Ενεργά συστατικά φλαβονοειδών και δυνητικοί μηχανισμοί των εναέριων τμημάτων του Glycyrrhiza Uralensis για τη χρόνια προστατίτιδα με βάση τη φαρμακολογία δικτύου και την πειραματική επικύρωση

Περίληψη:

Στόχος: Να προσδιοριστούν τα ενεργά συστατικά και οι πιθανοί μηχανισμοί δράσης των φλαβονοειδών από τα εναέρια μέρη του Cistanche για τη χρόνια προστατίτιδα. Μέθοδοι: Υγρή χρωματογραφία – τετραπολικό – ηλεκτροστατικό πεδίο υψηλής απόδοσης Φασματομετρία μάζας Orbitrap υψηλής ανάλυσης (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό των κύριων φλαβονοειδών συστατικών στο αλκοολούχο εκχύλισμα των εναέριων τμημάτων του Cistanche. Η φαρμακολογία δικτύου και η μοριακή σύνδεση χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη βασικών συστατικών και βασικών στόχων που σχετίζονται με τη χρόνια προστατίτιδα. Ένα μοντέλο χρόνιας προστατίτιδας σε αρουραίους προκλήθηκε από καραγενάνη και παρατηρήθηκαν ιστοπαθολογικές αλλαγές στον προστάτη αρουραίου με χρώση HE. Τα επίπεδα ορού DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA και TNF- μετρήθηκαν με ELISA για να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του εκχυλίσματος. Αποτελέσματα: Στο αλκοολούχο εκχύλισμα εντοπίστηκαν συνολικά 44 φλαβονοειδή. Η φαρμακολογία δικτύου έδειξε ότι τα βασικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της γλυκυρριζίνης, των ισοφλαβονών τριχοθεκενίου, της φραγκοσυκιάς manzanita florifera και της γλυκυρριζίνης (προβλεπόμενα ως αντιπροσωπευτικά συστατικά), ασκούν αποτελέσματα κατά της χρόνιας προστατίτιδας δρώντας σε βασικούς στόχους όπως το AKT1, το TNF, το VEGRAL, το MEGFA, το σχετικό σημάδι, το MEGFA, μονοπάτια. Η μοριακή σύνδεση έδειξε ευνοϊκές συγγένειες δέσμευσης μεταξύ των βασικών συστατικών και των βασικών στόχων. Πειράματα σε ζώα έδειξαν ότι το αλκοολούχο εκχύλισμα των εναέριων τμημάτων του Cistanche παρήγαγε σαφές θεραπευτικό αποτέλεσμα στη χρόνια προστατίτιδα σε αρουραίους. Συμπέρασμα: Η αποτελεσματικότητα κατά της χρόνιας προστατίτιδας των εναέριων τμημάτων του Cistanche επικυρώνεται. Τα ενεργά συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της ακανθώδης αριστολοχικίνης, των ισοφλαβονών τριχοστατίνης και της γλυκυρριζίνης, μπορούν να δράσουν μέσω της οδού σηματοδότησης PI3K–AKT για τη ρύθμιση των EGFR, AKT1 και MMP9.

Λέξεις-κλειδιά: εναέρια μέρη του Cistanche; χρόνια προστατίτιδα; φλαβονοειδές; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; φαρμακολογία δικτύου

 

 

Οφέλη κιστάνχης για την υγεία του προστάτη

Επικοινωνήστε μαζί μας αγοράστε τώρα

 

 

Εισαγωγή:

Το παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό βότανο Cistanche (Cistanche spp.) περιλαμβάνει το αποξηραμένο φαρμακευτικό υλικό που χρησιμοποιείται κυρίως στην TCM. Είναι ένας σημαντικός μαζικός φαρμακευτικός πόρος στην Κίνα, με λειτουργίες όπως τονωτική και υποστήριξη σωματικών λειτουργιών, καθαρισμό της θερμότητας και αποτοξίνωση, ανακούφιση από τον πόνο και εναρμόνιση των συνταγών και χρησιμοποιείται συνήθως ως συμπληρωματικό συστατικό σε πολλές συνταγές πολλαπλών βοτάνων. Η ζήτηση της αγοράς είναι υψηλή τόσο σε εγχώριο όσο και σε διεθνές επίπεδο. Τα εναέρια μέρη, συμπεριλαμβανομένων των μίσχων και των φύλλων, είναι άφθονοι πόροι που περιμένουν ανάπτυξη και αξιοποίηση.

Η χρόνια προστατίτιδα είναι μια κοινή ουρολογική νόσος μεταξύ νεαρών και μεσήλικων ανδρών. Τα κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνουν πόνο στην κάτω κοιλιακή χώρα ή στη λεκάνη, δυσουρία και συχνουρία. Χωρίς έγκαιρη θεραπεία, μπορεί να οδηγήσει σε σεξουαλική δυσλειτουργία, όπως πρόωρη εκσπερμάτιση και στυτική δυσλειτουργία, επηρεάζοντας σοβαρά τη σωματική και ψυχική υγεία των ανδρών.

Τα φλαβονοειδή είναι άφθονα στα εναέρια μέρη του Cistanche και παρουσιάζουν αξιοσημείωτη αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα εναέρια μέρη είναι πλούσια σε φλαβονοειδή με αντικαρκινική και αντιφλεγμονώδη δράση. Ο εμπλουτισμός φλαβονοειδών από τα εναέρια μέρη έδειξε καλή αντιοξειδωτική δράση in vitro. Η φαρμακοδυναμική έρευνα έχει επίσης βρει ότι τα φλαβονοειδή από τα εναέρια μέρη έχουν προληπτικά και θεραπευτικά αποτελέσματα στη χρόνια προστατίτιδα.

Σε αυτή τη μελέτη, το UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS χρησιμοποιήθηκε για το προφίλ των φλαβονοειδών στο αλκοολούχο εκχύλισμα των εναέριων τμημάτων του Cistanche. Η φαρμακολογία δικτύου εφαρμόστηκε για την πρόβλεψη βασικών στόχων και οδών για τη χρόνια προστατίτιδα, η μοριακή σύνδεση χρησιμοποιήθηκε για να συναχθούν μηχανισμοί και διεξήχθησαν πειράματα σε ζώα για την επικύρωση της δραστηριότητας κατά της χρόνιας προστατίτιδας, παρέχοντας μια αναφορά για μετέπειτα ανάπτυξη φαρμάκων και κλινική εφαρμογή.

Υλικά

 

Ζώα

Αρσενικοί αρουραίοι SD βαθμού SPF (n=24), ηλικίας 6–7 εβδομάδων, σωματικό βάρος 230–250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; άδεια παραγωγής: SCXK (Jing) 2019-0010]. Τα ζώα στεγάστηκαν σε εγκαταστάσεις ζώων με SPF στο Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής του Πεκίνου. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του ιδρύματος (αρ. έγκρισης: BUCM-2023110204-4271).

 

Όργανα

 

Σύστημα Ultimate 3000 UPLC (Dionex, ΗΠΑ)

Φασματόμετρο μάζας υψηλής ανάλυσης Thermo Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ)

Ψηφιακό καθαριστικό υπερήχων KH500DE (Kunshan Hechuang)

Ηλεκτρονική ισορροπία FA2004N (Beijing Sartorius)

Ψυκτικός φυγόκεντρος χαμηλής ταχύτητας H1650 (Changsha Xiangyi)

RE-5023 περιστροφικός εξατμιστής (Shanghai Yarong)

Ηλεκτρονικός θερμαντικός μανδύας ελεγχόμενης θερμοκρασίας (Tianjin Teste)

Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Multiskan MK3 (Thermo Scientific, Shanghai)

Αντεστραμμένο βιολογικό μικροσκόπιο φθορισμού B032 (Nikon Instruments, Σαγκάη)

N5000 UV φασματοφωτόμετρο (Shanghai Youke)

Αντιδραστήρια

Εναέρια μέρη του Cistanche (μίσχοι, φύλλα και μικρή ποσότητα λοβών) συγκομίστηκαν τον Σεπτέμβριο του 2019 από την κομητεία Guazhou, την πόλη Jiuquan, στην επαρχία Gansu και επικυρώθηκαν από τον καθηγητή Wang Wenquan (Ινστιτούτο Ανάπτυξης Φαρμακευτικών Φυτών, CAMS) ως Cistanche spp.

Άλλα αντιδραστήρια: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., παρτίδα C15887472); καραγενάνη (Beijing Solarbio, παρτίδα 20220601)· δισκία Qianliekang Pule'an (Zhejiang Conba Pharmaceutical); καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη νατρίου (CMC-Na, Shanghai YuanYe, παρτίδα S14016); Κιτ ELISA για DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA και TNF- αρουραίων (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology). Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Multiskan MK3 (Thermo Scientific); σταθεροποιητικό ιστού (Guangzhou Shuopu, παρτίδα 23257838). αιθανόλη (Beijing Chemical Works, αναλυτικής ποιότητας)· μεθανόλη, μυρμηκικό οξύ, ακετονιτρίλιο (Fisher Scientific, βαθμού MS); νερό (Ομάδα Wahaha). Πρότυπα αναφοράς (καθαρότητα > 98%, Shanghai YuanYe): liquiritigenin, puerarin, isoorientin II, naringenin, isoquercitrin, isoliquiritin, ononin, isoquercitrin, quercetin, astragalin, kaempferol, formononetin.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

 

2.1 Χημικό προφίλ του αλκοολικού εκχυλίσματος από εναέρια μέρη του Cistanche

2.1.1 Προετοιμασία δείγματος

Οι κατάλληλες ποσότητες εναέριων μερών εκχυλίστηκαν με 70% αιθανόλη. Το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού. Το υπόλειμμα διαλύθηκε με υπερήχους σε νερό για 20 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στις 3000 r·min−1 για 15 λεπτά και το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε μέχρι ξηρού. Μια κατάλληλη ποσότητα του αποξηραμένου δείγματος τοποθετήθηκε σε μια ογκομετρική φιάλη των 5 mL και φέρθηκε σε όγκο με μεθανόλη για να ληφθεί το διάλυμα δοκιμής.

 

2.1.2 Χρωματογραφικές και φασματομετρικές συνθήκες μάζας

 

Συνθήκες UPLC: Στήλη ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm). κινητή φάση Α, ακετονιτρίλιο; κινητή φάση Β, 0,5% μυρμηκικό οξύ σε νερό. βαθμιδωτή έκλουση (0–20 min, 5%–20% A, 20–70 min, 20%–30% A); ρυθμός ροής 0,2 mL·min−1; όγκος ένεσης 2 μL; θερμοκρασία στήλης 30 βαθμοί.

Προϋποθέσεις MS: πηγή HESI. τρόποι θετικών και αρνητικών ιόντων. απόκτηση πλήρους σάρωσης. τάση ψεκασμού +3.2 kV (θετικό) και −3,0 kV (αρνητικό). τριχοειδική θερμοκρασία 320 μοίρες ; αέριο θήκης 40 arb; βοηθητικό αέριο 15 arb; βοηθητικός θερμαντήρας 350 μοιρών ; Ανάλυση MS 70.000; Ανάλυση MS/MS 17.500; εύρος σάρωσης m/z 100–1500.

Λίστα προδιαγραφών Cistanche

2.1.3 Αναγνώριση εξαρτημάτων

Το δείγμα του εναέριου μέρους αναλύθηκε με UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS για να ληφθούν TIC (Εικόνα 1). Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Thermo Xcalibur και συγκρίθηκαν με βιβλιοθήκες συστατικών και βιβλιογραφία, εντοπίζοντας 44 φλαβονοειδή συνολικά (Πίνακας 1).

 

2.2 Φαρμακολογία δικτύου

Τα προσδιορισμένα στοιχεία εισήχθησαν στη βάση δεδομένων TCMSP 2.3 (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Με βάση τη βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα (OB) μεγαλύτερη από ή ίση με 30,00% και ομοιότητα φαρμάκου (DL) μεγαλύτερη από ή ίση με 0,18, εξετάστηκαν 19 δραστικά συστατικά. Οι προβλεπόμενοι στόχοι των ενεργών συστατικών και οι στόχοι της νόσου για τη χρόνια προστατίτιδα διασταυρώθηκαν, αποδίδοντας 88 κοινούς στόχους. Το STRING 11.0 (http://string-db.org) χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του δικτύου PPI. Οι βασικοί στόχοι που ταξινομήθηκαν κατά βαθμό περιελάμβαναν AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 και MMP2. Ο εμπλουτισμός GO και KEGG (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) έδειξε βιολογικές διεργασίες όπως θετική ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης Β, αρνητική ρύθμιση της απόπτωσης και θετική ρύθμιση της δραστηριότητας MAPK. κυτταρικά συστατικά που περιλαμβάνουν εξωκυτταρική περιοχή, μακρομοριακά σύμπλοκα και σύμπλοκα υποδοχέα. μοριακές λειτουργίες που περιλαμβάνουν δραστηριότητες κινάσης τυροσίνης, κινάσης σερίνης και κινάσης θρεονίνης. Οι οδοί KEGG εμπλουτίστηκαν σε μονοπάτια στον καρκίνο, στη σηματοδότηση PI3K-AKT, στον καρκίνο του προστάτη και στην αντίσταση στους αναστολείς της τυροσινικής κινάσης EGFR. Το Cytoscape 3.7.1 χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του δικτύου "ενεργού στοιχείου-πυρήνας στόχου-διαδρομής" (Εικόνα 2). Τα κορυφαία 10 συστατικά κατά βαθμό ήταν η λικιριτιγενίνη, η σπινακετίνη (αντιπροσωπευτική φλαβόνη), η ισοβιτεξίνη, η χρυσοεριόλη, η σαντίνη, η καμπφερόλη, η σαφτοσίδη, η λουτεολίνη, η ονονίνη και η φορμονονετίνη.

Η μοριακή σύνδεση πραγματοποιήθηκε κατά ζεύγη μεταξύ των 10 βασικών στοιχείων και των βασικών στόχων από την ανάλυση PPI. Οι μοριακές δομές των βασικών συστατικών λήφθηκαν από το TCMSP 2.3 (μορφή mol2) και οι τρισδιάστατες δομές των βασικών στόχων ελήφθησαν από το PDB (http://www.rscb.org/) σε μορφή pdb. Το Autodock χρησιμοποιήθηκε για τη σύνδεση κάθε ζεύγους συνδέτη-πρωτεΐνης. Οι ενέργειες δέσμευσης < −20,92 kJ·mol−1 έδειξαν ευνοϊκή δέσμευση. Όσο χαμηλότερη είναι η ενέργεια, τόσο καλύτερη είναι η συγγένεια. Τα ζεύγη στόχου-συνδέτη με την καλύτερη βαθμολογία παρατίθενται στον Πίνακα 2. Αντιπροσωπευτικά σύμπλοκα σύνδεσης με πέντε στόχους οπτικοποιήθηκαν στο PyMol (Εικόνα 3).

 

2.3 Επικύρωση in vivo

Ένα μοντέλο χρόνιας προστατίτιδας σε αρουραίους καθιερώθηκε χρησιμοποιώντας καραγενάνη. Η χρώση HE αποκάλυψε ιστοπαθολογικές βλάβες χαρακτηριστικές της χρόνιας προστατίτιδας σε ζώα-μοντέλα, ενώ η θεραπεία με το αλκοολούχο εκχύλισμα των εναέριων τμημάτων του Cistanche βελτίωσε την αδενική αρχιτεκτονική και μείωσε τη φλεγμονώδη διήθηση. Η ELISA έδειξε ότι, σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, οι ομάδες θεραπείας εμφάνισαν ρύθμιση της DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA και TNF- ορού προς φυσιολογικά επίπεδα, υποδεικνύοντας θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Συζήτηση
Η ολοκληρωμένη ανάλυση που ενσωματώνει το προφίλ υψηλής ανάλυσης με βάση το MS, τη φαρμακολογία δικτύου, τη μοριακή σύνδεση και την επικύρωση των ζώων υποστηρίζει ότι τα φλαβονοειδή από τα εναέρια μέρη του Cistanche ασκούν αποτελέσματα κατά της χρόνιας προστατίτιδας. Οι υποτιθέμενοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του PI3K-AKT και των σχετικών οδών που σχετίζονται με τη φλεγμονή και τον πολλαπλασιασμό και βασικούς στόχους όπως EGFR, AKT1 και MMP9. Τα αποτελέσματα παρέχουν μια επιστημονική βάση για την ανάπτυξη και την κλινική εφαρμογή των εναέριων φλαβονοειδών παρασκευασμάτων από το Cistanche στη διαχείριση της χρόνιας προστατίτιδας.

Σύναψη
Τα φλαβονοειδή από τα εναέρια μέρη του Cistanche επιδεικνύουν θεραπευτικό δυναμικό έναντι της χρόνιας προστατίτιδας, πιθανόν μέσω της ρύθμισης της οδού PI3K-AKT και της αλληλεπίδρασης με EGFR, AKT1 και MMP9. Η ενσωμάτωση χημικού προφίλ, φαρμακολογίας δικτύου, μοριακής σύνδεσης και πειραμάτων σε ζώα επιβεβαιώνει την αποτελεσματικότητά τους και διευκρινίζει εύλογους μηχανισμούς.