Κλωνοποίηση, Λειτουργική Αναγνώριση και Ανάλυση Έκφρασης Συνθάσης Χαλκόνης από Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Αποτελέσματα και ανάλυση

3.1 Κλωνοποίηση του γονιδίου CtCHS

Τέσσερις αλληλουχίες που σχολιάζονται ως "συνθάση χαλκόνης" υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μεταγραφής των λουλουδιών Cistanches tubulosa. Μέσω της σύγκρισης NCBI's Blast, βρέθηκε ότι μόνο μία αλληλουχία είχε ολόκληρο το μήκος του γονιδίου CHS και είχε FPKM μεγαλύτερο από 10. Ειδικοί εκκινητές σχεδιάστηκαν με βάση αυτή την αλληλουχία και ένα θραύσμα περίπου 1200 bp λήφθηκε με ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας cDNA λουλουδιών Cistanches tubulosa ως πρότυπο (Εικόνα 1). Το προϊόν PCR ανακτήθηκε σε πήκτωμα και συνδέθηκε με τον φορέα pCE2TA/Blunt-Zero. Τα αποτελέσματα της αλληλουχίας ήταν συνεπή με την ανάλυση μεταγραφώματος. Το γονίδιο ονομάστηκε CtCHS. Το μήκος της αλληλουχίας είναι 1173 bp και κωδικοποιεί 390 αμινοξέα.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-κατάστημα

3.2 Βιοπληροφορική ανάλυση CtCHS

3.2.1 Φυσικές και χημικές ιδιότητες CtCHS και ανάλυση διαμεμβρανικής περιοχής

Το διαδικτυακό λογισμικό ProtParam χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο CtCHS. Το CtCHS κωδικοποιεί 390 αμινοξέα, ο μοριακός τύπος είναι C1908H3041N511O562S22, η σχετική μοριακή μάζα είναι 42 836.54, το θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο είναι 5,85 και είναι ασταθές. Ο συντελεστής II είναι 43,24, που είναι μια ασταθής πρωτεΐνη, και η συνολική μέση υδροφιλικότητα (GRAVY) είναι −0,052, η οποία είναι μια υδρόφιλη πρωτεΐνη. Το διαδικτυακό εργαλείο Prot Scale χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω για την ανάλυση της υδροφιλικότητας/υδροφοβίας της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η μέγιστη τιμή της υδροφιλίας/υδροφοβίας της πρωτεΐνης CtCHS ήταν 2,422 (342) και η ελάχιστη τιμή ήταν −2,489 (119). Η πεπτιδική αλυσίδα αμινοξέων που κωδικοποιείται από το γονίδιο CtCHS έχει περισσότερα υδρόφιλα υπολείμματα αμινοξέων από τα υδρόφοβα υπολείμματα αμινοξέων, επομένως είναι μια υδρόφιλη πρωτεΐνη. Το διαδικτυακό λογισμικό TMHMM χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της διαμεμβρανικής δομής της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη CtCHS δεν έχει διαμεμβρανική περιοχή.

Εικ. 1 Ενίσχυση PCR του γονιδίου CtCHS

3.2.2 Πρόβλεψη δευτερογενούς δομής και τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης CtCHS

Το διαδικτυακό εργαλείο SOPMA χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της δευτερογενούς δομής της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο σχήμα 2-Α. 44,87% -έλικες, 31,03% τυχαίες σπείρες, 15,64% εκτεταμένες αλυσίδες και 8,46% - φύλλα αποτελούν τη δευτερογενή δομή της πρωτεΐνης CtCHS. δομή επιπέδου. Το διαδικτυακό λογισμικό ανάλυσης SWISS-MODEL χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης και η κρυσταλλική δομή του ρυζιού CHS1 χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης CtCHS. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 2-Β. Η συνοχή μεταξύ του Cistanche tubulosa CtCHS και του ρυζιού CHS1 είναι 83,55%.

3.2.3 Σύγκριση αλληλουχιών και φυλογενετική ανάλυση και εφαρμογή δένδρων

Το λογισμικό DNAMAN πραγματοποιεί σύγκριση ομολογίας μεταξύ CtCHS και αλληλουχιών αμινοξέων CHS άλλων ειδών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο σχήμα 3-Γ. Η αλληλουχία αμινοξέων CtCHS είναι σύμφωνη με το Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) και το Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) και Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Οι αλληλουχίες αμινοξέων του CHS είναι πολύ παρόμοιες, με την ομοιότητα να είναι 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% και 81,61%.

ΦΥΣΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 30% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 12% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ

Επιπλέον, η ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών έδειξε επίσης ότι το CtCHS έχει διατηρήσει τα καταλυτικά υπολείμματα Cys164, His303 και Asn336. Προκειμένου να κατανοηθεί περαιτέρω η εξελικτική θέση του Cistanche tubulosa CtCHS στην οικογένεια των φυτών CHS, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό MEGA-X για την κατασκευή ενός φυλογενετικού δέντρου μεταξύ των πρωτεϊνών CtCHS και CHS άλλων φυτών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3-DE lewisii AHJ80976.1) Το ElCHS σχετίζεται στενά.

3.3 CtCHS προκαρυωτική έκφραση και καθαρισμός

Το πλασμίδιο pET-28a-CtCHS μετασχηματίστηκε σε στέλεχος έκφρασης Ε. coli BL21 (DE3) και η έκφραση πρωτεΐνης προκλήθηκε με IPTG σε χαμηλή θερμοκρασία. Η πρωτεΐνη καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας στήλη χρωματογραφίας συγγένειας ιόντων νικελίου και η καθαρισμένη πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με 10% SDSPAGE. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3. Η ζώνη πρωτεΐνης CtCHS εμφανίστηκε κοντά στο 40,000, το οποίο είναι σύμφωνο με τη σχετική μοριακή μάζα της πρωτεΐνης CtCHS των 42.800.

3.4 Ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας CtCHS

Για να αναγνωριστεί η λειτουργία του CtCHS, η καθαρισμένη πρωτεΐνη CtCHS επωάστηκε με μηλονυλ-CoA, 4-κουμαροϋλ-CoA και τα προϊόντα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας HPLC και MS. Υπό φυσικές συνθήκες, η ναριγγενίνη-χαλκόνη είναι ασταθής σε διάλυμα και κυκλοποιείται εύκολα σε ναρινγενίνη. Ως εκ τούτου, η ναριγγενίνη-χαλκόνη και η ναριγγενίνη επιλέχθηκαν ως τυπικοί έλεγχοι.

Τα αποτελέσματα της δοκιμής HPLC φαίνονται στο Σχήμα 4-Α και Β. Ο χρόνος κατακράτησης του προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης είναι παρόμοιος με αυτόν του προτύπου ναρινγενίνης. Και τα δύο έχουν μέγιστη απορρόφηση στα 289 nm στο φάσμα απορρόφησης υπεριώδους ακτινοβολίας, το οποίο είναι διαφορετικό από το χρόνο κατακράτησης της ναρινγενίνης-χαλκόνης. Ο χρόνος και τα φάσματα απορρόφησης υπεριώδους ακτινοβολίας ήταν διαφορετικά, αλλά ως αρνητικός έλεγχος, το προϊόν μετά την επώαση της αδρανοποιημένης σε υψηλή θερμοκρασία πρωτεΐνης CtCHS με το υπόστρωμα δεν περιείχε ναρινγενίνη, χαλκόνη και ναριγγενίνη. Περαιτέρω ανίχνευση μέσω φασματομετρίας μάζας, το φάσμα μάζας πρώτου επιπέδου (Σχήμα 4-C, D) έδειξε ότι το προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης έχει [MH]-αιχμή m/z271.060 97, ενώ η ναρινγενίνη έχει [MH]. ]-κορυφή m/z 271.060 91.

Συγκρίνοντας τα φάσματα MS2 (Εικόνα 5-E, F), το προϊόν της ενζυμικής αντίδρασης CtCHS και η ναρινγενίνη έχουν χαρακτηριστικές κορυφές θραυσμάτων σε m/z 107, 151 και 177, κάτι που είναι σύμφωνο με τη βιβλιογραφική αναφορά [19], υποδεικνύοντας ότι το CtCHS έχει σύμπλοκο χαλκόνης. Ενζυματική δραστηριότητα, μπορεί να καταλύσει την αντίδραση του μηλονυλ-CoA και του 4-κουμαροϋλ-CoA σε ναρινγενίνη-χαλκόνη.

3.5 Ανάλυση υποκυτταρικού εντοπισμού

Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης CtCHS στα κύτταρα, το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS κατασκευάστηκε και μετασχηματίστηκε σε πρωτοπλάστες Arabidopsis thaliana για να παρατηρηθεί ο υποκυτταρικός εντοπισμός του. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο σχήμα 5. Ως έλεγχος, η πρωτεΐνη pCAMBIA1300-35S-GFP κατανεμήθηκε στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, ενώ η πρωτεΐνη σύντηξης pCAMBIA{1300-35S-GFP-CtCHS κατανεμήθηκε κυρίως σε το κυτταρόπλασμα, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη CtCHS μπορεί να λειτουργεί στο κυτταρόπλασμα των φυτικών κυττάρων. Λειτουργία.

3.6 Ανάλυση προτύπων έκφρασης CtCHS

Χρησιμοποιήθηκε qRT-PCR για την ανίχνευση της σχετικής έκφρασης του CtCHS σε άνθη Cistanche deserticola με τρία χρώματα: λευκό, μωβ και κόκκινο. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 6. Η έκφραση του CtCHS στα μωβ και κόκκινα άνθη ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή στα λευκά άνθη. ποσότητα. Σε σύγκριση με τα λευκά άνθη, το επίπεδο έκφρασης του CtCHS στα μωβ άνθη είναι 8,44 φορές υψηλότερο και το επίπεδο έκφρασης του CtCHS στα κόκκινα άνθη είναι 3,21 φορές υψηλότερο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης CtCHS μπορεί να σχετίζονται με τη διαφορά στο χρώμα των λουλουδιών του Cistanche deserticola. Όσο υψηλότερο είναι το επίπεδο έκφρασης, τόσο πιο σκούρο είναι το χρώμα του λουλουδιού. , όσο χαμηλότερο είναι το επίπεδο έκφρασης, τόσο πιο ανοιχτό είναι το χρώμα του λουλουδιού.

****P＜0.000 1Εικ. 6 Σχετικό επίπεδο έκφρασης CtCHS σε άνθη με διαφορετικά χρώματα

4. Συζήτηση

Το CHS είναι αβασικό ένζυμο στη βιοσυνθετική οδό των φλαβονοειδώνκαι σχετίζεται με ουρύθμιση του χρώματος των λουλουδιώνσε πολλά φυτά. Για παράδειγμα, το χρώμα των λουλουδιών τουDianthus chinensisL.[20] και Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] επηρεάζονται όλοι από CHS. έλεγχος.Cistanches tubulosaέχει κυρίως τρία χρώματα λουλουδιών: λευκό, κόκκινο και μοβ, αλλά ο μηχανισμός ρύθμισης του χρώματος των λουλουδιών του δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, ένα γονίδιο CtCHS κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR μέσωανάλυση δεδομένων μεταγραφής των λουλουδιών Cistanches tubulosa, και είναι

Βιοπληροφορική ανάλυσηδιεξήχθη και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CtCHS έχει υψηλή ομοιότητα και στενή γενετική σχέση με την αλληλουχία αμινοξέων του ElCHS του Physalis nigra (AHJ80976.1). Το CHS είναι μια πολυκετιδική συνθάση τύπου III (PKSIII) και οι μελέτες έχουν βρει ότι το CHS έχει μια διατηρημένη καταλυτική τριάδα Cys-His-Asn [23]. Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση ευθυγράμμισης αλληλουχίας αμινοξέων έδειξε ότι το CtCHS έχει διατηρήσει τα καταλυτικά υπολείμματα Cys164, His303 και Asn336, υποδεικνύοντας ότι το CtCHS μπορεί να έχει μια τυπική λειτουργία συνθάσης χαλκόνης.

ικανός. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ενζυμικής δραστηριότητας χρησιμοποιώντας προκαρυωτική έκφραση της πρωτεΐνης CtCHS σε Escherichia coli και ανιχνεύθηκε με HPLC και MS. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη CtCHS μπορεί να καταλύσει το 4-κουμαροϋλ-CoA και το μηλονυλ-CoA για να παράγει ναρινγενίνη-χαλκόνη.

Το CHS εμπλέκεται στη σύνθεση φλαβονοειδών σε πολλά φυτά, αλλά η υποκυτταρική του θέση είναι διαφορετική σε διαφορετικά είδη. Για παράδειγμα, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Το EaCHS[26] βρίσκονται όλα στο κυτταρόπλασμα, ενώ το Paeonia delavay var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], η μελιτζάνα Solanum melongena L. SmCHS [28] βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα και στο σταφύλι Vitis vinifera L. VvCHS βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα και το κυτταρικό τοίχωμα [29]. Σε αυτή τη μελέτη, το πλασμίδιο pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό των πρωτοπλάστων Arabidopsis thaliana και παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη CtCHS εντοπιζόταν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και μπορεί να καταλύσει την παραγωγή ναρινγενίνης-χαλκόνης στο κυτταρόπλασμα σε προάγουν τη συσσώρευση φλαβονοειδών.

Η οδός του φαινυλοπροπανοειδούς διακλαδίζεται από το 4-κουμαροϋλ-CoA στο μονοπάτι σύνθεσης φλαβονοειδών και στο μονοπάτι βιοσύνθεσης λιγνάνης. Το CHS καταλύει το 4-κουμαροϋλ-CoA και το μηλονυλ-CoA για να δημιουργήσει ναρινγενίνη και χαλκόνη για την έναρξη φλαβονοειδών. Η βιοσυνθετική οδός των ενώσεων που μοιάζουν με ένωση είναι το πρώτο βασικό ένζυμο σε αυτήν την οδό [30]. Επομένως, το CHS με υψηλή έκφραση είναι ευεργετικό για τα φυτά να συσσωρεύουν υψηλότερα επίπεδα φλαβονοειδών και να παράγουν πιο σκούρα άνθη. Για παράδειγμα, το επίπεδο έκφρασης του CHS σε ποικιλίες Hosta plantaginea (Lam.) Aschers με μοβ άνθη είναι υψηλότερο από αυτό των ποικιλιών με λευκά άνθη. Το Hosta HpCHS μετατρέπεται σε καπνό για να ληφθεί Σε σύγκριση με τον καπνό άγριου τύπου, τα φυτά υπερέκφρασης έχουν πιο σκούρα πέταλα και υψηλότερη περιεκτικότητα σε ολική ανθοκυανίνη [31].

Σε αυτή τη μελέτη, το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου CtCHS σχετίζεται με το χρώμα των λουλουδιών Cistanches tubulosa. Εκφράζεται έντονα σε πιο σκούρα μωβ άνθη και κόκκινα άνθη και είναι χαμηλή σε ανοιχτόχρωμα λευκά άνθη. Η διαφορά έκφρασης του CtCHS μπορεί να οφείλεται στη διαφορά στα άνθη Cistanches tubulosa. Ένας από τους λόγους για να έχεις διαφορετικά κοστούμια και χρώματα. Συνοπτικά, αυτή η μελέτη κλωνοποίησε ένα γονίδιο CtCHS από άνθη Cistanche deserticola και διεξήγαγε βιοπληροφορική ανάλυση σε αυτό. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CtCHS ελήφθη με εξωγενή έκφραση σε Escherichia coli. Η ανάλυση της ενζυμικής δραστηριότητας απέδειξε ότι η πρωτεΐνη CtCHS μπορεί να καταλύσει 4-κουμαροϋλικό συνένζυμο. Το Α και το μαλονυλο-συνένζυμο Α παράγουν ναριγγενίνη-χαλκόνη. Διαπιστώθηκε ότι το γονίδιο CtCHS εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε μωβ και κόκκινα άνθη και χαμηλή σε λευκά άνθη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το γονίδιο CtCHS μπορεί να ρυθμίζει την παραγωγή διαφορετικών χρωμάτων λουλουδιών στο Cistanche deserticola, κάτι που είναι ευεργετικό για περαιτέρω έρευνα σχετικά με τον ρυθμιστικό μηχανισμό του χρώματος λουλουδιών Cistanche tubulosa και παρέχει μια αναφορά για μετέπειτα έρευνα σχετικά με το ρόλο του CtCHS στη ρύθμιση του χρώμα λουλουδιών σε Cistanche deserticola.