Κεφάλαιο 2: Τα νεφρικά σωληναριακά υπεροξισώματα είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Συζήτηση

Η υψηλή αφθονία υπεροξισωμάτων στο εγγύς σωληνάριο μαζί με την παρουσία νεφρικών ανωμαλιών σε ασθενείς με ZSD υποδηλώνουν έντονα έναν σημαντικό ρόλο των υπεροξισωμάτων στηννεφρό. Επιπλέον, η ειδική για τους νεφρούς έκφραση αρκετών υπεροξυσωμικών ενζύμων υποστήριξε την ιδέα ότι τα νεφρικά υπεροξισώματα μπορεί να έχουν βιολογικές λειτουργίες εν μέρει διαφορετικές από αυτές σε άλλους ιστούς(15). Για να ελέγξουμε αυτές τις υποθέσεις, εξετάσαμενεφρική λειτουργίασε ποντίκια χωρίς υπεροξισώματα ειδικά στονεφρικό σωληνάριο. Μεταξύ διαφορετικών μοντέλων ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του ρόλου των υπεροξισωμάτων, επιλέξαμε ποντίκια που επιτρέπουν τη γενετική αδρανοποίηση υπό όρους του Pex5 που κωδικοποιεί τον παράγοντα βιογένεσης υπεροξισώματος PEX5 που είναι απαραίτητος για το σχηματισμό υπεροξισωμάτων. Αυτό το μοντέλο επιλέχθηκε επειδή τα (i)Pex5-μηδενικά ποντίκια παρουσιάζουν πολλαπλές βιοχημικές και λειτουργικές ανωμαλίες που θυμίζουν αυτές που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με ZSD(11) και (i) ένα μεγάλο φάσμα μοντέλων ποντικιών με ειδική για τον ιστό κατάλυση του Pex5 έχει αναλυθεί(16), επιτρέποντάς μας έτσι να συγκρίνουμε τις λειτουργικές συνέπειες μιας υπεροξισωμικής ανεπάρκειας στο νεφρικό σωληνάριο με αυτές που παρατηρούνται σε άλλους ιστούς. Όπως καταδεικνύεται από τους Baes et al., τα ποντίκια Pex5-null εμφάνισαν ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης, δυσπλασία του εγκεφάλου και σοβαρή υποτονία και πέθαναν μέσα στις πρώτες 72 ώρες της ζωής τους (11). Οι βιοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν αρκετά χαρακτηριστικά του ZSD, συμπεριλαμβανομένης της εξάντλησης των πλασμαγόνων στο ήπαρ και τον εγκέφαλο και μια ισχυρή αύξηση των επιπέδων του VLCFA στο πλάσμα. Δεν βρέθηκαν φλοιώδεις νεφρικές κύστεις στο νεφρό ποντικών Pex{{1{0}}μηδενικής τιμής στο P0,5, αλλά παρατηρήθηκε καθυστέρηση στην ενδομήτρια ωρίμανση των σπειραμάτων. Η παρουσία εναποθέσεων οξαλικού ασβεστίου δεν διερευνήθηκε.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε τα οφέλη του βοτάνου cistanche

Σε ποντικούς cKOm, η κατάλυση της υπεροξισωμικής βιογένεσης στο νεφρικό σωληνάριο δεν προκάλεσε κανένα κύριο φαινότυπο, εκτός από μειωμένα KW και BW σε βρέφη cKOm ποντίκια και μειωμένη αναλογία KW/BW σε ενήλικα ποντίκια cKOm. Σε ποντίκια cKOf, η ατελής εκτομή του αλληλόμορφου Pex5 μαζί με την πολύ ηπιότερη επίδραση της διαγραφής Pex5 στο νεφρικό μεταγραφικό και μεταβολισμό υποδηλώνουν ότι ορισμένα υπολειμματικά υπεροξισώματα μπορεί να παραμείνουν στο νεφρικό σωληνάριο. Ωστόσο,φύλοΗ εξειδίκευση των υπεροξισωμικών λειτουργιών στους νεφρούς δεν μπορεί επίσης να αποκλειστεί. Δεν βρήκαμε καμία σημαντική μορφολογική διαφορά στους νεφρούς ποντικών cKOm που θα μπορούσε να εξηγήσει τη χαμηλότερη αναλογία KW ή KW/BW. Ωστόσο, η τάση για μειωμένο πλάτος εγγύς κυψέλης μπορεί να είναι μια πιθανή αιτία αυτής της διαφοράς. Είναι σημαντικό, ότι η νεφρική ομοιοστατική λειτουργία διατηρήθηκε σε ποντικούς cKOm παρά τις έντονες αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαεπιθηλιακή μεταφορά ιόντων, νερού, αμινοξέων, οργανικών ανιόντων και κατιόντων, φωσφορικών, ουρικών και στα πολλαπλάσια που προκαλούνται από μεγαλίνη ενδοκυτταρική οδό του γάδου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πλειονότητα των προς τα κάτω ρυθμιζόμενων μεταγραφών κωδικοποιούσε μεταφορείς που εκφράζονται στο εγγύς σωληνάριο, ενώ τα περισσότερα από τα προς τα πάνω ρυθμισμένα μεταγραφήματα κωδικοποιούσαν μεταφορείς που εκφράζονται σε πιο απομακρυσμένα μέρη του νεφρώνα. Για παράδειγμα, η αυξημένη έκφραση των μεταγραφών Nkcc2, Clc-Kb, Ncc και ENaC πρότεινε μια αντισταθμιστική ανοδική ρύθμιση στη μετα-εγγύτερη επαναρρόφηση νατρίου. Η ολοκληρωμένη ανάλυση του νεφρικού μεταγραφώματος και του μεταβολισμού αποκάλυψε βαθιές αλλαγές σε μια ποικιλία κυτταρικών οδών που σχετίζονται με τον κυτταρικό μεταβολισμό, τη σύνθεση της λιπιδικής μεμβράνης και την οξειδοαναγωγική ομοιόσταση. Στους νεφρούς ποντικών cKOm, περίπου το 8 τοις εκατό του μεταγραφώματος και περίπου το 24 τοις εκατό των ανιχνευθέντων μεταβολιτών εμφάνισαν διαφορετικά επίπεδα σε σύγκριση με τα ποντίκια Ctrl. Όπως αναμενόταν, πολλά από αυτά τα μεταγραφήματα και μεταβολίτες σχετίζονταν με την υπεροξισωμική λειτουργία. Παρατηρήθηκε μια δραματική μείωση στην αφθονία των αιθεροφωσφολιπιδικών πλασμαγόνων που συντίθενται σε υπεροξισώματα (~67 τοις εκατό σε ποντικούς cKOm και ~50 τοις εκατό σε ποντικούς cKOf, μη σταθμισμένο άθροισμα όλων των ειδών πλασμαγόνων που ανιχνεύθηκαν). Τα πλασμαγόνα είναι κύρια φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης με έναν αυξανόμενο αριθμό αποδιδόμενων λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της ακεραιότητας της μεμβράνης, της κυτταρικής σηματοδότησης και της αντιοξειδωτικής άμυνας. Στο νεφρό, τα πλασμαγόνα αντιπροσωπεύουν περίπου το 20 τοις εκατό των συνολικών φωσφολιπιδίων(17), υποδηλώνοντας έτσι ότι τουλάχιστον το 10 τοις εκατό της σύνθεσης φωσφολιπιδίων διέφερε στους νεφρούς των ποντικών cKOm και cKOf από τους αντίστοιχους ελέγχους. Η εξάντληση των πλασμαγόνων αντισταθμίστηκε δυνητικά από μια αυξημένη αφθονία δομικά παρόμοιων φωσφατιδυλαιθανολαμινών (PEs) και από φωσφατιδυλοχολίνες (PCs), οι οποίες εμφάνισαν σημαντικό εμπλουτισμό στους νεφρούς τόσο των cKOm όσο και των cKOf ποντικών. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόμοια αντισταθμιστική αύξηση των PEs και PCs παρατηρήθηκε στους νεφρούς ασθενών με ZSD (17).

Ο μεταβολισμός του εγγύς σωληναρίου βασίζεται κυρίως στην οξείδωση των λιπαρών οξέων, η οποία χαρακτηρίζεται από μια υψηλή γενιά ROS που παράγεται τόσο στα μιτοχόνδρια όσο και στα υπεροξισώματα. Σε ποντικούς cKO, οι οδοί που σχετίζονται με την αποδόμηση/βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω, υποδηλώνοντας πιθανώς αντισταθμιστική ενίσχυση της παραγωγής μιτοχονδριακής ενέργειας από αυτά τα υποστρώματα. Δεδομένου ότι μία από τις κύριες λειτουργίες των υπεροξισωμάτων είναι η αποτοξίνωση των ROS, υποθέσαμε ότι η κατάλυση της βιογένεσης των υπεροξισωμάτων θα προκαλούσεοξειδωτικό στρεςστους νεφρούς ποντικών cKO. Ωστόσο, οι μοριακές αναλύσεις δεν αποκάλυψαν αλλαγές στην αντιοξειδωτική ικανότητα και στους βιοδείκτες του οξειδωτικού στρες. Η πρόκληση με HFD δεν προκάλεσε αλλοιώσεις στον λειτουργικό φαινότυπο, εκτός από μια ήπια αύξηση στον όγκο των ούρων και την απέκκριση ασβεστίου και ουρικού στα ούρα σε ποντικούς cKOm. Η ολοκληρωμένη ανάλυση μεταγραφώματος και μεταβολισμού επέτρεψε την ταυτοποίηση της οδού της γλουταθειόνης ως πιθανό αντισταθμιστικό μηχανισμό για τη διατήρηση της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας σε κύτταρα εγγύς νεφρικού σωληναρίου που δεν έχουν υπεροξισώματα.

Η υπό όρους διαγραφή του Pex5 στο εμβρυϊκό ήπαρ (12), στα παγκρεατικά κύτταρα (18) και σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ανασκόπηση στην αναφορά 16) προκαλεί μεταβλητές αλλά κυρίως σοβαρές λειτουργικές επιδεινώσεις ειδικών οργάνων. Αυτό δεν συνέβαινε στο νεφρό. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε αρκετούς εγγενείς νεφρικούς μηχανισμούς που δυνητικά επιτρέπουν την αντιμετώπιση της έλλειψης υπεροξισωμάτων. Καθώς ο νεφρός είναι το όργανο που εμφανίζει υψηλό ρυθμό αιμάτωσης, μια άλλη πιθανότητα έγκειται στην εξωνεφρική προέλευση τουλάχιστον ενός μέρους των μεταβολιτών που ο νεφρός δεν παράγει απουσία υπεροξισωμάτων αλλά που απαιτούνται για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Συλλογικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι τα νεφρικά σωληναριακά υπεροξισώματα είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία και ότι οι παθοφυσιολογικές αλλαγές στους νεφρούς ασθενών με ZSD είναι εξωνεφρικής προέλευσης.

Μέθοδοι

Των ζώων. Οι διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των ποντικών Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre περιγράφηκαν προηγουμένως (13). Οι 3 σειρές ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη είναι ενδογαμικά στελέχη, που εκτράφηκαν στο γενετικό υπόβαθρο του ποντικού C57BL/6J (The Jackson Laboratory). Πριν από όλα τα πειράματα, τα ποντίκια προσαρμόστηκαν σε έναν κύκλο 12-ώρας φωτός/12-ώρας σκότους. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κιρκαδικό χρόνο ZT3(ZT0είναι η ώρα που ανάβει το φως και ZT12 είναι η ώρα που σβήνει το φως).

Χρησιμοποιήθηκαν τριπλά διαγονιδιακά αρσενικά ή θηλυκά ποντίκια Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 (που αναφέρονται ως cKOm και cKOf) και ποντίκια Pex5l/a (αναφέρονται ως Ctrl ή Ctrl). Ο ανασυνδυασμός Pex5 σε νεογνά πραγματοποιήθηκε με προσθήκη 0.2 τοις εκατό DOX και 2 τοις εκατό σακχαρόζης στο πόσιμο νερό εγκύων θηλυκών ποντικών για 2 εβδομάδες, ξεκινώντας από την 14η ημέρα κύησης. Για τον ανασυνδυασμό Pex5 σε ενήλικα ποντίκια, DOX και σακχαρόζη προστέθηκαν στο πόσιμο νερό ποντικών 8-εβδομάδων. Η νεφρική δομή και λειτουργία αξιολογήθηκαν 4 εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας με DOX σε4-βρέφη ποντίκια εβδομάδων ή ενήλικα ποντίκια 14-εβδομάδων. Μετά τον απογαλακτισμό τους στις 3 εβδομάδες, τα ποντίκια τράφηκαν με μια τυπική δίαιτα ελέγχου που περιείχε 4,2 τοις εκατό λίπος (δίαιτα ελέγχου χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά Sniff) ή όταν αναφέρθηκε, για 4 εβδομάδες με ένα αντίστοιχο HFD που περιείχε 20,7 τοις εκατό λίπος (κυρίως LCFAs).

Μεταβολικοί κλωβοί και χημεία αίματος και ούρων. Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε μεμονωμένα μεταβολικά κλουβιά (Tecniplast). Η συλλογή ούρων πραγματοποιήθηκε μετά από μια περίοδο προσαρμογής 3- ημερών. Τα ούρα και η χημεία του αίματος αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (19). Η σύνθεση του πλάσματος και των ούρων μετρήθηκε στο Laboratoire Central de Chimie Clinique, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Λωζάνη, Ελβετία).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία. Τα δείγματα νεφρών κόπηκαν σε κομμάτια περίπου 1 mm³ και σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα γλουταραλδεΰδης (EMS) 2,5 τοις εκατό σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PB, 0.1 Μ pH7,4) (MilliporeSigma) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Στη συνέχεια, ξεπλύθηκαν 3 φορές, 5 λεπτά η καθεμία, σε ρυθμιστικό PB και στη συνέχεια στερεώθηκαν εκ των υστέρων με ένα φρέσκο ​​μίγμα τετροξειδίου του οσμίου 1 τοις εκατό (EMS) με 1,5 τοις εκατό σιδηροκυανιούχου καλίου (MilliporeSigma) σε PB για 2 ώρες σε RT. Τα δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές σε απεσταγμένο νερό και αφυδατώθηκαν σε διάλυμα ακετόνης (MilliporeSigma) σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις (30 τοις εκατό 90 λεπτά, 70 τοις εκατό 90 λεπτά, 100 τοις εκατό 120 λεπτά, 100 τοις εκατό 240 λεπτά). Ακολούθησε διήθηση σε ρητίνη Epon (MilliporeSigma) σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις (Επόνη/ακετόνη [1/3· v/v] 4 ώρες· Επόνη/ακετόνη [3/1; v/v] 4 ώρες, Epon/ακετόνη [1 /1·ν/ν] 8 ώρες· επόνη/ακετόνη [1/1· ν/ν] 24 ώρες) και τέλος πολυμερισμός για 48 ώρες στους 60 βαθμούς σε φούρνο. Υπερλεπτές τομές των 50 nm κόπηκαν σε Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) και συγκεντρώθηκαν σε χάλκινο πλέγμα σχισμής, 2×1 mm (EMS), επικαλυμμένο με φιλμ πολυστυρενίου (MilliporeSigma). Οι τομές χρωματίστηκαν μετά με οξικό ουρανύλιο (MilliporeSigma) 2 τοις εκατό σε Η, Ο για 10 λεπτά, ξεπλύθηκαν αρκετές φορές με Η, Ο ακολουθούμενο από κιτρικό μόλυβδο Reynolds για 10 λεπτά και ξεπλύθηκαν αρκετές φορές με Η, Ο.

Στερεολογία. Για στερεολογική ανάλυση, αναλύθηκαν 3 κομμάτια φλοιού νεφρού ανά ποντίκι, 15 μικρογραφίες ανά δείγμα με μέγεθος pixel 4,08 nm, χρησιμοποιώντας συστηματική ομοιόμορφη τυχαία δειγματοληψία με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) σε τάση επιτάχυνσης 80 kV με ψηφιακή κάμερα TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH).

Μεταγραφική ανάλυση. Όλα τα δεδομένα αλληλουχίας είναι δημόσια διαθέσιμα μέσω του NIH Gene Expression Omnibus (αριθμός πρόσβασης GSE179202). Οι βιβλιοθήκες RNA-Seq παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας 200 ng ολικού RNA νεφρού όπως περιγράφεται στους Nikolaeva et al. (19). Χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4. Τα δεδομένα αλληλουχίας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Mus musculus. Σχολιασμός γονιδίου GRCm38.86, Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε R (έκδοση 3.4.0). Οι μεταγραφές με χαμηλές μετρήσεις φιλτραρίστηκαν σύμφωνα με τον κανόνα της 1 καταμέτρησης ανά εκατομμύριο (CPM) σε τουλάχιστον 1 δείγμα. Τα μεγέθη της βιβλιοθήκης κλιμακώθηκαν χρησιμοποιώντας κανονικοποίηση TMM και μετασχηματίστηκαν σε CPM χρησιμοποιώντας voom (20). Η ανάλυση του κύριου συστατικού έδειξε μια μικρή διακύμανση μεταξύ των αντίγραφων δειγμάτων. Η διαφορική έκφραση μεταξύ cKO και Ctrl ποντικών υπολογίστηκε σε μια δοκιμή 1 F χρησιμοποιώντας limma (21). Οι τιμές P προσαρμόστηκαν όπως περιγράφηκε (22) σε τιμές FDR για να ληφθούν υπόψη για πολλαπλές συγκρίσεις, χρησιμοποιώντας αποτελέσματα όλων των μεταγραφών σε άρρενες και γυναίκες ή αποτελέσματα επιλεγμένων μεταφορέων ή μεταγραφές που σχετίζονται με υπεροξισωμικά μόνο σε άνδρες. Μεταγραφές με FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Μεταβολική ανάλυση. Μεταβολίτες από κατεψυγμένα δείγματα νεφρών ταυτοποιήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματοσκοπία μάζας υπερυψηλής απόδοσης και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας AUC (Metabolon Inc). Οι ακατέργαστες τιμές μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά και κανονικοποιήθηκαν ως προς τις μετρήσεις ακατέργαστων περιοχών. Χρησιμοποιήθηκαν αμφίδρομες δοκιμές αντίθεσης ANOVA για τον εντοπισμό βιοχημικών ουσιών που διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ποντικών cKO και Ctrl και των δύο φύλων. Οι τιμές P προσαρμόστηκαν όπως περιγράφεται (22) σε τιμές FDR για πολλαπλές συγκρίσεις και μεταβολίτες με FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Κοινή ανάλυση μεταγραφώματος-μεταβολώματος. Μια ολοκληρωμένη ανάλυση μεταβολικής οδού που συνδυάζει αποτελέσματα που λαμβάνονται από μελέτες γονιδιακής έκφρασης και μεταβολομικής διεξήχθη χρησιμοποιώντας την ενότητα Joint Pathway Analysis στον ιστότοπο MetaboAnalyst 5.0(24). Σύνθετη ονομασία μεταβολιτών και επίσημο σύμβολο γονιδίου των μεταγραφών σημαντικά περισσότερο ή λιγότερο άφθονα (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Χρωματισμοί. Χρωματισμοί της συνολικής δομής των νεφρών, εναποθέσεις οξαλικού ασβεστίου ή εναπόθεση ουδέτερου λιπιδίου πραγματοποιήθηκαν σε εγκάρσιες φέτες νεφρού που είχαν πάχος 5 μm. Εκτός από τη χρώση με ουδέτερο λιπίδιο, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και ο αριστερός νεφρός τους εγχύθηκε μέσω της κοιλιακής αορτής με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό πριν από τη συλλογή ιστού. Για ανάλυση της συνολικής δομής των νεφρών, φέτες νεφρού ενσωματωμένες σε παραφίνη αποπαραφινώθηκαν, επανυδατώθηκαν, χρωματίστηκαν με H&E, αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν σε ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH). Τα ουδέτερα λιπίδια χρωματίστηκαν σε φέτες νεφρού ενσωματωμένες σε ένωση OCT (Tissue-Tek) χρησιμοποιώντας διάλυμα Oil Red O. Οι αποθέσεις οξαλικού ασβεστίου χρωματίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Pizzolato (25). Εν συντομία, φέτες νεφρού ενσωματωμένες σε παραφίνη αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν, μετά βυθίστηκαν σε διάλυμα 1:1 νιτρικού αργύρου 5 τοις εκατό w/v και υπεροξειδίου του υδρογόνου 30 τοις εκατό και τοποθετήθηκαν κάτω από μια λάμπα 60 W για 30 λεπτά. Οι αντικειμενοφόροι πλύθηκαν καλά σε απεσταγμένο νερό και βάφτηκαν με Nuclear Fast Red (MilliporeSigma), και στη συνέχεια αφυδατώθηκαν πριν τοποθετηθούν σεROTI Histokitt. Διαμήκεις φέτες νεφρού από ποντίκι που υποβλήθηκε σε θεραπεία με δίαιτα που προκαλείται από νεφροπάθεια με οξαλικό ασβέστιο (1,5 τοις εκατό ασβέστιο συν 1,5 τοις εκατό υδροξυπρολίνη αναμεμειγμένη σε τυπική τροφή για 3 εβδομάδες) χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος των εναποθέσεων οξαλικού ασβεστίου στα νεφρά. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν σαρωτή διαφανειών Zeiss AxioScan.Z1 σε αρχική μεγέθυνση 100× ή 200×.

Δοκιμασία ELISA και Trolox. 4-Το HNE μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας υπεροξείδωσης λιπιδίων (4-HNE) από την Abcam (ab238538). Οι ολικές και μη ενζυμικές αντιοξειδωτικές ικανότητες αξιολογήθηκαν με ένα κιτ δοκιμασίας Trolox από την Abcam (ab65329).

Στατιστική. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Οι στατιστικές δοκιμές και το όριο σημαντικότητας περιγράφονται στα υπομνήματα των σχημάτων ή στις κατάλληλες ενότητες Μεθόδων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πακέτα R ή το λογισμικό GraphPad Prism έκδοση 8.2.1. Όλα τα t-test ήταν 2 ουράς.

Έγκριση μελέτης. Όλα τα πειράματα με ζώα πραγματοποιήθηκαν από τις ελβετικές κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα των ζώων, οι οποίες συμμορφώνονται με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας για τη φροντίδα των ζώων και έχουν εγκριθεί από τις ελβετικές καντονιές (Canton de Vaud) και τις ομοσπονδιακές κτηνιατρικές αρχές (εξουσιοδότηση 31827 στο DF) (Γενική οδηγία de P'agriculture, de la αμπελουργία et des affairs veterinaires, Epalinges, Ελβετία).

Προηγούμενη δημοσίευση: Ένα μέρος αυτής της εργασίας έχει υποβληθεί ως περίληψη στην Ετήσια Συνάντηση του 2021 της Αμερικανικής Εταιρείας Νεφρολογίας (4 Νοεμβρίου 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021 /program-abstract.aspx?controlId=3605774).