Το Cistanche βελτιώνει τη λοίμωξη των νεφρών λόγω του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου

Πυρηνικό αντιγόνο-αντιδραστικό CD4^συντα κύτταρα επεκτείνονται στον ενεργό συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, παράγουν κυτοκίνες τελεστές και μολύνουν τους νεφρούς

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dimas Abdirama , Sebastian Tesch κ.α

Συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείναι μια συστηματική και χρόνια αυτοάνοση νόσος που χαρακτηρίζεται από απώλεια ανοχής στα πυρηνικά αντιγόνα με αυτοαντιδραστικό CD4^συνΤ κύτταρα που εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ειδικότητά τους στον υποδοχέα από την ανίχνευση του ανθρώπινου αυτοαντιγόνου CD4^συνΤα Τ κύτταρα ήταν εξαιρετικά απαιτητικά. Εδώ παρουσιάζουμε μια ανάλυση του CD4^συν Τ κύτταρα αντιδρούν σε πυρηνικά αντιγόνα χρησιμοποιώντας δύο συμπληρωματικές μεθόδους: βιβλιοθήκες Τ κυττάρων και εμπλουτισμό Τ κυττάρων που αντιδρούν με αντιγόνο. Οι συχνότητες του ειδικού για το πυρηνικό αντιγόνο CD4^συν Τα Τ κύτταρα συσχετίζονται με τη σοβαρότητα της νόσου. Αυτά τα αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα παράγουν τελεστικές κυτοκίνες όπως η ιντερφερόνη-g, η ιντερλευκίνη-17 και η ιντερλευκίνη-10. Σε σύγκριση με το αίμα, αυτά τα κύτταρα εμπλουτίστηκαν στα ούρα ασθενών με ενεργό νεφρίτιδα λύκου, υποδηλώνοντας διήθηση του μολυσμένουνεφρά. Έτσι, αυτά τα προηγουμένως μη αναγνωρισμένα χαρακτηριστικά υποστηρίζουν έναν ρόλο για το ειδικό για πυρηνικό αντιγόνο A CD4^συνΤ κύτταρα σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

Πνευματικά δικαιώματα ª 2020, International Society of Nephrology. Δημοσιεύτηκε από την Elsevier Inc. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης με την άδεια CC BY-NC-ND

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: λύκοςερυθηματώδης, νεφρός,

Συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείναι μια συστηματική και χρόνια αυτοάνοση νόσος που χαρακτηρίζεται από απώλεια ανοχής στα πυρηνικά αντιγόνα λόγω ελαττωματικής διάθεσης βιολογικών αποβλήτων όπως αποπτωτικό υλικό που περιέχει ριβονουκλεοπρωτεΐνες και νουκλεοσώματα.1 Το αυτοαντίσωμα που στρέφεται κατά των πυρηνικών αντιγόνων είναι χαρακτηριστικόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςκαι συνήθως εμφανίζεται πριν από την εμφανή ασθένεια. Επιπλέον, αυτοαντιδραστικό CD4^συνΤα Τ κύτταρα εμπλέκονται στην παθογένεση τουσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςμε την προώθηση της παραγωγής αυτοαντισωμάτων από τα Β κύτταρα και την άμεση διάδοση της βλάβης οργάνων σε μολυσμένα όργανα-στόχους. Αν και η ανίχνευση αντιδρώντων με πυρηνικό αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρων έχει αναφερθεί προηγουμένως, τα στοιχεία για την ύπαρξή τους παραμένουν περιφερειακά μέχρι τώρα και δεν είναι επί του παρόντος ασαφές πώς αλληλεπιδρούν στην παθογένεση. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτά τα κύτταρα συμμετέχουν στην αυτοανοσία θα είναι κρίσιμη για το σχεδιασμό μιας αποτελεσματικής θεραπείας.

Η ανίχνευση των ειδικών για το αυτοαντιγόνο Τ κυττάρων εμποδίζεται από τις εξαιρετικά χαμηλές συχνότητές τους στο κυκλοφορούν αίμα. Προηγούμενες μελέτες ανθρώπινων αφελών CD4^συνΤα ρεπερτόρια Τ-κυττάρων έχουν χρησιμοποιήσει τεχνολογία που βασίζεται σε τετραμερή για την αποτελεσματική παροχή ακριβών πληροφοριών σχετικά με τις αποκρίσεις των Τ-κυττάρων σε συγκεκριμένους επίτοπους αντιγόνου. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος απαιτεί προηγούμενη γνώση των τύπων αντιγόνου ανθρώπινων λευκοκυττάρων του δότη. Αναπτύχθηκαν εναλλακτικές τεχνικές για την ταυτόχρονη ανίχνευση και απαρίθμηση σπάνιων πληθυσμών Τ-κυττάρων με αντιδραστικότητα σε διαφορετικά αντιγόνα χωρίς προηγούμενη γνώση των τύπων ανθρώπινων λευκοκυττάρων αντιγόνων με τη χρήση βιβλιοθηκών ενισχυμένων πολυκλωνικών Τ κυττάρων και με τον εμπλουτισμό των CD{4}}που εκφράζουν Τ κύτταρα μετά από διέγερση με ένα αντιγόνο που ονομάζεται ARTE (αντιγονο-δραστικός εμπλουτισμός Τλεμφοκυττάρων).

Συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείναι επιβλαβής γιανεφρά, αλλά το cistanche μπορεί να βελτιωθείνεφρόλειτουργίες.

CD4^συν Τα Τ κύτταρα ασκούν κυρίως τη λειτουργία τους μέσω της έκκρισης κυτοκινών κατά την αντιγονική ενεργοποίηση16 και με τη διάδοση της φλεγμονής των ιστών όπως σελύκοςνεφρίτιδαπου αντιπροσωπεύει μια από τις πιο σοβαρές επιπλοκές τουσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Ανάλυση του ρεπερτορίου Τ-κυττάρων που υπάρχει σενεφρόβιοψίες από ασθενείς μελύκοςνεφρίτιδααποκάλυψε ολιγοκλωνικότητα τουνεφρό-διηθητικό CD4^συν Τ κύτταρα, υποδεικνύοντας συσσώρευση αντιγονοειδικών Τ κυττάρων σε μολυσμένανεφρά. Η προηγούμενη μελέτη μας αποκάλυψε Τ κύτταρα ούρων σε ασθενείς με ενεργόλύκος νεφρίτιδαως ακριβής βιοδείκτης που μοιάζει με τον φαινότυπο των ενδονεφρικών κυττάρων. Αν και αυτά τα κύτταρα είναι εμπλουτισμένα με τον υποδοχέα χημειοκίνης CXC 3 και τον υποδοχέα χημειοκίνης CC 5 που εκφράζουν Τ κύτταρα ενδεικτικά ενός πληθυσμού Τ βοηθητικών κυττάρων 1 (Th1) και περιέχουν CD154^συνΤ κύτταρα που υποδηλώνουν πρόσφατη συνάντηση αντιγόνου, η εξειδίκευσή τους στο αντιγόνο προς τα πυρηνικά αντιγόνα παραμένει ασαφής.

Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζουμε μια ανάλυση του CD4^συν Τ κύτταρα αντιδρούν στα πυρηνικά αντιγόνα σε συνολικά 17 υγιή άτομα, 12 άτομα με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, και 20 θέματα με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςμε τη χρήση βιβλιοθηκών Τ-κυττάρων και τεχνικών ARTE για την ανάλυση των συχνοτήτων του αυτοαντιδραστικού CD4^συν Τ κύτταρα στο περιφερικό αίμα και στα ούρα ασθενών μελύκοςνεφρίτιδακαθώς και την παραγωγή κυτοκίνης.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Πυρηνικό αντιγόνο-αντιδραστικό CD4^συνΤα Τ κύτταρα είναι διογκωμένοι ανενεργός συστηματικός ερυθηματώδης λύκος όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων και το ARTE

με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Αυτά τα κύτταρα ήταν επίσης ανιχνεύσιμα σε 5 από τους 6 ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, ενώ μόνο 3 από τους 6 υγιείς μάρτυρες παρουσίασαν κυκλοφορίααυτοαντιδραστικήT κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι οι ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςέδειξε επίσης μια ευρύτερη ποικιλία αυτοαντιδραστικών αποκρίσεων Τ-κυττάρων, με κάθε ασθενή να έχει αντιδραστικά Τ κύτταρα έναντι τουλάχιστον 3 πυρηνικών αντιγόνων. Συγκριτικά, το χαρτοφυλάκιο-στόχος ήταν λιγότερο μεταβλητό σε ασθενείς με ανενεργούςσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςκαι υγιείς ελέγχους. Συνολικά, τα κυκλοφορούντα Τ κύτταρα αντιδρώντα με πυρηνικό αντιγόνο δεν είναι αποκλειστικά γιασυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, αλλά ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, ο αριθμός τους είναι μεγαλύτερος και οι δομές στόχου τους είναι πιο μεταβλητές.

Επειδή τα αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα παίζουν ρόλο στη διάδοση των αυτοάνοσων αποκρίσεων, συγκρίναμε τον αριθμό των αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων με τη σοβαρότητα της νόσου, που αξιολογήθηκε από τοσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςδείκτης δραστηριότητας της νόσου (συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςDAI) σκορ. Μόνο οι συχνότητες του CD4^συνΤα Τ κύτταρα που αντιδρούν στα RNP70, Ro και La συσχετίζονται θετικά μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ 0.4865; Ro: P ¼ 0.005. , r ¼ 0,6299, La: P ¼ 0,01, r ¼ 0,5651) (Εικόνα 1d). Αντίθετα, η συχνότητα των Τ-λεμφοκυττάρων που αντιδρούν στην τρανσθυρετίνη βρέθηκε σε αρκετά παρόμοιο επίπεδο και στις 3 ομάδες (Εικόνα 1e), απορρίπτοντας έτσι μια πιθανή πειραματική μεροληψία λόγω της γενικής μη ειδικής για αντιγόνο υπεραντιδραστικότητας των Τ-κυττάρων.συστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

Οι βιβλιοθήκες Τ-κυττάρων προσφέρουν μια σειρά πλεονεκτημάτων, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ευαισθησίας για την ανίχνευση πολύ σπάνιων κυττάρων εντός ενός μικρού αριθμού κυττάρων εισόδου. Ωστόσο, αυτή η τεχνική βασίζεται στην επέκταση των κυττάρων, η οποία μπορεί να αλλάξει τη σύνθεση των κυττάρων και παρέχει μόνο μια περιορισμένη δυνατότητα φαινοτυπικού χαρακτηρισμού των αντιδρώντων κυττάρων. Επομένως, επικυρώσαμε τις παρατηρήσεις μας με τη μέθοδο ARTE. Το πρωτόκολλο ARTE απαιτεί μεγαλύτερες ποσότητες κυττάρων εισόδου, κάτι που είναι ιδιαίτερα δύσκολο σε ασθενείς μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςπου συχνά παρουσιάζουν λεμφοπενία και αναιμία. Λόγω αυτού του περιορισμού και επίσης για να αυξήσουμε την αναμενόμενη ανάγνωση των αντιδραστικών κυττάρων, συγκεντρώσαμε και τα 5 κανονικά πυρηνικά αντιγόνα και χρησιμοποιήσαμε αυτήν την ομάδα για να διεγείρουμε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) πριν από τον εμπλουτισμό των κυττάρων που εκφράζουν CD{1}}(n ¼ 15 ασθενείς μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης; n ¼ 6 υγιείς μάρτυρες). Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό των επιφανειακών δεικτών CD154 και CD69, τα Τ κύτταρα αντιδρούν σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-συσχετισμένα πυρηνικά αντιγόνα θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν σε έναν πληθυσμό υποβάθρου (Εικόνα 1στ). Αν και η έκφραση υποβάθρου των CD154 και CD69 παρατηρήθηκε σε αφθονία σε όλα τα άτομα, ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείχαν σημαντικά αυξημένες συχνότητες CD154 συν CD69 συν Τ κύτταρα όταν διεγέρθηκαν με πυρηνικά αντιγόνα σε σύγκριση με τη διέγερση υποβάθρου (P ¼ 0.008), ενώ υγιή άτομα και ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείχαν παρόμοιες συχνότητες μεταξύ διεγερμένων από αντιγόνο και μη διεγερμένων κυττάρων (υγιή άτομα: P ¼ 0.44· ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης: P ¼ {{0}}.56) (Εικόνα 1ζ). Επιπλέον, αφαιρώντας τις συχνότητες υποβάθρου, οι συχνότητες των αντιδρώντων προς το πυρηνικό αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερες σε ασθενείς με ενεργό νόσο από ό,τι σε υγιή άτομα και ασθενείς με ανενεργή νόσο (P ¼ 0.02 και P. ¼ 0.11, αντίστοιχα) (Εικόνα 1η). Η συχνότητα των πυρηνικών αντιγονο-αντιδραστικών Τ κυττάρων που αφαιρούνται από το υπόβαθρο συσχετίζεται θετικά με τη δραστηριότητα της νόσου (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο τους στηνσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

Οι βιβλιοθήκες Τ-κυττάρων προσφέρουν μια σειρά πλεονεκτημάτων, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ευαισθησίας για την ανίχνευση πολύ σπάνιων κυττάρων εντός ενός μικρού αριθμού κυττάρων εισόδου. Ωστόσο, αυτή η τεχνική βασίζεται στην επέκταση των κυττάρων, η οποία μπορεί να αλλάξει τη σύνθεση των κυττάρων και παρέχει μόνο μια περιορισμένη δυνατότητα φαινοτυπικού χαρακτηρισμού των αντιδρώντων κυττάρων. Επομένως, επικυρώσαμε τις παρατηρήσεις μας με τη μέθοδο ARTE. Το πρωτόκολλο ARTE απαιτεί μεγαλύτερες ποσότητες κυττάρων εισόδου, κάτι που είναι ιδιαίτερα δύσκολο σε ασθενείς με συστηματικήλύκοςερυθηματώδηςπου συχνά παρουσιάζουν λεμφοπενία και αναιμία. Λόγω αυτού του περιορισμού και επίσης για να αυξήσουμε την αναμενόμενη ανάγνωση των αντιδραστικών κυττάρων, συγκεντρώσαμε και τα 5 κανονικά πυρηνικά αντιγόνα και χρησιμοποιήσαμε αυτήν την ομάδα για να διεγείρουμε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) πριν από τον εμπλουτισμό των κυττάρων που εκφράζουν CD{1}}(n ¼ 15 ασθενείς μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης; n ¼ 6 υγιείς μάρτυρες). Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό των επιφανειακών δεικτών CD154 και CD69, τα Τ κύτταρα αντιδρούν σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-συσχετισμένα πυρηνικά αντιγόνα θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν σε έναν πληθυσμό υποβάθρου (Εικόνα 1στ). Αν και η έκφραση υποβάθρου των CD154 και CD69 παρατηρήθηκε σε αφθονία σε όλα τα άτομα, ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείχαν σημαντικά αυξημένες συχνότητες του CD154^συνCD69^συνΤα Τ κύτταρα όταν διεγείρονται με πυρηνικά αντιγόνα σε σύγκριση με τη διέγερση υποβάθρου (P ¼ 0.008), ενώ τα υγιή άτομα και οι ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςείχαν παρόμοιες συχνότητες μεταξύ διεγερμένων από αντιγόνο και μη διεγερμένων κυττάρων (υγιή άτομα: P ¼ 0.44· ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης: P ¼ {{0}}.56) (Εικόνα 1ζ). Επιπλέον, αφαιρώντας τις συχνότητες υποβάθρου, οι συχνότητες των αντιδρώντων προς το πυρηνικό αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερες σε ασθενείς με ενεργό νόσο από ό,τι σε υγιή άτομα και ασθενείς με ανενεργή νόσο (P ¼ 0.02 και P. ¼ 0.11, αντίστοιχα) (Εικόνα 1η). Η συχνότητα των πυρηνικών αντιγονο-αντιδραστικών Τ κυττάρων που αφαιρούνται από το υπόβαθρο συσχετίζεται θετικά με τη δραστηριότητα της νόσου (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο τους στηνσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςπαθογένεση (Εικόνα 1i). Επιπλέον, CD4^συνΤα Τ κύτταρα που αντιδρούν σε ένα αντιγόνο ανάκλησης Candida albicans MP65 εμφάνισαν παρόμοιες συχνότητες σε όλους τους δότες (Εικόνα 1j), αποκλείοντας την πιθανότητα γενικής προκατάληψης προς υψηλότερες συχνότητες αντιδραστικών στο αντιγόνο Τ κυττάρων σε ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

Συλλογικά, τα δεδομένα μας που δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων και τις μεθόδους ARTE δείχνουν επέκταση του ειδικού για αυτοαντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα σε ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Και οι δύο τεχνικές είναι συγκρίσιμες όπως υποδεικνύεται από παρόμοιες διάμεσες τιμές δείκτη διέγερσης μεταξύ αποκρίσεων Τ-λεμφοκυττάρων διεγερμένων από αντιγόνο και μη διεγερμένων (διάμεσος δείκτης διέγερσης-Βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων: 1.857; ARTE: 1.614; P ¼ 0.33), αν και η τεχνική ARTE αποκάλυψε υψηλότερες συχνότητες αντιδρώντος με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συν Τ κύτταρα σε σχέση με την τεχνική βιβλιοθήκης Τ-κυττάρων (Εικόνα 1k).

Cistancheμπορεί να βελτιώσει τη μόλυνση τουνεφρό.

Τα πυρηνικά αντιγονικά αντιδρώντα Τ κύτταρα σε υγιή άτομα είναι αξιόπιστα αυτοαντιδραστικά CD4^συνΤ κύτταρα

Τόσο η βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων όσο και οι τεχνικές ARTE έδειξαν την ανίχνευση τουαυτοαντιδραστικήT κύτταρασε υγιή άτομα, τα οποία αντιπροσωπεύουν πιθανή προέλευση για την ανάπτυξη της ανθρώπινης αυτοανοσίας. Ωστόσο, ο αριθμός τους δεν ήταν σημαντικά διαφορετικός από τις συχνότητες υποβάθρου, αφήνοντας αβέβαιο εάν τα υγιή άτομα πρέπει πράγματι να κυκλοφορούν αντιδρώντα με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα. Για να αποκαλύψουμε την εξειδίκευση σε αντιγόνο των αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων σε υγιή άτομα, δημιουργήσαμε μεμονωμένους κλώνους Τ-κυττάρων από το CD154^συνCD69^συνCD4^συνΠρόδρομοι κυτταρικών κυττάρων που απομονώθηκαν από υγιή άτομα μετά από διέγερση των PBMCs με μεμονωμένα πυρηνικά αντιγόνα και ένα αντιγόνο ελέγχου που προέρχεται από το προϊόν λύσης Aspergillus fumigatus. Ένας σημαντικός αριθμός απόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-σχετιζόμενοι ειδικοί για αυτοαντιγόνο κλώνοι Τ-κυττάρων ανταποκρίθηκαν στα αντίστοιχα αντιγόνα τους μετά από επαναδιέγερση αντιγόνου όπως τονίζεται από τη συνέκφραση της IFN-g με το CD154 (αριθμός ειδικών κλώνων-Aspergillus fumigatus: 5 από 5, SmD1: 4 από 8, RNP70: . από 11· ιστόνη: 5 από 5· Ro: 4 από 9· La: 5 από 7) (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A και B). Επιπλέον, η απόκριση αντιγόνου (αντιπροσωπευτικά παρουσιάζεται για το SmD1) ήταν δοσοεξαρτώμενη, τονίζοντας ότι τα αντιδρώντα με πυρηνικό αντιγόνο Τ κύτταρα σε υγιή άτομα είναι αξιόπιστα αυτοαντιδραστικά CD4^συνΤ κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα S2C). Έτσι, επιβεβαιώσαμε την ύπαρξη Τ-λεμφοκυττάρων που αντιδρούν με πυρηνικό αντιγόνο σε υγιή άτομα εντός του σήματος υποβάθρου των εφαρμοζόμενων μεθόδων ανίχνευσης.

Παραγωγή κυτοκίνης αντιδρώντων με πυρηνικό αντιγόνο CD4 συν Τ κύτταρα

Στη συνέχεια εξετάσαμε την παραγωγή κυτοκίνης του αντιδρώντος με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα. Κύτταρα που εκφράζουν CD{0}}χρωματίστηκαν ενδοκυτταρικά για κυτοκίνες τελεστές όπως IFN-g, ιντερλευκίνη (IL)-17, IL-4 και IL-10 μετά από διέγερση με δεξαμενήσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-σχετιζόμενα πυρηνικά αντιγόνα (Εικόνα 2α). Συχνότητες IFN-g–, IL-17– και IL-10–που παράγουν CD154^συνCD4^συνΤα Τ κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά σε ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης(όλες οι κυτοκίνες: P ¼ {{0}}.004), ενώ η συχνότητα των αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων που παράγουν IL-4 παρέμεινε αδιάκριτη από τη συχνότητα υποβάθρου (P ¼ 0,125) (Εικόνα 2β). Επιπλέον, οι απόλυτοι αριθμοί αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων που παράγουν IFN-g– και IL-10 ήταν υψηλότεροι σε ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςπαρά σε υγιή άτομα και ασθενείς με ανενεργούςσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης(Εικόνα 2β). Αφαιρώντας τις συχνότητες φόντου, οι ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκος ερυθηματώδηςείχαν σημαντικά υψηλότερες συχνότητες αυτοαντιδραστικών Τ κυττάρων που παράγουν IFN-g– και IL{-10 από ότι τα υγιή άτομα (IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004) καθώς και των IFN-g–, IL-17– και IL-10–που παράγουν αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα από ότι οι ασθενείς με ανενεργάσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00 2; IL-10: P ¼ 0.005) (Εικόνα 2γ). Επιπλέον, η συχνότητα των αντιδρώντων Τ κυττάρων IFN-g– και IL-10– αλλά όχι της IL-17– και της IL{13}}–που παράγουν πυρηνικό αντιγόνο– συσχετίζεται με τη δραστηριότητα της νόσου. Ωστόσο, μόνο η συχνότητα των κυττάρων που παράγουν IL-4 έδειξε μικρότερη συσχέτιση με τη δραστηριότητα της νόσου (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574·="" il{{20}="" }:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889,="" il{-4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717·="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6977)="" (εικόνα="" 2d).="" κρίνεται="" από="" τη="" συχνότητα="" των="" παραγωγών="" ifn-g,="" το="" cd4="" που="" αντιδρά="" στο="">^συνΤα Τ κύτταρα ήταν κυρίως της σειράς Th1. Αντίθετα, το IL-17, καθώς και οι παραγωγοί IL-10, ανιχνεύθηκαν μόνο σε χαμηλότερες συχνότητες.26 Σε σύγκριση με τα επίπεδα αυτοαντισωμάτων, οι συχνότητες του CD4 που παράγει κυτοκίνη^συνΤα Τ κύτταρα δεν συσχετίστηκαν με τη συγκέντρωση του αντι-δίκλωνου DNA και με τον τίτλο ορού των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (Συμπληρωματικό Σχήμα S3A και B). Καμία άλλη συσχέτιση μεταξύ αντιδρώντος με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΠαρατηρήθηκαν Τ κύτταρα και αυτοαντισώματα εκτός από το La-αντιδραστικό CD4^συνΤ κύτταρα προς τα αυτοαντισώματα La (Συμπληρωματικό Σχήμα S3C).

Ανίχνευση πυρηνικών αντιγόνων αντιδραστικών CD4 συν Τ κυττάρων στα ούρα ασθενών με ενεργό συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και νεφρίτιδα λύκου

Ο πληθυσμός των κυττάρων Th1 που αντιδρούν με πυρηνικό αντιγόνο υπάρχει υποψία ότι εισβάλλει στονεφρόιστό, όπου μπορεί να συναντήσουν το σχεδόν πανταχού παρόν συγγενές αντιγόνο τους. Διερευνώντας το ρεπερτόριο του υποδοχέα Τ-κυττάρων (TCR)-b του CD4^συνΤα Τ κύτταρα που απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα σε σύγκριση με αυτά που απομονώθηκαν από τα ούρα 5 ασθενών μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςκαι ενεργόλύκοςνεφρίτιδα, παρατηρήσαμε ένα ολιγοκλωνικό λοξό TCR ρεπερτόριο κυττάρων που προέρχονται από ούρα (Εικόνα 3α). Η αθροιστική συχνότητα των 20 πιο άφθονων κλώνων Τ-κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα ούρα που αντιστοιχεί σε χαμηλότερο δείκτη ποικιλομορφίας (Συμπληρωματικό Σχήμα S4A). Για να ελέγξετε εάν αυτά τα κύτταρα επιδεικνύουν επίσης αντιδραστικότητα σε ένα σύνολοσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-σχετικά με πυρηνικά αντιγόνα, δημιουργήσαμε βιβλιοθήκες που αποτελούνται από CD4 ούρων^συνΤ κύτταρα που απομονώθηκαν από 3 ασθενείς μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςκαι ενεργόλύκοςνεφρίτιδα(Συμπληρωματικό Σχήμα S4B). CD4 ούρων^συν T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 συμπεριλήφθηκαν για την απαρίθμηση των CD4 των ούρων^συνΤ κύτταρα ειδικά για το μεμονωμένο πυρηνικό αντιγόνο. Παράλληλα με το CD4 των ούρων^συνΤ κύτταρα, η συχνότητα των αντιδρώντων με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΤα Τ κύτταρα στο περιφερικό αίμα προσδιορίστηκαν, επιτρέποντας μια άμεση σύγκριση των αντίστοιχων συχνοτήτων στα ίδια άτομα (Εικόνα 3β). Το βρήκαμε ανενεργόλύκοςνεφρίτιδα, τις συχνότητες του CD4 που αντιδρά με πυρηνικό αντιγόνο ούρων^συνΤα Τ κύτταρα ήταν υψηλότερα από αυτά του περιφερικού αίματος. Για να επιβεβαιώσουμε αυτήν την παρατήρηση, επισημάναμε ουρικά κύτταρα που απομονώθηκαν από 4 ενεργάλύκοςνεφρίτιδαδότες με ηλεκτριμιδυλεστέρα καρβοξυφθοροσκεΐνης και ανάμιξαν τα επισημασμένα κύτταρα με PBMC που ταιριάζουν με δότη για να επιτραπεί η άμεση σύγκριση των αντιδρώντων σε αντιγόνο κυττάρων σε 1 δοκιμασία χρησιμοποιώντας την τεχνική ARTE. Η συχνότητα του CD154^συνCD69^συνΤα Τ κύτταρα σε διεγερμένα και μη διεγερμένα δείγματα ουρικών και περιφερειακών κυττάρων αίματος ταιριασμένων με δότες χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί εάν τα αντιδρώντα στο πυρηνικό αντιγόνο Τ κύτταρα είναι εμπλουτισμένα στα ούρα ως υποκατάστατο τουνεφρόμε τον υπολογισμό του δείκτη διέγερσης (Εικόνα 3γ). Παρόλο που η βιβλιοθήκη ουρικών Τ-κυττάρων και οι μέθοδοι ARTE διέφεραν ως προς τον μέσο δείκτη διέγερσής τους σε σχέση με τα πυρηνικά αντιγόνα (δείκτης διέγερσης-βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων ούρων: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0.4) (Εικόνα 3δ) , ανάλυση της αυτοαντιδραστικότητας σε περιφερικό και ουρικό CD4^συν Τα Τ κύτταρα και από τις δύο μεθόδους (συνολικά n ¼ 7) επέδειξαν αυξημένο δείκτη διέγερσης ειδικού πυρηνικού αντιγόνου στα ούρα (P ¼ 0.0156) (Εικόνα 3e). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το CD4 αντιδρά με πυρηνικό αντιγόνο^συνΤα Τ κύτταρα εισβάλλουν και συσσωρεύονται στομολυσμένοςνεφρά. Έτσι, τοπική φλεγμονή ιστού σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςμπορεί να είναι ένα αντιγονοειδικό φαινόμενο και να ρυθμίζεται άμεσα από τη διήθησηαυτοαντιδραστικήT κύτταρα.

Για τη συνέχεια, για το Μέρος 2, κάντε κλικ εδώ.