκων [1, 3]. Η δυνατότητα για τα μικροβιακά παθογόνα να εξελιχθούν γρήγορα καθορίζεται από διάφορα χαρακτηριστικά, μεταξύ άλλων. (1) γρήγορος κύκλος ζωής και (2) μηχανισμοί που προάγουν τη σεξουαλική αναπαραγωγή [4]. Το τελευταίο μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλα επίπεδα μόνιμης γενετικής διαφοροποίησης που υπάρχει στους πληθυσμούς παθογόνων, τα οποία μπορούν να διατηρηθούν και να ενισχυθούν ενόψει εξωτερικών επιλεκτικών πιέσεων. Ενώ συγκεκριμένα γονίδια μπορεί να είναι πιθανό να παρουσιάζουν φυσική παραλλαγή γενετικής αλληλουχίας, οδηγώντας την εξέλιξή τους, άλλα δεν μπορούν να χαθούν (ή να αδρανοποιηθούν από μετάλλαξη) χωρίς να επηρεαστεί η ικανότητα των παθογόνων. Για τα ευκαρυωτικά και τα προκαρυωτικά παθογόνα φυτών, αυτή η διαφορά στα επίπεδα πολυμορφισμών μεταξύ των γονιδίων οδήγησε στην πραγματοποίηση «γονιδιωμάτων δύο ταχυτήτων» [5], τα οποία περιλαμβάνουν ορισμένα συστατικά που εξελίσσονται γρήγορα και πιστεύεται ότι ανταποκρίνονται σε εξωτερικούς οδηγούς (εύρος ξενιστή και ανοσία, κ.λπ.), ενώ το πιο αργά εξελισσόμενο σύνολο περιέχει γονίδια με βασική φροντίδα και άλλες βασικές λειτουργίες. Τα βοηθητικά και τα βασικά μέρη των γονιδιωμάτων των παθογόνων μπορούν να συναρμολογηθούν σε ένα «πανγονιδίωμα» το οποίο θα πρέπει να αντιπροσωπεύει σχεδόν το πλήρες σύνολο γονιδίων που υπάρχουν σε ένα είδος [6]. Το μέγεθος του πυρήνα και των βοηθητικών τμημάτων των πανγονιδιωμάτων ποικίλλει μεταξύ των ειδών βακτηρίων, μυκήτων και ωομυκήτων [7-13] και μπορεί να δώσει μια ένδειξη της δυνατότητας των μικροβιακών πληθυσμών να εξελιχθούν γρήγορα σε επιλεκτικές πιέσεις. Είναι κατανοητό ότι όσο μεγαλύτερο είναι το βοηθητικό πανγονιδίωμα σε σχέση με τον πυρήνα, τόσο πιο ικανοί είναι αυτοί οι πληθυσμοί να εξελιχθούν γρήγορα. Το μυκητιακό παθογόνο ασκομύκητα του σίτου, Zymoseptoria tritici, είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της κηλίδας Septoria tritici (STB), μιας παγκόσμιας σημαντικής ασθένειας που απειλεί την επισιτιστική ασφάλεια [14]. Το παθογόνο έχει επίσης θεωρηθεί από καιρό ως πρότυπο σύστημα για μελέτες σχετικά με τη βιολογία και την εξέλιξη του πληθυσμού [15-18]. Αυτό συμβαίνει επειδή το Z. tritici έχει υψηλό ποσοστό σεξουαλικού ανασυνδυασμού που διατηρεί μεγάλες ποσότητες μόνιμης γενετικής ποικιλότητας στους πληθυσμούς του και επιτρέπει την ταχεία προσαρμογή τόσο σε παγκόσμια όσο και σε τοπική κλίμακα [17, 19-24]. Κατά συνέπεια, τα κύρια γονίδια σίτου που προσδίδουν αντοχή στο Z. tritici ξεπερνιούνται γρήγορα [25]. Επιπλέον, τα περισσότερα από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα εμπορικά μυκητοκτόνα χάνουν την αποτελεσματικότητά τους με την πάροδο του χρόνου [3]. Ο συνδυασμός αυτών των δύο παραγόντων αποτελεί απειλή για την παγκόσμια παραγωγή σίτου, η οποία πρέπει να αντιμετωπιστεί επειγόντως. Το Z. tritici εμφανίστηκε επίσης πρόσφατα ως νέο μοντέλο για τη γονιδιωματική των παθογόνων με πολλές αναφορές γονιδιώματος υψηλής ποιότητας που είναι τώρα διαθέσιμες [26] επιπλέον των πανγονιδιωμάτων που κατασκευάζονται από μεγάλους αριθμούς μεμονωμένων γονιδιωμάτων απομόνωσης [27, 28]. Ίσως ένα από τα πιο ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά του γονιδιώματος του Z. tritici είναι η παρουσία 13 χρωμοσωμάτων πυρήνα (1-13) που βρίσκονται σε όλα τα απομονωμένα στελέχη, αλλά στη συνέχεια έως και άλλα 8 μικρότερα βοηθητικά χρωμοσώματα (14-21) τα οποία δείχνουν η παρουσία/απουσία και ο δομικός πολυμορφισμός μεταξύ των απομονώσεων [26, 29]. Ευτυχώς, ένα από τα απομονωμένα στελέχη αναφοράς της κοινότητας και το πρώτο που αναλύθηκε πλήρως η αλληλουχία, το ολλανδικό απομόνωση πεδίου IPO323 που συλλέχτηκε τη δεκαετία του 1980, φέρει 21 χρωμοσώματα, τον μεγαλύτερο αριθμό που έχει παρατηρηθεί μέχρι σήμερα. Ως εκ τούτου, το IPO323 χρησιμεύει ως εξαιρετικό σημείο αναφοράς για τη μελέτη της διακύμανσης σε άλλες απομονώσεις και ως ικρίωμα για την κατασκευή πανγονιδιωμάτων.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Ο κύκλος ασεξουαλικής μόλυνσης του Z. tritici είναι χαρακτηριστικός πολλών σχετικών φυτικών παθογόνων που επηρεάζουν πολλές καλλιέργειες τροφίμων [30]. Αυτοί οι μύκητες, που ανήκουν στην οικογένεια Mycosphaerellaceae της τάξης των Dothideomycetes, συνήθως εισβάλλουν στους φυτικούς ιστούς μέσω των στομάτων [30, 31]. Στη συνέχεια ακολουθεί μια περίοδος μακράς ασυμπτωματικής ανάπτυξης μεταξύ των φυτικών κυττάρων, διάρκειας τουλάχιστον 8 ημερών, η οποία τελειώνει απότομα με το σχηματισμό νεκρωτικών αλλοιώσεων στα φύλλα, κατάσταση που για το Z. tritici, φαίνεται να συμβαίνει ως αποτέλεσμα «υπερενεργοποίησης» του φυτού. ανοσία [32-34]. Ο θάνατος των φυτικών κυττάρων συνδέεται στη συνέχεια με το σχηματισμό νέων δομών σπορίωσης, πυκνιδίων, σε υποστοματικές κοιλότητες και την επακόλουθη εξώθηση και εξάπλωση των νεοσχηματισθέντων πυρηνιδιοσπορίων κατά τη διάρκεια περιόδων πιτσιλιών βροχοπτώσεων. Άλλοι μύκητες Dothideomycetes έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν υπερενεργοποίηση της ανοσίας των φυτών μέσω της έκκρισης πρωτεϊνικών «ενεργών» που αναγνωρίζονται σε ευαίσθητα φυτά, με αποτέλεσμα τον θάνατο κυττάρων και ιστών (νέκρωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος). Αυτοί οι νεκροτροφικοί μύκητες επωφελούνται από αυτή την απόκριση και οι εμπλεκόμενες πρωτεΐνες τελεστές αναφέρονται τώρα ως νεκροτροφικοί τελεστές [35, 36]. Ενώ υπάρχουν κάποιες προκαταρκτικές ενδείξεις ότι το Z. tritici μπορεί επίσης να αναπτύξει νεκροτροφικούς τελεστές στη μετάβαση στη συμπτωματική ανάπτυξη [37], επικαλούμενος βλάβες στα φύλλα, αυτή η υπόθεση δεν έχει ελεγχθεί σθεναρά μέχρι σήμερα. Οι δύο αμοιβαία μη αποκλειστικές οδοί για την προστασία της μελλοντικής παραγωγής σιταριού από τις επιπτώσεις του STB είναι η (1) ενίσχυση της φυσικής αντοχής στις ασθένειες των φυτών και (2) ο εντοπισμός νέων μοριακών στόχων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο της νόσου. Στην ιδανική περίπτωση, αυτά θα επέτρεπαν τον επιλεκτικό έλεγχο του παθογόνου παράγοντα, περιορίζοντας παράλληλα στο ελάχιστο τις άλλες περιβαλλοντικές και οικολογικές επιπτώσεις. Η γονιδιωματική των παθογόνων και ειδικότερα η πανγονιδιωματική προσφέρει τη δυνατότητα να αυξήσει και τις δύο στρατηγικές. Ενώ οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το εξάρτημα, το ταχέως εξελισσόμενο τμήμα του πανγονιδιώματος μπορεί να περιέχει πολλά γονίδια που αλληλεπιδρούν με την ανοσία των φυτών (π.χ. τελεστές), το γονιδίωμα του πυρήνα μπορεί να παρουσιάζει στόχους που μεταλλάσσονται λιγότερο εύκολα λόγω της μετάδοσης κυρώσεων αρνητικής καταλληλότητας (και λοιμογόνου δράσης). Για το λόγο αυτό, τα γεωργικά μυκητοκτόνα στοχεύουν συνήθως τις βασικές διεργασίες, οι οποίες πιθανώς θεωρούνται λιγότερο μεταβλητές. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ακόμη και αυτοί οι στόχοι μπορούν να εξελιχθούν σε κάποιο βαθμό για να αποφύγουν τη χημική αναστολή, όπως περιγράφεται για πολλές τρέχουσες πρωτεΐνες στόχους μυκητοκτόνων [3, 14]. Τα περισσότερα μυκητοκτόνα που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα έχουν στοχεύσει ένα αρκετά στενό σύνολο μοριακών διεργασιών (π.χ. βιοσύνθεση στερολών, αναπνοή κ.λπ.) [3]. Υπάρχουν δυνητικά πολλοί άλλοι στόχοι που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον επιλεκτικό έλεγχο μυκητιακών παθογόνων που θα πρέπει να προκύψουν από το συνδυασμό και την ανάλυση πολλαπλών συνόλων δεδομένων omics. Η υψηλή δυνατότητα ανακάλυψης τονίζεται από το γεγονός ότι τυπικά έως και το 40% όλων των γονιδίων που ταυτοποιούνται στις αλληλουχίες γονιδιώματος παθογόνων μυκήτων (και μυκήτων γενικά) εξακολουθούν να είναι άγνωστης λειτουργίας. Αυτά που υπάρχουν και ίσως διατηρούνται στο γονιδίωμα του πυρήνα των παθογόνων μυκήτων μπορεί να έχουν ιδιαίτερη σημασία.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >Το 80% των γονιδίων σημειώνονται ως πυρήνας [10]. Ωστόσο, άλλες αναλύσεις σε φλεγμονώδεις μύκητες που σχετίζονται με φυτά έχουν προβλέψει μεγαλύτερα βοηθητικά γονιδιακά συστατικά συμπεριλαμβανομένων ~38% για τα παθογόνα Claviceps purpurea [38] και ~44% στο Pyrenophora tritici-repentis [39]. Προηγούμενες ολοκληρωμένες παν-γονιδιωματικές μελέτες για το Z. tritici έχουν χρησιμοποιήσει παγκόσμιους και ιστορικούς πληθυσμούς που περιλαμβάνουν μεγάλους αριθμούς απομονώσεων, οι οποίοι έχουν αλληλουχηθεί τόσο σε κατακερματισμένη όσο και σε πλήρη κλίμακα γονιδιώματος [27, 28]. Αυτές οι μελέτες εντόπισαν ένα μεγάλο σύνολο βοηθητικών γονιδίων (~40% όλων των γονιδίων) για αυτό το είδος. Επιπλέον, αυτό συσχετίστηκε με εκτεταμένη παρουσία/απουσία και χρωμοσωμικούς δομικούς πολυμορφισμούς, που εμπλέκουν επίσης δυναμικά επαναλαμβανόμενα στοιχεία (συμπεριλαμβανομένων των μετατιθέμενων στοιχείων). Περαιτέρω ανάλυση έδειξε επίσης ότι πολλά βοηθητικά γονίδια εκφράζονται επίσης χαμηλότερα (κατά μέσο όρο) από τα γονίδια πυρήνα. Αυτές οι μελέτες αντιπροσωπεύουν το "χρυσό πρότυπο" για τη δομή του πανγονιδιώματος του είδους Z. tritici και τις πιο ολοκληρωμένες μέχρι σήμερα για οποιονδήποτε νηματώδη μύκητα. Ωστόσο, το ερώτημα παραμένει για αυτό, και για άλλα είδη, ως προς τον βαθμό που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί η πανγονιδιωματική για τον προσδιορισμό των βασικών γονιδίων και διεργασιών λοιμογόνου δράσης. Και εντός των συνόλων πυρήνων γονιδίων, εάν τα επίπεδα πολυμορφισμών σε όλο τον πληθυσμό που επηρεάζουν τις αλλαγές αμινοξέων, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων, προδίδουν την ταυτότητα των βασικών γονιδίων λοιμογόνου δράσης των παθογόνων;
Σε αυτή τη μελέτη, συνδυάσαμε την αλληλουχία του γονιδιώματος και τις μεταγραφικές προσεγγίσεις που βασίζονται σε RNAseq για να παράγουμε ένα πανγονιδίωμα από μια πρόσφατη ευρωπαϊκή συλλογή απομονώσεων Z. tritici. Ο κύριος στόχος μας ήταν να ελέγξουμε εάν τα γονίδια που υπάρχουν μέσα στο γονιδίωμα του πυρήνα που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με χαμηλά ποσοστά πολυμορφισμού αμινοξέων (δηλαδή σε κωδικοποιητικές αλληλουχίες) μεταξύ των απομονώσεων, φέρουν σημαντικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων σημαντικών ρόλων στις διαδικασίες μόλυνσης του πυρήνα στο σιτάρι. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες μελέτες [27, 28], αποδεικνύουμε ότι το Z. tritici έχει ένα εξαιρετικά μεγάλο βοηθητικό γονιδίωμα (~45% όλων των γονιδίων) που υποστηρίζει την ταχέως εξελισσόμενη κατάστασή του. Επιπλέον, παρέχουμε βιολογικά δεδομένα που υποστηρίζουν ξεκάθαρα τη χρησιμότητα της συνδυασμένης χρήσης και των δύο μεθόδων omics για τον εντοπισμό νέων γονιδίων μολυσματικότητας του πυρήνα. Αντίθετα, οι οθόνες υπερέκφρασης λειτουργικών πρωτεϊνών με τη μεσολάβηση του ιού υψηλής απόδοσης απέτυχαν να προσδιορίσουν υποψήφιους νεκροτροφικούς τελεστές που είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση αλλοιώσεων ασθένειας στα φύλλα σιταριού, είτε από τον πυρήνα είτε από το επικουρικό πανγονιδίωμα.
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
Αποτελέσματα
Οι οθόνες λοιμογόνου δράσης σε μια ευρωπαϊκή συλλογή Z. tritici εντοπίζουν παρόμοια επιθετικά στελέχη από γεωγραφικά ασύνδετες τοποθεσίες
Δοκιμάσαμε 43 απομονώσεις Z. tritici για λοιμογόνο δράση σε 21 ευρέως ευαίσθητες ευρωπαϊκές ποικιλίες σιταριού ψωμιού για να δώσουμε συνολικά 2709 σημεία δεδομένων (συμπεριλαμβανομένων τριών επαναλήψεων). Πληροφορίες απομόνωσης (κωδικός και χώρα προέλευσης) παρουσιάζονται στο Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1. Κάθε αλληλεπίδραση αξιολογήθηκε ποσοτικά για τις ακόλουθες παραμέτρους: (1) τη διάρκεια της περιόδου επώασης, (2) τον χρόνο που χρειάστηκε για να επιτευχθεί πλήρης νέκρωση (όταν συνέβη) και (3) τα επίπεδα ασεξουαλικής σπορίωσης (Εικ. 1Α). Με βάση τόσο την υπολογιστική όσο και την οπτική βαθμολόγηση ασθενειών (βλ. Μέθοδοι και πρόσθετο αρχείο 2: Εικ. S1), όλα τα απομονωμένα στελέχη ομαδοποιήθηκαν στη συνέχεια με βάση τα προφίλ λοιμογόνου δράσης τους στο πλαίσιο της ελεγχόμενης ποικιλίας (Εικ. 1Β). Το απομόνωμα θετικού μάρτυρα IPO323, το οποίο χρησιμεύει ως παγκόσμια αναφορά [26] με πλήρως προσδιορισμένο γονιδίωμα, ήταν λιγότερο επιθετικό από την πλειονότητα των δοκιμασμένων απομονώσεων έναντι όλων σχεδόν των ποικιλιών. Αυτή η απομόνωση συλλέχθηκε το ~1984 και από τότε φυλάσσεται σε αποθήκευση, με περιστασιακή επαναπέρασμα από φύλλα σιταριού. Ως εκ τούτου, δεν είναι επί του παρόντος ασαφές εάν αυτή η παρατήρηση θα μπορούσε (τουλάχιστον εν μέρει) να προέκυψε από την αποθήκευση δειγμάτων με την πάροδο του χρόνου. Εντοπίσαμε επτά απομονώσεις που δεν ήταν σε θέση να παράγουν συμπτώματα ασθένειας σε καμία από τις ποικιλίες σίτου (Εικ. 1Β). Καθώς όλα αυτά τα προϊόντα απομόνωσης προέρχονταν είτε από την Ισπανία είτε από την Ιταλία, όπου καλλιεργείται συχνότερα ο τετραπλοειδής (σκληρός/ζυμαρικό) σίτος (Triticum durum L.), είναι πιθανό ότι αυτά τα απομονωμένα στελέχη ήταν ειδικά για το σκληρό σιτάρι [40, 41]. Είναι σημαντικό ότι τα προϊόντα απομόνωσης με παρόμοια προφίλ λοιμογόνου δράσης δεν συγκεντρώθηκαν στη θέση συλλογής τους, με τα απομονωμένα στελέχη που προέρχονται από την ανατολική πλευρά της Σλοβακίας έως τη δυτική Ιρλανδία να ομαδοποιούνται όλα μαζί (Εικ. 1Β). Αυτή η παρατήρηση συμφωνεί καλά με τα υψηλά επίπεδα γενετικής διακύμανσης που υπάρχουν μεταξύ των απομονωμένων στελεχών και προηγούμενων μελετών που έχουν δείξει ότι αυτή είναι εξίσου υψηλή στην κλίμακα μιας μεμονωμένης βλάβης φύλλου σίτου, όπως σε όλες τις ηπείρους [42]. Πολλά από τα πιο επιθετικά στελέχη με διακριτά προφίλ λοιμογόνου δράσης επιλέχθηκαν στη συνέχεια για γονιδιωματικό προσδιορισμό αλληλουχίας (επισημαίνεται με "#" στο Σχ. 1 Β) και ανάλυση RNAseq (επισημαίνεται με "+" στο Σχ. 1 Β).
Εικ. 1 Αξιολογήσεις μολυσματικότητας της ευρωπαϊκής συλλογής απομόνωσης έναντι μιας σειράς εξαπλοειδών (ψωμιού) ποικιλιών σίτου. Μια τυπική χρονική πορεία εξέλιξης της νόσου που απεικονίζει τις παραμέτρους που αξιολογήθηκαν στην οθόνη, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου που απαιτείται για την εμφάνιση των πρώτων ορατών συμπτωμάτων και για την εμφάνιση της νέκρωσης του πλήρους φύλλου στην εμβολιασμένη περιοχή. Το σχήμα δείχνει τη μόλυνση της ποικιλίας σίτου Riband από απομόνωση Z. tritici IPO323. B Προφίλ μολυσματικότητας των απομονώσεων έναντι του πλαισίου της ποικιλίας με βάση τα επίπεδα νέκρωσης και χλωρίωσης των φύλλων. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τόσο με οπτικές αξιολογήσεις όσο και με τη χρήση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας LemnaTec και LemnaGrid με συγκρίσιμα τελικά αποτελέσματα. Τα απομονωμένα στελέχη ταξινομήθηκαν και ομαδοποιήθηκαν με βάση δεδομένα λοιμογόνου δράσης. Τα προϊόντα απομόνωσης Z. tritici που επισημαίνονται με # υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας γονιδιώματος για την κατασκευή ενός πανγονιδιώματος. Οι απομονώσεις που επισημαίνονται με + αναλύθηκαν επίσης με RNAseq transcriptomics. Η ποικιλία σίτου Panorama (επισημασμένη με Χ) προσδιορίστηκε ότι είναι εξίσου και πλήρως ευαίσθητη στα περισσότερα απομονωμένα στελέχη και επιλέχθηκε ως ο γονότυπος ξενιστής για τη μόλυνση των φύλλων RNAseq. Σημειώστε ότι τα δεδομένα χαμηλής μολυσματικότητας για την υπερομάδα επτά απομονωμένων στελεχών έναντι όλων των ποικιλιών είναι πιθανό να προκύψουν από την προσαρμογή αυτών των απομονώσεων για την πρόκληση ασθένειας στον τετραπλοειδή σίτο (σκληρό ή ζυμαρικό). Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών μολυσμένων φύλλων που αναλύθηκαν/αλληλεπιδρούν με από δύο πειράματα βιολογικών αντιγράφων (6 φύλλα συνολικά). C Ανάλυση SplitsTree της μοριακής φυλογένεσης απομονώσεων που επιλέχθηκαν για γονιδιωματική αλληλουχία. Η χώρα προέλευσης των απομονώσεων εμφανίζεται στη συντομογραφία (Pl=Poland; GB=Great Britain; Be=Belgium; Cz=Czech Republic; Ge {{8 }} Γερμανία, Sw=Σουηδία, Fr=Γαλλία, Sl=Σλοβακία, Ir=Ιρλανδία). Το προϊόν απομόνωσης αναφοράς, IPO323 που συλλέχθηκε το ~1984 από τις Κάτω Χώρες (Ne) αντιπροσωπεύεται επίσης
Η αλληλουχία του γονιδιώματος και η φυλογενετική ανάλυση σε δεκαεπτά ευρωπαϊκά απομονωμένα στελέχη αποκαλύπτουν υψηλά επίπεδα γενετικής ποικιλότητας
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >Το 97% σε όλες τις περιπτώσεις έδειξε καλή συναρμολόγηση του γονιδιακού χώρου (περιοχές κωδικοποίησης) για όλα τα στελέχη. Μερικά επιλεγμένα γονίδια BUSCO έλειπαν από όλα τα συγκροτήματα υποδηλώνοντας ότι το Z. tritici μπορεί να μην έχει ορθολόγους αυτών των γονιδίων. Για να προσδιορίσουμε την ποσότητα της γενετικής παραλλαγής που επηρεάζει τις προβλεπόμενες περιοχές κωδικοποίησης, στη συνέχεια εκτελέσαμε μια ανάλυση SNPEf για κάθε στέλεχος έναντι ενός πανγονιδιώματος που βασίζεται στο πλήρες γονιδίωμα της απομόνωσης αναφοράς IPO323 (Πίνακας 2). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι κάθε νέο στέλεχος είχε πάνω από 160,000 SNP έναντι του παραγόμενου πανγονιδιώματος. Μεταξύ αυτών ήταν περισσότερα από 65,000 τα οποία είτε προκάλεσαν πιθανή απώλεια της πρωτεϊνικής λειτουργίας (υψηλό αποτέλεσμα, μετατόπιση πλαισίου, χαμένη έναρξη, πρόωρα κωδικόνια λήξης) είτε προκάλεσαν αλλαγή αμινοξέων στις προβλεπόμενες πρωτεΐνες (Μέτρια). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν τη γενετική ποικιλομορφία που υπάρχει μεταξύ των απομονώσεων Z. tritici.
Πραγματοποιήθηκε ανάλυση σπασμένων δέντρων στα 17 στελέχη που προσδιορίστηκαν πρόσφατα σε αλληλουχία και στο IPO323 για να προσδιοριστεί εάν τα απομονωμένα στελέχη με παρόμοια πρότυπα μόλυνσης της ποικιλίας είχαν κάποια φυλογενετική σχέση και εάν αυτό συσχετίστηκε με τη χώρα προέλευσης. Η φυλογένεση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια συνένωση έξι κωδικοποιητικών και μη αλληλουχιών (βλ. Μέθοδοι και πρόσθετο αρχείο 3: Δεδομένα S1). Το δέντρο (Εικ. 1C) δείχνει για άλλη μια φορά ότι δεν υπήρχε σαφής σύνδεση μεταξύ των προφίλ μολυσματικότητας και της θέσης δειγματοληψίας για τα απομονωμένα στελέχη με την αλληλουχία, με στενά συνδεδεμένα προφίλ λοιμογόνου δράσης (σε σύγκριση με το Σχήμα 1Β) που φαίνονται για απομονώσεις που συλλέχθηκαν από διαφορετικές ευρωπαϊκές χώρες, οι οποίες ωστόσο ήταν φυλογενετικά στενά συνδεδεμένη.
Η κατασκευή και η ανάλυση του πανγονιδιώματος προβλέπει 9807 «πυρήνα» και 8083 «αξεσουάρ» γονίδια
Εκτός από τις αλληλουχίες του γονιδιώματος, επιλέξαμε 12 απομονώσεις για προφίλ μεταγραφής με βάση το RNAseq (υποδεικνύεται με + στο Σχήμα 1Β). Κάθε προϊόν απομόνωσης διαμορφώθηκε εις τριπλούν κατά τη διάρκεια της αξονικής ανάπτυξης σε ζωμό YPD και επίσης σε δύο ανεξάρτητα στάδια μόλυνσης των φύλλων. 6 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (dpi) που αντιπροσωπεύει τη μέση φάση χωρίς συμπτώματα και 9 dpi, στη μεταβατική φάση της πρώιμης ανάπτυξης συμπτωμάτων. Η παγκοσμίως ευαίσθητη ποικιλία σίτου Panorama χρησιμοποιήθηκε για δοκιμές μόλυνσης, τις οποίες όλα τα απομονωμένα στελέχη μπόρεσαν να μολύνουν πλήρως με δυσδιάκριτες κινητικές. Χρησιμοποιώντας αυτά τα δεδομένα μεταγραφής σε συνδυασμό με τα νέα συγκροτήματα γονιδιώματος και την αρχική αλληλουχία αναφοράς του IPO323 ως ικρίωμα, προσδιορίσαμε ένα πανγονιδίωμα για τα ευρωπαϊκά στελέχη που ενσωματώνουν επίσης αλληλουχίες που υπάρχουν σε άλλες απομονώσεις που δεν ανιχνεύθηκαν στο IPO323. Τα βήματα στην κατασκευή του πανγονιδιώματος και τα κριτήριά μας για την κατηγοριοποίηση των γονιδίων ως "πυρήνας" ή "αξεσουάρ" φαίνονται στο Σχ. 2. Είναι σημαντικό, ο πολυμορφισμός της αλληλουχίας αδρανοποίησης (υψηλό αποτέλεσμα, απώλεια λειτουργίας-LoF) και η παρουσία και η απουσία, εκτιμήσεις υποστηρίχθηκαν επίσης από στοιχεία γονιδιακής έκφρασης. Ως εκ τούτου, ένα γονίδιο θα πρέπει να υπάρχει σε λειτουργική μορφή και να εκφράζεται από όλα τα απομονωμένα στελέχη, για να αποδοθεί στην κατηγορία "πυρήνας". Η συνολική μας προσέγγιση (Εικ. 2) όρισε ένα συνολικό πανγονιδίωμα 17.890 γονιδίων συμπεριλαμβανομένου του 2017 που δεν υπήρχαν στο IPO323. Τα επόμενα βήματα φιλτραρίσματος κατηγοριοποίησαν το 9807 ότι βρίσκεται στο γονιδίωμα του πυρήνα, με μόνο έναν ελαφρώς μικρότερο αριθμό, το 8083, στο σετ εξαρτημάτων. Το τελευταίο αντιπροσωπεύει το ~45% του συνολικού πανγονιδιώματος, μια ελαφρά αύξηση σε σχέση με αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Αν και αυτοί οι αριθμοί γενικά συμφωνούν καλά, οι εκτιμήσεις των βοηθητικών γονιδίων είναι πιο υποκειμενικές σε μεροληψία λόγω των μεθόδων που χρησιμοποιούνται (Panseq, κ.λπ.) και δεν μπορούμε να υποθέσουμε ότι η πρόσθετη μελλοντική ανάλυση ενδέχεται να μην μειώσει τον αριθμό των βοηθητικών γονιδίων χρησιμοποιώντας, για παράδειγμα, βασισμένη στην ορθολογία προσεγγίσεις. Όλα τα πανγονίδια αναλύθηκαν για πολλαπλά χαρακτηριστικά (προβλέψεις έκκρισης, συσχέτιση μεμβράνης, εντοπισμό και περιεκτικότητα σε κυστεΐνη) και προβλεπόμενες λειτουργίες (σχολιασμοί BLAST, GO και Interpro). Παρέχεται ένας πίνακας που παρέχει όλες τις διαθέσιμες πληροφορίες για όλα τα γονίδια (Επιπλέον αρχείο 4: Πίνακας S2). Ο πίνακας εμφανίζει επίσης τα σχετικά μέσα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης που προέρχονται από RNAseq που προσδιορίζονται για όλα τα γονίδια και για τις 12 απομονώσεις υπό τις τρεις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Συλλογικά, σε σύγκριση επίσης με τις προηγούμενες πανγονιδιωματικές μελέτες σε αυτόν τον οργανισμό [27, 28], είναι σαφές ότι το Z. tritici έχει έναν από τους μεγαλύτερους αριθμούς βοηθητικών γενετικών συστατικών μυκήτων που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, γεγονός που πιθανώς αντανακλά την ταχεία εξέλιξή του φύση.
Πίνακας 1 Ανάλυση BUSCO για νέα γονιδιώματα
Πίνακας 2 Σύνοψη των επιπτώσεων του SNP effect για κάθε νέο γονιδίωμα σε σχέση με τα μοντέλα γονιδίων αναφοράς IPO323
Εικ. 2 Σύνοψη των βημάτων που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των κλήσεων και αριθμών γονιδίου "πυρήνα" και "αξεσουάρ" για το πρόσφατα κατασκευασμένο ευρωπαϊκό πανγονίδιο Ζ. tritici. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των γονιδίων που προσδιορίζονται σε κάθε στάδιο του αγωγού
Δομικά χαρακτηριστικά της παραλλαγής στο ευρωπαϊκό πανγονιδίωμα Z. tritici
Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η πανγονιδιωματική θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για να εντοπιστούν σημαντικά νέα γονίδια, είτε απαραίτητα για τη ζωή είτε για λοιμογόνους παράγοντες σε παθογόνους οργανισμούς. Υποθέσαμε ότι αυτά θα είναι γονίδια που υπάρχουν και λειτουργούν σε κάθε στέλεχος του παθογόνου και εκφράζονται από αυτό. Περαιτέρω υποθέσαμε ότι αυτά τα γονίδια θα έχουν χαμηλότερα επίπεδα μεταλλάξεων SNP υψηλής και μέτριας επίδρασης που επηρεάζουν τις κωδικοποιητικές αλληλουχίες (λιγότερο πολυμορφικές) και ότι μπορεί να συγκεντρώνονται σε περιοχές σε συγκεκριμένα χρωμοσώματα.
Χρησιμοποιήσαμε δεδομένα παραλλαγής SNP (υψηλή, μέτρια και τροποποιητή - βλ. Πρόσθετο αρχείο 4: Πίνακας S2), καθώς και δεδομένα μέσης έκφρασης για όλα τα γονίδια, για να διερευνήσουμε τα μέσα επίπεδα κωδικοποιητικού πολυμορφισμού και έκφρασης σε χρωμοσωμική βάση, χρησιμοποιώντας τα 21 χρωμοσώματα του IPO323 ως το ικρίωμα. Τα τροποποιητικά SNP αντιπροσωπεύουν αλλαγές νουκλεοτιδίων που δεν προκαλούν αλλαγή αμινοξέων. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι δεν υπήρχε ιδιαίτερη προκατάληψη για τη συχνότητα μετάλλαξης όταν τα αθροιστικά υψηλά, μέτρια και τροποποιητικά SNP εκφράστηκαν ως χαρακτηριστικό μέσου μήκους πρωτεΐνης ανά ολόκληρο χρωμόσωμα. Ωστόσο, όταν οι μεταλλάξεις τροποποιητών, δηλαδή αυτές που δεν προκαλούν αλλαγή αμινοξέων, παραλήφθηκαν, ήταν σαφές ότι τα μικρότερα 8 χρωμοσώματα διέθεταν γονίδια με υψηλότερους αριθμούς υψηλών και μέτριων μεταλλάξεων SNP (Εικ. 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα τονίστηκε περαιτέρω όταν αναλύθηκαν μόνο τα SNP υψηλής επίδρασης (Εικ. 3C). Σε αντίθεση με τα επίπεδα που είναι εμφανή στα χρωμοσώματα του πυρήνα 1-13 (~20%), έως και το 90% των γονιδίων που βρίσκονται στα οκτώ μικρότερα χρωμοσώματα 14-21 υπόκεινται σε υψηλή επίδραση, πιθανή απώλεια λειτουργίας μεταλλάξεων σε τουλάχιστον μία απομόνωση (Εικ. 3C). Τα σωρευτικά δεδομένα μεταγραφής και από τα 12 νέα στελέχη κατέδειξαν επίσης σχετικά χαμηλή μέση έκφραση των γονιδίων που υπάρχουν στα χρωμοσώματα 14-21 (Εικ. 3D), όπως είχε παρατηρηθεί προηγουμένως για το IPO323 [32, 43, 44]. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν μια σαφή γονιδιωματική διαμερισματοποίηση, με τα μικρότερα οκτώ βοηθητικά χρωμοσώματα να περιέχουν αλληλουχίες που είναι εξαιρετικά πολυμορφικές, βοηθητικές και γενικά ανεπαρκώς εκφρασμένες.
Η σύγκριση όλων των γονιδίων είτε στον πυρήνα είτε στο βοηθητικό γονιδίωμα αποκάλυψε ότι το ~60% όλων των γονιδίων στο τελευταίο βρέθηκαν σε τουλάχιστον ένα στέλεχος με μετάλλαξη υψηλής επίδρασης (απώλεια λειτουργίας (LoF)) και ότι το 47% απουσίαζε επίσης από τουλάχιστον ένα στέλεχος (Επιπλέον αρχείο 4: Πίνακας S2). Παρόμοια με την ανάλυση στα βοηθητικά χρωμοσώματα, τα μεμονωμένα βοηθητικά γονίδια εκφράστηκαν επίσης πολύ κακώς συνολικά στα στελέχη που δοκιμάστηκαν (Επιπλέον αρχείο 4: Πίνακας S2) και είχαν πολύ μεγαλύτερο αριθμό αλληλουχιών με άγνωστες λειτουργίες (περίπου 80%). Αυτές οι παρατηρήσεις συγκρίνονται καλά με προηγούμενες πανγονιδιωματικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε παγκόσμιες συλλογές του Z. tritici που συλλέχθηκαν με διαφορά δεκαετιών [27, 28].
Πραγματοποιήσαμε επίσης μια ανάλυση παραλλαγής παρουσίας και απουσίας γονιδίου (PAV) για όλα τα γονίδια που προβλέπονται στην απομόνωση αναφοράς IPO323, για τις άλλες 17 απομονώσεις με αλληλουχία. Αυτά τα δεδομένα παρουσίας/απουσίας σχεδιάστηκαν τοπικά για κάθε γονίδιο σε καθένα από τα 21 χρωμοσώματα που υπάρχουν στο IPO323. Τα σχήματα 3Ε και ΣΤ δείχνουν δεδομένα από αντιπροσωπευτικά χρωμοσώματα πυρήνα (1 και 7), ενώ τα Σχήματα 3G και Η δείχνουν δεδομένα για αντιπροσωπευτικά βοηθητικά χρωμοσώματα (13 και 14). Τα δεδομένα για τα υπόλοιπα χρωμοσώματα φαίνονται στο Πρόσθετο αρχείο 2: Εικ. S2. Αυτή η ανάλυση εντόπισε πολλά γονίδια που υπάρχουν στο IPO323 που λείπουν σε έναν αριθμό από τα απομονωθέντα στελέχη που επαναπροσδιορίστηκαν και δείχνει ξεκάθαρα τη διαφορά στη συνολική παρουσία/απουσία γονιδίου μεταξύ των χρωμοσωμάτων "πυρήνα" του IPO323 (τα οποία βρίσκονται σε κάθε στέλεχος Z. tritici) σε σύγκριση με τα 8 μικρότερα «αξεσουάρ» χρωμοσώματα. Τα δεδομένα υπογραμμίζουν επίσης μια περιοχή στο χρωμόσωμα 7 συγκεκριμένα, μεταξύ 1,7 Mb και 2,5 Mb, η οποία εμφανίζει υψηλή συχνότητα απουσίας γονιδίου στα νέα στελέχη (Εικ. 3F). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η περιοχή ταιριάζει ακριβώς με μια θέση γονιδιώματος που είχε προηγουμένως δει ότι έχει ελάχιστη ή καθόλου γονιδιακή έκφραση στο IPO323 είτε κατά την ανάπτυξη σε καλλιέργεια είτε κατά τη διάρκεια οποιασδήποτε φάσης μόλυνσης των φυτών [32, 43]. Αυτή η περιοχή ταιριάζει επίσης με μια χρωμοσωμική διαγραφή, η οποία παρατηρήθηκε σε μια απομόνωση της Υεμένης σε μια προηγούμενη μελέτη πανγονιδιώματος [28]. Μαζί, αυτά τα δεδομένα ενισχύουν την ιδέα ότι το Z. tritici αντιπροσωπεύει έναν ταχέως εξελισσόμενο οργανισμό με υψηλά επίπεδα και διαφορετικούς τύπους γενετικής και γονιδιωματικής ποικιλομορφίας στον πληθυσμό του.
Οι προβλέψεις εντοπισμού πρωτεϊνών αποκαλύπτουν γονίδια στο επικουρικό πανγονιδίωμα που μπορεί να λειτουργούν στην προσαρμογή σε μεταβαλλόμενα περιβάλλοντα
Οι προβλέψεις εντοπισμού πρωτεΐνης WolfPsort εκτελέστηκαν σε όλες τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το πανγονιδίωμα. Στη συνέχεια υπολογίσαμε το σχετικό ποσοστό των πρωτεϊνών που προβλέπεται να εντοπιστούν σε κάθε υποκυτταρική περιοχή ως χαρακτηριστικό του συνολικού αριθμού πρωτεϊνών για τον πυρήνα ή το βοηθητικό πανγονιδίωμα (Εικ. 4). Αρκετές κατηγορίες εντοπισμού εμπλουτίστηκαν στο γονιδίωμα του πυρήνα, συμπεριλαμβανομένων των "κυτταρόπλασμα", "εξωκυτταρική" και "πλασματική μεμβράνη", η τελευταία από τις οποίες περιέχει πολλές βασικές λειτουργίες μεταφοράς (Εικ. 4). Αντίθετα, οι θέσεις «πυρήνας» και «μιτοχόνδρια» συσχετίστηκαν με υψηλότερο ποσοστό γονιδίων στο βοηθητικό γονιδίωμα (Εικ. 4). Το βοηθητικό γονιδίωμα εμπλουτίστηκε για συγκεκριμένες περιοχές δέσμευσης ψευδαργύρου που μπορεί να παρέχουν ευελιξία μεταγραφής. Ο εμπλουτισμός αυτής της κατηγορίας αναφέρθηκε επίσης σε μια προηγούμενη μελέτη πανγονιδιώματος, υπογραμμίζοντας ότι ο συνολικός αγωγός μας παρήγαγε συγκρίσιμα αποτελέσματα [27, 28]. Ο «μιτοχονδριακός» εμπλουτισμός είναι ενδιαφέρον καθώς υπάρχουν ψευδογονίδια και παράλογοι μιτοχονδριακών πρωτεϊνών καλόπιστων που στοχεύουν αντιμυκητιακές χημικές ουσίες. Ένα σαφές παράδειγμα στο βοηθητικό πανγονιδίωμα είναι ένας παράλογος μιας υπομονάδας C ηλεκτρικής αφυδρογονάσης (SDHC3) που έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβεί σε όρθια αντίσταση έναντι μιας υποκατηγορίας μυκητοκτόνων SDHI (αναστολέας της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης) στο Z. tritici [45]. Προσδιορίσαμε πλήρεις αλληλουχίες αυτού του γονιδίου μόνο σε τρεις από τις δεκαεπτά απομονώσεις αλληλουχίας και εντοπίσαμε υψηλό επίπεδο γονιδιακής έκφρασης μόνο σε μία από τις 12 που μελετήθηκαν στη συνέχεια από το RNAseq (Εικ. 5Β). Ωστόσο, η προηγούμενη μελέτη και η τρέχουσα ανάλυσή μας τονίζουν ότι υπάρχουν πράγματι σημαντικές λειτουργίες στο βοηθητικό γονιδίωμα αλλά ότι αυτές είναι πιθανώς πιο σημαντικές για την προσαρμογή σε μεταβαλλόμενα περιβάλλοντα παρά για τον βασικό τρόπο ζωής.
Εικ. 3 Δομικά χαρακτηριστικά πανγονιδιώματος και πολυμορφισμοί παρουσίας/απουσίας στα 21 χρωμοσώματα της απομόνωσης IPO323 αναφοράς. Ένας συνολικός αριθμός αθροιστικών μεταλλάξεων SNP που προσδίδουν τροποποιητές, μέτριες (M) και υψηλές (H-απώλεια λειτουργίας-LoF) επηρεάζουν τις αλλαγές που εκφράζονται ως χαρακτηριστικό του μέσου μήκους πρωτεΐνης (aa) ανά χρωμόσωμα. B Συνολικός αριθμός αθροιστικών μεταλλάξεων SNP που προσδίδουν μέτριες και υψηλές αλλαγές επίδρασης που εκφράζονται ως χαρακτηριστικό του μέσου μήκους πρωτεΐνης ανά χρωμόσωμα. C Συνολικός αριθμός αθροιστικών μεταλλάξεων SNP που προσδίδουν αλλαγές υψηλού αντίκτυπου που εκφράζονται ως χαρακτηριστικό του μέσου μήκους πρωτεΐνης ανά χρωμόσωμα. D Μέση μέση έκφραση όλων των γονιδίων που υπάρχουν σε καθένα από τα 21 χρωμοσώματα σε όλα τα στελέχη. E Πολυμορφισμός παρουσίας και απουσίας (PaV) των γονιδίων που προβλέφθηκαν στο χρωμόσωμα 1 του πυρήνα της απομόνωσης IPO323 στα 17 νέα απομονωμένα στελέχη της αλληλουχίας. F PaV για γονίδια στο χρωμόσωμα πυρήνα 7. G PaV για γονίδια στο βοηθητικό χρωμόσωμα 15. G–F PaV για γονίδια στο βοηθητικό χρωμόσωμα 15. Τα δεδομένα υπογραμμίζουν την εκτεταμένη περιφερειακή διαφοροποίηση και σηματοδοτούν μια σαφή διάκριση μεταξύ των επιπέδων των συνολικών πολυμορφισμών αλληλουχίας και της παρουσίας/ απουσία εμφανής στον πυρήνα και στα βοηθητικά χρωμοσώματα
Εικ. 4 Προβλεπόμενος εντοπισμός πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από πυρήνα και βοηθητικά γονίδια. Σύνοψη των ποσοστιαίων προβλεπόμενων πρωτεϊνικών εντοπισμών που προσδιορίστηκαν από το WolfPsort για κατηγορίες που υποδεικνύονται σε σχέση με τις συνολικές πρωτεΐνες που υπάρχουν στον πυρήνα και το βοηθητικό πανγονιδίωμα
Οι πρωτεΐνες τελεστές στο βοηθητικό γονιδίωμα εμφανίζουν μεγαλύτερη μεταβλητότητα μεταξύ των στελεχών στην έκφραση από εκείνες στον πυρήνα
Πάνω από το οκτώ τοις εκατό των γονιδίων στο γονιδίωμα του πυρήνα κωδικοποιούσαν υποτιθέμενες εκκρινόμενες πρωτεΐνες, αριθμός υψηλότερος από αυτόν για το βοηθητικό γονιδίωμα (~5%). Ωστόσο, τα γονίδια στο βοηθητικό γονιδίωμα που κωδικοποιούν την εκκρινόμενη πρωτεΐνη είχαν συχνότερα άγνωστη λειτουργία, χωρίς αναγνωρίσιμους τομείς ή καταλυτικές περιοχές. Αυτές οι πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργίας αντιστοιχούσαν στο ~ 75% του συνολικού βοηθητικού εκκριτώματος σε σχέση με το 42% για το εκκριτικό πυρήνα. Πολλοί από τους υποψήφιους (και σε ορισμένες περιπτώσεις επικυρωμένους) τελεστές που υπάρχουν στο γονιδίωμα του πυρήνα εκφράστηκαν με παρόμοια μοτίβα και σε συγκρίσιμα επίπεδα και στα δώδεκα στελέχη που αναλύθηκαν με RNASeq. Για παράδειγμα, οι τρεις εκτελεστές που περιέχουν περιοχή LysM (Λυσίνη), 3LysM, 1LysM και xLysM, εκφράστηκαν σε πολύ παρόμοια επίπεδα και σε πανομοιότυπα μοτίβα, από κάθε στέλεχος (Εικ. 5C-E). Ο τελεστής Te 3LysM παραμένει ο μόνος κύριος εκκρινόμενος καθοριστικός λοιμογόνος παράγοντας του Z. tritici, όπου αυτή η πρωτεΐνη χρησιμεύει για την καταστολή της ανοσίας των φυτών που προκαλείται από τη χιτίνη κατά τη διάρκεια της πρώιμης μόλυνσης [46, 47]. Ωστόσο, και οι τρεις εκτελεστές LysM είναι γνωστό ότι συνεργάζονται για αυτό το σκοπό [48]. Είναι λοιπόν αξιοσημείωτο ότι υπήρχε πολύ μικρή διακύμανση έκφρασης για αυτά τα γονίδια μεταξύ των απομονώσεων, επιβεβαιώνοντας τις προτάσεις ότι αυτή η καταστολή της άμυνας είναι ένα βασικό συστατικό της μόλυνσης. Αντίθετα, οι υποψήφιοι τελεστές που βρέθηκαν στο βοηθητικό γονιδίωμα εμφάνισαν και παραλλαγή παρουσίας και απουσίας και εξαιρετικά μεταβλητή έκφραση μεταξύ των απομονώσεων (Εικ. 5F-H). Για παράδειγμα, το AvrStb6, ο πρώτος παράγοντας μη λοιμογόνου δράσης που εντοπίστηκε στο Z. tritici, [49, 50] εμφανίζει σημαντική διακύμανση έκφρασης (Εικ. 5F), παρά το γεγονός ότι υπάρχει σε όλα τα στελέχη. Αυτή η μεταβλητή αλληλουχίας, μια μικρή, εκκρινόμενη πρωτεΐνη, αναγνωρίζεται από ποικιλίες σίτου που περιέχουν λειτουργικά αλληλόμορφα της κινάσης που μοιάζει με υποδοχέα Stb6 [25, 51]. Αυτή η αναγνώριση παρέχει αντοχή στη νόσο έναντι όλων των απομονώσεων που φιλοξενούν ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο αυτού του παράγοντα. Υπήρχε μια σημαντική διακύμανση έκφρασης του AvrStb6 μεταξύ των απομονώσεων και εντοπίσαμε ένα προϊόν απομόνωσης (Zt118) όπου δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουμε καμία έκφραση, σε οποιαδήποτε από τις τρεις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Για το λόγο αυτό, στον αγωγό πρόβλεψής μας, το AvrStb6 ταξινομήθηκε στο βοηθητικό γονιδίωμα. Πολλοί άλλοι υποψήφιοι τελεστές άγνωστων επί του παρόντος λειτουργιών εμφάνισαν σημαντική παρουσία/απουσία και/ή παραλλαγή έκφρασης στο βοηθητικό γονιδίωμα (Εικ. 5G και Η).
Εικ. 5 Παραλλαγή έκφρασης γονιδίων στον πυρήνα και το βοηθητικό πανγονιδίωμα και καθιέρωση ενός παροδικού συστήματος υπερέκφρασης του ιού που αναπτύσσεται για διαλογές νεκροτροφικών τελεστών. Ένα κλειδί για την ερμηνεία δεδομένων φαίνεται στα σχήματα. B Παρουσία/απουσία και παραλλαγή γονιδιακής έκφρασης για τον παράλογο υπομονάδας C της αφυδρογονάσης ηλεκτρικού που υπάρχει στο βοηθητικό γονιδίωμα. Προφίλ έκφρασης C–E των τελεστών ZtLysM, 3LysM, 1LysM και xLysM, όλα παρόντα στον πυρήνα του πανγονιδιώματος. F Προφίλ έκφρασης του παράγοντα μη τοξικότητας AvrStb6. Η έλλειψη οποιασδήποτε έκφρασης στην απομόνωση 118 ταξινομεί τον εκτελεστή στο βοηθητικό πανγονιδίωμα. G και H Αντιπροσωπεύουν παραδείγματα επιπρόσθετων υποψηφίων τελεστών στο βοηθητικό πανγονιδίωμα.
Οι λειτουργικές οθόνες δεν παρέχουν ενδείξεις για δραστηριότητα νεκροτροφικού τελεστή είτε στο πυρήνα είτε στο επικουρικό πανγονιδίωμα
Υιοθετήσαμε ένα πρόσφατα αναπτυγμένο σύστημα μεταβατικής έκφρασης πρωτεϊνών με τη μεσολάβηση ιικού φορέα για σιτάρι (και άλλες καλλιέργειες δημητριακών και μη), χρησιμοποιώντας τον ιό Foxtail Mosaic (FoMV), για να εκτελέσουμε μια οθόνη μέσης έως υψηλής απόδοσης των υποψηφίων Z. tritici efectors από το πανγονιδίωμα. Σκοπεύαμε συγκεκριμένα να ελέγξουμε εάν κάποια είχε την ικανότητα να προκαλέσει νέκρωση σε ένα μικρό πάνελ ποικιλιών σιταριού, κάτι που θα μπορούσε να υποδηλώνει τη λειτουργία τους στη μετάβαση στα συμπτώματα της νόσου ως «νεκροτροφικοί τελεστές» [36, 52]. Για αυτήν τη μελέτη, κάναμε ορισμένες τροποποιήσεις στο προηγουμένως δημοσιευμένο σύστημα [53]. Για να προωθήσουμε την έκκριση εξωκυττάριας πρωτεΐνης στο σιτάρι, χρησιμοποιήσαμε τη σηματοδοτική αλληλουχία πεπτιδίου πρωτεΐνης 1 (TaPR1) που σχετίζεται με την παθογένεια του σίτου, βελτιστοποιημένη με κωδικόνιο σε Arabidopsis thaliana, η οποία στη συνέχεια συντήχθηκε στο πλαίσιο με κάθε υποψήφια ακολουθία μυκητιακού τελεστή μέσω γονιδιακής σύνθεσης (Εικ. 5I). Η αποτελεσματικότητα του πεπτιδίου σήματος TaPR1 να εκκρίνει λειτουργικές εξωκυτταρικές πρωτεΐνες Z. tritici αποδείχθηκε από την ικανότητά του να προκαλεί νέκρωση των φύλλων στον καπνό όταν τοποθετείται μπροστά από τη νέκρωση του Z. tritici και την πρωτεΐνη που μοιάζει με αιθυλένιο (ZtNLP), η οποία είναι μόνο λειτουργική όταν στοχεύεται για εξωκυτταρική έκκριση (Εικ. 5 Jl) [54]. Στη συνέχεια επιβεβαιώσαμε ότι ο φορέας μπορούσε να υπερεκφράζει εξίσου καλά πρωτεΐνες σε μια σειρά ποικιλιών σίτου οπτικοποιώντας την τοπική και συστημική έκφραση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) σε όλα τα φύλλα διαφορετικών ποικιλιών σίτου (Επιπλέον αρχείο 2: Εικ. S3). Τέλος, στη συνέχεια δοκιμάσαμε την ικανότητα του καλά χαρακτηρισμένου νεκροτροφικού τελεστή SnToxA, από το σχετικό παθογόνο σίτου Parastagonospora nodorum, να προκαλεί νέκρωση σε φύλλα σιταριού γονότυπου που διαθέτουν το γονίδιο ευαισθησίας Tsn1 [55]. Όπως αναμενόταν, η μεσολαβούμενη από FoMV υπερέκφραση του SnToxA, με το πεπτίδιο σήματος TaPR1, προκάλεσε νέκρωση μόνο στην ποικιλία σίτου που κατείχε Tsn1 (cv Halberd στο Σχήμα 5Κ) χωρίς να παρατηρήθηκαν συμπτώματα σε ποικιλίες που δεν είχαν αυτό το γονίδιο ευαισθησίας (cv Riband στο Σχ. 5Κ ). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι το σύστημα υπερέκφρασης με τη μεσολάβηση ιικού φορέα ήταν κατάλληλο για διαλογή μεγαλύτερης κλίμακας των υποψήφιων τελεστών Z. tritici για την ταυτοποίηση οποιουδήποτε με δραστηριότητα νεκροτροφικού τελεστή. Συνολικά επιλέχθηκαν 88 υποψήφιοι και εξετάστηκαν έναντι πέντε ποικιλιών σιταριού (Επιπλέον αρχείο 5: Πίνακας S3). Αυτές περιλάμβαναν 66 πρωτεΐνες που κατοικούσαν στο πανγονιδίωμα του πυρήνα και 22 από το εξάρτημα. Τα γονίδια που επιλέχθηκαν (Επιπλέον αρχείο 5: Πίνακας S3) κυμαίνονταν από γονίδια πυρήνα χωρίς πολυμορφισμούς ειδικούς για το στέλεχος (μονόμορφα) και με υψηλή έκφραση φυτών, έως εκείνα στο βοηθητικό γονιδίωμα που παρουσίαζαν παρουσία/απουσία και/ή ουσιαστικό πολυμορφισμό έκφρασης. Σε όλα τα πειράματα, εκτελέστηκαν παράλληλοι τεχνικοί έλεγχοι ToxA έναντι cv Halberd και cv Riband, και αυτοί πάντα παρήγαγαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Αντίθετα, καμία από τις 88 εξετασθείσες πρωτεΐνες του Z. tritici που υπερέκφραζαν δεν προκάλεσε νέκρωση φύλλων σε οποιαδήποτε ποικιλία σίτου. Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα δεν παρείχαν καμία ένδειξη για νεκροτροφικούς τελεστές και επομένως, καμία υποστήριξη για κανέναν από τους υποψηφίους που δοκιμάστηκαν στην πρόκληση της μετάβασης σε νεκροτροφική ανάπτυξη κατά τη διάρκεια της μόλυνσης.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Τα βασικά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με αποδεδειγμένες, ή προβλεπόμενες, βασικές για τη ζωή ή βασικές λοιμογόνους λειτουργίες έχουν χαμηλότερα συνολικά επίπεδα πολυμορφισμού αμινοξέων
Πραγματοποιήσαμε μια βιβλιογραφική αναζήτηση για να ταυτοποιήσουμε όλα τα γονίδια του Z. tritici που είχαν υποβληθεί σε λειτουργικό χαρακτηρισμό, είτε ως λοιμογόνου χαρακτήρα είτε ως βασικά γονίδια που χρονολογούνται έως το 2018. Αυτό δημιούργησε μια λίστα με 28 πρωτεϊνικές αλληλουχίες (Επιπλέον αρχείο 6: Πίνακας S4). Ομοίως, εντοπίσαμε μια λίστα με 26 πρωτεΐνες που είχαν επίσης χαρακτηριστεί λειτουργικά, αλλά είχε αποδειχθεί ότι δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη λοιμογόνο δράση ή ότι είναι απαραίτητες (Επιπλέον αρχείο 6: Πίνακας S4). Στη συνέχεια, ερευνήσαμε τα επίπεδα αθροιστικών περιττών υψηλών και μέτριων μεταλλάξεων σε αυτά τα γονίδια και εκφράσαμε τις τιμές τους ως χαρακτηριστικό κάθε μήκους πρωτεΐνης και στη συνέχεια προσδιορίσαμε τις μέσες τιμές για το σύνολο. Το Σχήμα 6 υπογραμμίζει ότι τα δημοσιευμένα γονίδια που επηρεάζουν τη λοιμογόνο δύναμη είχαν στατιστικά σημαντική χαμηλότερη συχνότητα (p{8}}.007) μετάλλαξης (πολυμορφισμός) από εκείνα που έχουν αποδειχθεί ότι είναι λειτουργικά περιττά.
Οι μελέτες που στοχεύουν στον καθορισμό γονιδίων απαραίτητων για τη ζωή σε νηματοειδείς μύκητες (εξαιρουμένων των ζυμομυκήτων) είναι λίγες, και μέχρι σήμερα, μόνο ένας εκπρόσωπος υπάρχει στη βάση δεδομένων των βασικών γονιδίων (DEG), που προέρχεται από το ευκαιριακό ανθρώπινο παθογόνο Aspergillus fumigatus [56-58]. Προσδιορίσαμε τον ορθολόγο Z. tritici και των 28 γονιδίων που αποδείχθηκε πειραματικά ότι είναι απαραίτητα για τη ζωή στο A. fumigatus και υπολογίσαμε ξανά τους σχετικούς ρυθμούς μετάλλαξης κάθε σε σχέση με τα μήκη της αλληλουχίας (Επιπλέον αρχείο 7 Πίνακας S5). Για άλλη μια φορά, βρήκαμε μια σαφή στατιστικά σημαντική μείωση (p=0.0148) στη συχνότητα υψηλών και μέτριων μεταλλάξεων SNP σε αυτά τα υποψήφια βασικά γονίδια, και στη συνέχεια παρατηρήθηκε για γονίδια που αποδείχθηκε ότι δεν είναι απαραίτητα ούτε για τη λοιμογόνο δύναμη ούτε για τη ζωή. Εικ. 6). Αντίθετα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά (p=0.2128) μεταξύ των ρυθμών μετάλλαξης για πειραματικά επικυρωμένα γονίδια λοιμογόνου δράσης και των προβλεπόμενων βασικών γονιδίων (Εικ. 6). Αυτά τα δεδομένα μαζί υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα επίπεδα πολυμορφισμών αμινοξέων σε πληθυσμούς θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της σχετικής σημασίας των γονιδίων για τον βασικό τρόπο ζωής του οργανισμού.
Εικ. 6 Ανάλυση συνόλων πυρήνων γονιδίων πειραματικά επικυρωμένης παθογένειας και/ή προβλεπόμενων βασικών για τη ζωή γονιδίων αποκαλύπτει χαμηλότερα ποσοστά μετάλλαξης από ό,τι παρατηρείται σε μη βασικά γονίδια. Οι μέσοι υψηλοί και μέτριοι (Η/Μ) ρυθμοί μετάλλαξης που εκφράζονται ως χαρακτηριστικό των μηκών πρωτεΐνης (aa) για λίστες γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που έχουν? 1- πειραματικά αποφασισμένος να παίζει κανέναν (ή πολύ δευτερεύοντα) ρόλο στη λοιμογόνο δράση των μυκήτων. 2-πειραματικά αποφασισμένος να παίξει σημαντικό ρόλο στη λοιμογόνο δράση και 3-προβλέφθηκε ότι θα κωδικοποιήσει υποτιθέμενα απαραίτητα για τη ζωή γονίδια μέσω της ορθολογίας σε πρωτεΐνες που χαρακτηρίζονται πειραματικά στον Aspergillus fumigatus. Το σύμβολο του αστερίσκου (*) υποδεικνύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ρυθμών μετάλλαξης μεταξύ των υποδεικνυόμενων συνόλων γονιδίων. Οι λίστες γονιδίων και τα σχετικά δεδομένα πολυμορφισμού εμφανίζονται στο Πρόσθετο αρχείο 6: Πίνακας S4
Η χρησιμότητα της συνδυασμένης προγνωστικής προσέγγισης για την αποκάλυψη της αδυναμίας του παθογόνου υποστηρίζεται μέσω μελετών γενετικής συμπλήρωσης σε ένα μεταλλάκτη διαγραφής γονιδίων πέντε «πυρήνων»
Το Z. tritici μπορεί να προωθήσει γενετικές εξετάσεις που βασίζονται σε τυχαία ενσωμάτωση του T-DNA μέσω μετασχηματισμού μυκήτων που προκαλείται από το Agrobacterium (AMT). Η προηγούμενη εργασία μας είχε δημιουργήσει ένα μετάλλαγμα T-DNA του Z. tritici, το οποίο δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει πλήρη ασθένεια σε μολυσμένα φύλλα σίτου (Εικ. 7Α). Αυτό το μετάλλαγμα, που ονομάζεται 23-21 (ο 23ος γύρος μετασχηματισμού και η 21η αποικία που επιλέχθηκε), θα μπορούσε να αναπτυχθεί κανονικά ως άγριος τύπος σε θρεπτικό μέσο άγαρ (YPD), αλλά απέτυχε να επεκτείνει συγκρίσιμα επίπεδα μυκητιακών υφών όταν αναπτύχθηκε σε μέσο χωρίς θρεπτικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένου υδάτινου άγαρ (Εικ. 7Α). Χρησιμοποιήσαμε επαναπροσδιορισμό αλληλουχίας του 23-21 με βάση ολόκληρο το γονιδίωμα Illumina για να αποκαλύψουμε τη θέση της δυνητικά αιτιολογικής εισαγωγής Τ-DNA. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε μια μοναδική ενσωμάτωση Τ-DNA μεταξύ των θέσεων 899878 και 912699 στο χρωμόσωμα 8, προκαλώντας μια διαγραφή/διακοπή πέντε προβλεπόμενων κωδικοποιητικών αλληλουχιών (Εικ. 7Β). Η ανάλυση SNP και indel δεν αποκάλυψαν επιπλέον μεταλλάξεις χωρίς επισήμανση στο στέλεχος 23-21 σε σχέση με την αλληλουχία γονιδιώματος άγριου τύπου του IPO323. Η διαγραφή 23-21 T-DNA αφαίρεσε αποτελεσματικά πέντε γονίδια, τα οποία βρίσκονται όλα στο γονιδίωμα του πυρήνα, και με τις ακόλουθες λειτουργικές (Interpro) προβλέψεις. γονίδιο 1=Κυτόχρωμα P450; γονίδιο 2=μεθυλτρανσφεράση S-αδενοσυλ μεθειονίνης. γονίδιο 3=Ψευδάργυρος (2) πρωτεΐνη σύνδεσης DNA τύπου C6. γονίδιο 4=Διφωσφορική κινάση νουκλεοσιδίου (NDK) και γονίδιο 5=Υδρολάση γλυκοζυλίου 31 (Εικ. 7Β). Ερευνήσαμε τους σχετικούς αριθμούς υψηλών και μέτριων μεταλλάξεων σε κάθε πρωτεΐνη ως χαρακτηριστικό του μήκους της πρωτεΐνης, το οποίο αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη 4 (NDK) είχε πολύ λιγότερες μεταλλάξεις που επηρεάζουν τις αλλαγές της αλληλουχίας αμινοξέων από τις άλλες τέσσερις αναλυμένες αλληλουχίες σε όλο το απομονωμένο σύνολο (Εικ. 7C και πρόσθετο αρχείο 2: Εικ. S4). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τη μέση σχετική έκφραση και των πέντε γονιδίων σε όλες τις δοκιμασμένες απομονώσεις. Αποκάλυψε επίσης ότι το γονίδιο 4 (που κωδικοποιεί το NDK) εκφραζόταν σημαντικά υψηλότερα από όλα τα άλλα υποψήφια (Εικ. 7D και Πρόσθετο αρχείο 2: Εικ. S5). Υποθέσαμε λοιπόν ότι η απώλεια του λιγότερο πολυμορφικού και του υψηλότερου εκφρασμένου γονιδίου, του γονιδίου 4, του NDK, ήταν υπεύθυνη για την απώλεια της λοιμογόνου δράσης και το σχετικό ελάττωμα στα εκτεινόμενα φλόγα της υφής. Για να το ελέγξουμε αυτό, μετασχηματίσαμε κάθε ένα από τα πέντε υποψήφια γονίδια ξεχωριστά στο μεταλλαγμένο στέλεχος 23-21 Z. tritici, το καθένα καθοδηγούμενο από τον δικό του ενδογενή προαγωγέα. Ελήφθησαν πολλαπλά προϊόντα μετασχηματισμού από το καθένα και δοκιμάστηκαν εκ νέου για λοιμογόνο δράση σε φύλλα σιταριού και την ικανότητα επέκτασης νηματωδών υφών σε υδάτινο άγαρ. Αυτό έδειξε ότι η επανεισαγωγή μόνο του γονιδίου NDK (γονίδιο 4) αποκατέστησε πλήρως τόσο τη λοιμογόνο δύναμη όσο και την ανάπτυξη υφών σε επίπεδα άγριου τύπου (Εικ. 7Ε και πρόσθετο αρχείο 2: Εικ. S6). Η επανεισαγωγή καθενός από τους άλλους τέσσερις υποψήφιους δεν προκάλεσε καμία αλλαγή στον φαινότυπο από το αρχικό μεταλλαγμένο στέλεχος 23-21 (Εικ. 7Ε). Για να εξασφαλιστεί ότι όλα τα επανεισαχθέντα γονίδια εκφράστηκαν στο αντίστοιχο συμπληρωμένο στέλεχος τους, πραγματοποιήθηκε RT-PCR σε καθένα από τα μετασχηματισμένα κύτταρα και στην αρχική μετάλλαξη 23-21. Αυτό επιβεβαίωσε την αναμενόμενη έλλειψη κάθε μεταγραφής στο μετάλλαγμα 23-21 και έδειξε σωστή έκφραση κάθε γονιδίου στόχου στα συμπληρωμένα στελέχη (Εικ. 7F). Έτσι, η επανεισαγωγή του μοναδικού γονιδίου με τους λιγότερους πολυμορφισμούς σε επίπεδο πληθυσμού των πέντε υποψηφίων, και την υψηλότερη σχετική έκφραση, αποκατέστησε τους ελαττωματικούς φαινότυπους σε αυτό το παθογόνο σίτου. Αυτή η πειραματική παρατήρηση υποστηρίζει τη χρησιμότητα του συνδυασμού πανγενωμικής και μεταγραφτομικής για την πρόβλεψη γονιδίων που είναι δυνητικά σημαντικά για βασικά λειτουργικά χαρακτηριστικά της ζωής.
Εικ. 7 Δοκιμασίες λειτουργικής συμπλήρωσης σε ένα μη παθογόνο μετάλλαγμα Z. tritici με διαγραφή πέντε γονιδίων υποστηρίζουν τη συνδυασμένη χρήση του ρυθμού μετάλλαξης που προέρχεται από το πανγονίδιο και της ανάλυσης επιπέδου έκφρασης ως προγνωστικούς παράγοντες για σημαντικά βασικά γονίδια του τρόπου ζωής. Χαρακτηριστικά ανάπτυξης και μόλυνσης ενός μεταλλάγματος "23-21" τυχαίας εισαγωγής Τ-DNA του Z. tritici. Το στέλεχος αναπτύσσεται κανονικά σε πλούσιο θρεπτικό άγαρ, αλλά είναι ελαττωματικό σε νηματώδη ανάπτυξη σε φτωχό θρεπτικό άγαρ και επηρεάζεται σοβαρά στη δραστηριότητα που προκαλεί ασθένειες στα φύλλα σίτου. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 1 cm. B Η αναδιάταξη ολόκληρου του γονιδιώματος του στελέχους 23-21 αποκαλύπτει μια διαμεσολαβούμενη από T-DNA διαγραφή μιας γονιδιωματικής περιοχής 13 kb που διαταράσσει ή διαγράφει πέντε προβλεπόμενα γονίδια από το πυρήνα του πανγονιδιώματος. C Εμφανίζει το μέσο όρο συμβάντων μετάλλαξης Υψηλή και Μέτρια για κάθε γονίδιο (με επισήμανση 1-5) από το πανγονιδίωμα σε σχέση με το μήκος της κωδικοποιημένης πρωτεΐνης (aa)
Συζήτηση
Η συνδυασμένη πανγενωμία και η μεταγραφική μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως όπλα ενάντια στα ταχέως εξελισσόμενα παθογόνα
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% των συνολικών γονιδίων) βοηθητικό γονιδίωμα από αυτά τα είδη. Το γιατί και πώς το Z. tritici και δυνητικά άλλοι παθογόνοι μύκητες φυτών διατηρούν ένα τόσο μεγάλο βοηθητικό συστατικό είναι ασαφές. Για παράδειγμα, τα μικρότερα οκτώ χρωμοσώματα που προσδιορίζονται στο IPO323 δεν έχουν καμία σαφή σημαντική επίδραση στη λοιμογόνο δράση ή σε άλλες διαδικασίες, με μόνο μία μελέτη να υποδεικνύει επί του παρόντος ότι τα χρωμοσώματα 14, 16, 18, 19 και 21 διαδραματίζουν διακριτικό ρόλο στη λοιμογόνο δράση στο επιλεγμένες ποικιλίες σιταριού [59]. Ωστόσο, συνδυασμοί αυτών των μικρών χρωμοσωμάτων διατηρούνται σε πληθυσμούς. Έχει προταθεί ότι προβλέπουν γεγονότα ανασυνδυασμού που μπορεί να αποτελούν τη βάση της ικανότητας του μύκητα να εξελίσσεται γρήγορα για να προσαρμόζεται στις περιβαλλοντικές πιέσεις, ενδεχομένως σε συνδυασμό με υψηλά ποσοστά δραστηριότητας μεταφερόμενων στοιχείων [60-62]. Μια παρόμοια περίπτωση μπορεί να υποστηριχθεί για το μεγάλο βοηθητικό γονιδίωμα. Υποστήριξη για αυτό παρέχεται από τη λειτουργική σημασία δύο βοηθητικών συστατικών του γονιδιώματος που αναφέρονται σε αυτή τη μελέτη, της υπομονάδας SDH C paralogue και AvrStb6, τα οποία έχουν και οι δύο βασικούς ρόλους στην αλληλεπίδραση με μεταβλητά στοιχεία του εξωτερικού περιβάλλοντος (εφαρμογή μυκητοκτόνου και ποικιλίες με αντιστοίχιση γονίδια αντοχής σε ασθένειες, αντίστοιχα) [25, 45]. Έχουν περιγραφεί και άλλες βιολογικές διεργασίες οι οποίες μπορούν επίσης να χαθούν σε μεμονωμένα στελέχη Z. tritici χωρίς σαφή ελαττώματα φυσικής κατάστασης, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου της μελανοποίησης (μελάγχρωση) [63]. Η μελέτη μας έχει επισημάνει ότι το βοηθητικό, ταχέως εξελισσόμενο γονιδίωμα του Z. tritici θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί εναντίον του όταν αντ' αυτού εστιάζει σε αυτό που δεν μπορεί να χαθεί ή έχει περιορισμένο πολυμορφισμό. Αυτή η μελέτη επιδίωξε να το κάνει αυτό, θεωρώντας τα γονίδια του πυρήνα όχι μόνο ως παρόντα και λειτουργικά σε όλα τα απομονωμένα στελέχη, αλλά και ως εκφραζόμενα σε όλα τα απομονωμένα στελέχη. Ακολουθήσαμε επίσης την προσέγγιση της προσπάθειας κατάταξης των συνόλων γονιδίων στο γονιδίωμα του πυρήνα, με βάση τα επίπεδα μεταβλητότητας της αλληλουχίας αμινοξέων. Υπάρχουν βέβαια κάποιες επιφυλάξεις με τις μεθόδους που χρησιμοποιήσαμε, ιδιαίτερα στο ότι οι πλεονάζουσες μεταλλάξεις (πανομοιότυπου τύπου και θέσης) δεν μπορούν εύκολα να διαχωριστούν από έναν παρόμοιο αριθμό μεταλλάξεων που μπορεί να συμβούν σε μοναδικές θέσεις σε κάθε απομόνωση (μη πλεονάζουσες μεταλλάξεις). Έτσι, η μέθοδός μας δεν είναι κατάλληλη για την κατάταξη των ταχέως εξελισσόμενων γονιδίων. Ωστόσο, η μέθοδος επιτρέπει σε γονίδια χωρίς και χαμηλή μεταβλητότητα να αναγνωρίζονται εύκολα με βάση τα χαμηλά ποσοστά πολυμορφισμών που επηρεάζουν τις αλλαγές αμινοξέων. Η προσέγγιση έδειξε ότι τα πειραματικά επαληθευμένα και προβλεπόμενα γονίδια βασικά για τη ζωή ή γονίδια λοιμογόνου δράσης περιείχαν σημαντικά λιγότερο πολυμορφισμό αυτού του τύπου μεταξύ των απομονώσεων, από εκείνα των οποίων οι λειτουργίες είναι απαραίτητες για αυτές τις διεργασίες. Τέλος, επεκτείναμε αυτήν την προσέγγιση για να αναγνωρίσουμε μια νέα λοιμογόνο δράση μιας νουκλεοσιδικής διφωσφορικής κινάσης (NDK), η οποία εμφάνισε τη μικρότερη παραλλαγή όλων των γονιδίων σε μια 5-διαγραφή T-DNA γονιδίου. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι τα επίπεδα πολυμορφισμού σε γονίδια πυρήνα που προσδιορίζονται στην πανγενωμία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να συναχθούν σημαντικές λειτουργίες για τις κωδικοποιημένες πρωτεΐνες και ως εκ τούτου να δοθεί προτεραιότητα στα γονίδια για λειτουργική ανάλυση για τον εντοπισμό νέων στόχων για την προστασία των καλλιεργειών και ενδεχομένως την υγεία των ζώων.
Μια αναδυόμενη αδυναμία στη βιολογία των λοιμώξεων του Z. tritici και των σχετικών παθογόνων;
Αυτή η μελέτη παρείχε επίσης περαιτέρω συγκεκριμένες γνώσεις σχετικά με τη βιολογία μόλυνσης αυτού του σημαντικού παθογόνου σίτου. Πρώτον, δεν ελήφθησαν στοιχεία που να υποστηρίζουν την παρουσία σημαντικών νεκροτροφικών δραστικών τελεστών για 88 εκκρινόμενες πρωτεΐνες που επιλέχθηκαν τόσο από το πυρήνα όσο και από το βοηθητικό γονιδίωμα. Δεν μπορούμε να απορρίψουμε την πιθανότητα ότι δεν επιλέξαμε τις σωστές πρωτεΐνες ή ότι πολλοί τελεστές θα μπορούσαν να συνεργαστούν για να προκαλέσουν τον θάνατο των φυτικών κυττάρων (που προτείνεται επίσης από παρόμοια προφίλ έκφρασης). Εάν ισχύει το τελευταίο, αυτό θα διέφερε από τη σαφή σημασία των μεμονωμένων νεκροτροφικών τελεστών σε σχετικούς μύκητες που μολύνουν το σιτάρι, ιδίως τα είδη Parastagonospora nodorum και Pyrenophora [35]. Είναι επίσης πιθανό τα επίπεδα έκφρασης που αντλούμε από το παροδικό σύστημα FoMV να είναι χαμηλότερα από αυτά που απαιτούνται για τελεστές των οποίων η αναγνώριση είναι λιγότερο έντονη από αυτή του SnToxA. Ωστόσο, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δεν υποστηρίζουν την ιδέα ότι η μετάβαση στη συμπτωματική ανάπτυξη και στον θάνατο των φυτικών κυττάρων επικαλείται την αναγνώριση των κύριων (μονών) νεκροτροφικών Z. tritici efectors. Είναι επομένως πιθανό ότι η μαζική παραγωγή αυτών των πρωτεϊνών κατά την έναρξη των συμπτωμάτων μπορεί να χρησιμεύσει για την προστασία των μυκητιακών υφών από την προφανή υπερενεργοποίηση του κυτταρικού θανάτου και την απόκριση των φυτών. Σε συμφωνία με αυτό, οι εκκρινόμενοι τελεστές από αυτόν και άλλους μύκητες έχουν αποδειχθεί ότι έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν πρωτεάσες, χιτινάσες και άλλα ένζυμα που επιτίθενται στο κυτταρικό τοίχωμα που προέρχονται από φυτά, τα οποία προκαλούνται από τα φυτά κατά τη διάρκεια αμυντικών αποκρίσεων [46, 48, 64, 65 ]. Πιο πρόσφατα, οι μυκητιασικοί τελεστές έχουν επίσης αποδειχθεί ότι χειραγωγούν και αναδιαμορφώνουν μικροβιώματα [66, 67].
Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
Ωστόσο, ο προσδιορισμός ενός βασικού ρόλου στη λοιμογόνο δράση για το NDK είναι σημαντικός. Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν αποδοθεί σε πολλαπλές λειτουργίες από διαφορετικούς προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στους μύκητες, υπάρχει μια αναφορά που αποδίδει ρόλο στη ρύθμιση της ανοσίας των φυτών [68], ενώ σε ένα άλλο είδος (A. fumigatus), έχει αποδειχθεί μια σημαντική για τη ζωή λειτουργία [69]. Ωστόσο, η κύρια και διατηρημένη λειτουργία αυτών των πρωτεϊνών είναι να φωσφορυλιώνουν διφωσφορικά νουκλεοσίδια, συνήθως χρησιμοποιώντας το ATP ως υπόστρωμα, για να δημιουργήσουν άλλα τριφωσφορικά νουκλεοσίδια (NTPs) που απαιτούνται για να βοηθήσουν στην τροφοδοσία διαφόρων κυτταρικών διεργασιών [70, 71]. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν οι περιορισμένοι πόροι καθιστούν δυσκολότερη τη δημιουργία ορισμένων NTP με άλλα μέσα. Έτσι, οι NDKs παρουσιάζουν μια βασική δραστηριότητα οδού διάσωσης για την αναγέννηση των NTP που είναι πιθανότατα σημαντική όταν οι εξωκυτταρικοί πόροι είναι περιορισμένοι. Σημαντικοί ρόλοι για πολλά άλλα μονοπάτια διάσωσης, και ιδιαίτερα βιοσυνθετικά μονοπάτια, προέκυψαν πρόσφατα από άλλες μελέτες γονιδιακής λειτουργίας για το Z. tritici. Για παράδειγμα, η βιοσύνθεση λυσίνης είναι απαραίτητη για τη μόλυνση και την ανάπτυξη υφών σε φτωχά θρεπτικά συστατικά [72], όπως και η βιοσύνθεση πουρίνης [73]. Αυτές οι λειτουργίες είναι περιττές για ανάπτυξη σε πλήρη μέσα. Προηγούμενα δεδομένα μεταγραφής σχετικά με το πολύ πρώιμο στάδιο του αποικισμού της επιφάνειας των φύλλων έδειξαν ότι ο μύκητας βρίσκεται σε ένα περιβάλλον εξαντλημένο σε θρεπτικά συστατικά και εξαρτάται από τη χρήση ενδοκυτταρικών αποθεμάτων [33]. Λαμβάνοντας υπόψη τις προηγούμενες λειτουργικές μελέτες, και τον βασικό ρόλο που έδειξε για το NDK, είναι σαφές ότι το Z. tritici είναι εξαιρετικά ευάλωτο στην αναστολή των βασικών βιοσυνθετικών οδών και οδών διάσωσης όταν βρίσκεται στην επιφάνεια του φύλλου κατά τη διάρκεια του πρώιμου αποικισμού και ενδεχομένως μέχρι την πρόκληση θάνατο των φυτικών κυττάρων περίπου 7-10 ημέρες αργότερα. Έτσι, νέα προϊόντα ή στρατηγικές φυτοπροστασίας θα μπορούσαν να κατευθυνθούν προς την αναστολή αυτών των διεργασιών, που μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια αδυναμία στο Z. tritici, και ενδεχομένως σε μια μεγάλη ποικιλία άλλων σχετικών μυκήτων με παρόμοιους τρόπους μόλυνσης.
συμπεράσματα
Αυτή η μελέτη παρέχει αρχική υποστήριξη για τη συνδυασμένη χρήση της πανγενωμικής και της μεταγραφτομικής για τον καθορισμό γονιδίων που αντιπροσωπεύουν τις βασικές και δυνητικά εκμεταλλεύσιμες αδυναμίες στα ταχέως εξελισσόμενα παθογόνα. Ωστόσο, κατ' αρχήν, οι προσεγγίσεις θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για ιεράρχηση γονιδίων σε οποιοδήποτε βιολογικό σύστημα όπου είναι διαθέσιμα πολλαπλά γονιδιώματα και μεταγραφήματα. Αναμένουμε ότι αυτές οι προσεγγίσεις θα μπορούσαν να προωθήσουν τους αγωγούς ανακάλυψης βασικών βιολογικών διεργασιών σε πολλά διαφορετικά βιολογικά συστήματα.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Η παγκόσμια εμφάνιση αντοχής στα αντιμυκητιακά φάρμακα προκαλεί την ανθρώπινη υγεία και την επισιτιστική ασφάλεια. Επιστήμη. 2018; 360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Αναδυόμενες μυκητιακές απειλές για την υγεία των ζώων, των φυτών και των οικοσυστημάτων. Φύση. 2012; 484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Η εξέλιξη της αντοχής στα μυκητοκτόνα. Adv Appl Microbiol. 2015; 90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Σεξουαλική αναπαραγωγή και εξέλιξη μικροβιακών παθογόνων. Curr Biol. 2006; 16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Τα γονιδιώματα δύο ταχυτήτων των νηματωδών παθογόνων: βαλς με φυτά. Curr Opin Genet Dev. 2015; 35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin Η, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Ανάλυση γονιδιώματος πολλαπλών παθογόνων απομονώσεων του Streptococcus aga-lactiae: επιπτώσεις για το μικροβιακό «παν-γονιδίωμα». Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Εξέλιξη του πυρήνα και του παν-γονιδιώματος του στρεπτόκοκκου σε κόκκο: θετική επιλογή, ανασυνδυασμός και σύνθεση γονιδιώματος. Genome Biol. 2007; 8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. Η συγκριτική γονιδιωματική των οζωδών κόκκων σόγιας ριζόβιας υποδηλώνει εκτεταμένη στρατολόγηση γονιδίων ειδικά για τη γενεαλογία σε προσαρμογές. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora συγκριτική ανάλυση γονιδιώματος-πρόβλεψη τελεστή και εξέλιξη γονιδιώματος. Genome Biol Evol. 2018; 10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Παν-γονιδιωματικές αναλύσεις μοντέλων μυκητιακών ειδών. Microb. Γονιδιωματική. 2019; 5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et αϊ. Ανάλυση του παν-γονιδιώματος για τον εντοπισμό των βασικών γονιδίων και των βασικών γονιδίων του Brucella spp. Mol Genomics. 2016; 291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber ΑΕ, Sae-Ong Τ, Kang Κ, Seelbinder Β, Li J, Walther G, et αϊ. Η ανάλυση του πανγονιδιώματος Aspergillus-lus fumigatus προσδιορίζει γενετικές παραλλαγές που σχετίζονται με ανθρώπινη μόλυνση. Nat Microbiol. 2021; 6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et αϊ. Η αναδιάταξη ολόκληρου του γονιδιώματος αποκαλύπτει τη φυσική παραλλαγή και την προσαρμοστική εξέλιξη του Phytophthora sojae. Front Microbiol. 2019; 10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: μια σημαντική απειλή για την παραγωγή σίτου, ολοκληρωμένες προσεγγίσεις ελέγχου. Fungal Genet Biol. 2015; 79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Μέτρηση της μετανάστευσης και της σεξουαλικής αναπαραγωγής σε πληθυσμούς αγρού Mycosphaerella graminicola. Φυτοπαθολογία. 1998, 88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Κατανομή αλληλόμορφων τύπων ζευγαρώματος στο παθογόνο του σίτου Mycosphaerella graminicola σε χωρικές κλίμακες από βλάβες σε ηπείρους. Fungal Genet Biol. 2002; 36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Προέλευση και εξημέρωση του μυκητιακού παθογόνου σίτου Mycosphaerella gramini-cola μέσω συμπαθητικής ειδογένεσης. ΜοΙ Biol Evol. 2007; 24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Πληθυσμιακή δομή του Mycosphaere-lla graminicola: από τις βλάβες στις ηπείρους. Φυτοπαθολογία. 2002; 92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Η γενετική βάση της τοπικής προσαρμογής για παθογόνους μύκητες στα γεωργικά οικοσυστήματα. ΜοΙ Ecol. 2017; 26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Ο αντίκτυπος των εστιών ανασυνδυασμού στην εξέλιξη του γονιδιώματος ενός παθογόνου μυκητιακού φυτού. Γενεσιολογία. 2015; 201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Διατήρηση της διακύμανσης της λοιμογόνου δράσης και της αναπαραγωγής σε πληθυσμούς παθογόνου γεωργικών φυτών. Evol Appl. 2021; 14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Η ενδοειδική ανταλλαγή γονιδίων εισάγει υψηλή γενετική μεταβλητότητα στο παθογόνο της καλλιέργειας. Genome Biol Evol. 2019; 11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Ένα μυκητιακό παθογόνο σίτου εξελίχθηκε εξειδίκευση ξενιστή με εκτεταμένες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Η Meiosis οδηγεί σε διάχυτη διακύμανση του αριθμού αντιγράφων και παραμορφωμένη κληρονομικότητα του βοηθητικού χρωμο-κάποιου από το παθογόνο του σίτου Zymoseptoria tritici. Genome Biol Evol. 2018; 10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth Η, McDonald Μ, Bansal Α, Burcu Turgay Ε, et αϊ. Αξιοσημείωτες πρόσφατες αλλαγές στη γενετική ποικιλότητα του γονιδίου μη τοξικότητας AvrStb6 σε παγκόσμιους πληθυσμούς του παθογόνου σίτου Zymoseptoria tritici. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. Το ολοκληρωμένο γονιδίωμα του μυκητιακού παθογόνου σίτου Mycosphaerella graminicola αποκαλύπτει τη δομή διανομής, την πλαστικότητα των χρωμοσωμάτων και την παθογένεια stealth. PLoS Genet. 2011; 7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. Ένα 19-απομόνωση παγκόσμιου πανγονιδιώματος ποιότητας αναφοράς για το μυκητιακό παθογόνο σίτου Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020; 18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Οι αναλύσεις πανγονιδιώματος του παθογόνου του σίτου Zymoseptoria tritici αποκαλύπτουν τη δομική βάση ενός εξαιρετικά πλαστικού ευκαρυωτικού γονιδιώματος. BMC Biol. 2018; 16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Η μείωση οδηγεί σε εξαιρετική πλαστικότητα του γονιδιώματος στο απλοειδές μυκητιακό παθογόνο φυτών Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009; 4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Κυτταρική βιολογία της Zymoseptoria tritici: οργάνωση κυττάρων παθογόνου και μόλυνση σίτου. Fungal Genet Biol. 2015; 79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Ιστολογία της παθογένεσης του Mycosphaerella graminicola στο σιτάρι. Φυτοπαθολογία. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka Κ, Hassani-Pak Κ, Derbyshire Μ, Andongabo Α, Devon-Shire J, et αϊ. Το προφίλ μεταγραφής και μεταβολιτών του κύκλου μόλυνσης της Zymoseptoria tritici στο σιτάρι αποκαλύπτει μια διφασική αλληλεπίδραση με την ανοσία των φυτών που περιλαμβάνει διαφορικές χρωμοσωμικές συνεισφορές παθογόνων και μια παραλλαγή στον ορισμό του ημιβιοτροφικού τρόπου ζωής. Plant Physiol. 2015; 167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et αϊ. Μεταγραφική προσαρμογή του Mycosphaerella graminicola στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (PCD) του ευαίσθητου ξενιστή του σίτου. Μοl Φυτό-Μικρόβιο Αλληλεπίδραση. 2007; 20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Οι ενεργοποιημένες από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες σίτου TaMPK3 και TaMPK6 ρυθμίζονται διαφορετικά σε πολλαπλά επίπεδα κατά τη διάρκεια αλληλεπιδράσεων συμβατών ασθενειών με το Mycosphaerella graminicola. Plant Physiol. 2008; 147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Ο χαρακτηρισμός των αλληλεπιδράσεων τελεστή-στόχου σε νεκροτροφικά παθοσυστήματα αποκαλύπτει τάσεις και παραλλαγές στον χειρισμό του ξενιστή. Annu Rev Phytopathol. 2021; 59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Ειδικές για τον ξενιστή τοξίνες: τελεστές νεκροτροφικής παθογένειας. Cell Microbiol. 2008; 10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.χ.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari Α, et al. Το FPLC και η φασματομετρία μάζας με υγρή χρωματογραφία προσδιορίζουν υποψήφιες πρωτεΐνες που προκαλούν νέκρωση από διηθήματα καλλιέργειας του μυκητιακού παθογόνου σίτου Zymoseptoria tritici. Fungal Genet Biol. 2015; 79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Ένα μεγάλο βοηθητικό γονιδίωμα και υψηλά ποσοστά ανασυνδυασμού μπορεί να επηρεάσουν την παγκόσμια κατανομή και το ευρύ φάσμα ξενιστών του μυκητιακού παθογόνου φυτού Claviceps purpurea. PLoS One. 2022; 17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Βλέπε PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Ένα παγκόσμιο πανγονιδίωμα για το μυκητιακό παθογόνο του σίτου Pyrenophora triticirepentis και πρόβλεψη δομικής ομολογίας πρωτεΐνης εκτελεστή. Microb. Γονιδιωματική. 2022; 8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Γενετική παραλλαγή για λοιμογόνο δύναμη και αντοχή στο μονοπάτι-σύστημα σίτου-Mycosphaerella graminicola II. Ανάλυση αλληλεπιδράσεων μεταξύ απομονωμένων παθογόνων και ποικιλιών ξενιστών. Φυτοπαθολογία. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Γενετική παραλλαγή για λοιμογόνο δύναμη και αντοχή στο παθοσύστημα σίτου Mycosphaerella graminicola I. αλληλεπιδράσεις μεταξύ απομονώσεων παθογόνων και ποικιλιών ξενιστών. Φυτοπαθολογία. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Η παγκόσμια γενετική δομή του παθογόνου του σίτου Mycosphaerella graminicola χαρακτηρίζεται από υψηλή πυρηνική ποικιλομορφία, χαμηλή μιτοχονδριακή ποικιλομορφία, κανονικό ανασυνδυασμό και ροή γονιδίων. Fungal Genet Biol. 2003; 38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala Μ, Carter D, Courbot Μ, Rudd JJ, et al. Οι συγκριτικές μεταγραφικές αναλύσεις των στελεχών Zymoseptoria tritici δείχνουν πολύπλοκες μεταβάσεις στον τρόπο ζωής και ενδοειδική μεταβλητότητα στα προφίλ μεταγραφής. ΜοΙ. Φυτό Pathol. 2016; 17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Το προφίλ έκφρασης του παθογόνου του σίτου Zymoseptoria tritici αποκαλύπτει γονιδιωματικά πρότυπα μεταγραφής και ρυθμιστικά προγράμματα ειδικά για τον ξενιστή. Genome Biol Evol. 2014; 6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat Μ, Frey R, Mosbach Α, Luksch Τ, Balmer D, et αϊ. Ένα απαραίτητο παράλογο της υπομονάδας C της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης μεσολαβεί σε αντίσταση σε όρθια θέση έναντι μιας υποκατηγορίας μυκητοκτόνων SDHI στο Zymoseptoria tritici. PLoS Pathog. 2019; 15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink Α, Motteram J, Loza-Reyes Ε, Lucas J, Hammond Kosack KE, et αϊ. Η ανάλυση δύο ομόλογων εκφρασμένων σε φυτά LysM efector από τον μύκητα Mycosphaerella graminicola αποκαλύπτει νέες λειτουργικές ιδιότητες και ποικίλες συνεισφορές στη λοιμογόνο δράση στο σιτάρι. Plant Physiol. 2011; 156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Η λίστα Mycosphaerella graminicola με τη μεσολάβηση του efector stealth παθογένεση ανατρέπει την αναγνώριση τόσο μέσω ομολόγων cerk1 όσο και cebip στο σιτάρι. Μοl Φυτό-Μικρόβιο Αλληλεπίδραση. 2014; 27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian Η, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen Η, Rudd JJ, et al. Τρεις εκτελεστές LysM του Zymoseptoria tritici αφοπλίζουν συλλογικά την ανοσία των φυτών που προκαλείται από τη χιτίνη. Mol Plant Pathol. 2021; 22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Ζ, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala Μ, et αϊ. Μια μικρή εκκρινόμενη πρωτεΐνη στο Zymoseptoria tritici είναι υπεύθυνη για τη μη τοξικότητα στις ποικιλίες σίτου που φέρουν το γονίδιο ανθεκτικότητας Stb6. Νέο Phytol. 2017; 214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari Α, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Το άγχος και η σεξουαλική αναπαραγωγή επηρεάζουν τη δυναμική του ενεργού παθογόνου θερμότητας AvrStb6 και την αντίσταση στη στροβιλουρίνη. Nat Genet. 2018, 50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Η πρωτεΐνη Stb6 που μοιάζει με υποδοχέα κινάσης σίτου ελέγχει την αντίσταση γονίδιο προς γονίδιο στο μυκητιακό παθογόνο Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018, 50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Πρωτεϊνικοί νεκροτροφικοί τελεστές σε μυκητιασική λοιμογόνο δύναμη. Funct Plant Biol. 2010; 37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen Η, Azhakanandam Κ, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Foxtail mosaic virus: ένας ιικός φορέας για έκφραση πρωτεΐνης σε δημητριακά. Plant Physiol. 2018; 177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürn-berger T, et al. Μοριακός χαρακτηρισμός και λειτουργική ανάλυση του MgNLP, της μοναδικής πρωτεΐνης που περιέχει τον τομέα NPP1, από το μυκητιακό παθογόνο φύλλων σίτου mycosphaerella graminicola. Μοl Φυτό-Μικρόβιο Αλληλεπίδραση. 2009; 22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Ζ, Lu Η, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et αϊ. Ένα μοναδικό γονίδιο που μοιάζει με αντίσταση στη νόσο του σίτου διέπει την ευαισθησία που προκαλείται από τελεστές σε νεκροτροφικά παθογόνα. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Πρόβλεψη βασικών γονιδίων για τον εντοπισμό πιθανών στόχων φαρμάκων στο Aspergillus fumigatus. Comput Biol Chem. 2014; 50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Αναγνώριση και ανάλυση βασικών γονιδίων Aspergillus nidulans με χρήση της τεχνικής διάσωσης ετεροκαρυών. Nat Protoc. 2006; 1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton Α, et αϊ. Βασική γονιδιακή ταυτοποίηση και ιεράρχηση στόχων φαρμάκου στο Aspergillus fumigatus. PLoS Pathog. 2007; 3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Η προσέγγιση της μπροστινής γενετικής αποκαλύπτει την εξαρτώμενη από τον γονότυπο ξενιστή σημασία των βοηθητικών χρωμοσωμάτων στο μυκητιακό παθογόνο του σίτου Zymoseptoria tritici. MBio. 2017; 8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Δυναμική αποκαταστάσεως μετατιθέμενου στοιχείου με γνώμονα το στρες και εξέλιξη της λοιμογόνου δράσης σε ένα μυκητιακό παθογόνο. ΜοΙ Biol Evol. 2020; 37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Έκτακτη αστάθεια του γονιδιώματος και εκτεταμένες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις κατά τη διάρκεια της βλαστικής ανάπτυξης. Γενεσιολογία. 2018; 210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Τα αξεσουάρ κάνουν το ντύσιμο: βοηθητικά χρωμοσώματα και άλλες αναλώσιμες περιοχές DNA σε φυτοπαθογόνους μύκητες. Μοl Φυτό-Μικρόβιο Αλληλεπίδραση. 2018; 31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-στ.
63. Krishnan Ρ, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et αϊ. Οι εισαγωγές μεταφερόμενων στοιχείων διαμορφώνουν τη γονιδιακή ρύθμιση και την παραγωγή μελανίνης σε ένα μυκητιακό παθογόνο του σίτου. BMC Biol. 2018; 16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. Ένας εκκρινόμενος εκτελεστής LysM προστατεύει τις μυκητιακές υφές μέσω πολυμερισμού ομοδιμερούς που εξαρτάται από χιτίνη. PLoS Pathog. 2020; 16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Οι πρωτεΐνες PR-1 σίτου στοχεύονται από πρωτεΐνες τελεστών νεκροτροφικών παθογόνων. Plant J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Μια αρχαία αντιμικροβιακή πρωτεΐνη που επιλέγεται από ένα μυκητιακό φυτικό παθογόνο για τον χειρισμό του μυκοβιώματος του φυτού. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich Η, Petti GC, Rocafort Μ, van den Berg GCM, Vorholt JA, et αϊ. Χειρισμός μικροβιώματος από ένα παθογόνο μυκητιακών φυτών που μεταφέρεται στο έδαφος χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες τελεστές. Φυτά Nat. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Η διφωσφορική νουκλεοσιδική κινάση Magnaporthe oryzae απαιτείται για τη μεταβολική ομοιόσταση και την καταστολή της έμφυτης ανοσίας του ξενιστή με τη μεσολάβηση οξειδοαναγωγής. ΜοΙ Microbiol. 2020; 114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580
