Το Cistanche βελτιώνει τη λοίμωξη των νεφρών λόγω του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Για το Μέρος 1, κάντε κλικ εδώ.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η διακοπή της ανοχής έναντι των πυρηνικών αντιγόνων είναι το χαρακτηριστικό γνώρισμασυστήματος λύκοςερυθηματώδηςκαι εκτός από τα Β κύτταρα, τα αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα πιστεύεται ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στην παθογένειά τους. Ωστόσο, ως ανίχνευση (αυτο)ειδικού αντιγόνουCD4^συν Τα Τ κύτταρα εξακολουθούν να αποτελούν μια σημαντική πρόκληση στην έρευνα για την αυτοανοσία, μέχρι σήμερα, ελάχιστα είναι γνωστά για το αντιδραστικό με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

Πρόσφατα, νέες μέθοδοι για την ανίχνευση και την απαρίθμηση του ειδικού για το αντιγόνο CD4^συνΤα Τ κύτταρα έχουν αναπτυχθεί. Η προσέγγιση βιβλιοθήκης Τ-κυττάρων εκμεταλλεύεται την προηγούμενη πολυκλωνική επέκταση των Τ κυττάρων για να επιτρέψει την ανίχνευση σπάνιων κλώνων Τ-κυττάρων ειδικών για αντιγόνο. Αυτή η στρατηγική προσφέρει υψηλή ευαισθησία και επιτρέπει την εργασία με περιορισμένες ποσότητες κυττάρων. Χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική, μπορέσαμε να επιδείξουμε αντιδραστικά Τ κύτταρα έναντι 5 κανονικών πυρηνικών αντιγόνων σε ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Τα μειονεκτήματα της ανίχνευσης με βάση τη βιβλιοθήκη είναι, εκτός από το ότι είναι εντατικής εργασίας, ότι δεν μπορεί να αποκλειστεί η ανάπτυξη ή η απώλεια ορισμένων κλώνων κατά τη διάρκεια της φάσης επέκτασης και οι περιορισμένες επιλογές για φαινοτυπική ανάλυση των κυττάρων.

Η τυπική κυτταρομετρία των συναδέλφων περιορίζεται από τον αριθμό των ανιχνεύσιμων συμβάντων, που συνήθως περιορίζει την ανάλυση των δειγμάτων στον πληθυσμό με συχνότητες άνω του 0,01 τοις εκατό . Η παρατήρησή μας χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη Τ-κυττάρων αποκάλυψε ότι η συχνότητα του κυκλοφορούντος αυτοαντιδραστικού CD4^συνΤα Τ κύτταρα για ένα συγκεκριμένο αυτοαντιγόνο σε ασθενείς με έξαρση της νόσου ήταν w20 κύτταρα σε ένα εκατομμύριο κύτταρα, που αντιπροσωπεύει συχνότητα 0,002 τοις εκατό . ως εκ τούτου, η ανίχνευση του ειδικού για το αυτοαντιγόνο CD4^συνΤα Τ-κύτταρα με τη χρήση τυπικής, μη χειριζόμενης κυτταρομετρίας είναι σχεδόν αδύνατη. Bacher et al. εισήγαγε προεμπλουτισμό του CD4^συνΤ-κύτταρα που αντιδρούν σε συγκεκριμένα αντιγόνα πριν από την απόκτηση σε συναδέλφους κυτταρομετρία, γνωστή ως μέθοδος ARTE. Υιοθέτηση αυτής της προσέγγισης για την ανίχνευση ειδικού για πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα, μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματά μας και να δείξουμε την επέκταση του πυρηνικού αντιγόνου αντιδρώντος CD4^συνΤ κύτταρα σε ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Συγκεκριμένα, η συχνότητα των Τ-λεμφοκυττάρων που αντιδρούν με την τρανσθυρετίνη και το C. Albicans ήταν αδιάφορη μεταξύ υγιών μαρτύρων και ασθενών μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςμε ποικίλη δραστηριότητα της νόσου. Επομένως, η παρατηρούμενη επέκταση τουαυτοαντιδραστικήT κύτταραείναι πιθανό να μην είναι αποτέλεσμα γενικής υπεραντιδραστικότητας ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςαλλά της επέκτασης των αντιγονοειδικών Τ κυττάρων.

οΣυστηματικός ερυθηματώδης λύκοςμολύνει τονεφρό, έτσι το cistanche χρησιμοποιείται για προστασίανεφρά.

Προηγούμενες αναφορές έχουν ήδη καταδείξει την ύπαρξηαυτοαντιδραστικήΤ κύτταρασεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, χρησιμοποιώντας κυρίως πολλαπλασιασμό, παραγωγή κυτοκίνης ή ανοδική ρύθμιση των δεικτών ενεργοποίησης, αν και χωρίς να μπορούμε να ποσοτικοποιήσουμε έναν σαφή πληθυσμό αυτών των κυττάρων. Τα καλύτερα στοιχεία σχετικά με τη συχνότητα των ειδικών για πυρηνικό αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρων υπάρχουν για αντιδραστικότητα έναντι της μικρής ριβονουκλεοπρωτεΐνης U1, ενός χαρακτηριστικού στόχου αυτοαντιγόνου στη μεικτή νόσο του συνδετικού ιστού και βρίσκεται μόνο σε ένα κλάσμα ασθενών μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. U1 μικρή πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη - αντιδραστική CD4^συνΤα Τ κύτταρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας περιοριστική αραίωση και Ένζυμο-Συνδεδεμένη Ανοσολογική Δοκιμασία Κηλίδων (ELISPOT) και αναφέρθηκε ότι εμφανίζονται σε συχνότητα (40 έως 250) 106 Τ κύτταρα και (20 έως 60) 106 PBMCs, αντίστοιχα, η οποία είναι παρόμοια μέγεθος ως η συχνότητα των αυτοαντιδραστικών κυττάρων στη μελέτη μας. Στην εργασία μας, διερευνήσαμε την αντιδραστικότητα έναντι πολλών χαρακτηριστικώνσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης-συσχετισμένα πυρηνικά αντιγόνα. Είναι ενδιαφέρον, αν και όλοι οι ασθενείς με ενεργό LN εμφάνισαν αυξημένες συχνότητες αντιπυρηνικού αντιγονο-αντιδραστικού CD4^συνΤ κύτταρα, οι ασθενείς διέφεραν ως προς το χαρτοφυλάκιο-στόχο τους και η αντιδραστικότητα στόχευε σε ένα ευρύτερο σύνολο αντιγόνων σε σύγκριση με ασθενείς με ανενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Η βιολογική σημασία αυτού είναι προς το παρόν άγνωστη. Διαφορετικό CD4^συνΗ αντιδραστικότητα των Τ κυττάρων μπορεί να σχετίζεται με ορισμένες κλινικές εκδηλώσεις διαφορετικών αντιδραστηρίων που μπορεί να είναι περιττές για την παθογένεση της νόσου.

Παρόμοια με άλλες αυτοάνοσες ασθένειες, μπορέσαμε επίσης να αποδείξουμε την ύπαρξη αυτοαντιδραστικού CD4^συνΤ κύτταρα σε υγιή άτομα, αν και σε πολύ χαμηλότερες συχνότητες σε σύγκριση με ασθενείς με ενεργό συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Αυτά τα κύτταρα ήταν μη ανιχνεύσιμα συγκρίνοντας τον αριθμό των ενεργοποιημένων κυττάρων με ή χωρίς διέγερση αντιγόνου, ακόμη και με τόσο ευαίσθητες τεχνικές όπως οι βιβλιοθήκες Τ-κυττάρων ή οι μέθοδοι ARTE. Ωστόσο, με κλωνοποίηση ενός κυττάρου, μπορέσαμε να δείξουμε ότι το σήμα "υπόβαθρου" περιείχε όντως CD4 ειδικό για αυτοαντιγόνο^συνΤ κύτταρα. Ποια συγκεκριμένα γεγονότα οδηγούν σε διάρρηξη της ανοχής και αύξηση της συχνότηταςαυτοαντιδραστικήT κύτταραπαραμένει κερδοσκοπικό? Ωστόσο, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η επέκταση των αυτοαντιδραστικών κλώνων παίζει ρόλο στην παθογένεση του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου.

Κυκλοφορούν πυρηνικό αντιγόνο-αντιδραστικό CD4^συνΤα Τ κύτταρα παρήγαγαν κυρίως IFN-g και, σε μικρότερο βαθμό, IL-17 και IL-10. Αυτό το προφίλ κυτοκίνης μαζί με την ασθενή/καμία συσχέτιση με την παραγωγή αυτοαντισωμάτων υποδηλώνει ότι ο ρόλος του πυρηνικού αντιγόνου αντιδρώντος CD4^συνΤα Τ κύτταρα μπορεί να μην είναι ο αποκλειστικός πάροχος βοήθειας Β κυττάρων. Η IFN-g έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη στην παθογένεση του LN. Τα κύτταρα Th1 έχουν αποδειχθεί ότι στρατολογούνται στομολυσμένος νεφρόιστός σεσυστήματος λύκοςερυθηματώδης, καθιστώντας τα αντιδρώντα με πυρηνικό αντιγόνο Τ κύτταρα πρωταρχικά υποψήφια για εισβολή στονεφρά, όπου θα συναντούσαν το πανταχού παρόν συγγενές αυτοαντιγόνο τους. Τα κύτταρα Τ ούρων έχουν περιγραφεί προηγουμένως ότι αντικατοπτρίζουν τη δραστηριότητα της νόσου και αντικατοπτρίζουν τον φαινότυπο των ενδονεφρικών κυττάρων στο LN20,33. Έτσι, χρησιμοποιήσαμε Τ κύτταρα ούρων ως υποκατάστατο γιανεφρόΤ κύτταρα. Τα Τ κύτταρα ούρων αποκάλυψαν περιορισμένη μεταβλητότητα TCR, η οποία είναι σύμφωνη με τις παρατηρήσεις στονεφρόβιοψίες, υποδεικνύοντας εμπλουτισμό ορισμένων κλώνων Τ-κυττάρων στομολυσμένοςνεφρόιστός. Μεταξύ των Τ-λεμφοκυττάρων ούρων, μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε Τ κύτταρα αντιδρώντα με πυρηνικό αντιγόνο και η συχνότητά τους εμπλουτίστηκε σε σύγκριση με τα Τ κύτταρα της κυκλοφορίας. Κατά συνέπεια, φαίνεται πιθανό ότι τα πυρηνικά αντιγόνα αντιδρώντα κύτταρα συμμετέχουν άμεσα στη διάδοση της τοπικής βλάβης οργάνων.

Συνοπτικά, εδώ αποδεικνύουμε ότι το CD4 αντιδρά με πυρηνικό αντιγόνο^συνΤα Τ κύτταρα διαστέλλονται ανενεργάσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης; είναι φαινοτυπικά κυρίως Th1 T κύτταρα που παράγουν IFN-g και εισβάλλουνμολυσμένοςόργανα-στόχους όπως τονεφρό.

Το Cistanche μπορεί να αποφύγει τη μόλυνση στονεφρόεξαιτίαςσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Λεπτομερείς μέθοδοι δίνονται στο Συμπληρωματικό Υλικό.

Υποκείμενα και δείγματα αίματος και ούρων

Ελήφθησαν δείγματα αίματος από 17 υγιή άτομα, 12 ασθενείς με ανενεργούςσυστήματοςλύκος ερυθηματώδης(συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςβαθμολογία DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">συστήματοςλύκοςερυθηματώδης(συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςDAI score >10). Επιπλέον, ελήφθησαν δείγματα ούρων από 12 ασθενείς με ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςκαι LN. Όλα τα υποκείμενα είχαν δώσει τη συγκατάθεσή τους μετά από ενημέρωση βάσει της δεοντολογικής έγκρισης που έλαβε η επιτροπή θεσμικής αναθεώρησης και οι αρχές δεοντολογίας στο Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07, και EA 1/036/16 ). Τα PBMCs και τα ουρικά κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια βαθμίδα πυκνότητας FicollHypaque.

Αντισώματα και ακολουθεί κυτταρομετρία

Ανάλογα με τα πειράματα, αρκετά επιφανειακά μόρια χρωματίστηκαν σε διεγερμένα από αντιγόνο κύτταρα σε διαφορετικούς συνδυασμούς των ακόλουθων μονοκλωνικών αντισωμάτων: αντι-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 και -CD154. για τη διάκριση ζωντανών και νεκρών κυττάρων, το κιτ LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd.,Παισυστημικόςλύκοςερυθηματώδης, UK) χρησιμοποιήθηκε.

Για τη χρώση του ενδοκυτταρικού κυτταρικού διαμερίσματος, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 2 τοις εκατό (ο/ο) παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διαπερατοποιήθηκαν με BD FACS Διαπερατό Διάλυμα 2 (BD Biosciences, San Jose, CA). τα ακόλουθα αντιγόνα χρωματίστηκαν ενδοκυτταρικά χρησιμοποιώντας ένα τυπικό πρωτόκολλο: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 και IL-17.

Τα δείγματα ελήφθησαν σε BD FACSCanto II και BD LSRFortessa (BD Biosciences) ακολουθώντας τα κυτταρόμετρα στο Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin χρησιμοποιώντας το λογισμικό BD FACSDiva (BD Biosciences). Τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).

Προετοιμασία δεξαμενής αντιγόνου και αντιγόνου

Χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα αντιγόνα για να διεγείρουμε το CD4^συνΤ κύτταρα στην ανάλυση βιβλιοθήκης Τ κυττάρων: {{0}}.5 mg/ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 50 ng/ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SNRP70 (RNP70) (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0,5 mg/ml φυσικής πρωτεΐνης ανθρώπινης ιστόνης (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml ανθρώπινης SS - Ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη A/Ro (παρέχεται ευγενικά από την Euroimmun AG, Lübeck, Γερμανία), 0,5 mg/ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SS-B/La (παρέχεται ευγενικά από την Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Γερμανία), 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Γερμανία), 1 mg/ml PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Γερμανία) και 0,5 mg/ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης τρανσθυρετίνης (ATGen, Seongnam, Νότια Κορέα ).

Περιφερικές και ουρικές βιβλιοθήκες Τ-κυττάρων Το πρωτόκολλο για τη δημιουργία ενισχυμένων βιβλιοθηκών περιφερικών και ουρικών Τ-κυττάρων υιοθετήθηκε και προσαρμόστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.14 Brieflfly, 200,000 περιφερειακό CD4^συνΤ κύτταρα ή 500 έως 2000 CD4 ούρων^συνΤα Τ κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο CD4^συνMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα του CD4^συνΤο κλάσμα των Τ-κυττάρων ελέγχθηκε τακτικά χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ακολουθίας με βάση το CD3^συνCD4^συν expression, where the purity always reached >99 τοις εκατό και 70 τοις εκατό έως 75 τοις εκατό για δείγματα περιφερικού αίματος και ούρων, αντίστοιχα. Παράλληλα, κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο παρασκευάστηκαν συλλέγοντας κύτταρα CD3 από PBMCs μετά από εξάντληση με αντι-ανθρώπινα CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) και κρυοσυντηρήθηκαν. Μετά από 1 έως 2 εβδομάδες καλλιέργειας, κλάσματα ενισχυμένου CD4^συνΤα Τ κύτταρα κατανεμήθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων, ανάλογα με τον αριθμό των αντιγόνων που θα αναλυθούν. Πριν από τη διέγερση με τα αντιγόνα, τα κύτταρα ξεκουράστηκαν για τουλάχιστον 4 ημέρες. Την ημέρα της διέγερσης, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα αποψύχθηκαν και κατανεμήθηκαν στην καλλιέργεια Τ-κυττάρων σε αναλογία τουλάχιστον 1 αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο προς 100 CD4^συνΤ κύτταρα. CD4^συνΒιβλιοθήκες Τ-κυττάρων για αρνητικό μάρτυρα (μη διεγερμένα κύτταρα) και θετικό έλεγχο (κύτταρα διεγερμένα με SEB) περιλαμβάνονταν πάντα στα πειράματα. CD4^συν Τα Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με το αντιγόνο για 4 ημέρες και ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο [3Η]-θυμιδίνης.

Οι ενισχυμένοι βλάστες Τ-κυττάρων ανταποκρίθηκαν διαφορετικά στα αντιγόνα που εμφανίστηκαν με εξαιρετικά ετερογενή CPM σπινθηρισμού. Ως εκ τούτου, ήταν απαραίτητη μια κανονικοποίηση του ορίου πολλαπλασιασμού που προσδιορίστηκε ως βαθμολογία z για τον δότη. Η βαθμολογία z υπολογίστηκε ως 5 διαφορές του 75ου και του 25ου εκατοστημόριου πάνω από το διάμεσο CPM των μη διεγερμένων μικροκαλλιεργειών. Κύτταρα σε μικροκαλλιέργειες που διεγέρθηκαν με SEB χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι μικροκαλλιέργειες με δείκτη διέγερσης SEB του<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">^συνΤα Τ κύτταρα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας αριθμούς αρνητικών μικροκαλλιεργειών σύμφωνα με την κατανομή Poisson και εκφράστηκαν ανά 1 εκατομμύριο κύτταρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η χρήση της κατανομής Poisson βασίζεται στην πιθανότητα τουλάχιστον 1CD4^συνΤο Τ κύτταρο υπάρχει σε μία μόνο μικροκαλλιέργεια βιβλιοθηκών Τ-κυττάρων όταν το ραδιενεργό σήμα ανιχνεύθηκε μετά από ειδική για αντιγόνο διέγερση.

Περιφερικές και ουρικές μεθόδους ARTE ακολουθήσαμε το πρωτόκολλο που χρησιμοποιεί το κιτ CD154 MicroBead (Miltenyi Biotec GmbH). Εν συντομία, τα κύτταρα διεγέρθηκαν για 7 ώρες με αντιγόνα και στη συνέχεια επισημάνθηκαν με αντισώματα αντι-ανθρώπινης CD154-βιοτίνης και μικροσφαιρίδια κατά της βιοτίνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επισημασμένα κύτταρα φορτώθηκαν σε βαθμονομημένες στήλες MS (Miltenyi Biotec GmbH) για να εμπλουτιστούν κύτταρα που εκφράζουν CD154-. Η επισήμανση των κυττάρων με διοξική καρβοξυφθοροσκεΐνη Ν-ηλεκτριμιδυλεστέρα (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) έγινε σύμφωνα με ένα τυπικό πρωτόκολλο.

Το Cistanche βελτιώνεταινεφρόλειτουργίες.

Δημιουργία μονοκυτταρικών κλώνων

Κλώνοι μονοκυττάρου δημιουργήθηκαν από κύτταρα αντιδρώντα με αντιγόνο, τα οποία εμπλουτίστηκαν με έκφραση CD154 ακολουθώντας το πρωτόκολλο ARTE. Κύτταρα που εκφράζουν CD{3}}διηθήθηκαν με ένα φίλτρο παρασκευής 30-mm (Miltenyi Biotec GmbH) και επαναιωρήθηκαν σε 1 ml 20 τοις εκατό (v/v) ψυχρό φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά, 0,5 αλβουμίνη ορού βοοειδών και 2 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ. Τα κύτταρα ήταν μεμονωμένα κύτταρα ταξινομημένα για το CD154^συνCD69^συνφαινότυπο, και μεμονωμένα διαλεγμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια πλακών 96-πηγαδιών παρουσία κυττάρων τροφοδοσίας. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν για 3 έως 4 ημέρες έως ότου ήταν ορατοί αρκετοί κλώνοι. Μία ημέρα πριν από την επαναδιέγερση, τα κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο αποψύχθηκαν και κατανεμήθηκαν στην καλλιέργεια Τ-κυττάρων σε αναλογία

τουλάχιστον 1 αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο σε 100 CD4^συνΤ κύτταρα. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 1 mg/ml αντιγόνου και οι μη διεγερμένοι κλώνοι χρησίμευσαν ως αρνητικός έλεγχος.

Ανάλυση ρεπερτορίου TCR με βάση την αλληλουχία επόμενης γενιάς

Το γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από το περιφερειακό CD4^συνΤ κύτταρα και ουρικά κύτταρα χρησιμοποιώντας το AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Ολλανδία). Ο ανασυνδυασμένος τόπος TCR-b ενισχύθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι αναγνώσεις υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας IMSEQ και ίσοι κλωνότυποι συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν περαιτέρω.

Στατιστική

Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές δοκιμές με λογισμικό GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Εφαρμόστηκε προσαρμογή Bonferroni για πολλαπλές συγκρίσεις. Η δοκιμή Mann-Whitney U και η δοκιμή υπογεγραμμένης κατάταξης Wilcoxon χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα με ανεξάρτητο και εξαρτώμενο σύνολο δεδομένων, αντίστοιχα. Μετά την προσαρμογή Bonferroni για πολλαπλές συγκρίσεις, ο υπολογισμός των κρίσιμων τιμών P διορθώθηκε επειδή βασίζεται στον αριθμό των προγραμματισμένων συγκρίσεων. Τιμές P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">συστήματοςλύκοςερυθηματώδηςΤιμές DAI αντί για ταξινομημένες τιμές για την καλύτερη κατανόηση της συσχέτισης μεταξύ του αριθμού των κυττάρων και της δραστηριότητας της νόσου. Για ανάλυση συσχέτισης, τιμές P<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">^συνΤ κύτταρα, οι συχνότητες χωρίς φόντο ορίστηκαν ως μηδέν. Ένας μετασχηματισμός log(x þ 1) εφαρμόστηκε στο σύνολο δεδομένων όταν περιλάμβανε μηδενικές τιμές. Συμπληρωματικά δεδομένα ασθενών και στατιστικά δεδομένα είναι διαθέσιμα στους συμπληρωματικούς πίνακες S1 και S2.

Πυρηνικό αντιγόνο-αντιδραστικό CD4^συντα κύτταρα επεκτείνονται σε ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, παράγουν κυτοκίνες τελεστές και μολύνουν τανεφρά,το κιστάνχο μπορεί να προστατεύσει τονεφρά.

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Όλοι οι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Ευχαριστούμε τους Toralf Kaiser και Jenny Kirsch (Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) για τη βοήθεια με την κυτταρομετρία ροής και τη διαλογή κυττάρων. Υποστήριξη για αυτές τις μελέτες παρασχέθηκε με επιχορηγήσεις από το Deutsche Forschungsgemeinschaft εντός του Sonderforschungsbereich 650 στην GR και από επιχορηγήσεις από το Deutsche Gesellschaft für Nephrologie και το Πρόγραμμα Κλινικών Επιστημόνων του Charité–Universitätsmedizin του Βερολίνου και του Ινστιτούτου Υγείας του Βερολίνου στην PE.

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Συμπληρωματικό αρχείο (PDF)

Εικόνα S1. Αυτοαντιδραστικό πυρηνικό-ειδικό αντιγόνο CD4^συνΤα Τ κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο βιβλιοθήκης Τ κυττάρων. Εικόνα S2. CD154^συνCD69^συνCD4^συνΤα Τ-κύτταρα που απομονώνονται μετά από διέγερση με πυρηνικά αντιγόνα από υγιή άτομα είναι συγκεκριμένα για αντιγόνο CD4^συνΤ κύτταρα.

Εικόνα S3. Οι συχνότητες του αυτοαντιδραστικού CD4 που παράγει κυτοκίνη^συνΤα Τ κύτταρα συγκρίθηκαν με τον τίτλο των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (αντι-ΑΝΑ) (Α) και με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων DNA αντι-δικλώνου (anti-dsDNA) (Β).

Εικόνα S4. Πυρηνικό αντιγόνο-αντιδραστικό CD4^συνΤα Τ κύτταρα ανιχνεύθηκαν στα ούρα του ενεργούσυστήματοςλύκοςερυθηματώδηςασθενείς με LN.

Πίνακας S1. Κλινικά δεδομένα.

Πίνακας S2. Σύνοψη διάμεσων τιμών.

Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Μόλις τονεφρόέχει μολυνθεί λόγω του αντιδρώντος με πυρηνικό αντιγόνο CD4^συνκύτταρα που επεκτείνονται σε ενεργόσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης, ονεφρόη λειτουργία καταστρέφεται, το cistanche χρησιμοποιείται για βελτίωσηνεφρόλειτουργία.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted inσυστήματος λύκοςερυθηματώδηςσυγκεντρώνονται σε δύο πληθυσμούς επιφανειακών δομών σε αποπτωτικά κερατινοκύτταρα. J Εχρ Med. 1994, 179: 1317–1330.

2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Ανάπτυξη αυτοαντισωμάτων πριν από την κλινική έναρξη τηςσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.

3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. Τ κύτταρα σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Curr Opin Immunol. 2016; 43:32–38.

4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et αϊ. Πολλαπλασιασμός Τ-λεμφοκυττάρων ειδικός για αυτοαντιγόνο που προκαλείται από τη ριβοσωμική πρωτεΐνη P2 σε ασθενείς μεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. J Clin Invest. 1994; 94:345-352.

5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Αποκάλυψη του αυτοαντιδραστικού CD4^συνΤ κύτταρα με εξάντληση των CD25 ρυθμιστικών Τ κυττάρων σεσυστήματοςλύκοςερυθηματώδης. Ann Rheum Dis. 2011; 70: 2176-2183.

και τα λοιπά.