Η χρόνια νεφρική νόσος αυξάνει τις εγκεφαλικές μικροαιμορίες σε ποντίκια και τον άνθρωπο

Επαφή:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Γουέι Λινγκ Λάου1,2 & Αν Κ. Φ. Νούνες 1 & Βιτάλι Βασιλέφκο3 , Ντέιβιντ Φλόριολι4 , Λονγκ Λερτπανίτ 1 & Τζαβάντ Σαβόι 1 & Μαρία Μπανγκάς 1 & Ζιχούι Γιάο 1,5 & Κρονάλ Σαχ6 & Σάμεν Νάκβι 1 & Άνλια Παγκανίνι-Χιλ6 & Νοσρατόλα Ντ. Βαζίρι 1 & Ντέιβιντ Χ Κριμπς3 & Μαρκ Φίσερ6,7

Ελήφθη: 25 Αυγούστου 2018 /Αναθεωρημένο: 28 Ιανουαρίου 2019 /Αποδεκτό: 22 Φεβρουαρίου 2019 /Δημοσιεύθηκε στο διαδίκτυο: 4 Μαΐου 2019

# Ο Συγγραφέας(οι) 2019

Σιστάντσεμπορεί να ανακουφίσεινεφρική νόσο

Αφηρημένος

Οι μικρορορραγίες του εγκεφάλου αυξάνονται σεχρόνιοςνεφρόςαρρώστια(ΧΝΝ) και η παρουσία τους αυξάνει τον κίνδυνο γνωστικής εξασθένησης και εγκεφαλικού επεισοδίου. Εξετάσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ της ΧΝΝ και των μικροαιμορραγιών του εγκεφάλου (το νευροπαθολογικό υπόστρωμα των μικροαιμορραγιών) σε μοντέλα ποντικών και κυτταροκαλλιέργειας και μελετήσαμε την εξέλιξη του φορτίου μικροαιμορραγίας στη σειριακή απεικόνιση του εγκεφάλου από τον άνθρωπο. Μελέτες σε ποντίκια: Διερευνήθηκαν δύο μοντέλα ΧΝΝ: η σωληναρινική νεφρίτιδα που προκαλείται από αδενίνη και η χειρουργική νεφρεκτομή 5/6. Μελέτες κυτταροκαλλιέργειας: bEnd.3 τα ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου ποντικού αναπτύχθηκαν σε συρροή και η ακεραιότητα της μονοστιβάδας μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 5-15% ανθρώπινο ουραιμικό ορό ή αυξανόμενες συγκεντρώσεις ουρίας. Μελέτες σε ανθρώπους: Η εξέλιξη των μικρορορραγιών του εγκεφάλου αξιολογήθηκε σε σειριακή μαγνητική τομογραφία από ασθενείς με έλεγχο, ΧΝΝ πριν από την αιμοκάθαρση και αιμοκάθαρση. Οι μικροαιμορραγίες αυξήθηκαν 2-2,5 φορές σε ποντίκια με ΧΝΝ ανεξάρτητα από την υψηλότερη αρτηριακή πίεση στο μοντέλο νεφρεκτομής 5/6. Η χρώση IgG αυξήθηκε σε ζώα με ΧΝΝ, σύμφωνα με την αυξημένη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Η επώαση των κυττάρων bEnd.3 με ουραιμικό ορό ή αυξημένη ουρία προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη πτώση της δια-ενδοθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης. Η αυξημένη ουρία προκάλεσε διαταραχές του κυτταροσκελετού ακτίνης και μείωσε την έκφραση claudin-5. Σε ανθρώπους, ο επιπολασμός των μικροαιμορραγιών ήταν 50% και στις δύο κοόρτεις ΧΝΝ σε σύγκριση με 10% στους μάρτυρες που αντιστοιχίστηκαν με την ηλικία. Περισσότεροι ασθενείς στην κοόρτη αιμοκάθαρσης είχαν αυξημένες μικρορορραγίες κατά τη μαγνητική τομογραφία παρακολούθησης μετά από 1,5 έτος. Η ΧΝΝ διαταράσσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και αυξάνει τις μικροαιμορραγίες του εγκεφάλου σε ποντίκια και τις μικροαιμορραγίες στους ανθρώπους. Η αυξημένη ουρία μεταβάλλει τον κυτταροσκελετό ακτίνης και τις πρωτεΐνες στενής σύνδεσης σε καλλιεργημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι αυτός ο μηχανισμός εξηγεί (τουλάχιστον εν μέρει) τις μικροαιμορρορροές και τις μικρορορραγίες που παρατηρούνται σε μελέτες σε ζώα και ανθρώπους.

Λέξεις-κλειδιά Χρόνια νεφρική νόσο. Μικρορορραγίες. Μοντέλο ποντικιού. Ενδοθηλιακή κυτταροκαλλιέργεια. ΕγκέφαλοςMRI

για την ανακούφιση τηςχρόνιοςνεφρόςασθένεια μεcistanche

Εισαγωγή

Μία από τις σημαντικότερες ανακαλύψεις νευρολογίας εγκεφαλικού επεισοδίου τα τελευταία χρόνια είναι η εμφάνιση τουχρόνιοςνεφρόςαρρώστιανα έχουν αντίκτυπο που υπερβαίνει κατά πολύ τους παραδοσιακούς παράγοντες κινδύνου όπως η υπέρταση και ο διαβήτης [10, 11]. Δεδομένου του υψηλού επιπολασμού (περίπου 50%) των εγκεφαλικών μικροαιμορραγιών και της γνωστικής εξασθένησης σε ασθενείς με προχωρημένη ΧΝΝ [2-4, 6, 7], αυτή η σχέση αξίζει περαιτέρω μελέτη.

Οι εγκεφαλικές μικροαιμορραγίες είναι μικρές εστίες αιμοσιδερίνης-σιδήρου που μπορούν να αποδειχθούν στην απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI), που πιστεύεται ότι αντανακλούν υποκείμενες εγκεφαλικές μικροαιμορρορροές [12, 13], και ενδεικτικές αυξημένου κινδύνου για εγκεφαλικό επεισόδιο, τόσο αιμορραγικό όσο και ισχαιμικό [9, 14]. Ειδικές αλληλουχίες μαγνητικής τομογραφίας (ηχώ κλίσης και απεικόνιση σταθμισμένη ως προς την ευαισθησία) καταδεικνύουν αυτές τις εστιακές περιοχές απώλειας σήματος στο εγκεφαλικό παρέγχυμα που μετρά ≤ 10 mm [12, 15]. Οι εγκεφαλικές μικροαιμορραγίες εξαρτώνται από την ηλικία, με τον επιπολασμό να πλησιάζει το 20% μέχρι την ηλικία των 65 ετών [16]. Εκτός από την ηλικία, η υπέρταση και η εγκεφαλική αγγειοειδής αγγειοπάθεια είναι οι καλύτερα περιγραφόμενοι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη μικροαιμορραγιών [13, 17]. Στη ΧΝΝ τελευταίου σταδίου, οι μικροαιμορραγίες υπάρχουν έως και στο 50% του πληθυσμού [2-4].

Ταυτόχρονα, η γνωστική εξασθένηση είναι τόσο πιο διαδεδομένη όσο και πιο σοβαρή σε χαμηλότερα επίπεδανεφρόςλειτουργία[18], φθάνοντας σε επιπολασμό 30-70% σε ασθενείς με χρόνια αιμοκάθαρση [6, 7]. Σε μια συγχρονική ανάλυση 338 ασθενών που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση ηλικίας 55 ετών και άνω με ελέγχους που ταιριάζουν στην ηλικία, το 34% των ασθενών που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση είχαν σοβαρή γνωστική εξασθένηση σε σύγκριση με το 12% των μαρτύρων [6]. Ένα άλλο 35% της κοόρτης της αιμοκάθαρσης είχε μέτρια γνωστική εξασθένηση [6].

Αρκετές μελέτες σε κοόρτεις που δεν σχετίζονται με τη ΧΝΝ έχουν καταδείξει μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των εγκεφαλικών μικροαιμορραγιών και της φθίνουσας γνωστικής λειτουργίας [19–22]. Τα επιδημιολογικά δεδομένα υποστηρίζουν τη συνύπαρξη του φορτίου της μαγνητικής μικροαλγίας και της γνωστικής δυσλειτουργίας σε ασθενείς τελικού σταδίου νεφρικής νόσου (ESRD) [8, 23]. Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση 28 ασθενών με χρόνια αιμοκάθαρση με σειριακή μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου έδειξε μια συσχέτιση μεταξύ των νέων μικροαιμορραγιών και της μείωσης της βαθμολογίας της εξέτασης μίνι ψυχικής κατάστασης (MMSE) [4]. Επιπλέον, οι ασθενείς με ESRD έχουν 3 έως 4 φορές υψηλότερο ποσοστό επίπτωσης τόσο ισχαιμικών όσο και αιμορραγικών εγκεφαλικών επεισοδίων σε σύγκριση με τον γενικό πληθυσμό [5]. Σε μια κοόρτη Ιαπώνων ασθενών που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση οι οποίοι ήταν χωρίς εγκεφαλικό επεισόδιο κατά την έναρξη, η παρουσία εγκεφαλικών μικροαιμορραγιών ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας της ενδοεγκεφαλικής αιμορραγίας κατά τη διάρκεια μιας 5ετούς περιόδου παρακολούθησης [9].

Εδώ αναφέρουμε αποτελέσματα από μελέτες σε ποντίκια και σε ασθενείς με ΧΝΝ. Βρήκαμε αυξημένες μικροαιμορραγίες του εγκεφάλου σε ποντίκια με ΧΝΝ και περιγράφουμε την εξασθενημένη ενδοθηλιακή στενή σύνδεση και τη διάσπαση του κυτταροσκελετού κασσιτέρου ως πιθανούς μηχανισμούς για το σχηματισμό μικροαιμορραγίας στο περιβάλλον της ΧΝΝ. Η αναδρομική ανάλυση της σειριακής μαγνητικής τομογραφίας εγκεφάλου από άτομα χωρίς ΧΝΝ, προ-αιμοκάθαρση και χρόνια αιμοκάθαρση επιβεβαίωσε την ESRD ως σημαντικό παράγοντα κινδύνου για την εξέλιξη του φορτίου μικροαιμορραγίας.

Μεθόδους

Πειράματα ποντικών

Πειραματόζωα και ομάδες θεραπείας

Διερευνήθηκαν δύο μοντέλα ποντικιών CKD. (1) Μοντέλο σωληναριακής νεφρίτιδας αδενίνης: Αρσενικά ποντίκια C57BL/6J από την Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ηλικίας 10- 12 εβδομάδων τράφηκαν με δίαιτα που περιείχε 0,2% αδενίνη για 18 ημέρες για να προκαλέσουν χρόνια διάμεση νεφροπάθεια, τοποθετήθηκαν ξανά σε κανονικό chow για 2 εβδομάδες και στη συνέχεια εκτέθηκαν εκ νέου σε δίαιτα αδενίνης για 1 εβδομάδα για να διατηρήσουν τη ΧΝΝ (Εικ. 1α). Τα ποντίκια ελέγχου διατηρήθηκαν σε κανονικό chow. (2) Μοντέλο νεφρεκτομής 5/6: Αρσενικά ποντίκια C57BL/6J ηλικίας 10 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση δύο σταδίων στα Εργαστήρια Τζάκσον που περιλάμβανε αριστερή μερική νεφρεκτομή ακολουθούμενη από δεξιά ολική νεφρεκτομή 1 εβδομάδα αργότερα. Τα ζώα παραδόθηκαν στο εργαστήριο 1 εβδομάδα μετά την

δεύτερη χειρουργική επέμβαση. Αυτά τα δύο μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της επίδρασης της υπέρτασης. η υπέρταση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του μοντέλου νεφρεκτομής 5/6, ενώ η αδενίνη-ΧΝΝ είναι μη υπερτασική [24].

Τα ζώα με ΧΝΝ τυχαιοποιήθηκαν σε καθόλου λιποπολυσακχαρίτες (LPS) ή ενέσεις LPS. (Σε πιλοτικές μελέτες, καταρρίψαμε ότι χρειαζόταν μεγαλύτερη διάρκεια ουραιμίας για την ανίχνευση υψηλότερου φορτίου αυθόρμητων μικροαιμορραγιών σε ζώα με ΧΝΝ που δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπεία. Τα ποντίκια σε δίαιτα αδενίνης μόνο για 10 ημέρες πέρα από την αρχική έκθεση των 18 ημερών είχαν 3,0 ± 0,4 μικροαιμορραγίες ανά cm2.)

Πέντε εβδομάδες μετά την αρχική επαγωγή της ΧΝΝ και σε ισοδύναμη ηλικία στους μάρτυρες, σε ποντίκια δόθηκαν ενδοπεριτοναϊκές (i.p.) ενέσεις LPS (Salmonella enterica serotype Typhimurium, L6511-10MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) για την πρόκληση μικρορορραγιών στον εγκέφαλο. Το LPS χορηγήθηκε σε τρεις δόσεις, 1 mg/kg στις 0, 6 και 24 ώρες [25]. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS έλαβαν ενυδάτωση με υποδόριες ενέσεις φυσιολογικού ορού δύο έως τρεις φορές την ημέρα για 3 ημέρες μετά τη θεραπεία με LPS. Η αρτηριακή πίεση (BP) μετρήθηκε 2 ημέρες πριν από τις ενέσεις LPS μέσω της πλευστογραφίας ουράς-περιχειρίδας (CODA-S2 πολυκαναλική, Kent Scientific). Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, την Irvine Institutional Animal Care και την Επιτροπή Χρήσης.

Συγκομιδή ιστών και χημικές ουσίες αίματος

Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 1 εβδομάδα μετά από ενέσεις LPS ή σε ισοδύναμη ηλικία σε ζώα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αφαίμαξη χρησιμοποιώντας καρδιακή παρακέντηση υπό εισπνεόμενη αναισθησία ισοφλουρανίου. Μια βελόνα 26 gauge χρησιμοποιήθηκε ως σωληνίσκος και εισήχθη στην αριστερή κοιλία και εφαρμόστηκε παγωμένο διάλυμα PBS με ρυθμό ροής 7-8 ml/min. Μετά

αιμάτωση για 5 λεπτά, το αριστερό ημισφαίριο του εγκεφάλου ήταν παγωμένο για δυτική κηλίδα. Το δεξί ημισφαίριο του εγκεφάλου και τα δύο νεφρά σταθεροποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας σε παραφορμαλδεΰδη 4% και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε κρύο PBS πριν από την τομή. Ο ορός υποβαθμίστηκε για χημικές ουσίες αίματος. Το άζωτο ουρίας αίματος (BUN) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το χρωματομετρικό κιτ από τα συστήματα bioassay (Hayward, CA). Η κρεατινίνη ορού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τριχοειδή ηλεκτροφόρηση στο Κέντρο Πυρήνα Έρευνας Νεφρών O'Brien (UT Southwestern, Ντάλας, TX).

Ανίχνευση μικροαιμορραγιών

Οι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν σε 1,5% αγαρόζη και διατομήστηκαν με δονητικό διάλυμα για τη δημιουργία στεφανιαίων τομών (40 μm). Κάθε 5ο τμήμα συλλέχθηκε για την πρωσική μπλε χρώση για την ανίχνευση μικροαιμορραγιών [26]. Η πρωσική μπλε χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πρόσφατα παρασκευασμένο 5% εξακυανοφερικό κάλιο-τριυδρικό και 10% υδροχλωρικό οξύ. Είκοσι λεπτά αργότερα, τα τμήματα ξεπλύθηκαν με νερό και αντικολλήθηκαν με πυρηνικό γρήγορο κόκκινο, αφυδατωμένο και καλυμμένο. Οι μικροαιμορραγίες εντοπίστηκαν σε μεγέθυνση × 20 καθώς οι μωβ-μπλε εναποθέσεις που μετρήθηκαν από τρεις ενέσεις δόθηκαν σε 0,6 και 24 ώρες. Η ενυδάτωση του υποδόριου φυσιολογικού ορού χορηγήθηκε για 3 ημέρες μετά τις ενέσεις LPS. Η αρτηριακή πίεση της ουράς (ΑΠ) μετρήθηκε πριν από τις ενέσεις LPS. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 1 εβδομάδα μετά τις ενέσεις LPS. β Αντιπροσωπευτικά τμήματα νεφρών με χρώση H&E που καταδεικνύουν σωληναριακή βλάβη που προκαλείται από αδενίνη σε ποντίκια ΧΝΝ (δεξί πάνελ) σε σύγκριση με φυσιολογικούς νεφρούς από ζώα CTL (αριστερό πάνελ), × 20 μεγέθυνση. Ράβδος κλίμακας = 100 μm

ανεξάρτητους παρατηρητές, και στη συνέχεια υπολογίστηκε ο μέσος όρος. Οι εικόνες των παρατηρούμενων θετικά χρωματισμένων τμημάτων τραβήχτηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτομικροσκόπιο (Nikon Eclipse, Ιαπωνία) για τρία ζώα ανά ομάδα για τον υπολογισμό της περιοχής μικροαιμορραγίας. Σαρώθηκαν ολόκληρες εικόνες διαφανειών και το δωρεάν λογισμικό ImageJ (έκδοση 10.2) από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (www.imagej.nih.gov/ij/) χρησιμοποιήθηκε για να

υπολογίστε τη συνολική επιφάνεια του εγκεφάλου. Ο αριθμός των μικροαιμορραγιών ομαλοποιήθηκε στη συνολική επιφάνεια του εγκεφάλου ανά ζώο.

Δυτική στύπωση

Τα ημισφαίρια του εγκεφάλου για ανάλυση πρωτεϊνών καταψύχθηκαν κατά τη στιγμή της συλλογής ιστών και ομογενοποιήθηκαν σε παγωμένο αντιδραστήριο εκχύλισης ιστού Ι (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Οι συγκεντρώσεις πρωτεϊνών μετρήθηκαν με ένα κιτ ανάλυσης πρωτεϊνών BCA (Thermo Fisher Scientific). Η ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-PAGE έγινε με 100 μg πρωτεΐνης ανά δείγμα. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν για

1 ώρα σε 5% μη λιπαρό ξηρό αποβουτυρωμένο γάλα που παρασκευάζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T (10 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl και 0,1% Tween-20) και επωάζεται με πρωτογενή αντισώματα που στοχεύουν στην κλαυδίνη-5 (αραιωμένο 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (αραιωμένο 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) και κανονικοποιημένο σε εσωτερικό έλεγχο GAPDH (αραιωμένο 1:10.000, Abcam, Cambridge, MA) σε 5% μη λιπαρό γάλα TBS-T κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 °C. Οι κηλίδες στη συνέχεια επωάστηκαν με τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα κατά του κουνελιού ή του ποντικού για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο με TBS-T, ανιχνεύθηκαν ζώνες χρησιμοποιώντας τον αναλυτή φωταύγειας εικόνας LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

Ανοσοϊστοχημεία

Για την ανίχνευση της διαρροής του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB), τα τμήματα επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο αντι-ποντικό δευτερογενές αντίσωμα IgG σε 1:100 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ΗΠΑ). Μετά το πλύσιμο με PBS, τα τμήματα επωάστηκαν για 30 λεπτά με σύμπλοκο αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Vector Laboratories) σε αραίωση 1:200. Η χρώση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας 3′,3′- διαμινοβενζιδίνη (DAB, Vector Laboratories) ως χρωμο-gen. Η περιοχή ποσοστού χρωματισμένης με IgG αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ σε εγκεφάλους CTL και CKD που δεν είναι LPS. Ένα όριο για τη θετική χρώση IgG επιλέχθηκε με τη χειροκίνητη αξιολόγηση ενός ζώου ελέγχου για χρώση IgG, και αυτό το όριο στη συνέχεια διατηρήθηκε ίσο για όλα τα συμπεριλαμβανόμενα ζώα [27].

Cistanche έρημος αποτρέπει τη νεφρική νόσο

Πειράματα κυτταροκαλλιέργειας

Καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων εγκεφάλου και θεραπεία ορού

Τα αθάνατα κύτταρα bEnd.3 ποντικού αγοράστηκαν από την Αμερικανική Συλλογή Καλλιέργειας Τύπου (ATCC, Manassas, VA). Ο φαινότυπος των ενδοθηλιακών κυττάρων επιβεβαιώθηκε μέσω ανοσοχρωματισμού για τον παράγοντα von Willebrand.

Οι κυτταρικές καλλιέργειες επωάστηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco με πλήρη υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη (DMEM, ATCC 30-2002) που περιείχε 25 mM γλυκόζης συμπληρωμένης με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 °C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν στο πέρασμα 5 για όλα τα πειράματα. Τα κύτταρα σπέρνονταν σε πυκνότητα 5× 106 σε πολυεστερικά ένθετα Transwell 12 κοιλοτήτων (0,4 μm πόρου, Costar) και η συρροή επιτεύχθηκε σε 24-48 ώρες. Στη συνέχεια, το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας άλλαξε για να εκθέσει τα κύτταρα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις FBS, ανθρώπινου φυσιολογικού ορού (HNS) ή ουραιμικού ορού (ΧΝΝ) από ασθενείς που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση. Οι μετρήσεις TEER μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τον μετρητή EVOM2 volt/Ohm (World Precision Instruments, Sarasota, FL) σε τρεις θέσεις ανά κοιλότητα για να ληφθεί ένας μέσος όρος. Τα πειράματα συνεχίστηκαν για 21 ημέρες και το μέσο καλλιέργειας ανανεώθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Το NHS και ο ουραιμικός ορός προέρχονταν από δείγματα που είχαν προηγουμένως συγκεντρωθεί και ελήφθησαν μετά από έγκριση IRB και συναίνεση κατόπιν ενημέρωσης.

Πειράματα καλλιέργειας κυττάρων ουρίας

Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της ουρίας (η πιο άφθονη παρακρατούμενη τοξίνη στη ΧΝΝ), τα κύτταρα bEnd.3 επωάστηκαν σε DMEM υψηλής γλυκόζης με 10% FBS μόνο ή σε μέσο συμπληρωμένο με 42 ή 72 mg/dL (70 ή 120 μm) ουρίας (Sigma- Aldrich). Αυτές οι συγκεντρώσεις ουρίας προσεγγίζουν τις τιμές πριν και μετά την αιμοκάθαρση που βρίσκονται γενικά σε ασθενείς με ESRD και θεωρούνται κλινικά σημαντικές [28]. Στο τέλος μιας περιόδου επώασης 24 ωρών, μετρήθηκε το TEER και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση δυτικής κηλίδας. Για την απεικόνιση του κυτταροσκελετού ακτίνης, τα κύτταρα bEnd.3 αναπτύχθηκαν σε ολίσθηση υαλοβάμβακα και εκτέθηκαν στις παραπάνω συγκεντρώσεις ουρίας για 24 ώρες, σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά σε ψύχεται 4% φορμαλίνη / PBS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας φαραλοειδίνη φθορισμού actistain 488 με πυρηνική χρώση DAPI (κατάλογος # PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Οι τριπλές διαφάνειες έγιναν ανά ομάδα και τρία καρέ απεικονίστηκαν ανά διαφάνεια στο λογισμικό ImageJ για να υπολογιστεί η περιοχή της χρώσης φαλλοϊδίνης κανονικοποιημένη στην περιοχή DAPI.

Δυτική στύπωση

bEnd.3 κύτταρα από τα πειράματα ουρίας σφαιροποιήθηκαν και στη συνέχεια λύθηκαν στο αντιδραστήριο εκχύλισης ιστού I (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche Applied Science). Οι συγκεντρώσεις πρωτεϊνών μετρήθηκαν με ένα κιτ ανάλυσης πρωτεϊνών BCA και η δυτική στύπωση έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω με claudin-5 (αραιωμένη 1:500) και occludin (αραιωμένη 1:500) κανονικοποιημένη σε εσωτερικό έλεγχο GAPDH (αραιωμένη 1:20.000). Οι δυτικές κηλίδες επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές για κάθε δείγμα.

Μελέτες για τον άνθρωπο

Αναδρομική αναθεώρηση χαρτών μαγνητικής τομογραφίας εγκεφάλου

Τα ηλεκτρονικά ιατρικά αρχεία μεταξύ 1 Ιανουαρίου 2008 και 31 Δεκεμβρίου 2014, στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια-Irvine εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Honest Broker και το UCReX (Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας Research Exchange) μετά την έγκριση του IRB. Εντοπίστηκαν ασθενείς με ΧΝΝ πριν από την αιμοκάθαρση (n =8) και ασθενείς με χρόνια αιμοκάθαρση (n =9) που είχαν τουλάχιστον δύο μαγνητικές τομογραφίες εγκεφάλου σε ξεχωριστά χρονικά σημεία (από τους 10 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αιμοκάθαρση που εντοπίστηκαν αρχικά, 1 αφαιρέθηκε από την τελική ανάλυση λόγω ελλιπών εικόνων στο ακτινολογικό σύστημα PACS). Οι μάρτυρες με φυσιολογική νεφρική λειτουργία (n = 10) αντιστοιχίστηκαν χειροκίνητα με τους ασθενείς με ΧΝΝ υπό αιμοκάθαρση ανά φύλο και ηλικία ± 5 ετών.

Ανασκόπηση της μαγνητικής τομογραφίας για εγκεφαλικές μικροαιμορίες

Οι μικροαιμορραγίες καταμετρήθηκαν από έναν θεράποντα νευροακτινολόγο (DF) και αναλύθηκαν για εξέλιξη με την πάροδο του χρόνου. Η μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου με εικόνες T2*-σταθμισμένης και σταθμισμένης ως προς την ευαισθησία im- aging (SWI) και FLAIR (ανάκτηση αναστροφής με εξασθένιση υγρών) πραγματοποιήθηκε σε σαρωτές μαγνητικής τομογραφίας 1,5T και 3T. Το πάχος του στρώματος για ακολουθίες SWI πραγματοποιήθηκε στα 2 mm, με διάστημα ενδιάμεσου φύλλου 0. Οι μικρορορραγίες μετρήθηκαν με βάση το αξονικό SWI των 2 mm. FLAIR ήταν ανά-

που σχηματίζεται για την ανίχνευση βλαβών λευκής ουσίας σε πάχος φέτας 3 mm, επίσης με διάστημα ενδιάμεσου φύλλου 0.

Στατιστική ανάλυση

Δεν υπήρχαν ακραίες τιμές δεδομένων κατά τον έλεγχο με τη δοκιμή Grubbs (ακραία μαθητευμένη αποκλίνουσα μέθοδος, http://graphpad.com/γρήγορες κλήσεις/grubbs1/). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων σε ποντίκια και στον άνθρωπο συγκρίθηκαν με δοκιμές chi-square (ακριβές του Fisher) για κατηγορικές μεταβλητές και t-δοκιμές και ANOVA για συνεχείς μεταβλητές. Τα συνεχή δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM. Για δεδομένα ποντικιού, εκτελέσαμε τόσο ένα μη παραμετρικό Kruskal-Wallis όσο και ένα μονόδρομο ANOVA με δοκιμές Tukey HSD. Η αμφίδρομη ANOVA (CKD-ναι/όχι και LPS- ναι/όχι) χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή της αλληλεπίδρασης με τη ΧΝΝ. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν σημαντικές εάν το P< 0.05.="" figures="" were="" generated="" using="" graphpad="" prism="" 4="" software="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Αποτελέσματα

Επιβίωση με θεραπεία LPS

Τα ποντίκια με ΧΝΝ που έλαβαν θεραπεία με LPS είχαν ποσοστό επιβίωσης 80%. Μόνο τα ποντίκια που επέζησαν έως 1 εβδομάδα μετά τη θεραπεία με LPS ήταν

περιλαμβάνονται στις τελικές αναλύσεις. Όλα τα ποντίκια σε άλλες ομάδες επέζησαν μέχρι το τέλος του πειράματος.

Η ΧΝΝ αύξησε σημαντικά τις μικροαιμορραγίες του εγκεφάλου

Επιβάρυνση μετά τη θεραπεία LPS

Τα ζώα με ΧΝΝ που προκλήθηκε από αδενίνη και 5/6 νεφρεκτομή έδειξαν σημαντικά αυξημένες τιμές αζώτου ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνης ορού σε σύγκριση με τα ζώα CTL (Πίνακας 1). Η απεξάρτηση της ουράς ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ζώα νεφρεκτομής-ΧΝΝ σε σύγκριση με τα ζώα CTL και αδενίνης-ΧΝΝ (Πίνακας 1). Ωστόσο, οι αριθμοί μικροαιμορραγιών στις δύο ομάδες ΧΝΝ ήταν παρόμοιοι. H &E χρώση επιβεβαίωσε αδενίνη-προκληθείσα σωληναριακή in- jury στα νεφρά από ποντίκια ΧΝΝ (Εικ. 1β).

Το μέσο φορτίο μικροαιμορραγίας του εγκεφάλου ήταν 2,0 ± 0,5 ανά cm2 σε ποντίκια που δεν ήταν LPS CTL και αυξήθηκε 2-2,5 φορές σε ζώα χωρίς LPS CKD (ποντίκια αδενίνης-ΧΝΝ 4,5 ± 0,9 ανά cm2.

νεφρεκτομή-ΧΝΝ ποντίκια 4,2 ± 1,1 ανά cm2) (Πίνακας 1, Εικ. 2α). Για τις ομάδες εκτός LPS, η αύξηση των μικροαιμορραγιών ήταν σημαντική για τη ΧΝΝ αδενίνης σε σύγκριση με τη CTL αλλά όχι για τη νεφρεκτομή-ΧΝΝ. Η θεραπεία με LPS αύξησε το σχηματισμό μικροαιμορραγίας στον ίδιο βαθμό σε ζώα CTL και CKD από