Κεφάλαιο 2: Ο παράγοντας 15 που μοιάζει με Krϋppel καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των νεφρικών σπειραματικών μεσαγγειακών κυττάρων μέσω της ενίσχυσης της σύζευξης P53 SUMO1

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Έλεγχος γονιδίων που δεσμεύουν KLF15- μέσω του ChIP-Seq σε πρωτοπαθή νεφρικά σπειραματικά MCs

Για να ταυτοποιήσουμε τα γονίδια συνεργατών άμεσης δέσμευσης του KLF15, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ChlP-Seq και τελικά εξετάσαμε 2478 γονίδια. Η ανάλυση GO αυτών των γονιδίων μέσω του εργαλείου στον ιστότοπο www.uniprot.org (Εικόνα 1Α, Β) αποκάλυψε όρους μοριακής λειτουργίας που σχετίζονται με γονίδια 1941, όρους κυτταρικών συστατικών που σχετίζονται με 1662 γονίδια και όρους βιολογικής διεργασίας που σχετίζονται με 1766 γονίδια. Δεδομένου ότι ο στόχος μας ήταν να μάθουμε πώς το KLF15 επηρεάζει τα MCs, εστιάσαμε στα γονίδια που σχετίζονται με τη διαδικασία των κυττάρων. Μεταξύ των 1315 γονιδίων που σχετίζονται με τη διεργασία των κυττάρων, βρέθηκαν 74 γονίδια να συμμετέχουν σε διεργασίες του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, αυτά τα γονίδια συμμετείχαν στον μιτωτικό κυτταρικό κύκλο, στη μετάβαση φάσης του κυτταρικού κύκλου και σε άλλες διεργασίες (Εικόνα 1C, D). Επιπλέον, αναλύσαμε τα γονίδια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και βρήκαμε ότι σχετίζονται με την αναπτυξιακή ανάπτυξη, την κυτταρική ανάπτυξη και άλλους τύπους ανάπτυξης (Εικόνα 1Ε).

3.2|Έλεγχος διαφορικά ρυθμιζόμενων γονιδίων σε KLF15-που υπερεκφράζουν νεφρικά σπειραματικά MCs χρησιμοποιώντας SILAC και LC/MS

Η ανάλυση SILAC και LC/MS των HRMCs που υπερεκφράζουν το KLF15 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα οδήγησε στην ταυτοποίηση 1357 πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήσαμε το DAVID και το IPA για να αποκτήσουμε τους τομείς GO και τις εμπλουτισμένες οδούς των ποσοτικοποιημένων πρωτεϊνών που προσδιορίζονται από το SILAC. Είναι ενδιαφέρον ότι οι όροι που σχετίζονται με τη βιολογική λειτουργία πολλών πρωτεϊνών ήταν μεταξύ των κορυφαίων 30 σημαντικά εμπλουτισμένων όρων GO, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της κυτταρικής μεταβολικής διαδικασίας αμινοξέων, του συμπλέγματος πρωτεασώματος, της δέσμευσης πρωτεϊνών και των όρων μεταγραφής και μετάφρασης, οι οποίοι σχετίζονται στενά με ουβικουϊτινοποίηση (Εικόνα 2Α). Το Σχήμα 2Β δείχνει τους κορυφαίους 30 σημαντικά εμπλουτισμένους όρους διαδρομής. Αρκετοί όροι βιολογικής διεργασίας, συμπεριλαμβανομένων των όρων πρωτεασώματος και νευροεκφυλιστικής νόσου, σχετίζονταν επίσης με την ουβικουιτίνη.

Κάντε κλικ για να μάθετε σχετικάκιστανάκιπωλείται με λεπτομέρειες

3.3|Βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων που δεσμεύουν KLF15- που συνδέονται δυνητικά με τον πολλαπλασιασμό του νεφρικού σπειραματικού MC

Για να εξερευνήσετε τα γονίδια δέσμευσης KLF15-που δυνητικά σχετίζονται μενεφρική σπειραματικήΜε τον πολλαπλασιασμό MC, πραγματοποιήσαμε μια βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων ChIP-Seq και των δεδομένων SILAC-LC/MS. Ελέγχθηκαν πενήντα δύο γονίδια (Πίνακας 2 και Εικόνα 2C) και πέντε από αυτά τα γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του SUMO1, του ανασταλτικού παράγοντα μετανάστευσης μακροφάγων (MIF), του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης (EIF), του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF) και του reticulocalbin (RCN). ), είχαν στενή σχέση μεπολλαπλασιασμός των κυττάρων. Δεδομένου ότι οι αναλύσεις GO και μονοπατιών των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών υποδεικνύουν ότι τα γονίδια που εξετάστηκαν σχετίζονταν κυρίως με τη διαδικασία ουβικουιτίνης, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το SUMO1, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών τύπου ουβικιτίνης (UBL), συμμετέχει σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση παρόμοια με ουβικουϊτινίωση ως το γονίδιο στόχο του KLF15.

Όλο και περισσότερα στοιχεία έχουν δείξει ότι η HG είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που επάγουν την ανάπτυξη διαβητικής νεφροπάθειας και προάγει τον πολλαπλασιασμό MC και την αυξημένη σύνθεση μήτρας in vitro.25 Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το PDGF-BB είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό του MC πριν από την ανάπτυξη της σπειραματοσκλήρωσης σε πειραματική σπειραματονεφρίτιδα.26 Αφού επιβεβαιώσαμε ότι τα MCs διεγέρθηκαν από HG ή PDGF-BB in vitro, εντοπίσαμε αλλαγές στην έκφραση του KLF15 και του SUMO1 τόσο στο RNA όσο και στην πρωτεΐνη

επίπεδα και διαπίστωσε ότι αυτά τα μόρια είχαν παρόμοιες τάσεις (Εικόνα 2D-l). Τέλος, προσδιορίσαμε το SUMO1 ως το γονίδιο στόχο του KLF15.

3.4|Το KLF15 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του γονιδίου SUMO{-1 δεσμεύοντας σε μια περιοχή προαγωγέα CACCCA-SUMO-1 16 bp και ένα μοτίβο πλούσιο σε C συν Α

Χρησιμοποιήσαμε τη σουίτα MEME(http://meme-suite.org/tools/meme) για να χαρακτηρίσουμε τα μοτίβα δέσμευσης KLF15-των 52 ελεγμένων γονιδίων από τα δεδομένα KLF15 ChlP-Seq και προσδιορίσαμε το μοτίβο δέσμευσης KLF (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, αναλύσαμε περαιτέρω περισσότερες από χίλιες βάσεις ανάντη του προαγωγέα SUMO1 και βρήκαμε ότι το KLF15 μπορούσε να αναγνωρίσει και να συνδεθεί σε μια αλληλουχία 16 bp (νουκλεοτίδια -205~{-199) συμπεριλαμβανομένων - CACCCA-(Εικόνα 3Β). Η ChIP-PCR επιβεβαίωσε ότι το KLF15 είναι συνδεδεμένο με τον προαγωγέα SUMO1 και τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του SUMO1 στην ομάδα αντισωμάτων αντι-KLF15 από ότι στην ομάδα ελέγχου υποβάθρου (Εικόνα 3C).

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία αναφοράς διπλής λουσιφεράσης για να επιβεβαιώσουμε τη σχέση στόχευσης μεταξύ SUMO1 και KLF15. Η άγριου τύπου ομάδα προαγωγέα SUMO1 έδειξε υψηλότερη δραστικότητα λουσιφεράσης από τον φορέα pGL3 και τις μεταλλαγμένες ομάδες στα HRMCs και η δραστηριότητα αυξήθηκε σημαντικά από την υπερέκφραση του KLF15. Οι βελτιώσεις στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης αντιστράφηκαν με επιμόλυνση με ένα πλασμίδιο που εκφράζει την περιοχή του μεταλλαγμένου προαγωγέα (Εικόνα 3D). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το SUMO1 είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του KLF15.

3.5 |Έλεγχος του P53 ως υποστρώματος SUMOylation του SUMO1

Οι τροποποιήσεις SUMO είναι ευρέως εκφρασμένες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε ευκαρυώτες. Η αναστρέψιμη σύζευξη αυτών των τροποποιήσεων σε πρωτεΐνες υποστρώματος είναι επίσης γνωστή ως SUMOylation, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των λειτουργιών των πρωτεϊνών-στόχων και περαιτέρω συμμετέχει σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η νουκλεοκυτταροπλασματική μεταφορά, η μεταγραφική ρύθμιση, η απόπτωση, η σταθεροποίηση πρωτεΐνης, οι αντιδράσεις στο στρες και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.27 Για να εξερευνήσουμε τα κατάντη μόρια σηματοδότησης που συζευγνύονται απευθείας από το SUMO1, πραγματοποιήσαμε ανάλυση δικτύου του SUMO1 χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων IPA και τα δεδομένα έδειξαν ότι το SUMO1 θα μπορούσε να συζευχθεί απευθείας με τα P53, APP, JUN και AKT, μεταξύ άλλων πρωτεΐνες (Εικόνα 4A-C). Αρχικά επιλέξαμε το P53 ως μόριο κατάντη του SUMO1 επειδή είναι μια πολύ γνωστή πρωτεΐνη που σχετίζεται στενά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.28.29 Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό SUMOsp για να προβλέψουμε τις πιθανές αλληλουχίες SUMOylation του P53invariousspecies και βρήκαμε ότι η P53 είχε την αλληλουχία SUMOylation Εικόνα 4Δ). Για να προσδιορίσουμε εάν το P53 τροποποιείται πράγματι από SUMOylation, επιμολύναμε παροδικά HRMCs με ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης SUMO1 ή SUMO1 siRNA. Τόσο τα αποτελέσματα IP όσο και τα αποτελέσματα Western blot αποκάλυψαν τάσεις στις αλλαγές έκφρασης του SUMO1-P53 και του P53 που ήταν σύμφωνες με τις αλλαγές στο SUMO1 (Εικόνα 4E-J). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το P53 είναι ένα υπόστρωμα SUMOylation του SUMO1.

3.6|Το KLF15 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό MC προάγοντας την έκφραση SUMO1 και την P53 SUMOylation

Για να καθιερωθεί η ρύθμιση της P53 SUMOylation και του πολλαπλασιασμού MC από τα KLF15 και SUMO1, παρέμβαμε με την έκφραση KLF15 ή SUMO1 σε HRMCs και αντιμετωπίσαμε τα HRMCs με PDGF-BB. Μεταξύ των HRMC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-BB, τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση των SUMO1-P53, P53, KLF15 και SUMO1 από τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο ελέγχου KLF15. Οι ίδιες αλλαγές στα SUMO1-P53, P53 και SUMO1 βρέθηκαν στα επιμολυσμένα με πλασμίδιο κύτταρα υπερέκφρασης SUMO1, ενώ η έκφραση KLF15 παρέμεινε αμετάβλητη σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 5Α-ΣΤ). Ο PDGF-BB είναι ένας από τους πιο αποτελεσματικούς αυξητικούς παράγοντες των MCs που έχουν περιγραφεί μέχρι τώρα, και παρατηρήθηκε πολλαπλασιαστική απόκριση των HRMCs στο PDGF-BB. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5G, Η, το ποσοστό των θετικών σε EdU κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά με τη χορήγηση ανασυνδυασμένου PDGF-BB. Τα αποτελέσματα χρώσης EdU έδειξαν ότι τόσο η υπερέκφραση KLF15 όσο και η υπερέκφραση SUMO1 ανέστειλαν τον επαγόμενο από PDGF-BB πολλαπλασιασμό κυττάρων (Εικόνα 5G, Η).

Για να αποκτήσουμε περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τους ρόλους του KLF15 και του SUMO1 στον πολλαπλασιασμό των HRMCs, επιμολύναμε κύτταρα μόνο με SUMO1 siRNA ή τα συνεπιμολύναμε με SUMO1 siRNA και ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15. Η καθοδική ρύθμιση του SUMO1 δεν επηρέασε την έκφραση του KLF15, αλλά τα επίπεδα έκφρασης των SUMO1-P53 και P53 μειώθηκαν προφανώς μετά τη διαμόλυνση SUMO1 siRNA (Εικόνα 6A-C). Επιπλέον, όταν η έκφραση του SUMO1 αναστέλλεται, τα επίπεδα έκφρασης SUMO1-P53 και P53 επίσης καταστέλλονται ακόμη και σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το KLF15 (Εικόνα 6D-F). Στη συνέχεια, ο πολλαπλασιασμός MC αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό χρώσης EdU. Το SUMO1 RNAi ενίσχυσε το πολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα των PDGF-BBon HRMCs και η ομάδα που συνεπιμολύνθηκε με το πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 και το SUMO1 siRNA είχε περισσότερα κύτταρα θετικά σε EdU από την ομάδα που συνεπιμολύνθηκε με το πλασμίδιο υπερέκφρασης και την υβριδική αλληλουχία ελέγχου siRNA (Εικόνα 6) . Επομένως, συμπεραίνουμε ότι το KLF15 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό MC ενισχύοντας την P53 SUMOylation.

3.7|Η σφαιρική έκφραση SUMO1 και P53 στα σπειραματικά MCs συσχετίζεται αρνητικά με τον πολλαπλασιασμό MC σε νεφρίτιδα Thy{4}} αρουραίου

Η νεφρίτιδα Anti-Thy1 είναι ένα κλασικό μοντέλο αυτοπεριοριζόμενης μεσαγγειακής πολλαπλασιαστικής σπειραματονεφρίτιδας με πολλαπλασιαστική φάση και φάση ανάρρωσης. Ενέσαμε ένα αντίσωμα Thy1 σε αρουραίους Wistar για να δημιουργήσουμε αυτό το μοντέλο. Τόσο το άζωτο ουρίας ορού όσο και η κρεατινίνη δεν έχουν σημαντική αλλαγή μεταξύ των αρουραίων ελέγχου και των αρουραίων μοντέλου (Εικόνα S1). Σημαντικός μεσαγγειακός πολλαπλασιασμός και συσσώρευση ECM παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της πολλαπλασιαστικής φάσης (ημέρες 5 και 7) στους αρουραίους μοντέλου και ο αριθμός των MCs μειώθηκε κατά τη φάση ανάκτησης την ημέρα 10 (Εικόνα 7Α). Ανιχνεύσαμε επίσης τις αλλαγές έκφρασης στον δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων PCNA με IHC (Εικόνα 7Α, Β). Τα επίπεδα του PCNA αυξήθηκαν την ημέρα 5, κορυφώθηκαν την ημέρα 7 και μειώθηκαν την ημέρα 10 (Εικόνα 7ΣΤ). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η έκφραση πρωτεΐνης των P53, SUMO1 και KLF15 σε απομονωμένα σπειράματα ήταν χαμηλότερη στις ομάδες μοντέλου από ότι στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 7C, D), σύμφωνα με τα ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα (Εικόνα 7Ε, ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο μη φυσιολογικός πολλαπλασιασμός των MCs σε αρουραίους μοντέλου αντι-Thy1 σχετίζεται με την έκφραση χαμηλού επιπέδου των KLF15 και SUMO1. Η παρέμβαση στην έκφραση αυτών των μορίων αναμένεται να ανακουφίσει τον παθολογικό φαινότυπο σε αρουραίους.

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

οσπειράματαείναι οι μονάδες φιλτραρίσματος τουνεφρό. Η διαταραχή της σπειραματικής λειτουργίας μπορεί να προκληθεί από πρωτοπαθή σπειραματική παθολογία ή μπορεί να είναι δευτερογενής σε συστηματικές ασθένειες. Μεσαγγειακές αλλαγές παρατηρήθηκαν μετά από σπειραματική βλάβη, συμπεριλαμβανομένου του υπερπολλαπλασιασμού των MCs ακολουθούμενο από υπερβολική παραγωγή ECM (μεσαγγειακή επέκταση) και παραγωγή χημειοελκυστικού για φλεγμονώδη κύτταρα. Ως εκ τούτου, η τροποποίηση των αποκρίσεων MC, ειδικά ο μη φυσιολογικός πολλαπλασιασμός, είναι μια νέα θεραπευτική προσέγγιση. Η KLF15 είναι μια πρωτεΐνη που παίζει ρυθμιστικό ρόλο ως μεταγραφικός παράγοντας δεσμεύοντας σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA. Πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι το KLF15 εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι το KLF15 συμμετέχει στην αναστολή των σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό του MC,15,30 αλλά το γονίδιο του άμεσου στόχου του δεν έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Επομένως, αυτή η μελέτη περιελάμβανε κυρίως κοινή διαλογή των επιπέδων μεταγραφής και μετάφρασης για τον εντοπισμό του άμεσου γονιδίου στόχου του KLF15.

Το KLF15 ρυθμίζει διαφορετικά γονίδια σε διαφορετικά είδη και σε διαφορετικούς ιστούς και όργανα. Στη διαδικασία ρύθμισης του πολλαπλασιασμού των MCs, το KLF15 επηρεάζει την έκφραση πολλαπλών γονιδίων και συμμετέχει σε πολλαπλές οδούς.131,32 Για να εξερευνήσουμε τα γονίδια άμεσου στόχου του KLF15, χρησιμοποιήσαμε το ChIP-Seg. Klein RH και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν ChlP-seq τεχνολογία για τη μελέτη της ρύθμισης του KLF7 στη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς.33 Οι Ying M et al χρησιμοποίησαν αυτήν την τεχνική για να μελετήσουν την ανασταλτική επίδραση του KLF9 στην πολυδυναμία του γλοιοβλαστώματος.34Σε σύγκριση με το ChlP-chip, το ChIP-Seq επιτρέπει την πραγματική ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος με υψηλότερη ανάλυση, υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης και χαμηλότερη ζήτηση μεγέθους δείγματος.35 Χρησιμοποιήσαμε ChP για να λάβουμε τα θραύσματα DNA που συνδέονται άμεσα με το KLF15 και μετά από σύγκριση και ανάλυση με την GenBank, εξετάσαμε 2478 πιθανά γονίδια-στόχους. Μέσω αναλύσεων GO και μονοπατιών, εντοπίσαμε πολλά γονίδια στόχους που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και τις διαδικασίες πολλαπλασιασμού.

Τα πειράματα ChlP-Seq απαιτούν PCR για την ενίσχυση του σήματος ανίχνευσης και κάποιος βαθμός προκατάληψης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης είναι αναπόφευκτος. Επιπλέον, το ChIP-Seq λαμβάνει μόνο τα γονίδια που μπορεί να δεσμεύσει το KLF15 και δεν υποδεικνύει τις αλλαγές που συμβαίνουν στην έκφραση αυτών των γονιδίων όταν αλλάζει η έκφραση του KLF15. Χρησιμοποιήσαμε πρωτεομική ανάλυση SILAC-LC/MS για να αντισταθμίσουμε αυτές τις ελλείψεις. Αυτή η τεχνική παρέχει πληροφορίες για όλες τις πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση αλλάζει με τη ρύθμιση από το KLF15, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών που ρυθμίζονται άμεσα από το KLF15 και των πρωτεϊνών που ρυθμίζονται έμμεσα ή τροποποιούνται μετα-μεταφραστικά. Τα HRMCs καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας SILAC και το KLF15 υπερεκφράστηκε στα κύτταρα μέσω επιμόλυνσης πλασμιδίου. Οι πρωτεΐνες συλλέχθηκαν για ανίχνευση LC/MS και ελήφθησαν 1357 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες. Οι αναλύσεις GO και μονοπατιών αποκάλυψαν ότι ορισμένες από τις διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες εμπλέκονται στην ουμπικουϊτινοποίηση. Τα δεδομένα γονιδίου και πρωτεΐνης διασταυρώθηκαν. Τα γονίδια που δεν σχετίζονται με τον ερευνητικό σκοπό και τα γονίδια που δεν ρυθμίζονται άμεσα από το KLF15 αφαιρέθηκαν. Τελικά, εξετάστηκαν 52 γονίδια. Μεταξύ αυτών, επιλέχθηκαν τα πέντε γονίδια με τις πιο εμφανείς διαφορές έκφρασης που σχετίζονταν περισσότερο με τον πολλαπλασιασμό. Δεδομένων των συνδυασμένων αποτελεσμάτων της ανάλυσης οδού, της ανάλυσης έκφρασης SUMO1 και KLF15 σε πολλαπλασιαζόμενα HRMCs, ChlP-PCR και αναλύσεις αναφοράς διπλής λουσιφεράσης, η πρωτεΐνη SUMO1 επιλέχθηκε ως το γονίδιο-στόχος του KLF15.

Εκτός από την ουβικιτίνη, ταυτοποιούνται αυξανόμενοι αριθμοί UBL πρωτεϊνών, 3637 συμπεριλαμβανομένης της SUMO, 38 νευρωνικών πρόδρομων κυττάρων που εκφράζονται, αναπτυξιακά προς τα κάτω ρυθμιζόμενης 8(NEDD8)3940 και διεγερμένου από ιντερφερόνη γονίδιο 15 (ISG15),41. Αυτές οι τροποποιητικές πρωτεΐνες ρυθμίζουν δυναμικά μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών. Η ομοιοπολική προσθήκη SUMO σε υποστρώματα, που ονομάζεται SUMOylation, είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση που εμπλέκεται σε μια σειρά κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της πυρηνικής-κυτταροπλασματικής μεταφοράς, της μεταγραφικής ρύθμισης, της απόπτωσης, του ελέγχου της πρωτεϊνικής σταθερότητας, των αποκρίσεων στο στρες και της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου.27Το SUMO είναι συνήθως συνδέεται με υπολείμματα λυσίνης δέκτη πρωτεϊνικών υποστρωμάτων που φιλοξενούν μια συναινετική αλληλουχία και συμβάλλει στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης καθώς και στην υποκυτταρική διαμερισματοποίηση και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης.2 Το sUMO1, ως μέλος της οικογένειας SUMOS, μπορεί να επηρεάσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό τροποποιώντας το υπόστρωμα και σταθεροποιώντας τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου.43 Επομένως, σε συνδυασμό με τη βιβλιογραφική αναφορά και τα ολοκληρωμένα αποτελέσματα διαλογής και ανάλυσης, εστιάσαμε στο πώς το KLF15 ρυθμίζει την επίδραση του SUMO1 στον πολλαπλασιασμό των μεσαγγειακών κυττάρων.

Για να αναγνωρίσουμε τα υποστρώματα του SUMO1, πραγματοποιήσαμε ανάλυση δικτύου του SUMO1 χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων IPA και το λογισμικό SUMOsp. Σε συνδυασμό με δημοσιευμένη έρευνα για το P53, τα αρχικά μας δεδομένα διαλογής πρότειναν το P53 ως κατάντη μόριο του SUMO1 με την αλληλουχία SUMOylation YKxD/E. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το P53 ήταν ένα υπόστρωμα της SUMOylation,45 και η ενισχυμένη σύζευξη P53 SUMO1 προήγαγε τη σταθερότητα και τη δραστηριότητα του P53 και προκάλεσε γήρανση.46 Στη μελέτη μας, η παρέμβαση στην έκφραση του SUMO1 σε HRMCs παρήγαγε τις ίδιες τάσεις αλλαγής SUMO1-P53 και P53, υποδεικνύοντας ότι το P53 ήταν ένα υπόστρωμα SUMOylation του SUMO1.

Αναδυόμενα στοιχεία έχουν δείξει ότι η SUMOylation και η de-SUMOylation παίζουν ρόλο σε πολυάριθμες νεφροπαθητικές ασθένειες, όπως η νεφρική δυσγένεση, το νεφρικό καρκίνωμα, η σπειραματική νόσος, η απόπτωση των ποδοκυττάρων και η υπερτονία του νεφρικού μυελού, η οξεία νεφρική βλάβη και η νεφρολιθίαση.{1}} Για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation και πολλαπλασιασμού MC, πραγματοποιήσαμε μια σειρά θεραπειών επιμόλυνσης σε κύτταρα που είχαν υποστεί πολλαπλασιασμό επαγόμενο από PDGF-BB. Η υπερέκφραση του KLF15 ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση του SUMO1, ενώ η υπερέκφραση του SUMO1 δεν επηρέασε την έκφραση του KLF15. Η υπερέκφραση είτε του KLF15 είτε του SUMO1 αύξησε τη SUMOylation του P53 και ανταγωνίστηκε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό που επάγεται από τον PDGF-BB. Όταν η έκφραση του SUMO1 αναστέλλεται, η SUMOylation του P53 αναστέλλεται επίσης και το KLF15 έχασε την ανταγωνιστική του επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. In vivo. ο πολλαπλασιασμός των MCs σταδιακά αυξήθηκε με την επιδείνωση της μεσαγγειακής πολλαπλασιαστικής νεφρίτιδας, ενώ η έκφραση των KLF15, SUMO1 και P53 μειώθηκε σημαντικά. Λαμβάνοντας υπόψη τις ολοκληρωμένες παρατηρήσεις σε κύτταρα και ιστούς, συμπεραίνουμε προκαταρκτικά ότι το KLF15 ρυθμίζει την SUMOylation του P53 μέσω του SUMO1, αναστέλλοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό MC.

5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι το KLF15 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των MCs. Σε αυτή την εργασία, διερευνήσαμε τους μηχανισμούς καταστολής του πολλαπλασιασμού MC που μεσολαβεί από αυτόν τον μεταγραφικό παράγοντα. Προσδιορίσαμε το SUMO1 ως τον πρωταρχικό στόχο του KLF15 σε MCs μέσω αναλύσεων βιοπληροφορικής που περιλαμβάνουν ChIP-Seq και SILAC-LC/MS. Επιπλέον, με τη βοήθεια της βάσης δεδομένων IPA και του λογισμικού SUMOsp, προσδιορίσαμε ότι το P53 ήταν ένα άμεσο υπόστρωμα του SUMO1. Πειράματα in vitro και in vivo επιβεβαίωσαν ότι το KLF15 θα μπορούσε να προάγει την έκφραση του SUMO1 και η SUMOylation του P53 στη συνέχεια να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των MCs (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα συμβάλλουν στην κατανόηση του ρυθμιστικού ρόλου του KLF15 στον πολλαπλασιασμό του MC και παρέχουν μια θεωρητική βάση για την εύρεση νέων θεραπειών για ασθένειες των νεφρών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό του MC.