Οι πολυσακχαρίτες Cistanche Deserticola ανακουφίζουν τη γνωστική παρακμή και βελτιώνουν τη μνήμη σε γηρασμένα μοντέλα ποντικών

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Πρόσφατα στοιχεία υποδεικνύουν ότι αλλαγές στον άξονα μικροχλωρίδας του εντέρου-εγκεφάλου μπορεί να οδηγήσουν σε γνωστική εξασθένηση με τη γήρανση. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η παρατεταμένη χορήγηση D-γαλακτόζης σε ποντίκια προκάλεσε γνωστική έκπτωση, μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου, περιφερική φλεγμονή και οξειδωτικό στρες. Σε αυτό το μοντέλο γνωστικής έκπτωσης που σχετίζεται με την ηλικία, οι πολυσακχαρίτες Cistanche deserticola (CDPS) βελτίωσαν τη γνωστική λειτουργία σε ποντίκια που έλαβαν D γαλακτόζη αποκαθιστώντας τη μικροβιακή ομοιόσταση του εντέρου, μειώνοντας έτσι το οξειδωτικό στρες και την περιφερική φλεγμονή. Οι ευεργετικές επιδράσεις του CDPS σε αυτά τα γερασμένα μοντέλα ποντίκια καταργήθηκαν μέσω αφαίρεσης της μικροχλωρίδας του εντέρου με αντιβιοτικά ή ανοσοκαταστολής με κυκλοφωσφαμίδη. Τα μεταβολικά προφίλ ορού έδειξαν ότι τα επίπεδα της κρεατινίνης, της βαλίνης, της L-μεθειονίνης, της ο-Τολουιδίνης, της Ν-αιθυλανιλίνης, του ουρικού οξέος και της προλίνης άλλαξαν στα γηρασμένα μοντέλα ποντικών, αλλά αποκαταστάθηκαν από το CDPS. Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι το CDPS βελτιώνει τη γνωστική λειτουργία σε ένα μοντέλο γήρανσης που προκαλείται από D-γαλακτόζη σε ποντίκια αποκαθιστώντας την ομοιόσταση του άξονα του εγκεφάλου της μικροχλωρίδας του εντέρου, η οποία ανακούφισε μια ανισορροπία αμινοξέων, περιφερική φλεγμονή και οξειδωτικό στρες. Το CDPS δείχνει έτσι θεραπευτικές δυνατότητες για ασθενείς με διαταραχές μνήμης και μάθησης, ειδικά εκείνες που σχετίζονται με μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου.

Cistancheβότανο

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρατεταμένη χορήγηση αλάτων D-γαλακτόζης (D-gal) και βηρυλλίου προκαλεί γήρανση σε πειραματικά ζωικά μοντέλα και in vitro πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες και χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό μηχανισμών που διέπουν τη φυσική διαδικασία γήρανσης [1-4]. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η γνωστική έκπτωση σε ποντίκια-μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη σχετίζεται με μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης αυξητικού παράγοντα νεύρων (NGF) και αυξημένα είδη αντιδρώντος οξυγόνου (ROS) στον εγκέφαλο, τα οποία προκαλούν εκφυλισμό των νευρώνων του ιππόκαμπου και μειώνουν νευρογένεση [3, 4]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν επίσης ότι η σύνθεση και ο αριθμός της ανθρώπινης μικροχλωρίδας του εντέρου αλλάζει σημαντικά κατά τη διαδικασία της γήρανσης[5].

Το Cistanche deserticola είναι ένα βότανο που φύεται κυρίως στη βορειοδυτική περιοχή της ερήμου της Κίνας και χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Είναι κοινώς γνωστό ως το «τζίνσενγκ της ερήμου». Τα εκχυλίσματα Cistanche deserticola περιέχουν αρκετές φαρμακολογικά δραστικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων, ιριδοειδή, λιγνόζη, ολιγοσακχαρίτες, πολυσακχαρίτες και αμινοξέα. Αυτές οι ενώσεις συνδέονται με αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, αντιγηραντικές, νευροπροστατευτικές και ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες [6, 7]. Για παράδειγμα, οι πολυσακχαρίτες που εξάγονται από το Cistanche deserticola έχουν χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου [8]. Ένα ευρύ φάσμα ασθενώς τοξικών πολυσακχαριτών με χρήσιμες βιοδραστηριότητες έχει απομονωθεί από διάφορους οργανισμούς, όπως ο πολυσακχαρίτης Chuanqiong, ο πολυσακχαρίτης Ganoderma lucidum και ο πολυσακχαρίτης Lycium barbarum [9-11]. Το CDA 0.05 είναι μια γαλακτογλυκάνη που απομονώνεται από το Cistanche deserticola που προάγει την ανάπτυξη πολλών ευεργετικών εντερικών βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων αρκετών ειδών Bacteroides και Lactobacillus [12].

Οι υποκείμενοι μηχανισμοί της φυσιολογικής διαδικασίας γήρανσης εμπλέκονται επίσης σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες όπως οι νευροεκφυλιστικές διαταραχές, η στεφανιαία αθηροσκλήρωση, ο διαβήτης τύπου 2 (ΣΔ2) και η υπέρταση [13, 14]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι αλλαγές στην εντερική χλωρίδα παίζουν σημαντικό ρόλο στη γήρανση του ανθρώπου [15]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η παρατεταμένη χορήγηση D-γαλακτόζης σε πειραματικούς ποντικούς και αρουραίους μιμείται τη φυσιολογική διαδικασία γήρανσης και είναι ένα χρήσιμο μοντέλο για τη μελέτη φαινοτύπων που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως η γνωστική έκπτωση [16]. Επιπλέον, τα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη παρουσιάζουν αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου [17]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι οι αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου μπορεί να προκαλέσουν γνωστική έκπτωση στα γηρασμένα μοντέλα ποντικών που προκαλούνται από γαλακτόζη D και ερευνήσαμε εάν οι πολυσακχαρίτες Cistanche deserticola (CDPS) μπορεί να ανακουφίσουν τη γνωστική έκπτωση αποκαθιστώντας τη δυσβίωση της μικροχλωρίδας του εντέρου.

στέλεχος κιστάνι

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ποντίκια γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη παρουσιάζουν γνωστική έκπτωση και μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου

Αναλύσαμε τη συμπεριφορά των ποντικών άγριου τύπου (WT) και εκείνων που έλαβαν θεραπεία με 150 mg D-gal ανά κιλό σωματικού βάρους για 2 μήνες (μοντέλο ή Mod) χρησιμοποιώντας νέες δοκιμές αναγνώρισης αντικειμένων και υδατικού λαβύρινθου Morris (MWM). Οι προτιμησιακές τιμές του δείκτη στο νέο τεστ αναγνώρισης αντικειμένων μειώθηκαν σημαντικά στα ποντίκια της ομάδας Mod σε σύγκριση με τα ποντίκια της ομάδας WT (Εικόνα 1Α, 1Β). Τα αποτελέσματα της δοκιμής MWM έδειξαν ότι ο χρόνος καθυστέρησης διαφυγής μετά την έκτη ημέρα αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα Mod σε σύγκριση με την ομάδα WT (Εικόνα 1C, 1D). Επιπλέον, οι διασταυρώσεις της πλατφόρμας στόχου και οι χρόνοι κολύμβησης εντός του τεταρτημορίου στόχου μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα Mod σε σύγκριση με την ομάδα WT (Εικόνα 1Ε, 1ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν σημαντική μείωση στις ικανότητες μάθησης και μνήμης των ποντικών μοντέλων γήρανσης που προκλήθηκαν από το νόμο.

Στη συνέχεια, αναλύσαμε τις διαφορές στην αφθονία και τη σύνθεση των μικροβιακών φύλων, γενών και ειδών του εντέρου στα δείγματα κοπράνων των ομάδων Mod και WT ποντικών χρησιμοποιώντας δεδομένα αλληλουχίας 16S ριβοσωμικού RNA (rRNA) από δείγματα κοπράνων. Η κυρίαρχη εντερική χλωρίδα στα ποντίκια της ομάδας WT και Mod ήταν τα Firmicutes και Bacteroides. Ωστόσο, η αφθονία των Bacteroides μειώθηκε σημαντικά και η αφθονία των Firmicutes αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα Mod σε σύγκριση με την ομάδα WT (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ανάλυση γραμμικής διάκρισης (LDA) για να προσδιορίσουμε τις βαθμολογίες μεγέθους επίδρασης LDA (LEfSe) ακολουθούμενες από δοκιμές Kruskal-Wallis και Wilcoxon για να αξιολογήσουμε τη σχετική αφθονία διαφορετικών ταξινομικών κατηγοριών στους ποντικούς της ομάδας WT και Mod. Τα αποτελέσματα LDA φαίνονται στο Σχήμα 2Β. Επιπλέον, κατασκευάσαμε κλαδογράμματα που δείχνουν διαφορικό εμπλουτισμό διαφόρων γενών και ειδών που ανήκουν στη φυλή Bacteriodes και Firmicutes στις ομάδες WT και μοντέλα (Εικόνα 2C). Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν μειωμένη γνωστική ικανότητα και μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη.

Οφέλη για την υγεία του κιστάνι: αντιοξείδωση

Η θεραπεία CDPS βελτιώνει τη γνωστική ικανότητα στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-gal

Αναλύσαμε εάν η θεραπεία με CDPS ανακουφίζει τη γνωστική έκπτωση σε ποντίκια-μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-gal. Κατά τους 2 μήνες της χορήγησης, το σωματικό βάρος μετρούνταν κάθε δεύτερη μέρα. Τα σωματικά βάρη του μοντέλου και των ομάδων ποντικών CDPS ήταν παρόμοια (Εικόνα 3Α). Διεξάγετε πειράματα συμπεριφοράς μετά την τελευταία δόση. Η αναγνώριση νέων αντικειμένων και τα αποτελέσματα της δοκιμής υδάτινου λαβύρινθου Morris έδειξαν ότι η βραχυπρόθεσμη μνήμη ήταν σημαντικά υψηλότερη στις ομάδες ποντικών CDPS σε σύγκριση με την ομάδα ποντικιών μοντέλου. Η μακροπρόθεσμη μνήμη στην ομάδα ποντικών CDPS ήταν υψηλότερη αλλά στατιστικά ασήμαντη σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου ποντικών (Εικόνα 3Β, 3Γ). Αυτό υποδηλώνει ότι η θεραπεία με CDPS ακύρωσε την απώλεια βραχυπρόθεσμης μνήμης αναγνώρισης αντικειμένων σε ποντίκια που έλαβαν D-gal.

Η χωρική μάθηση και η μνήμη αυτών των ποντικών αξιολογήθηκαν με τη δοκιμή υδάτινου λαβύρινθου Morris και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι χρόνοι λανθάνουσας κατάστασης διαφυγής της ομάδας ποντικών CDPS ήταν συγκρίσιμοι με την ομάδα ποντικών WT και σημαντικά μικρότεροι από τους ομαδικούς ποντικούς Mod (Εικόνα 3D) . Επιπλέον, οι χρόνοι λανθάνοντος χρόνου διαφυγής ήταν σημαντικά χαμηλότεροι την έκτη ημέρα μετά τη χορήγηση CDPS σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου (Εικόνα 3Ε). Ο χρόνος κολύμβησης εντός του τεταρτημορίου στόχου ήταν σημαντικά υψηλότερος στις ομάδες CH και CM σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου. Η ομάδα CL είναι υψηλότερη από την ομάδα του μοντέλου αλλά δεν έχει στατιστική σημασία (Εικόνα 3F). Επιπλέον, ο αριθμός των διασταυρώσεων πλατφόρμας ήταν σημαντικά υψηλότερος στις ομάδες CM και CL σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων. Ωστόσο, η ομάδα CH είναι υψηλότερη από την ομάδα μοντέλου και δεν έχει στατιστική σημασία (Εικόνα 3G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CDPS βελτίωσε τη χωρική μάθηση και τη μνήμη στα μοντέλα γήρανσης που προκλήθηκαν από D-gal.

Εικόνα 1. Η παρατεταμένη χορήγηση D-γαλακτόζης προκαλεί εξασθένηση της μάθησης και της μνήμης σε ποντικούς.

Εικόνα 2. Η παρατεταμένη χορήγηση D-γαλακτόζης προκαλεί μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου σε ποντικούς.

Η θεραπεία CDPS αποκαθιστά την ομοιόσταση της σύνθεσης της μικροχλωρίδας του εντέρου στα ποντίκια μοντέλου γήρανσης D-γαλακτόζης

Οι μονοσακχαρίτες και οι πολυσακχαρίτες είναι τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά που απαιτούνται για την ανάπτυξη των βακτηρίων [18-21]. Αναφέρεται επίσης ότι το CDPS ρυθμίζει τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου [22]. Επομένως, αναλύσαμε εάν οι θεραπείες CDPS ανακούφισαν τη μικροβιακή δυσβίωση του εντέρου στα ποντίκια της ομάδας μοντέλου αξιολογώντας τα δεδομένα αλληλουχίας 16S rRNA δειγμάτων κοπράνων από τις ομάδες ποντικών WT, μοντέλου και CDPS.

Πρώτον, υπολογίσαμε τους δείκτες άλφα ποικιλομορφίας για να αξιολογήσουμε τον συνολικό πλούτο της μικροχλωρίδας των κοπράνων και τη δομική διαφορά μεταξύ αυτών των ομάδων. Αναλύσαμε τους δείκτες άλφα ποικιλομορφίας (-ποικιλομορφία), όπως τα παρατηρούμενα είδη, τις τιμές του δείκτη Shannon, Chao 1, ACE και Simpson για να προσδιορίσουμε τις αλλαγές στη σύνθεση διαφόρων βακτηριακών ειδών στα δείγματα κοπράνων διαφορετικών ομάδων ποντικού. Οι δείκτες ποικιλομορφίας (παρατηρηθέντα είδη, δείκτες Shannon, Chao 1, ACE και Simpson) ήταν υψηλότεροι στις ομάδες ποντικών WT και CDPS σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, αλλά παρατηρήθηκε στατιστική σημασία μόνο για τις τιμές του δείκτη Chao 1 μεταξύ των CM ομάδα και ομάδα Mod. Έδειξε ότι η χορήγηση με CDPS αυξάνει τον πλούτο του μικροβιώματος (Εικόνα 4Α-4Ε). Στη συνέχεια, αναλύσαμε δείκτες ποικιλομορφίας για να εντοπίσουμε διαφορές στα μικροβιακά είδη του εντέρου μεταξύ των ομάδων ποντικών WT, μοντέλου και CDPS χρησιμοποιώντας μη μετρική πολυδιάστατη κλίμακα (NMDS), ανάλυση βασικών συντεταγμένων (PCoA) και ανάλυση βασικών συστατικών (PCA) . Το PCA έδειξε παραλλαγές στη μικροβιακή σύνθεση του εντέρου των ποντικών της ομάδας μοντέλου κατά τη διάρκεια της διαδικασίας γήρανσης, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης της διάστασης και της διατήρησης προτύπων και τάσεων (Εικόνα 4ΣΤ). Οι διαφορές στη μικροχλωρίδα των κοπράνων μεταξύ των ομάδων WT, μοντέλου και CDPS προσδιορίστηκαν με βάση το PCoA των μη σταθμισμένων αποστάσεων UniFrac για τα γονίδια 16S rRNA (Εικόνα 4G). Η ανάλυση ομαδοποίησης έδειξε σημαντικές διαφορές στο NMDS μεταξύ της ομάδας μοντέλου και των ομάδων WT και CDPS (Εικόνα 4Η).

Αξιολογήσαμε τις 10 κορυφαίες φυλές της μικροχλωρίδας του εντέρου και βρήκαμε ότι η αφθονία της φυλής Bacteroides ήταν σημαντικά υψηλότερη στις ομάδες CH, CM και CL σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου (Εικόνα 4I). Αυτό υποδηλώνει ότι το CDPS αποκατέστησε την ομοιόσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου σε ποντίκια που έλαβαν D-gal. Τα cladograms έδειξαν διαφορικό εμπλουτισμό διαφόρων γενών και ειδών που ανήκουν σε Bacteriodes και Firmicutes phyla στις ομάδες WT, μοντέλο και CDPS (Εικόνα 4J). Όπως φαίνεται στους χάρτες θερμότητας, οι θεραπείες CDPS μείωσαν τη σχετική αφθονία Θερμοπλασμάτων, Βάκιλλων, μη αναγνωρισμένων Actinobacteria, Fusobacteriia και μη αναγνωρισμένων Elusimicrobia και αύξησαν τη σχετική αφθονία Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, unidentified{5}Nibacterias,Decuteréaeros. ,Ερυσιπελοτριχία και μη αναγνωρισμένα_Κυανοβακτήρια σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων (Εικόνα 4Κ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με CDPS αποκατέστησε σημαντικά την ομοιόσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου στα μοντέλα γήρανσης που προκλήθηκαν από D-gal.

Εικόνα 3. Η θεραπεία CDPS βελτιώνει τη μάθηση και τη μνήμη στα ποντίκια μοντέλου γήρανσης D-gal.

Η θεραπεία με CDPS ανακουφίζει από τον νευροεκφυλισμό στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-gal μειώνοντας το οξειδωτικό στρες

Στη συνέχεια αναλύσαμε τις επιδράσεις του CDPS στη φλεγμονή αναλύοντας τα επίπεδα στον ορό των προφλεγμονωδών κυτοκινών (IL-2 και TNF- ) και των αντιφλεγμονωδών κυτοκινών (IL-4 και IL-10 ) σε διαφορετικές ομάδες ποντικών. Τα επίπεδα ορού IL-2 και TNF- ήταν σημαντικά χαμηλότερα και τα επίπεδα ορού IL-4 και IL-10 ήταν σημαντικά υψηλότερα στις ομάδες CH, CM και CL σε σύγκριση με το μοντέλο ομάδα. Αποδεικνύεται ότι το CDPS έχει αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα (Εικόνα 5A–5D).

Το οξειδωτικό στρες προκαλείται από την αυξημένη παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) και είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που προάγουν τη γήρανση [23]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τις επιδράσεις του CDPS στο οξειδωτικό στρες στο μοντέλο γήρανσης ποντικού που προκαλείται από D-gal αξιολογώντας τα επίπεδα ορού του αντιοξειδωτικού ενζύμου, SOD, και του προϊόντος υπεροξείδωσης λιπιδίων, της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA). Τα επίπεδα του MDA στον ορό ήταν σημαντικά υψηλότερα και τα επίπεδα του SOD στον ορό μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα Mod σε σύγκριση με την ομάδα WT, αλλά η θεραπεία με CDPS ανέστρεψε αυτές τις επιδράσεις (Εικόνα 5Ε, 5ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το οξειδωτικό στρες ήταν αυξημένο στα μοντέλα γήρανσης που προκλήθηκαν από D-gal, αλλά μειώθηκε με τη θεραπεία με CDPS.

Επιπλέον, αξιολογήσαμε τα επίπεδα οξειδωτικού στρες στους ιστούς του εγκεφάλου αναλύοντας τα επίπεδα του προηγμένου προϊόντος οξειδωμένης πρωτεΐνης (AOPP), της άμεσης υπεροξείδωσης λιπιδίων (LPO) και του MDA καθώς και των δραστηριοτήτων αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GSH-Px). ) και η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) στον εγκεφαλικό ιστό ομογενοποιείται. Οι εγκέφαλοι των ποντικών της ομάδας Mod εμφάνισαν σημαντικά μειωμένες δραστηριότητες SOD και GSH-PX και σημαντικά αυξημένα επίπεδα AOPP, LPO και MDA σε σύγκριση με την ομάδα WT, αλλά αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν στην ομάδα CH, CM και CL (Εικόνα 6Α- 6Ε).

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ιστολογική χρώση τμημάτων εγκεφάλου με χρώσεις H&E και Nissl για να αξιολογήσουμε τις προστατευτικές επιδράσεις του CDPS στους εγκεφάλους ποντικών μοντέλων γήρανσης που προκαλούνται από D-gal. Τα ποντίκια της ομάδας Mod παρουσίασαν σημαντική μείωση στον αριθμό και τον όγκο των νευρώνων, αυξημένο χάσμα μεταξύ των νευρώνων, ακανόνιστη διάταξη των νευρώνων και πυρηνική πύκνωση στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου σε σύγκριση με την ομάδα WT, αλλά αυτές οι παθολογικές αλλαγές μειώθηκαν σημαντικά από τις θεραπείες CDPS ( Εικόνα 6ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι θεραπείες CDPS μείωσαν σημαντικά το οξειδωτικό στρες και την παθολογία του εγκεφάλου στα μοντέλα γήρανσης που προκλήθηκαν από D gal.

Εικόνα 4. Η θεραπεία CDPS αποκαθιστά τη μικροβιακή σύνθεση του εντέρου στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη.

Η θεραπεία CDPS μειώνει την περιφερική φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες διατηρώντας τη μικροβιακή ομοιόσταση του εντέρου σε μοντέλα ποντίκια που προκαλούνται από D-gal

Στη συνέχεια, αναλύσαμε εάν οι αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου συσχετίστηκαν με αυξημένη περιφερική φλεγμονή και οξειδωτικό στρες κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Προς αυτή την κατεύθυνση, χρησιμοποιήσαμε ένα κοκτέιλ τριπλού αντιβιοτικού (ομάδα ABX) ή κυκλοφωσφαμίδιο (ομάδα Cy, βλέπε επίσης Υλικά και μεθόδους) για να αφαιρέσουμε τη μικροχλωρίδα του εντέρου ή να προκαλέσουμε ανοσοκαταστολή στα γηρασμένα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με CDPS. Η αντιβιοτική θεραπεία ακύρωσε τα ευεργετικά αποτελέσματα της θεραπείας με CDPS στα γερασμένα μοντέλα ποντικών. Παρατηρήσαμε εξασθενημένη μάθηση και μνήμη (Εικόνα 7Α) και αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου (Εικόνα 7Β, 7Γ) στα ποντίκια της ομάδας ABX σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε θεραπεία με CDPS. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι ακόμη και η χορήγηση CDPS δεν μπορεί να αυξήσει την ικανότητα μάθησης και μνήμης των ποντικών μετά την αλλαγή της εντερικής χλωρίδας. Επιπλέον, παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών στον εγκέφαλο και στον ορό ποντικών της ομάδας ABX σε σύγκριση με την ομάδα CDPS (Εικόνα 7D-7N). Τα αποτελέσματα της ομάδας ABX και της ομάδας CY έδειξαν ότι μετά την καταστροφή της εντερικής χλωρίδας και της ανοσολογικής λειτουργίας, ακόμη και η χορήγηση CDPS δεν μπορούσε να βελτιώσει τη μάθηση και την ικανότητα μνήμης των ποντικών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία με CDPS μείωσε την περιφερική φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και τη γνωστική έκπτωση στα ποντίκια μοντέλου γήρανσης που προκλήθηκε από το νόμο, αποτρέποντας τη δυσβίωση του εντέρου.

Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το ανοσοκατασταλτικό φάρμακο, κυκλοφωσφαμίδη [24] για να προσδιορίσουμε τον ρόλο της φλεγμονής στις ευεργετικές επιδράσεις του CDPS. Τα ποντίκια CDPS που έλαβαν αγωγή με κυκλοφωσφαμίδη (ομάδα Cy) εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα μάθησης και μνήμης, αλλοιώσεις στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και ανώμαλα επίπεδα προ- και αντιφλεγμονωδών κυτοκινών στον εγκέφαλο και στον ορό σε σύγκριση με τα ποντίκια άγριου τύπου και της ομάδας CDPS. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία σημασία σε σύγκριση με το μοντέλο και την ομάδα ABX. (Εικόνα 7Α–7Ν). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι οι αλλαγές στη σύσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου αυξάνουν την περιφερική φλεγμονή στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-gal.

Σχήμα 5. Η θεραπεία με CDPS ρυθμίζει τα κυκλοφορούντα επίπεδα προ- και αντιφλεγμονωδών κυτοκινών και παραγόντων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη.

Το CDPS αποτρέπει τη γήρανση που προκαλείται από το D-gal ρυθμίζοντας το μεταβολισμό των αμινοξέων

Το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή επηρεάζεται από μεταβολίτες που παράγονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου [25]. Οι μεταβολίτες των κοπράνων αντιπροσωπεύουν μια λειτουργική ανάγνωση του μικροβιακού μεταβολισμού του εντέρου και της μικροβιακής σύνθεσης του εντέρου[26]. Επιπλέον, οι μεταβολίτες της μικροχλωρίδας του εντέρου εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος και επηρεάζουν το μεταβολισμό και την υγεία του ξενιστή [26, 27]. Συνολικά 1058 μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν σε δείγματα ορού από ποντικούς FWT, Mod και CDPS. Στη συνέχεια, αναλύσαμε αυτούς τους μεταβολίτες χρησιμοποιώντας BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) και Human Metabolome Database (HMDB) και βρήκαμε ότι 65 μεταβολίτες εκφράστηκαν διαφορετικά στην ομάδα Mod σε σύγκριση με την ομάδα WT. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα 8 μεταβολιτών (κρεατινίνη, βαλίνη, L-(-)-Μεθειονίνη, ο-Τολουιδίνη, Ν Αιθυλανιλίνη, ουρικό οξύ, προλίνη και φαινυλαλανίνη) διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων WT, Mod και CDPS. Η ανάλυση εμπλουτισμού οδού αυτών των 8 μεταβολιτών χρησιμοποιώντας το MetaboAnalyst [28, 29] έδειξε ότι αυτοί οι μεταβολίτες σχετίζονται με τον μεταβολισμό αργινίνης, ιστιδίνης, αργινίνης, προλίνης και πουρίνης (Εικόνα 8Α, 8Β). 7 διαφορετικοί μεταβολίτες της ομάδας MOD και της ομάδας CDPS στην ομάδα WT.

Στη συνέχεια, αναλύσαμε εάν οι αλλαγές στον μεταβολισμό των αμινοξέων σχετίζονται με αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου. Παρατηρήσαμε ότι 7 διαφορετικοί μεταβολίτες των ομάδων WT, Mod και CDPS (κρεατινίνη, βαλίνη, L-(-)-Μεθειονίνη, ο-Τολουιδίνη, Ν-Αιθυλανιλίνη, ουρικό οξύ και προλίνη) μειώθηκαν σημαντικά στα ABX, Cy, και ομάδες Mod σε σύγκριση με τις ομάδες WT και CDPS. Επιπλέον, δεν υπάρχει καμία σημασία μεταξύ των ομάδων ABX και Cy (Εικόνα 8C). Τέλος, προκειμένου να διερευνηθεί υπάρχει μια συσχέτιση μεταξύ του διαφορικού μεταβολισμού και άλλων ασθενειών που σχετίζονται με τη γήρανση. Αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ αυτών των επτά διαφορικά εκφραζόμενων μεταβολιτών και των ανθρώπινων ασθενειών χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων MetaboAnalyst και βρήκαμε ότι αυτοί οι μεταβολίτες συσχετίστηκαν με τη νόσο του Αλτσχάιμερ (p=0.00173; Εικόνα 8D, 8E). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το CDPS προστατεύει από τη γήρανση που προκαλείται από το D-gal ρυθμίζοντας το μεταβολισμό των αμινοξέων.

Εικόνα 6. Η θεραπεία με CDPS μειώνει το οξειδωτικό στρες στους εγκεφάλους ποντικιών γήρανσης που προκαλούνται από D-γαλακτόζη

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η προοδευτική μείωση της γνωστικής λειτουργίας είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της γήρανσης. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία με CDPS βελτίωσε σημαντικά τη μάθηση και τη μνήμη στα γερασμένα μοντέλα ποντικών [30-33]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η θεραπεία με CDPS βελτίωσε τη γνωστική λειτουργία αναστέλλοντας την περιφερική φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες μέσω της αποκατάστασης της μικροβιακής ομοιόστασης του εντέρου στα μοντέλα γήρανσης που προκαλούνται από D-gal (Εικόνα 9). Οι αρουραίοι Sprague-Dawley που τράφηκαν με πολυσακχαρίτες Cistanche εμφάνισαν αυξημένη ανάπτυξη ωφέλιμων βακτηρίων του εντέρου και ενισχυμένη μικροβιακή ποικιλομορφία του εντέρου [34]. Το CDA-0.05, ένας ουδέτερος πολυσακχαρίτης Cistanche, βελτίωσε την ανάπτυξη των προβιοτικών Lactobacilli [22]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι πολυσακχαρίτες Cistanche βελτίωσαν την ομοιόσταση των βακτηρίων του εντέρου.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το CDPS έχει αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα και βελτιώνει τη γνωστική ικανότητα των γηρασμένων ποντικών μοντέλων ρυθμίζοντας την αφθονία των βακτηριακών γενών του εντέρου όπως τα Bacteroidetes, Firmicutes και Proteobacteria. Ως εκ τούτου, τα CDPs μπορεί να είναι θεραπευτικά ωφέλιμα για ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση, αναδιαμορφώνοντας τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου [35,36]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτοκινών στον ορό και το κόλον σχετίζονται με τη σχετική αφθονία βακτηριακών γενών όπως Bacteroidetes, Firmicutes και Proteobacteria [37, 38]. Επιπλέον, η μικροβιακή σύνθεση του εντέρου ρυθμίζει τη λειτουργία του εγκεφάλου ρυθμίζοντας τα κυκλοφορούντα επίπεδα αρκετών κυτοκινών [39-43]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία με CDPS μείωσε τη σχετική αφθονία Θερμοπλασμάτων, Βάκιλλων, μη αναγνωρισμένων Actinobacteria, Fusobacteriia και μη αναγνωρισμένων Elusimicrobia και αύξησε τη σχετική αφθονία Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, μη ταυτοποιημένων_Deferriolineaeeris, Deferriolineaeaes, Anadolus Ερυσιπελοτριχία και μη αναγνωρισμένα_κυανοβακτήρια.

Οι μικροβιοτικοί μεταβολίτες του εντέρου απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος και ρυθμίζουν την υγεία και το μεταβολισμό του ξενιστή [26, 27]. Οι μικροβιοτικοί μεταβολίτες του εντέρου μπορούν να εκτιμηθούν αξιολογώντας τη σύνθεση του μεταβολίτη των κοπράνων, η οποία αλλάζει με τις αλλαγές στη σύνθεση των μικροβίων του εντέρου [44]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της κιτρουλίνης, της προλίνης, της αργινίνης, της ασπαραγίνης, της φαινυλαλανίνης και της θρεονίνης στο πλάσμα σχετίζονται με νευροεκφυλιστικές διαταραχές συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Alzheimer [45, 46]. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα επίπεδα κρεατινίνης, βαλίνης, L-μεθειονίνης, ο-Τολουιδίνης, Ν αιθυλανιλίνης, ουρικού οξέος και προλίνης στον ορό συσχετίστηκαν με τη γήρανση που προκαλείται από το D-gal σε ποντίκια.

Εκχύλισμα Cistanche: κατά της νόσου του Alzheimer

Οι εγγενείς και προσαρμοστικοί βραχίονες του ανοσοποιητικού συστήματος διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης της μικροβιακής ξενιστή στην εντερική επιφάνεια του αυλού [47]. Η εντερική μικροχλωρίδα παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και της ανοσίας απελευθερώνοντας κυτοκίνες και μεταβολίτες στην κυκλοφορία του αίματος [48, 49]. Οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες παίζουν βασικό ρόλο σε αρκετές νευροεκφυλιστικές ασθένειες [50-52]. Για παράδειγμα, η ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (AMD) και το γλαύκωμα σχετίζονται με εξωκυτταρική συσσώρευση αμυλοειδούς (A ) και ενδοκυτταρική εναπόθεση υπερφωσφορυλιωμένης tau (p tau) και σιδήρου στα γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς (RGC) [44]. Επιπλέον, η φλεγμονή παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση που σχετίζεται με το γλαύκωμα [53]. Η όραση είναι ένα πρώιμο σύμπτωμα της νόσου του Alzheimer (AD) και εκδηλώνεται πριν από την έναρξη της γνωστικής έκπτωσης [54]. Η μελέτη μας έδειξε ότι το CDPS προστατεύει από τη γνωστική έκπτωση και την περιφερική φλεγμονή διατηρώντας την ομοιόσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου.

Υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Πρώτον, η σχέση μεταξύ του μεταβολισμού των αμινοξέων και της σύνθεσης της μικροχλωρίδας του εντέρου δεν είναι καλά γνωστή. Δεύτερον, η σύνθεση και η μοριακή δομή του CDPS δεν είναι γνωστές. Ως εκ τούτου, απαιτούνται μελλοντικές μελέτες για την περαιτέρω διερεύνηση του ρυθμιστικού ρόλου του CDPS στην ανακούφιση της AD μέσω του άξονα του εντερικού μικροβιώματος-εγκεφαλικής σηματοδότησης.

Συμπερασματικά, η μελέτη μας έδειξε ότι το CDPS βελτίωσε τη γνωστική ικανότητα σε ποντίκια που προκαλούνται από D-gal αποκαθιστώντας την ομοιόσταση της μικροχλωρίδας του εντέρου, αποκαθιστώντας έτσι την ανισορροπία αμινοξέων, την περιφερική φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το CDPS είναι ένα πιθανό θεραπευτικό μέσο για ασθενείς με διαταραχές μάθησης και μνήμης, ειδικά εκείνων που σχετίζονται με δυσβίωση του εντέρου.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Προετοιμασία CDPS

Περίπου 1.0 Kg καθαρισμένου Cistanche deserticola ξηράνθηκε στον αέρα στον φούρνο στους 40 βαθμούς C και κονιοποιήθηκε σε ακατέργαστη σκόνη. Η σκόνη εκχυλίστηκε σε θερμή αιθανόλη για 3 ώρες. Το υπόλειμμα διηθήθηκε μέσω γάζας για να απομακρυνθεί το διήθημα και στη συνέχεια αραιώθηκε με νερό (8Χ) και ανέρρευσε διαδοχικά για 2 ώρες, 1,5 ώρα και 1 ώρα στους 90 βαθμούς C. Σε κάθε χρονικό σημείο, το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε για να διαχωριστεί το υπερκείμενο υγρό και σε συνδυασμό με το καφέ-κόκκινο διήθημα. Στη συνέχεια, το διήθημα συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση, ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκε βραδέως σε 95 τοις εκατό αιθανόλη (3Χ) και αφέθηκε να παραμείνει στους 4 βαθμούς C για 24 ώρες. Κατόπιν, το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε στις 6000 r/min για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς C. Το ίζημα συλλέχθηκε μετά από επανειλημμένη εκχύλιση νερού και καταβύθιση αλκοόλης τρεις φορές. Το ίζημα ανασυστάθηκε σε νερό, αποπρωτεϊνοποιήθηκε, υποβλήθηκε σε διαπίδυση και λυοφιλοποιήθηκε για να ληφθεί ακατέργαστος πολυσακχαρίτης Cistanche deserticola (CDPs). Η περιεκτικότητα σε πολυσακχαρίτες ήταν περισσότερο από 90 τοις εκατό όπως αξιολογήθηκε με υπεριώδη φασματοφωτομετρία.

εκχύλισμα κιστάνι

Ομαδοποίηση ζώων και θεραπείες

Αρσενικά ποντίκια Kunming οκτώ εβδομάδων (SCXK License No.2019-0010) αγοράστηκαν από την SPF Biotechnology Co. Ltd (Πεκίνο, Κίνα), στεγάστηκαν σε ένα δωμάτιο με φως και ελεγχόμενη θερμοκρασία και τράφηκαν με τροφή και νερό. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου Inner Mongolia. Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (NIH).

Μετά από 1 εβδομάδα προσαρμογής στο νέο περιβάλλον, 120 ποντίκια χωρίστηκαν στις ακόλουθες 7 ομάδες: (1) έλεγχος άγριου τύπου (WT). ομάδα μοντέλου (150 mg/Kg/ημέρα D-gal; Mod); (3) CH: D-gal συν 100 mg/kg CDPS. (4) CM: D-gal συν 50 mg/kg CDPS. (5) CL: D-gal συν 25 mg/kg CDPS. (6) Ομάδα ABX: αντιβιοτικά συν D-gal συν 50 mg/Kg CDPS. (7) Ομάδα Cy: κυκλοφωσφαμίδη συν D-gal συν 50 mg/kg CDPS.

Τα ποντίκια από τις ομάδες μοντέλου, ABX, Cy και CDPS έλαβαν υποδόριες ενέσεις 150 mg/kg D-gal διαλυμένου σε αλατούχο διάλυμα κάθε μέρα για 2 μήνες. Η ομάδα WT εγχύθηκε υποδόρια με ίσο όγκο φυσιολογικού ορού για 2 μήνες. Στα ποντίκια της ομάδας CDPS χορηγήθηκαν επίσης καθημερινά ενδογαστρικές ενέσεις που περιείχαν 100 mg/kg, 50 mg/Kg ή 25 mg/Kg CDPS για 2 μήνες. Τα ποντίκια της ομάδας ABX έλαβαν πόσιμο νερό με 0,1 mg/mL αμπικιλλίνη και 0,5 mg/mL στρεπτομυκίνη για 2 μήνες επιπλέον των ενέσεων D-gal και CDPS. Πριν από τη χορήγηση D-gal, τα ποντίκια έλαβαν ενέσεις που περιείχαν 0,1 mg/mL αμπικιλλίνη, 0,5 mg/mL στρεπτομυκίνη και 0,1 mg/mL κολιστίνη για 7 ημέρες στην ομάδα ΑΒΧ. Τα ποντίκια της ομάδας Cy έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις 20 mg/Kg κυκλοφωσφαμίδης κάθε δεύτερη μέρα (qod) για 2 μήνες επιπλέον των ημερήσιων ενέσεων D-gal και CDPS.

Τεστ αναγνώρισης νέου αντικειμένου

Διεξάγετε πειράματα συμπεριφοράς μετά την τελευταία δόση. Το τεστ αναγνώρισης αντικειμένων περιλάμβανε στάδια εξοικείωσης, εκπαίδευσης και δοκιμής. Κατά τη διάρκεια του σταδίου εξοικείωσης, τα ποντίκια εξοικειώθηκαν σε έναν άδειο θάλαμο δοκιμής για 10 λεπτά για δύο ημέρες. Στη συνέχεια, την τρίτη ημέρα (ημέρα προπόνησης), δύο αντικείμενα του ίδιου μεγέθους, σχήματος και χρώματος (Α1 και Α2) τοποθετήθηκαν στα απέναντι άκρα του θαλάμου. Σε κάθε ποντίκι δόθηκε στη συνέχεια 10 λεπτά για να εξερευνήσει τα δύο παρόμοια αντικείμενα. Μετά από 1-hour (την τρίτη ημέρα) και 24-hour (την τέταρτη ημέρα) διαστήματα εκπαίδευσης έως δοκιμής, ένα από τα παρόμοια αντικείμενα (A1 ή A2) αντικαταστάθηκε με ένα B ή C αντικείμενο που είναι διαφορετικό σε μέγεθος, χρώμα και σχήμα την ημέρα της δοκιμής. Κατά τη διάρκεια του σταδίου δοκιμής, κάθε ποντίκι δοκιμάστηκε για 5 λεπτά και ο προτιμησιακός δείκτης υπολογίστηκε για τον προσδιορισμό της μνήμης της αναγνώρισης νέου αντικειμένου (Β ή Γ) χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Προτιμητικό ευρετήριο=Χρόνος στο αντικείμενο Β ή Γ/ (Χρόνος στο αντικείμενο Β ή Γ συν Χρόνος στο αντικείμενο Α)×100 τοις εκατό .

Δοκιμή λαβύρινθου νερού Morris

Η δοκιμή λαβύρινθου νερού Morris πραγματοποιήθηκε σε μια στρογγυλή πισίνα 45 cm σε βάθος και 90 cm σε διάμετρο. Το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Ruediger S, et al. (2011) [55] και Wood RA, et al. (2018) [56] απασχολήθηκε εδώ. Το βάθος του νερού στην πισίνα ήταν 30 cm και η θερμοκρασία του νερού ήταν 20±1 βαθμός C. Η πλατφόρμα είχε διάμετρο 6 cm και υποβρύχια 1 cm. Ο χρόνος για την εκπαίδευση και τις δοκιμές ήταν 60 δευτερόλεπτα το καθένα. Για την εκπαίδευση, πραγματοποιήσαμε τέσσερις δοκιμές των 60 δευτερολέπτων η καθεμία με μια κρυφή πλατφόρμα κάθε μέρα για πέντε συνεχείς ημέρες. Εάν η πλατφόρμα δεν ανακαλύφθηκε από τα ποντίκια σε 60 δευτερόλεπτα, οδηγήθηκαν στην πλατφόρμα και τοποθετήθηκαν στην πλατφόρμα για 5 δευτερόλεπτα. Κατά τη διάρκεια του δοκιμαστικού σταδίου, καταγράφηκε και αναλύθηκε ο λανθάνοντας χρόνος για να φτάσετε στην κρυφή πλατφόρμα στις συνεδρίες εκπαίδευσης και δοκιμών ανίχνευσης, ο αριθμός διέλευσης πάνω από την αφαιρεθείσα θέση πλατφόρμας και ο χρόνος που δαπανήθηκε στο τεταρτημόριο στόχο (πλατφόρμα).

Αναλύσεις ELISA

Τα επίπεδα ορού των προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως IL-2(), IL-4, IL-10 και TNF- αναλύθηκαν για κάθε ομάδα ποντικών χρησιμοποιώντας κιτ ELISA που αγοράστηκαν από τη Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστηριότητα του αντιοξειδωτικού ενζύμου, δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD) και τα επίπεδα του προϊόντος υπεροξείδωσης λιπιδίων, μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), στον ορό κάθε ομάδας ποντικών αναλύθηκε με κιτ ανάλυσης που αγοράστηκαν από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα) . Τα επίπεδα των προϊόντων προηγμένης πρωτεΐνης οξείδωσης (AOPP) στα δείγματα ιππόκαμπου ποντικού υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA από την Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Εκτίμηση οξειδωτικού στρες σε εγκεφάλους ποντικών

Ομογενοποιήσαμε 100 mg ιστού ιππόκαμπου με 0,9 ml φυσιολογικό ορό και το ομογενοποιημένο προϊόν φυγοκεντρήθηκε στις 12000 rpm για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς C. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στο υπερκείμενο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA ( Beyotime Biotechnology, Σαγκάη, Κίνα). Τα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων (LPO) και μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) και οι δραστηριότητες των GSH-Px και SOD στα δείγματα ιππόκαμπου αναλύθηκαν με χρωματομετρία χρησιμοποιώντας κιτ από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Συμπλήρωμα Cistanche: βελτιώνει τη μνήμη

Σύνθεση μικροχλωρίδας του εντέρου

Συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων από όλα τα ποντίκια και αποθηκεύτηκαν αμέσως σε -80 βαθμό C. Η περιοχή V3 plus V4 του γονιδίου 16S rRNA αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Πεκίνο, Κίνα) και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το QIIME ανοιχτή πλατφόρμα για τον προσδιορισμό των προφίλ μικροχλωρίδας του εντέρου.

Ανάλυση LC/MS μεταβολιτών ορού

Τα δείγματα ορού επωάστηκαν για 10 λεπτά με προψυγμένη μεθανόλη σε αναλογία 1:3 για να κατακρημνιστούν οι πρωτεΐνες. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12000r/min για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς C. Τα υπερκείμενα αναλύθηκαν με Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography και QExactive φάσμα μάζας. Οι χρωματογραφικές συνθήκες φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι αναλυόμενες ουσίες διαχωρίστηκαν σε χρωματογραφική στήλη αμιδίου XBridge BEH (2,1×100 mm· Waters Co., Milford, ΜΑ, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ και ακετονιτρίλιο ως κινητές φάσεις Α και Β , αντίστοιχα. Ο ρυθμός ροής ορίστηκε σε 0,4 ml/min, ο όγκος έγχυσης ήταν 5 μΐ και η θερμοκρασία της στήλης ορίστηκε στους 25 βαθμούς C (Πίνακας 1). Τα σήματα φάσματος μάζας ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τους τρόπους σάρωσης θετικών και αρνητικών ιόντων. Η τάση ψεκασμού ιόντων και άλλες συγκεκριμένες παράμετροι MS φαίνονται στον Πίνακα 2.

Στατιστική ανάλυση

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 και σ< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">