Κλωνοποίηση, Λειτουργική Αναγνώριση και Ανάλυση Έκφρασης Συνθάσης Χαλκόνης από το Cistanche Tubulosa

Περίληψη: Στόχος

Να μελετήσει τη λειτουργία τουσυνθάση χαλκόνης από Cistanche tubulosaκαι το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου CtCHS σε λευκά, κόκκινα και μοβ άνθη.

ΜέθοδοιΤο γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε με RT-PCR και πραγματοποιήθηκε ανάλυση βιοπληροφορικής. Το πλασμίδιο pET-28a-CtCHS μεταφέρθηκε στο Escherichia coli για να προκληθεί έκφραση πρωτεΐνης με IPTG. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CtCHS επωάστηκε με τα υποστρώματα ρ-κουμαροϋλ CoA και μηλονυλ CoA και τα προϊόντα ανιχνεύθηκαν με HPLC και MS. Το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS μεταφέρθηκε στον πρωτοπλάστη του Arabidopsis thaliana για να παρατηρηθεί ο υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS. Το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου CtCHS στα άνθη του C. tubulosa με τρία χρώματα ανιχνεύθηκε με qRT-PCR.

ΑποτελέσματαΈνα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε. Το μήκος του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) ήταν 1173 bp, που κωδικοποιούσε 390 αμινοξέα και το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης ήταν 42 8000.

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 30% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 12% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ

Το CtCHS περιείχε τα καταλυτικά υπολείμματα Cys164, His303, Asn336, τα οποία διατηρήθηκαν σε συνθάση χαλκόνης. Η πρωτεΐνη CtCHS εκφράστηκε σε Ε. coli και καθαρίστηκε για να ληφθεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη CtCHS θα μπορούσε να καταλύσει το π-κουμαροϋλ CoA και το μηλονυλ CoA για να παράγει ναρινγενίνη χαλκόνη. Η πρωτεΐνη CtCHS εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Το γονίδιο CtCHS εκφραζόταν σε μεγάλο βαθμό στα μωβ και κόκκινα άνθη και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ήταν 8,44 και 3,21 φορές υψηλότερα από αυτά στα λευκά άνθη, αντίστοιχα.

Συμπέρασμα Ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε από το άνθος του C. tubulosa και εκφράστηκε πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη CtCHS έχει λειτουργία συνθάσης χαλκόνης και η έκφραση του γονιδίου CtCHS είναι υψηλότερη σε πιο σκούρα άνθη, υποδεικνύοντας ότι το γονίδιο CtCHS μπορεί να ρυθμίζει το χρώμα των λουλουδιών του C. tubulosa, το οποίο θέτει τα θεμέλια για περαιτέρω έρευνα σχετικά με τον μηχανισμό ρύθμισης του χρώματος των λουλουδιών του C. σωληνοειδές.

Λέξεις κλειδιά: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; συνθάση χαλκόνης; ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας; υποκυτταρικός εντοπισμός? ανάλυση έκφρασης

Cistanche Tubulosa(SCHENK) Το WIGHT είναι το γένος Pyreal φυτό, το οποίο διανέμεται φυσικά στο νότιο Xinjiang [1] στην περιοχή Hetian του Xinjiang [2]. Τα άνθη του σωλήνα έχουν υψηλή φαρμακευτική αξία. Οι μίσχοι του κρέατος είναι μια από τις πηγές της έκδοσης 2020 του "Κινεζική Φαρμακοποιία[3] Η έρευνα για τα λουλούδια σωλήνων, οι μίσχοι κρέατος cordonus έχουν αυξηθεί, αλλά υπάρχουν σχετικά λίγες βιολογικές έρευνες για τα άνθη του. Η περίοδος ανθοφορίας των λουλουδιών του σωλήνα είναι από τον Απρίλιο έως τον Μάιο [4], κυρίως Υπάρχουν τρία χρώματα του λευκού , κόκκινο και μωβ Τα λουλούδια του σωλήνα είναι πλούσια σε χρώμα, αλλά ο μηχανισμός ρύθμισης του χρώματος των λουλουδιών τους δεν έχει αναφερθεί με τον τύπο, το περιεχόμενο, το περιεχόμενο και την κατανομή της δομής του ιστού των πετάλων, και τη ρύθμιση των περιβαλλοντικών παραγόντων. και γενετικοί παράγοντες [5] Η χρωστική ουσία στα άνθη των φυτών περιλαμβάνει κυρίως τρεις κατηγορίες: φλαβονοειδή, καροτίνη και τετράδα, το ευρύτερο φάσμα των χρωμάτων [7] ως οι τρεις ποικιλίες Paeonia Lactiflora Pall.

Εμφανίζεται ως λευκό και το κύριο χρώμα του χρώματος περιέχει το χρώμα του κόκκινου και η όμορφη ικανότητα κάνει τα λουλούδια να εμφανίζονται ως μωβ-κόκκινο [8]. Το χρώμα των λουλουδιών είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό πολλών καλλωπιστικών φυτών και είναι επίσης ο βασικός παράγοντας που προσελκύει τα ροζ έντομα [9]. Μελέτες έχουν δείξει ότι μεταδίδεται. Για τη βιολογική έρευνα σχετικά με τη συνθετική γενετική έρευνα των κιστανοειδών στα λουλούδια του σωλήνα cistanosaurus, είναι ευνοϊκό για την αποσαφήνιση του μηχανισμού ελέγχου χρωματισμού κορδόνιου λουλουδιών σωλήνα, παρέχοντας θεωρητική βάση για τη βελτίωση του χρώματος της τεχνολογίας γενετικής μηχανικής, την προώθηση των πλουσιότερων χρωμάτων του, την αύξηση της προβολής. διευρύνοντας το πεδίο εφαρμογής των εφαρμογών.

Η βιοσυνθετική οδός τουφλαβονοειδήαρχίζει με τοφαινυλοπροπανοειδές μονοπάτι. Η φαινυλαλανίνη μετατρέπεται αρχικά σε κινναμωμικό οξύ υπό τη δράση της αμμωνιαλυάσης της φαινυλαλανίνης (PAL) και το κινναμικό οξύ 4-υδροξυλιώνεται από το κινναμωμικό οξύ. Το ένζυμο (κινναμωμικό οξύ-4-υδροξυλάση, C4H) και 4-κουμαρικό συνένζυμο Α λιγάση (4-κουμαρικό συνένζυμο Α λιγάση, 4CL) καταλύουν την αντίδραση για να δημιουργήσουν 4-κουμαροϋλ-CoA [11]. Ένα μόριο 4-κουμαροϋλ-CoA και τρία μόρια μηλονυλ-CoA καταλύονται από τη συνθάση της χαλκόνης (CHS) για τη δημιουργία της ναρινγενίνης χαλκόνης, η οποία έχειφλαβονοειδείς ενώσεις.Ο βασικός σκελετός της ισομεράσης της χαλκόνης, της-3-υδροξυλάσης της φλαβανόνης, της αναγωγάσης της διυδροφλαβονόλης, κ.λπ. δημιουργεί μια ποικιλία φλαβονοειδών όπως ισοφλαβόνες, φλαβονόλες, ανθοκυανίνες κ.λπ. [12]. Ως βασικό ένζυμο στη βιοσυνθετική οδό των φλαβονοειδών, το CHS ρυθμίζει την περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή στα φυτά και επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του χρώματος των λουλουδιών των φυτών [13]. Για παράδειγμα, η μετα-μεταγραφική σίγαση του γονιδίου Gentiana scabra Bunge CHS μπορεί να αναστείλει τη βιοσύνθεση των ανθοκυανινών και να προκαλέσει ειδική λεύκανση των λοβών του στεφάνη [14]. Σίγαση γονιδίου CHS Actinidia eriantha Benth. Το CHS μειώνει την περιεκτικότητα σε ανθοκυανίνη στα πέταλα και προκαλεί Το χρώμα των κόκκινων πετάλων γίνεται πιο ανοιχτό [15]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε από άνθη Cistanche deserticola και διεξήχθησαν σε αυτό ανάλυση βιοπληροφορικής, προκαρυωτική έκφραση και καθαρισμός, ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας, ανάλυση υποκυτταρικού εντοπισμού και ανάλυση έκφρασης σε τρία χρώματα λουλουδιών για να διερευνηθεί η λειτουργία του CtCHS Η πρωτεΐνη και το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου CtCHS χρησιμοποιήθηκαν για την προκαταρκτική διερεύνηση της σχέσης μεταξύ CtCHS και χρώματος λουλουδιών Cistanche deserticola, που έθεσε τα θεμέλια για τη μελέτη του ρυθμιστικού μηχανισμού του χρώματος λουλουδιών Cistanche deserticola.

1 Υλικά και όργανα

1.1 Υλικά

Τα άνθη Cistanche tuberosa συλλέχθηκαν από την κομητεία Yutian, στην επαρχία Hotan, στο Xinjiang τον Μάιο του 2018. Κατά τη δειγματοληψία ακολουθήθηκε η τυχαία αρχή και επιλέχθηκαν άνθη Cistanche tuberosa με καλή φυσιολογική κατάσταση και σταθερό ύψος φυτού. Τρία στελέχη Cistanche deserticola με τρία χρώματα λουλουδιών λευκό, κόκκινο και μοβ λήφθηκαν και αναγνωρίστηκαν ως Cistanche tubulosa (Schenk) Wight από τον καθηγητή Tu Pengfei της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο, αποθηκεύτηκαν σε ξηρό πάγο και μεταφέρθηκαν στο Πεκίνο. Τα χημικά ικανά κύτταρα E. coli DH5 αγοράστηκαν από την Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. και E. coli BL21 (DE3) χημικά ικανά κύτταρα αγοράστηκαν από την Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Ο φορέας αγοράστηκε από την Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Το Malonyl-CoA αγοράστηκε από την Sigma Company, 4-κουμαροϋλ-CoA, naringenin -Η χαλκόνη αγοράστηκε από τη Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., και η ναρινγενίνη από τη Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Όργανα

Φασματοφωτόμετρο Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, ΗΠΑ); όργανο gradient PCR (Eppendorf Company, Γερμανία). Όργανο ποσοτικής PCR φθορισμού CFX 96, συσκευή απεικόνισης γέλης UVP, όργανο ηλεκτροφόρησης γέλης, όργανο ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (BioRad Company, ΗΠΑ) ;EnSpire

Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (PerkinElmer Company, ΗΠΑ). θερμοκοιτίδα σταθερής θερμοκρασίας (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Ταλαντωτής πλήρους θερμοκρασίας μεγάλης χωρητικότητας DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory). THZ-82Ένας ταλαντωτής σταθερής θερμοκρασίας υδατόλουτρου ( Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Εξαιρετικά καθαρός πάγκος εργασίας AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); αποστειρωτής ατμού υψηλής πίεσης (TOMY Company, Ιαπωνία). Όργανο καθαρού νερού Milli Q (Millipore, Ηνωμένες Πολιτείες). LC-20Ένας χρωματογράφος υγρής φάσης υψηλής απόδοσης (Shimadzu Company, Ιαπωνία). Φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, ΗΠΑ). Συνεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ FV1200 (Olympus Company, Ιαπωνία).

2 Πειραματικές μέθοδοι

2.1 Εκχύλιση RNA και σύνθεση cDNA. Τα άνθη Cistanche deserticola αλέστηκαν σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία εκχύλισης RNA.

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ (Norgen, Cat 17200), η συγκέντρωση και η ποιότητα του RNA ανιχνεύθηκαν με NanoDrop 2000C και επιλέχθηκαν δείγματα RNA με αναλογία Α260/Α280 μεταξύ 1,8 και 2,1 για σύνθεση αντίστροφης μεταγραφής του cDNA. Η αντίστροφη μεταγραφάση M-MLV (Promega, M170B) χρησιμοποιήθηκε για την ανάστροφη μεταγραφή του αναγνωρισμένου ολικού RNA σε cDNA. Οι πειραματικές πράξεις έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες.

2.2 Κλωνοποίηση του γονιδίου CtCHS

Με βάση τα δεδομένα μεταγραφής λουλουδιών Cistanche deserticola της ερευνητικής μας ομάδας [16], εξετάστηκε ένα CtCHS με πλήρες ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης και το λογισμικό SnapGene χρησιμοποιήθηκε για τον σχεδιασμό συγκεκριμένων εκκινητών με βάση τη γονιδιακή αλληλουχία (Πίνακας 1). Η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας cDNA λουλουδιών Cistanche deserticola ως εκμαγείο. Το σύστημα ενίσχυσης ήταν 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, upstream και downstream primers (10 μmol/L) 2 μL το καθένα, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA Πολυμεράση 1 μL, ddH2O 17 μL. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν: προ-μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 3 λεπτά. 25 κύκλοι μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 βαθμούς για 15 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 βαθμούς για 1 λεπτό. και επέκταση αντίδρασης στους 72 βαθμούς για 5 λεπτά. Το προϊόν PCR ανιχνεύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης 1% και το κιτ καθαρισμού DNA (Novizan, Cat DC301-01) χρησιμοποιήθηκε για ανάκτηση γέλης και στη συνέχεια το ανακτηθέν DNA καθαρίστηκε με κιτ ταχείας κλωνοποίησης (Novizan, Cat Γ601-01). Το θραύσμα DNA συνδέθηκε με τον φορέα pCE2 TA/Blunt-Zero, μετασχηματίστηκε σε κατάλληλα κύτταρα Escherichia coli DH5 και μετά από καλλιέργεια όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς, επιλέχθηκαν στελέχη απλού κλώνου και στάλθηκαν στην εταιρεία για προσδιορισμό αλληλουχίας.

Πίνακας 1 Αλληλουχίες εκκινητών

2.3 Βιοπληροφορική ανάλυση

Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ProtParam για να αναλύσετε τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο Prot Scale για να αναλύσετε την υδροφιλία/υδροφοβία των πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό εργαλείο SOPMA για να προβλέψετε τη δευτερογενή δομή πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το διαδικτυακό λογισμικό ανάλυσης SWISS-MODEL για να προβλέψετε την τριτογενή δομή πρωτεΐνης. χρήση διαδικτυακού λογισμικού TMHMM Πρόβλεψη της διαμεμβρανικής δομής της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό DNAMAN για να συγκρίνετε την ομολογία του CtCHS με τις αλληλουχίες αμινοξέων CHS άλλων ειδών. χρησιμοποιήστε το λογισμικό MEGA-X για να κατασκευάσετε ένα φυλογενετικό δέντρο, χρησιμοποιώντας γειτονική ένωση (NJ) και διόρθωση Poisson Η εξελικτική απόσταση υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bootstrap και ο αριθμός των επαναλήψεων Bootstrap είναι 1000 φορές.

Το UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω ανίχνευση. Οι συνθήκες υγρής φάσης ήταν στήλη Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), θερμοκρασία στήλης 40 βαθμοί, ναρινγενίνη , χαλκόνη και ναρινγενίνη. Ο όγκος φόρτωσης της ουσίας ελέγχου είναι 4 μL και ο όγκος φόρτωσης του προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης είναι 7 μL. Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται νερό (Α)-ακετονιτρίλιο (Β). Η βαθμίδα έκλουσης είναι: 0 έως 5 λεπτά, 30% Β. 5 έως 15 λεπτά. , 30%~60% Β; 15~20 λεπτά, 60%~100% Β; 20~25 λεπτά, 100% Β; 25~31 min, 100%~30% B. Ο ογκομετρικός ρυθμός ροής είναι 0,3 mL/min. Οι συνθήκες φασματομετρίας μάζας είναι πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού, άζωτο ως φέρον αέριο, πίεση αερίου περιβλήματος 3,5 MPa, πίεση βοηθητικού αερίου 1,0 MPa, πίεση ψεκασμού 3500 V, θερμοκρασία τριχοειδούς 350 μοίρες, θερμοκρασία θέρμανσης βοηθητικού αερίου 200 μοίρες, θετικές και αρνητικές λειτουργίες ιόντων, σάρωση Το εύρος ιόντων m/z είναι 100-1500, η ανάλυση πλήρους MS είναι 35 000, η ανάλυση dd-MS2 είναι 17 500, (N)

CE/stepped nce ορίστηκε σε 35, 60.

2.6 Υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS

Με βάση την αλληλουχία CtCHS και την αρχή της απρόσκοπτης κλωνοποίησης, σχεδιάστηκαν εκκινητές με θέσεις κοπής ενζύμου Kpn Ⅰ και BamH Ⅰ και τα αντίστοιχα θραύσματα στόχου ενισχύθηκαν με PCR. Το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP υποβλήθηκε σε πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Kpn Ⅰ και BamH Ⅰ και το θραύσμα στόχος και ο φορέας συνδέθηκαν μέσω του κιτ κλωνοποίησης χωρίς ραφή (Novizan, Cat C115-01) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κατάλληλα κύτταρα E. coli DH5. , επιλέξτε στελέχη μεμονωμένων κλώνων για αλληλούχιση και εκχυλίστε πλασμίδια από τα σωστά στελέχη. Τα πλασμίδια pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS και pCAMBIA 1300-35S-GFP μετασχηματίστηκαν σε πρωτοπλάστες Arabidopsis thaliana χρησιμοποιώντας PEG4000 και καλλιεργήθηκαν υπό χαμηλό φως για 8 έως 10 ώρες. Ο υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης CtCHS παρατηρήθηκε κάτω από ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ.

2.7 Ανάλυση προτύπων έκφρασης CtCHS

Με βάση την αλληλουχία CtCHS, το DNAMAN χρησιμοποιήθηκε για τον σχεδιασμό ποσοτικών εκκινητών φθορισμού σε πραγματικό χρόνο, με το F-box ως το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1. Η σχετική έκφραση του CtCHS σε άνθη Cistanche deserticola διαφορετικών χρωμάτων ανιχνεύθηκε με ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο. Χρησιμοποιήστε TransStart Green qPCR SuperMix (full gold, AQ101-02) για μέτρηση με τη μέθοδο SYBR Green φθορίζουσας βαφής, σύστημα αντίδρασης: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, upstream και downstream primer (10

μmol/L) {{0}}.2 μL το καθένα, πρότυπο cDNA 0,5 μL, νερό χωρίς νουκλεοτιδάση 4,1 μL, χρησιμοποιήθηκε μέθοδος δύο σταδίων για την αντίδραση και η διαδικασία αντίδρασης βασίστηκε στη μέθοδο των Dong Xianjuan et al. [18]. Κάθε δείγμα περιείχε 3 βιολογικά αντίγραφα και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση Excel to 2

Η σχετική έκφραση του CtCHS υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο -ΔΔCt και το GraphPad Prism 8 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ανάλυσης σημασίας και τη σχεδίαση ιστογραμμάτων.