Κεφάλαιο 1: Ο παράγοντας 15 που μοιάζει με Krϋppel καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των νεφρικών σπειραματικών μεσαγγειακών κυττάρων μέσω της ενίσχυσης της σύζευξης P53 SUMO1

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη

Μεσαγγειακό κύτταρο (MC)πολλαπλασιασμόςείναι ένα βασικό παθολογικό χαρακτηριστικό σε έναν αριθμό κοινού ανθρώπουνεφρικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της μεσαγγειακής πολλαπλασιαστικής νεφρίτιδας και των διαβητικών νεφροπαθειών. Η γνώση των αποκρίσεων MC σε παθολογικά ερεθίσματα είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση αυτών των διαδικασιών της νόσου. Προσδιορίσαμε προηγουμένως ότι ο παράγοντας 15 που μοιάζει με Krüppel (KLF15), ένας μεταγραφικός παράγοντας ψευδάργυρου-δακτύλου εμπλουτισμένος με νεφρό, ήταν απαραίτητος για την αναστολή του πολλαπλασιασμού MC. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε το άμεσο γονίδιο στόχο και τον υποκείμενο μηχανισμό με τον οποίο το KLF15 ρύθμιζε τον μεσαγγειακό πολλαπλασιασμό. Αρχικά, εξετάσαμε τον μικρό τροποποιητή 1 που σχετίζεται με την ουβικιτίνη (SUMO1) ως τον άμεσο μεταγραφικό στόχο του KLF15 και επικυρώσαμε αυτό το εύρημα με προσδιορισμούς ChlP-PCR και λουσιφεράσης. Επιπλέον, δείξαμε ότι η υπερέκφραση του KLF15 ή του SUMO1 ενίσχυσε τη σταθερότητα του P53, το οποίο εμπόδισε τον κυτταρικό κύκλο των ανθρώπινων νεφρικών MCs (HRMCs) και επομένως κατάργησε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αντίθετα, η μείωση του SUMO1 σε HRMCs, ακόμη και σε αυτά που υπερεκφράζονται με KLF15, δεν θα μπορούσε να αναστείλει τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού του HRMC και να αυξήσει τη SUMOylation του P53. Τέλος, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του SUMOylated P53 στους φλοιούς των νεφρών των αρουραίων μοντέλου anti-Thy 1 μειώθηκαν κατά τη διάρκεια των περιόδων πολλαπλασιασμού. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν τον κρίσιμο μηχανισμό με τον οποίο το KLF15 στοχεύει το SUMO1 για να μεσολαβήσει στον πολλαπλασιασμό των MCs.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: KLF15, μεσαγγειακός κυτταρικός πολλαπλασιασμός, P53, SUMO1

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε τα οφέλη τουκιστανάκικαι πού μπορείτε να αγοράσετε cistanche tubulosa

1| ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα μεσαγγειακά κύτταρα (MCs) αντιπροσωπεύουν περίπου το ένα τρίτο του κυτταρικού πληθυσμού εντός του σπειράματος. Παίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση διατηρώντας τη δομική αρχιτεκτονική του σπειράματος, παράγοντας και διατηρώντας τη μεσαγγειακή μήτρα, ρυθμίζοντας την επιφάνεια διήθησης και φαγοκυτταρώνοντας αποπτωτικά κύτταρα ή ανοσοσυμπλέγματα. , τα MCs τραυματίζονται και υφίστανται σημαντική αλλαγή στον φαινότυπο, με αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο μεσαγγειακό πολλαπλασιασμό και την υπερβολική εναπόθεση της μεσαγγειακής μήτρας. απελευθερώνουν φλεγμονώδεις παράγοντες, με αποτέλεσμα σπειραματική σκλήρυνση και διάμεση ίνωση. επιδεινώνουν περαιτέρω τη νεφρική βλάβη και προκαλούν εξέλιξη σε μη αναστρέψιμη νεφρική νόσο τελικού σταδίου.5-Η γνώση της ανταπόκρισης MC σε παθολογικά ερεθίσματα είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη θεραπειών για τη μείωση της νεφρικής βλάβης που προκαλείται από τον μη φυσιολογικό πολλαπλασιασμό των MC και την καθυστέρηση της εξέλιξης σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου.

Οι παράγοντες τύπου Krüppel (KLFs) είναι μια ομάδα παραγόντων μεταγραφής που δεσμεύουν το DNA του ψευδαργύρου-δακτύλου. Όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι αυτή η οικογένεια εμπλέκεται σε μια ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, η αναδιαμόρφωση της καρδιάς, η αιμοποίηση και ο προσδιορισμός της τύχης των βλαστοκυττάρων.8-10 Η οικογένεια KLF αποτελείται από δεκαοκτώ μέλη, μεταξύ των οποίων το KLF15 είναι ευρέως κατανεμημένο. στονεφρό, παγκρέας, καρδιά,συκώτι, και τους σκελετικούς μύες. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το KLF15 είναι ένας βασικός μεταγραφικός ρυθμιστής σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της γλυκονεογένεσης,ανοσοαποκρίσεις, και τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων.1-14 Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι το KLF15 απαιτείται για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των MCs.15 Αυτή η μελέτη είχε στόχο να αποσαφηνίσει το άμεσο γονίδιο στόχο και τον μηχανισμό κατάντη με τον οποίο το KLF15 ρυθμίζει τον μεσαγγειακό πολλαπλασιασμό.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 |Μοντέλο νεφρίτιδας Anti-Thy1

Αρσενικοί αρουραίοι Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) με βάρος μεταξύ 200 και 220 g κατανεμήθηκαν τυχαία στις ομάδες ελέγχου και αντι-Thy1. Όλοι οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε μια μονάδα φροντίδας ζώων υπό κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Σε όλο το πείραμα πραγματοποιήθηκαν αξιολογήσεις και παρεμβάσεις που σχετίζονται με την ευημερία. Συνολικά, 28 αρουραίοι έχουν κάνει ένεση με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Thy1 ποντικού, όπως περιγράφηκε προηγουμένως,16 και σε επτά ενέθηκαν φυσιολογικό ορό (μάρτυρες). Τα σπειράματα καθαρίστηκαν από τον ιστό του νεφρικού φλοιού χρησιμοποιώντας μια μέθοδο κοσκίνισης. Συλλέχθηκαν οροί για μετρήσεις των επιπέδων αζώτου ουρίας και κρεατινίνης ορού. Αρουραίοι μοντέλου Anti-Thy1 θανατώθηκαν τις ημέρες Ο, 3, 5, 7 και 10 και τα σπειράματά τους συλλέχθηκαν. Όλες οι διαδικασίες για την καλή διαβίωση των ζώων και οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν αυστηρά σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων (Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας των ΗΠΑ, 1996).

2.2|Καλλιέργεια και θεραπεία ανθρώπινης νεφρικής MC (HRMC).

Τα πρωτογενή νεφρικά HRMC αγοράστηκαν από την ScienCell (San Diego, CA). Τα HRMC από την τρίτη έως την έκτη διέλευση διατηρήθηκαν σε μέσο MC (MsCM, ScienCell) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για πειράματα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή, διακόπηκε η ανάπτυξη σε μειωμένο ορό (0,5 τοις εκατό FBS) για 24 ώρες και χωρίστηκαν σε διαφορετικές πειραματικές ομάδες.

Για θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε MsCM που περιείχε είτε 5 mmol/L γλυκόζη (κανονική γλυκόζη) είτε 30 mmol/L γλυκόζη (υψηλή γλυκόζη, HG) για 48 ώρες στους 37 βαθμούς C. Τα κύτταρα επωάστηκαν υπό πανομοιότυπα πειραματικά Συνθήκες με 5 mmol/L γλυκόζης και 25 mmol/L μαννιτόλης αντί για 30 mmol/L γλυκόζης χρησιμοποιήθηκαν ως ωσμωτικοί έλεγχοι. Για θεραπεία με PDGF-BB, τα κύτταρα επωάστηκαν σε MsCM που περιείχε 20ng/ml PDGF-BB(R&D Systems,Minneapolis,MN) για 48 ώρες στους 37 βαθμούς C.

2.3|Ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ο νεφρικός ιστός ενσωματωμένος σε παραφίνη τεμαχίστηκε σε πάχος 4 μm και οι τομές χρωματίστηκαν για IHC. Οι φέτες επωάστηκαν με 3 τοις εκατό Η, Ο, για να αποκλειστεί η ενδογενής υπεροξειδάση μετά την αποπαραφινοποίηση. Μετά την ανάκτηση και τον αποκλεισμό αντιγόνου, οι φέτες επωάστηκαν με αντισώματα αντι-KLF15 (ab81604, Abcam), αντι-μικρό τροποποιητή 1 (SUMO1, ab32058, Abcam) και αντι-PCNA (ab92552, Abcam) στους 4 βαθμούς C Οι φέτες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα επισημασμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά και η ανοσοϊστοχημική αντίδραση παρατηρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με 3,3'-διαμινοβενζιδίνη (DAB, ORIGINE, CN) ως χρωμογόνο παράγοντα. . Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φωτός (Olympus). Η ανοσοϊστοχημική χρώση αξιολογήθηκε με το λογισμικό Image J σύμφωνα με την τιμή μέσης οπτικής πυκνότητας (AOD).

2.4 |Ανοσοκαθίζηση χρωματίνης (ChlP) με παράλληλη αλληλουχία (ChIP-Seq)

Το ChIP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ απλού ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP (Magnetic Beads, Cell Signaling Technology) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα HRMCs υπερεκφράστηκαν είτε με KLF15 είτε με scramble σε κυτταρική πυκνότητα 2.0×103 κύτταρα/mL και διασταυρώθηκαν με 1,7 τοις εκατό φορμαλδεΰδη σε PBS για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT ). Τα διασυνδεδεμένα κύτταρα λύθηκαν για να ληφθεί το πυρηνικό κλάσμα, το οποίο υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα 1× ChIP. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στους 9300×g για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς. Τα δείγματα χρωματίνης επωάστηκαν είτε με αντίσωμα αντι-KLF15 (ab81604, Abcam) είτε με αντίσωμα anti-lgG (έλεγχος υποβάθρου) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Τα δεσμευμένα σε αντίσωμα σύμπλοκα συλλήφθηκαν με επώαση με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης G. Οι βιβλιοθήκες ChlP-Seq για αλληλούχιση παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προετοιμασίας δείγματος TruSeq ChlP (Illumina). Οι βιβλιοθήκες υποβλήθηκαν σε παράλληλη αλληλουχία με έναν HiSeq2500 sequencer (Illumina) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο μήκους αλληλουχίας 50 bp ενός άκρου. Τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) μετατράπηκαν σε αρχεία FASTQ χρησιμοποιώντας το λογισμικό CASAVA (έκδοση 1.8.2) και κάθε σύνολο δεδομένων ευθυγραμμίστηκε με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (UCSC hg19) χρησιμοποιώντας το Burrows-Wheeler Aligner (έκδοση 0.7.12 ).17 Η κλήση αιχμής ChIP-Seq πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MACS2 (έκδοση 2.0.1) με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους, αλλά τιμή υδατ. 0,05, με τα δεδομένα εισόδου για αφαίρεση.18 Σύγκριση κορυφής με τον κωδικοποιημένο έλεγχο (τα γονικά κελιά) και τα δείγματα υπερέκφρασης πραγματοποιήθηκαν με Diffbind, ένα πακέτο R, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο DeSeq2, και ένας ψευδής ρυθμός ανακάλυψης 0,1 θεωρήθηκε ότι υποδεικνύει σημαντικότητα. λογισμικό ROSE.2 βαθμός Οι κορυφές ChIP-Seq σχολιάστηκαν με το πακέτο R ChlPpeakAnno και οι υποκινητές ορίστηκαν ως περιοχές εμπλουτισμένες με KLF15- εντός 1 kb από την τοποθεσία έναρξης της μεταγραφής.21 Το γονίδιο με τη θέση έναρξης μεταγραφής πλησιέστερα στο ντο Η εισαγωγή κάθε υπερ-ενισχυτή ορίστηκε ως το γονίδιο στόχος αυτού του υπερ-ενισχυτή.

2.5|ChIP-ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (ChlP-PCR)

Η διαδικασία ChlP-PCR ήταν παρόμοια με τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. ChIP DNA από κύτταρα που είχαν υποστεί αγωγή με αντίσωμα αντι-KLF15 χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της συσχέτισης μεταξύ KLF15 και SUMO1. Ως έλεγχος χρησίμευσε DNA από κύτταρα που είχαν υποστεί αγωγή με αντίσωμα anti-lgG. Καθαρισμένο DNA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της περιοχής του εγγύς προαγωγέα SUMO1 με PCR πραγματικού χρόνου σε ABI PRISM 7600 χρησιμοποιώντας SYBR GreenER qPCR Supermix. Οι εκκινητές SUMO1 ήταν οι εξής: προς τα εμπρός: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';αντίστροφα:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Η σχετική ενίσχυση της αλληλουχίας προαγωγέα του γονιδίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το {{18 }}Μέθοδος ActT, και η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε έναντι αραίωσης 1:100 του DNA εισόδου.

2.6|Σήμανση κυττάρων και σήμανση σταθερών ισοτόπων με ανάλυση αμινοξέων σε κυτταροκαλλιέργεια (SILAC)

Κύτταρα σε συρροή 15 τοις εκατό σπάρθηκαν στο κατάλληλο πλήρες μέσο (για HRMCs: MsCM). Οι διαδικασίες επισήμανσης και SILAC έχουν περιγραφεί σε προηγούμενη έρευνα.22 Εν συντομία, μετά την επισήμανση με ελαφριά (13C,-επισημασμένη) ή βαριά (15N,-επισημασμένη) λυσίνη και ελαφριά (1c-επισημασμένη) ή βαριά (15N-επισημασμένη )αργινίνη, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 ή ένα πλασμίδιο ελέγχου. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θρυψίνη και μετρήθηκαν για να ληφθεί ένα σφαιρίδιο κυττάρων 2×10' κυττάρων/συνθήκης, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση SILAC χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας. Τα σφαιρίδια βαρέων και ελαφρών κυττάρων υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα ραδιοανοσοκαθίζησης με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης χρησιμοποιώντας σύντομες 15-δεύτερες εκρήξεις υπερήχων. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 14,000 rpm για 20 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή αμινοξέων Hitachi L-8900. Παρασκευάστηκαν κλάσματα 200 μg πρωτεΐνης από τα δείγματα, συνδυάστηκαν και καταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο καθίζησης μεθανόλης-χλωροφορμίου. Τα σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε 8 mol/L ουρίας/0,4 mol/L ρυθμιστικό διάλυμα διττανθρακικού αμμωνίου, ανήχθησαν με 45 mmol/L DTT για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς C, αλκυλιώθηκαν με 100 mmol/L ιωδοακεταμίδιο για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και πέψη με Lys-C πρωτεάση (1:20 β/β) όλη τη νύχτα (~ 16 ώρες) στους 37 βαθμούς. Η πέψη Lys-C αραιώθηκε περαιτέρω και υπέστη πέψη με θρυψίνη (1:20 β/β) για 8 ώρες στους 37 βαθμούς. Το προϊόν πέψης αφαλατώθηκε με στήλη MacroSpin (The Nest Group, Inc) και ξηράνθηκε σε συμπυκνωτή SpeedVac. Τα αφαλατωμένα πεπτίδια στη συνέχεια εμπλουτίστηκαν με φωσφοπεπτίδια χρησιμοποιώντας ρητίνη διοξειδίου του τιτανίου ενσωματωμένη σε άκρα 10 μL (Glygen Corp). Οι ροές κρατήθηκαν και τα εμπλουτισμένα πεπτίδια εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας αναλογία 1:33 υδροξειδίου του αμμωνίου προς το νερό. Τα αποξηραμένα με SpeedVac κλάσματα ροής και έκλουσης επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό) και υποβλήθηκαν σε ανάλυση υγρής χρωματογραφίας-διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC/MS).

2.7| Δοκιμασία αναφοράς διπλής λουσιφεράσης

Ανθρώπινος υποκινητής SUMO1(NM_001005781) άγριου τύπου με 1604 bp(-1474nt- συν 129nt) συμπεριλαμβανομένης της πιθανής θέσης δέσμευσης (-205nt--199nt) λήφθηκε με χρήση PCR ενισχύουν και υποκλωνοποιούνται σε ένα pGL3-Βασικό φορέα (Cat.# E1751 Promega) με θέσεις περιοριστικών ενζύμων SacI και Bgl ll, που ονομάζεται pGL3-WT-SU. Επίσης, η θέση δέσμευσης-CACCCA-μέσα στον προαγωγέα του SUMO1 μεταλλάχθηκε σε -CGTTTG-, που ονομάζεται pGL3-MT-SU. Το πλασμίδιο (pReceiver-M94) που περιείχε το πλήρους μήκους cDNA ανθρώπινου KLF15 ελήφθη από την GeneCopoeia. Το πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 και το pGL3-WT-SU ή pGL3-MT-SU επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ με αντιδραστήριο Lipofectamine 2000. Τα δείγματα στη συνέχεια συνεπιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο pRL-TK (Cat #E2241, Promega) που εκφράζει τη λουσιφεράση Renilla. Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα λύθηκαν. Τα επίπεδα δραστηριότητας της Firefly και της λουσιφεράσης Renilla εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης αναφοράς διπλής λουσιφεράσης (Biotek).

2.8 |Παρασκευή RNA, σύνθεση cDNA και ανάλυση RT-qPCR

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας TRlzol (Invitrogen) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy Mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA πρώτης έλικος ProtoScript (New England Biolabs. Η ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται για RT-qPCR παρέχονται στον Πίνακα 1.

2.9 |Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ανθρώπινο πλήρους μήκους cDNA SUMO1 (NM_003352.8) που ελήφθη από την OriGene Technologies (Πεκίνο, Κίνα) εισήχθη στο πλασμίδιο pCMV6-Entry (CAT#: RC200633). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με ένα κιτ απεικόνισης Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 6-πηγαδιού και επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο ελέγχου KLF15 (Scramble, η ομάδα VECTOR), ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 (το ίδιο παραπάνω, η ομάδα KLF15), έναν φορέα έκφρασης για το SUMO1 (η ομάδα VECTOR), ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης SUMO1 (η ομάδα SUMO1), siRNA αρνητικού ελέγχου (η ομάδα SI CON), SUMO1 siRNA (η ομάδα SI SUMO1), ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 με SUMO1 siRNA (η ομάδα KLF15 συν SI SUMO1) ή ένα πλασμίδιο υπερέκφρασης KLF15 με αρνητικό μάρτυρα siRNA (η ομάδα KLF15 συν SICON) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με ένα μέσο συμπληρωμένο με 20 ng/mL PDGF-BB για 48 ώρες και μια βελτιστοποιημένη συγκέντρωση EdU 10 μmol/L προστέθηκε περίπου 12 ώρες πριν από τη διέγερση με PDGF-BB. Μετά την κατεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό φορμαλδεΰδη, διαπερατήθηκαν με 0,5 τοις εκατό Triton X-100, πλύθηκαν με 3 τοις εκατό BSA σε PBS, επωάστηκαν με κοκτέιλ αντίδρασης Click-iT⑧ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με Ρυθμιστικό διάλυμα δράσης DAPIre για 10 λεπτά σε RT ενώ προστατεύεται από το φως. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι πυρήνες των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κόκκινο χρώμα.

2.10|Ανάλυση στυπώματος Western και ανοσοκατακρήμνιση (IP)

Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Scientific) και η συνολική πρωτεΐνη στα υπερκείμενα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Thermo Scientific). Η ανάλυση στυπώματος Western και η IP διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 23.24 Αντίσωμα κατά του KLF15 (AV32587, Merk), αντίσωμα αντι-SUMO1 (S8070, Merk) και αντι- -ακτίνη (A5316, Sigma) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. Το αντίσωμα αντι-Ρ53 (Ρ5813, Merk) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση IP.

2.11 |Ανάλυση βιοπληροφορικής

Οι υποψήφιοι από το ChIP-Seq ή το SILAC έδειξαν τουλάχιστον διπλό εμπλουτισμό σε σχέση με τους ελέγχους. Η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (GO) πραγματοποιήθηκε με τη βάση δεδομένων για σχολιασμό, οπτικοποίηση και ολοκληρωμένη ανακάλυψη (DAVID, έκδοση 6.7). Οι τιμές P προσαρμόστηκαν για τον έλεγχο πολλαπλών υποθέσεων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini-Hochberg. Σημαντικά εμπλουτισμένες κατηγορίες στην υποοντολογία συναρτήσεων και στα μονοπάτια KEGG με προσαρμοσμένη τιμή P<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SE. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS (έκδοση 20.0; SPSS Inc) και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή t Student ή την μονόδρομη ANOVA. Μια τιμή P<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">