Κεφάλαιο 1: Τα νεφρικά σωληναριακά υπεροξισώματα είναι διαθέσιμα για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία

Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

Τα υπεροξισώματα είναι εξειδικευμένα κυτταρικά οργανίδια που εμπλέκονται σε μια ποικιλία μεταβολικών διεργασιών. Στους ανθρώπους, μεταλλάξεις που οδηγούν σε πλήρη απώλεια υπεροξισωμάτων προκαλούν πολυοργανική ανεπάρκεια (διαταραχές φάσματος Zellweger, ZSD), συμπεριλαμβανομένωννεφρική δυσλειτουργία. Ωστόσο, ο (παθο)φυσιολογικός ρόλος των υπεροξισωμάτων στονεφρόπαραμένει άγνωστη. Αναφέραμε τον ρόλο των υπεροξισωμάτων σενεφρική λειτουργίασε ποντίκια με υπό όρους αφαίρεση υπεροξισωμικής βιογένεσης στο νεφρικό σωληνάριο (ποντίκια cKO). Οι λειτουργικές αναλύσεις δεν αποκάλυψαν κανένα εμφανή φαινότυπο νεφρού σε ποντικούς cKO. Ωστόσο, τα βρέφη αρσενικά ποντίκια cKO είχαν χαμηλότερο βάρος σώματος και νεφρού και τα ενήλικα αρσενικά ποντίκια cKO εμφάνισαν σημαντικές μειώσεις στο βάρος των νεφρών και στην αναλογία βάρους νεφρού/σωματικού βάρους. Η στερεολογική ανάλυση έδειξε αύξηση στην πυκνότητα των μιτοχονδρίων σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου ποντικών cKO. Ολοκληρωμένες αναλύσεις μεταγραφώματος και μεταβολισμού αποκάλυψαν βαθύ επαναπρογραμματισμό αρκετών μεταβολικών οδών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού της γλουταθειόνης και της βιοσύνθεσης/βιομετασχηματισμού πολλών κύριων κατηγοριών λιπιδίων. Αν και αυτή η ανάλυση πρότεινε αντισταθμιστείοξειδωτικό στρες, η πρόκληση με σίτιση με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά δεν προκάλεσε σημαντικές νεφρικές δυσλειτουργίες σε ποντικούς cKO. Αποδεικνύουμε ότι τα νεφρικά σωληναριακά υπεροξισώματα είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν επίσης ότι οι νεφρικές δυσλειτουργίες σε ασθενείς με ZSD είναι εξωνεφρικής προέλευσης.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε για τα οφέλη του εκχυλίσματος cistanche tubulosa

Εισαγωγή

Τα υπεροξισώματα είναι οργανίδια συνδεδεμένα με μία μεμβράνη που βρέθηκαν για πρώτη φορά σε νεφρούς ποντικού από τον Rhodin το 1954(1). Οι τρέχουσες εκτιμήσεις δείχνουν ότι τα υπεροξισώματα περιέχουν περισσότερα από 50 ένζυμα που εμπλέκονται σε μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της -οξείδωσης λιπαρών οξέων πολύ μακράς αλυσίδας (VLCFAs), λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας (LCFAs) και δικαρβοξυλικού οξέος μακράς αλυσίδας. α-και -οξείδωση λιπαρών οξέων διακλαδισμένης αλυσίδας. οξείδωση προσταγλανδινών και λευκοτριενίων. μεταβολισμός των αμινοξέων? βιοσύνθεση αιθερικών φωσφολιπιδίων (συμπεριλαμβανομένων των πλασμαγόνων) και χολικών οξέων. ομοιόσταση οξειδοαναγωγής; αποτοξίνωση γλυοξυλικού? και φερρόπτωση. Τα υπεροξισώματα είναι πανταχού παρόντα σε όλα σχεδόν τα κύτταρα θηλαστικών, με την υψηλότερη αφθονία στα κύτταρα των εγγύς νεφρικών σωληναρίων και στα ηπατοκύτταρα. Σε αυτά τα κύτταρα, τα υπεροξισώματα καταλαμβάνουν περίπου το 3 τοις εκατό του κυτταρικού όγκου, αλλά ο αριθμός, το μέγεθος και το σχήμα τους ποικίλλουν σημαντικά κατά την εμβρυϊκή και μεταεμβρυϊκή ανάπτυξη (2). ο αριθμός τους μπορεί να αυξηθεί πολύ σε διάφορες συνθήκες στρες (3). Αν και πολλά υπεροξισωμικά ένζυμα έχουν καλά χαρακτηριστεί, οι μελέτες που αφορούν την έκφραση και τον λειτουργικό τους ρόλο στο νεφρό είναι σπάνιες. Επιπλέον, η συνολική λειτουργική συνάφεια των υπεροξισωμάτων στους νεφρούς παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Στοιχεία για το ρόλο των υπεροξισωμάτων στη νεφρική (παθο)φυσιολογία έχουν προκύψει κυρίως από μελέτες ανθρώπινης γενετικής. Έχουν εντοπιστεί δύο τύποι μεταλλάξεων που οδηγούν σε ανθρώπινες υπεροξισωμικές διαταραχές: (i) μεταλλάξεις στα αποκαλούμενα γονίδια της υπεροξίνης (PEX) που εμπλέκονται στη βιογένεση των υπεροξισωμάτων και (ii) μεταλλάξεις σε συγκεκριμένα υπεροξυσωματικά ένζυμα. Ο πρώτος τύπος μετάλλαξης οδηγεί σε γενικευμένη υπεροξισωμική δυσλειτουργία που προκαλεί εγκεφαλοηπατονεφρικές διαταραχές φάσματος Zellweger (ZSD)(4). Τα βρέφη με σοβαρές μορφές ZSD συνήθως πεθαίνουν κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους της ζωής τους από πολυοργανική ανεπάρκεια. Παρόλο που η παρουσία κύστεων του φλοιού των νεφρών και/ή νεφρικών οξαλικών λίθων σε ασθενείς με ZSD έχει τεκμηριωθεί καλά εδώ και χρόνια (5, 6), οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν σε αυτές τις βλάβες παραμένουν μέχρι στιγμής άγνωστοι. Άλλες πιθανές νεφρικές ανωμαλίες στο ZSD δεν έχουν διερευνηθεί επειδή η νόσος κυριαρχείται από νευρολογικές επιπλοκές. Η επίδραση των ενδιάμεσων ή ηπιότερων μορφών ZSD στη νεφρική λειτουργία δεν έχει αξιολογηθεί συστηματικά. Τα στοιχεία που συνδέουν την ανεπάρκεια ενός μεμονωμένου υπεροξυσωμικού ενζύμου με την παθοφυσιολογία των νεφρών παραμένουν επίσης περιορισμένα.

Μεταλλάξεις στην υπεροξισωμική αλανίνη του ήπατος: η γλυοξυλική αμινοτρανσφεράση που κωδικοποιείται από το γονίδιο AGXT οδηγεί σε πρωτοπαθή υπεροξαλουρία τύπου Ι, μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από εναπόθεση κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου στους νεφρούς (ανασκόπηση στην αναφορά 7). Πρόσφατα, μια αυτοσωματική επικρατούσα μετάλλαξη που οδηγεί στο νεφρικό σύνδρομο Fanconi, ή γενικευμένη δυσλειτουργία του εγγύς σωληνίσκου, έχει εντοπιστεί στο υπεροξισωμικό ένζυμο enoyl-CoA υδρτάση και 3-υδροξυακυλ CoA αφυδρογονάση (EHHADH)(8) . Αυτή η μετάλλαξη προκαλεί λανθασμένη στόχευση του EHHADH στα μιτοχόνδρια και διαταραχή της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Γενετικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε συγγενή στελέχη αρουραίων έδειξαν ότι το υπεροξισωμικό ένζυμο υδροξυοξέα οξειδάση 2(HAO2) μπορεί να παίζει ρόλο στον έλεγχο της αρτηριακής πίεσης (9,10). Ωστόσο, το εάν αυτός ο φαινότυπος οφείλεται στην αλλοιωμένη λειτουργία του HAO2 στους νεφρούς ή σε άλλους ιστούς παραμένει άγνωστο. Γενικά, εξακολουθούν να λείπουν δεδομένα από ζωικά μοντέλα με νεφρικά ειδικά ελαττώματα βιογένεσης υπεροξισωμάτων ή ειδική για τους νεφρούς αδρανοποίηση ενός μεμονωμένου υπεροξισωμικού ενζύμου. Εδώ, εξετάσαμε τον ρόλο των υπεροξισωμάτων στη νεφρική λειτουργία σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια με υπό όρους κατάλυση της υπεροξισωμικής βιογένεσης στο νεφρικό σωληνάριο.

Αποτελέσματα

Δημιουργία και βασικός χαρακτηρισμός βρεφών αρσενικών και θηλυκών ποντικών με υπό όρους κατάλυση υπεροξισωμικής βιογένεσης στο νεφρικό σωληνάριο. Η βιογένεση υπεροξισωμάτων στο νεφρικό σωληνάριο διαταράχθηκε μέσω της υπό όρους αδρανοποίησης του Pex5 που κωδικοποιεί τον υποδοχέα σήματος 1 (PTS1) στόχευσης του κυτοσολικού υπεροξισώματος, ο οποίος είναι απαραίτητος για την εισαγωγή πρωτεϊνών που περιέχουν μοτίβο PTS1 σε υπεροξισώματα(11,12). Η υπό όρους διαγραφή του Pex5 στο νεφρικό σωληνάριο επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα επαγόμενο από δοξυκυκλίνη (DOX-επαγώγιμα) σύστημα (ποντίκια PexSanlo/Pax{10}}rtTA/LC1, αναφ. 13). Επειδή η λειτουργική σημασία των υπεροξισωμάτων μπορεί να εξαρτάται από την ηλικία(14), ο βασικός χαρακτηρισμός της ανεπάρκειας Pex5 στους νεφρούς πραγματοποιήθηκε τόσο σε βρέφη όσο και σε ενήλικα ποντίκια. Σε πειράματα με βρέφη ποντίκια, η εκτομή του αλληλόμορφου Pex5 επετεύχθη μέσω χορήγησης DOX (2 mg/mL σε πόσιμο νερό) σε έγκυες γυναίκες στο Ε14 και διατηρήθηκε μέχρι το Ρ7. Βρέφη ποντίκια θυσιάστηκαν στο Ρ28. Ποντικοί με γονότυπο Pex5oilo χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α (συμπληρωματικό υλικό διαθέσιμο στο διαδίκτυο με αυτό το άρθρο. https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), η θεραπεία με DOX οδήγησε σε σχεδόν πλήρη εκτομή του αλληλόμορφου Pex5 στο Pexswn/Pax{{ 29}}Αρσενικά και θηλυκά βρέφη ποντίκια GTA/LC1. Η ανάλυση νεφρικών τομών δεν αποκάλυψε εμφανείς ιστολογικές ανωμαλίες ή νεφρικές πέτρες σε βρέφη ποντίκια χωρίς Pex.5 στο νεφρικό σωληνάριο (δεν φαίνεται). Η λευκωματουρία απουσίαζε σε δείγματα ούρων κηλίδων σε βρέφη ποντίκια χωρίς Pex5-και των δύοφύλα(Συμπληρωματικό Σχήμα 1Β). Το σωματικό βάρος (BW) και το βάρος των νεφρών (KW) αλλά όχι η αναλογία KW/BW ήταν χαμηλότερα σε αρσενικά βρέφη ποντίκια χωρίς Pex5- σε σύγκριση με τους συγγενείς ελέγχους (Συμπληρωματικό Σχήμα 1C).

Δημιουργία και βασικός χαρακτηρισμός ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ποντικών με υπό όρους κατάλυση υπεροξισωμικής βιογένεσης στο νεφρικό σωληνάριο. Η διαγραφή Pex5 στο νεφρικό σωληνάριο ενηλίκων ποντικών προκλήθηκε από 2-εβδομαδιαία θεραπεία με DOX αρσενικών και θηλυκών ποντικών Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1 εβδομάδων 8-εβδομάδας και θηλυκών ποντικών, εφεξής ως ποντίκια cKOm και cKOf, αντίστοιχα (βλ. Μέθοδοι). Παράλληλα, η ίδια θεραπεία DOX παρασχέθηκε στους συγγενείς τους μάρτυρες (ποντίκια Pex5a/lx, που στη συνέχεια αναφέρονται ως ποντίκια Ctrlm και Ctrlf, αντίστοιχα). Όλα τα πειράματα σε ενήλικα ποντίκια πραγματοποιήθηκαν 4 εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας με DOX. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η έκφραση του Pex5 mRNA μειώθηκε σημαντικά στους νεφρούς και των ποντικών cKOm και cKOf. Ωστόσο, σε ποντικούς cKOf, κάποιο υπολειπόμενο πλήρους μήκους mRNA του Pex5 ήταν επίσης ανιχνεύσιμο, γεγονός που υποδηλώνει ατελή εκτομή του λυγισμένου αλληλόμορφου. Ομοίως, η πρωτεΐνη PEX5 ήταν ουσιαστικά απούσα στους νεφρούς των ποντικών cKOm αλλά ακόμα ανιχνεύτηκε σε ποντίκια cKOf, αν και σε σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο. Αυτή η διαφορά ήταν ορατή όταν νεφρικά εκχυλίσματα από cKOm και cKOf ποντίκια φορτώθηκαν στην ίδια γέλη SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν μαζί (Εικόνα 1Β). Και τα δύο ποντίκια Kim και cKOf ήταν βιώσιμα, δεν εμφάνισαν εμφανείς ανωμαλίες και είχαν φυσιολογικό ΣΚ σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Οι αναλογίες KW και KW/BW ήταν σημαντικά χαμηλότερες στα ποντίκια cKOm σε σύγκριση με τα ποντίκια Ctrl αλλά όχι στα ποντίκια cKOf σε σύγκριση με τα ποντίκια Ctrlf (Εικόνες 1, C και D, αντίστοιχα). Η ανάλυση δειγμάτων ούρων και πλάσματος 24-ωρών δεν αποκάλυψε επίδραση του γονότυπου σε ποντίκια και των δύο φύλων, εκτός από τα χαμηλότερα επίπεδα καλίου στο πλάσμα σε ποντικούς cKOm σε σύγκριση με τα ποντίκια Ctrl (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Η λευκωματουρία απουσίαζε στα ούρα και των ποντικών cKOm και cKOf (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Α). Δεν παρατηρήθηκαν μεγάλες μορφολογικές αλλαγές, εναποθέσεις οξαλικού ασβεστίου ή συσσώρευση λιπιδίων στους νεφρούς ποντικών cKOm (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, BD, αντίστοιχα).

Αξιολόγηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κυττάρων εγγύς σωληναρίου σε ενήλικα ποντίκια cKO. Η αξιολόγηση του φλοιού των νεφρών με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποκάλυψε υψηλό αριθμό υπεροξισωμάτων σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου ποντικών Ctrlm και Ctrlf (Εικόνα 2, Α και Β, αντίστοιχα). Τα υπεροξισώματα ουσιαστικά απουσίαζαν στα εγγύς σωληνάρια ποντικών cKOm και cKOf (Εικόνα 2, Cand D, αντίστοιχα). Χρησιμοποιήθηκαν στερεολογικά εργαλεία για την ποσοτική ανάλυση των κυτταρικών

οργανίδια και κυτταρικές διαστάσεις σε εγγύς σωληνάρια ποντικών Ctrlm και cKOm. Τόσο η πυκνότητα όγκου των υπεροξισωμάτων (αριθμός/μm² κυτταρόπλασμα) όσο και το ποσοστό του κυτταροπλάσματος που καταλαμβάνεται από υπεροξισώματα σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου μειώθηκαν δραματικά σε ποντικούς cKOm (Εικόνα 3, Α και Β, αντίστοιχα), Αντίθετα, η πυκνότητα του μιτοχονδρίου καθώς και η πυκνότητα όγκου Το ποσοστό του κυτταροπλάσματος που καταλαμβάνεται από μιτοχόνδρια σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου, αυξήθηκε σε ποντικούς cKOm σε σύγκριση με ποντίκια Ctrl (Εικόνα 3, C και D, αντίστοιχα). Επίσης, η πυκνότητα όγκου και το ποσοστό του κυτταροπλάσματος που καταλαμβάνεται από λυσοσώματα σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου δεν ήταν διαφορετικά μεταξύ των ποντικών Kim και Ctrlm (Εικόνα 3, Ε και F, αντίστοιχα). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3G, τα εγγύς σωληνάρια από ποντίκια cKOm είχαν μειωμένο πλάτος κυττάρου (Ρ= 0.083).

Οι ολοκληρωμένες μεταγραφικές και μεταβολομικές αναλύσεις υποδηλώνουν βαθύ επαναπρογραμματισμό σε μεταβολικές, αντιοξειδωτικές και λιπιδικές οδούς σύνθεσης στους νεφρούς ποντικών cKO. Πραγματοποιήθηκε ολοκληρωμένη ανάλυση αλληλουχίας σε βάθος μεταγραφώματος και ανάλυση μεταβολισμού για τον εντοπισμό μοριακών αλλοιώσεων στους νεφρούς ποντικών cKO (GSE179202). Οι συγκρίσεις των μεταγραφωμάτων αποκάλυψαν 1350 μεταγραφές που εκφράζονται διαφορετικά σε νεφρούς ποντικών Ctrlm και cKOm (Εικόνα 4Α και Συμπληρωματικός Πίνακας 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Από το σύνολο των 852 μεταβολιτών που ανιχνεύθηκαν, 207 έδειξαν διαφορική αφθονία στους νεφρούς ποντικών Ctrlm και cKOm και 118 έδειξαν διαφορική αφθονία στους νεφρούς ποντικών Ctrlf και cKOf (Συμπληρωματικός Πίνακας 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Ανάλυση κοινής οδού (MetaboAnalyst 5.0) των μεταγραφών και των μεταβολιτών που παρουσιάζουν αυξημένη ή μειωμένη αφθονία σε νεφρούς ποντικών cKOm σε σύγκριση με ποντίκια Ctrl που εντόπισαν 22 οδούς προς τα κάτω και 7 προς τα πάνω (Εικόνα 6, Α και Β, αντίστοιχα· FDR<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Η πρόκληση σίτισης με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά δεν οδηγεί σε πρόσθετο οξειδωτικό στρες στο ckKOmice. Αλλαγές στα μονοπάτια που σχετίζονται με τη γλουταθειόνη, η εξάντληση των πλασμαγόνων και η μειωμένη έκφραση της καταλάσης υποδηλώνουν οξειδωτικό στρες και/ή αναδιάταξη διαφορετικών συστημάτων αντιοξειδωτικής άμυνας σε νεφρά ποντικών cKOm. Για να ελέγξουμε αυτές τις υποθέσεις, προκαλέσαμε ποντίκια cKOm με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD) για 4 εβδομάδες. Αυτή η πρόκληση δεν είχε ως αποτέλεσμα λευκωματουρία αλλά αυξημένο όγκο ούρων και απέκκριση ασβεστίου και ουρικού στα ούρα. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στις ελεγμένες παραμέτρους του πλάσματος, συμπεριλαμβανομένης της ασβεστιαιμίας και της ουρικαιμίας (Συμπληρωματικός Πίνακας 8). Δεν ανιχνεύθηκαν μεγάλες μορφολογικές αλλαγές ή συσσώρευση λιπιδίων στους νεφρούς ποντικών Ctrlm και cKOm που προκλήθηκαν με HFD (Εικόνα 7Α). Η ολική και η μη ενζυματική αντιοξειδωτική ικανότητα όπως αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία Trolox (Εικόνα 7Β) καθώς και τα επίπεδα μηλονοδιαλδεΰδης στους ιστούς, δείκτης υπεροξείδωσης πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Εικόνα 7C), δεν διέφεραν μεταξύ των θεραπειών και των γονότυπων. Η αφθονία του προϊόντος υπεροξείδωσης των λιπιδίων 4-υδροξυνενεάλης (4-HNE) αυξήθηκε σε ποντίκια Ctrlm που έλαβαν θεραπεία με HFD σε σύγκριση με ποντίκια Ctrl στη δίαιτα ελέγχου, αλλά δεν παρατηρήθηκε διαφορά σε ποντικούς cKOm που έλαβαν το 2 δίαιτες (Εικόνα 7Δ).