Υπερέκφραση CD73 σε ποδοκύτταρα: Ένας νέος δείκτης τραυματισμού των ποδοκυττάρων στην ανθρώπινη νεφρική νόσο

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη:Η οδός CD73 είναι ένας σημαντικός αντιφλεγμονώδης μηχανισμός σε διάφορες ασθένειες. Παρατηρήσεις σε μοντέλα ποντικιών έδειξαν ότι το CD73 μπορεί να έχει προστατευτικό ρόλονεφρική βλάβη; Ωστόσο, καμία άμεση απόδειξη του ρόλου του στον άνθρωποΝεφρική Νόσοςέχει περιγραφεί μέχρι σήμερα. Εδώ, υποθέσαμε ότι ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων στον άνθρωπονεφρικές παθήσειςαλλάζει την έκφραση του CD73 που μπορεί να διευκολύνει τη διάγνωση των ποδοκυτταροπαθειών. Αξιολογήσαμε την έκφραση του CD73 και ενός από τους λειτουργικά σημαντικούς στόχους του, τον υποδοχέα χημειοκίνης CC τύπου 2 (CCR2), σε ποδοκύτταρα απόνεφρόβιοψίες 39 ασθενών με ποδοκυτταροπάθεια (συμπεριλαμβανομένης της εστιακής τμηματικής σπειραματοσκλήρωσης (FSGS), της νόσου ελάχιστης αλλαγής (MCD), της μεμβρανώδους σπειραματονεφρίτιδας (MGN) και της αμυλοείδωσης) και μιας ομάδας ελέγχου. Η έκφραση του ποδοκυττάρου CD73 σε καθεμία από τις ομάδες ασθενειών αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τους μάρτυρες (p < 0.0{{1{0}}1–p="">< 0,0001).="" επιπλέον,="" υπήρξε="" μια="" αξιοσημείωτη="" αρνητική="" συσχέτιση="" μεταξύ="" της="" έκφρασης="" cd73="" και="" ccr2,="" όπως="" επιβεβαιώθηκε="" από="" την="" ανοσοϊστοχημεία="" και="" τον="" ανοσοφθορισμό="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0,0313," αντίστοιχα),="" υποδηλώνοντας="" έτσι="" έναν="" προστατευτικό="" ρόλο="" του="" cd73="">νεφρική βλάβη.Τέλος, προσδιορίζουμε το CD73 ως έναν νέο δυνητικό διαγνωστικό δείκτη ανθρώπινων ποδοκυτταροπαθειών, ιδιαίτερα του MCD που ήταν διαβόητο για την έλλειψη παθολογικών χαρακτηριστικών αναγνωρίσιμα από τη μικροσκοπία φωτός και την ανοσοϊστοχημεία.

Λέξεις-κλειδιά:Ποδοκύτταρο; ασθένεια ελάχιστης αλλαγής. CD73; CCR2;νεφρική βλάβη?ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Εισαγωγή

Ο εξελικτικός κρίσιμος ρόλος της τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) ως της πανταχού παρούσας ενδοκυτταρικής πηγής ενέργειας έχει ενημερωθεί πριν από περισσότερες από τρεις δεκαετίες με μια επαναστατική αντίληψη ότι τα μέλη του πουρινεργικού συστήματος (ATP, δι- και τριφωσφορική αδενοσίνη (ADP και AMP, αντίστοιχα) μπορεί επίσης να παρέχει εξωκυτταρικά σήματα για να μεσολαβήσουν κυτταρικές αλληλεπιδράσεις [1, 2]. Αυτή η ιδέα οδήγησε στην κατανόηση ότι το πουρινεργικό σύστημα συμμετέχει στη διαμόρφωση των ανοσολογικών αποκρίσεων μέσω της διαμόρφωσης του προφίλ έκφρασης του υποδοχέα, της έκκρισης κυτοκίνης, της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και ενδοκυτταρική πέψη παθογόνου [3-7]. Το εξωκυτταρικό ATP υφίσταται μετατροπή/αποφωσφορυλίωση σε ADP και AMP μέσω CD39 (εκτο-νουκλεοσιτριφωσφορική διφωσφοϋδρολάση 1) και τελικά, το AMP αποικοδομείται σε αδενοσίνη από το CD73 (ecto-5 0) πυρήνα [8]] Το CD73 μπορεί να υπάρχει σε μεμβράνη ή σε διαλυτή μορφή Η μεμβράνη έχει δομή διμερούς που αποτελείται από δύο ίδιες υπομονάδες 70 kD που συνδέονται με της πλασματικής μεμβράνης μέσω μιας σύνδεσης μεταξύ της C-τερματικής σερίνης και της γλυκοσυλφωσφατιδυλικής ινοσιτόλης (GPI) [9]. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα υποστρώματα CD39 ATP και ADP φαίνεται να είναι ανταγωνιστικοί αναστολείς του CD73 [9-11]. Η έκφραση CD73 αντιπροσωπεύει έτσι την κρίσιμη οδό συντονισμού του επιπέδου αδενοσίνης στον εξωκυτταρικό χώρο. Το CD73 δεν είναι συγκεκριμένο μόριο κυττάρου ή οργάνου. η έκφρασή του σε λευκοκύτταρα, ενδοθήλιο, επιθηλιακά ή μεσεγχυματικά κύτταρα διαφόρων οργάνων (νεφρό, του πνεύμονα, του ήπατος, του παχέος εντέρου, του εγκεφάλου και της καρδιάς) και των βλαστοκυττάρων έχει τεκμηριωθεί καλά [12-14]. Ένας προστατευτικός ρόλος της αδενοσίνης μέσω της οδού σύνθεσης του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) σε μια βλάβη που προκαλείται από ισχαιμία του ήπατος αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Peralta et al. [15]. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, η δράση του έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει την οξεία πνευμονική βλάβη, την απόρριψη των αεραγωγών αλλομοσχεύματος, την οξεία νόσο μοσχεύματος έναντι του ξενιστή και τη σήψη [4,16-19].

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Όπως αποδεικνύεται πειστικά σε πολλά μοντέλα ποντικών, το CD73 μπορεί να συμμετέχει στη σωληναριακή αλληλεπίδραση στονεφρό. Η προκαλούμενη από CD{0}}δημιουργία αδενοσίνης που προέρχεται από το CD73 από ATP σωληναριακής προέλευσης κατά τη διάρκεια βλάβης ισχαιμίας-επαναιμάτωσης έχει αποδειχθεί ότι εξασθενεί τη φλεγμονή μέσω της αναστολής της τελεστικής λειτουργίας των ουδετερόφιλων [20]. Επιπλέον, τα ποντίκια με ανεπάρκεια CD73-εμφανίζουν αυτοάνοση φλεγμονή που συνοδεύεται από μειωμένο αριθμό ποδοκυττάρων και ενδοθηλιακές οπές [21]. Αυτό το φαινόμενο συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών στον ορό, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF)-άλφα ή ο μοτίβος 2 της χημειοκίνης CXC (CXCL-2). Στο σκηνικό του ανθρώπουΝεφρική Νόσος,Έχει υποστηριχθεί ότι η βλάβη των ποδοκυττάρων πιθανότατα αντιπροσωπεύει ένα μείγμα προσαρμοστικών και καταστροφικών μηχανισμών κυτταρικής απόκρισης σε παθολογικά ερεθίσματα, που δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα δημοσιευμένες παρατηρήσεις από in vitro ή ζωικά μοντέλα. Η αιτιολογία του τραυματισμού των ποδοκυττάρων ποικίλλει από μηχανικό στρες (σπειραματική υπερδιήθηση), οξειδωτικό στρες (όπως στην υπερτασική ή διαβητική νεφροπάθεια, τοξικό τραυματισμό, διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων ή ζωικά μοντέλα ασθένειας ελάχιστης αλλαγής) έως ανοσολογικό στρες (δηλαδή, βλάβη που προκαλείται από ανοσοσύμπλεγμα και συμπλήρωμα κατά τη διάρκεια σπειραματονεφρίτιδας) [22]. Η φλεγμονώδης ρύθμιση της σπειραματονεφρίτιδας μπορεί να διεγείρει τα ποδοκύτταρα να συνθέσουν διάφορες κυτοκίνες, πιθανώς μέσω σηματοδότησης με τη μεσολάβηση του υποδοχέα χημειοκίνης CC 2 (CCR2). Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο του CD73 στον άνθρωποΝεφρική Νόσος, ειδικά σε συνθήκες χρόνιας φλεγμονής και τραυματισμού των ποδοκυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι το CD73 παίζει ρόλο στην παθογένεση των ανθρώπινων σπειραματικών παθήσεων και αναλύσαμε την έκφραση του CD73 του ποδοκυττάρου στον άνθρωπονεφρόβιοψίες από ασθενείς με παθολογίες που σχετίζονται με την ποδοκυτταροπάθεια. Αποδεικνύουμε ότι η επιφανειακή έκφραση των ποδοκυττάρων του CD73 είναι ένας αξιόπιστος δείκτης βλάβης των ποδοκυττάρων, υποστηρίζοντας έτσι ιδιαιτέρως τη διαγνωστική αξία του CD73 στη νόσο ελάχιστης αλλαγής (MCD). Επιπλέον, αναφέρουμε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των ποδοκυττάρων CCR2 και CD73, υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του CD73 αντιπροσωπεύει μια προσαρμοστική απόκριση στη σπειραματική βλάβη.

Αποτελέσματα

Κλινικά Δεδομένα και Υπερδομική Απεικόνιση Βλαβών ΠοδοκυττάρωνΟ Πίνακας 1 περιγράφει την κλινική παρουσίαση των περιπτώσεων που περιλαμβάνονται στη μελέτη σχετικά με την ηλικία, το φύλο, την κρεατινίνη και τις τιμές ολικής πρωτεϊνουρίας. Όλοι οι ασθενείς με FSGS είχαν μια πρωτογενή μορφή NOS (δεν προσδιορίζεται διαφορετικά). Μεταξύ 12 ασθενών με MGN, 5 ήταν θετικοί στον υποδοχέα φωσφολιπάσης Α2 (PLA2R) (42 τοις εκατό). Στην ομάδα της αμυλοείδωσης, 2 ασθενείς είχαν ΑΑ-αμυλοείδωση (16,7 τοις εκατό) και 10 AL-αμυλοείδωση (83,3 τοις εκατό). σε 2 ασθενείς με ελαφριά αλυσίδα κάππα AL-αμυλοείδωσης ήταν εμφανής (20 τοις εκατό) και 8 ήταν θετικοί στο λάμδα (80 τοις εκατό της ομάδας AL-αμυλοείδωσης). Σε όλους τους ασθενείς με MCD, FSGS, MGN και αμυλοείδωση, η βλάβη των ποδοκυττάρων ανιχνεύθηκε ξεκάθαρα με ηλεκτρονική μικροσκοπία (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Υπερδομική εικόνα πρωτογενούς και δευτερογενούς βλάβης των ποδοκυττάρων. (α) Εξάπλωση του σώματος του ποδοκυττάρου σε σπειραματική βασική μεμβράνη (βέλος) με ανάκληση των διεργασιών του ποδιού σε περίπτωση MCD. (β) Εκτεταμένη εξάλειψη της διεργασίας του ποδιού ποδοκυττάρου (βέλος) και κυτταροπλασματική κενοτόπιση (αστέρι) σε ασθενή με πρωτοπαθή FSGS. ( γ ) Εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού (βέλος), κενοτόπιση και προεξέχοντα οργανίδια (διπλό βέλος) με υποκείμενο επιμεμβρανώδες υλικό πυκνότητας ηλεκτρονίων (αστέρι) στην πρωτοπαθή μεμβρανώδη σπειραματονεφρίτιδα. (δ) Υποεπιθηλιακή συσσώρευση ινιδίων αμυλοειδούς (βέλος δύο κεφαλών) με διαδοχική αποκόλληση ποδοκυττάρων (ως σημάδι μη αναστρέψιμης βλάβης των ποδοκυττάρων) σε ασθενή με AL-αμυλοείδωση (λάμδα). Όλες οι ηλεκτρονικές μικρογραφίες παρουσιάζονται σε μεγέθυνση 4000 ×. Ένθετα—αντίστοιχες φωτομικρογραφίες μικροσκοπίου φωτός (40 × /0,65 NA, μέγεθος ράβδου κλίμακας: 50 μm σε (a,c,d) και 100 μm στο (β), χρώση PAS).

Η επιφανειακή έκφραση του CD73 σχετίζεται με τραυματισμό των ποδοκυττάρων στην ανθρώπινη νεφρική νόσο

Για να διερευνηθεί εάν τα ποδοκύτταρα εκφράζουν το CD73 στο φυσιολογικό περιβάλλον και για να αξιολογηθεί το μοτίβο του CD73 αδιάφορων ρυθμίσεων ασθενειών που σχετίζονται με βλάβη στοποδοκύτταρο, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης CD73. Η υπερδομική ανάλυση επιβεβαίωσε τη βλάβη των ποδοκυττάρων ως κυτταροσκελετική ανωμαλία με τουλάχιστον εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού (Εικόνα 1). Στην ομάδα αρνητικών μαρτύρων μας χωρίς αλλοίωση των ποδοκυττάρων, δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σημαντική έκφραση του CD73 από ποδοκύτταρα παρά τη θετικότητα ενός εσωτερικού μάρτυρα (περισωληνοειδή τριχοειδή αγγεία) που συνήθως χρωματίζεται θετικά (Εικόνα 2). Από την άλλη πλευρά, οι ομάδες βλάβης των ποδοκυττάρων (MCD, FSGS, MGN και αμυλοείδωση) εμφάνισαν στατιστικά πολύ σημαντική ανοδική ρύθμιση του ποδοκυττάρου CD73 (p < 0.{{1{{2{25}}}}}}="" 001);="" η="" σημαντική="" αύξηση="" ήταν="" συνεπής="" και="" όταν="" συγκρίθηκαν="" μεμονωμένες="" οντότητες="" με="" αρνητικούς="" ελέγχους="" (p="" τουλάχιστον="">< 0,001).="" είναι="" ενδιαφέρον="" ότι="" η="" έκταση="" της="" ανοδικής="" ρύθμισης="" του="" cd73="" έτεινε="" να="" είναι="" χαμηλότερη="" στην="" ομάδα="" mcd,="" αν="" και="" σημαντικά="" χαμηλότερη="" μόνο="" σε="" σύγκριση="" με="" δείγματα="" mgn="" (p="0.0043)" (εικόνα="" 2).="" σε="" ομάδες="" βλάβης="" των="" ποδοκυττάρων,="" δεν="" υπήρχε="" συσχέτιση="" μεταξύ="" της="" ημιποσοτικής="" βαθμολογίας="" cd73="" και="" της="" πρωτεϊνουρίας="" σε="" δυαδικό="" (νεφρωσικό/μη="" νεφρωσικό)="" ή="" ποσοτικό="" (g/24="" h)="" επίπεδο="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" .6302="" και="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," αντίστοιχα·="" εικόνα="" 3a).="" συνολικά,="" δεν="" υπήρχε="" συσχέτιση="" μεταξύ="" της="" βαθμολογίας="" cd73="" και="" του="" επιπέδου="" κρεατινίνης="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259·" εικόνα="" 3β).="" επιπλέον,="" δεν="" μπορέσαμε="" να="" εντοπίσουμε="" σημαντική="" συσχέτιση="" μεταξύ="" της="" έκφρασης="" cd73="" και="" της="" υπέρτασης="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0,8384)" ή="" του="" σακχαρώδους="" διαβήτη="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45="">

Η ανοδική ρύθμιση του CD73 που προέρχεται από ποδοκύτταρα στην ανθρώπινη σπειραματική νόσο συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση του υποδοχέα CCR2 και δεν συσχετίζεται με την έκφραση της νεφρίνης και της ποδοκίνηςΕκτιμώντας τα δημοσιευμένα δεδομένα σχετικά με τη μείωση της έκφρασης του CCR2 των μακροφάγων μετά από υπερέκφραση CD73 σε ένα μοντέλο βλαστοκυττάρων, υποθέσαμε ότι η ανοδική ρύθμιση του CD73 κατά τη διάρκεια τραυματισμού των ποδοκυττάρων συσχετίζεται αντιστρόφως με την έκφραση του προφλεγμονώδους CCR2 και πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση CCR2. Στην ομάδα ελέγχου, δεν μπορούσε να ανιχνευθεί καμία ή μόνο ήπια έκφραση του CCR2, χωρίς σημαντική απόκλιση σε σύγκριση με την υπογραφή CD73 στα ίδια δείγματα. Αντίθετα, ως επί το πλείστον σημαντική ανοδική ρύθμιση της επιφανειακής CCR2 (αλλά διαφορετικής έντασης) μπορούσε να παρατηρηθεί στην πλειονότητα των δειγμάτων από βιοψίες βλάβης των ποδοκυττάρων και γενικά ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p=0.0206; Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Οι ομάδες ασθενειών δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους ως προς αυτό.

Αναλύσαμε περαιτέρω μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ των εντάσεων έκφρασης του CD73 και του CCR2. Πράγματι, συγκρίνοντας τις βαθμολογίες CD73 και CCR2 από την κοόρτη βιοψίας τραυματισμού ποδοκυττάρων, μπορούσε να παρατηρηθεί μια αξιοσημείωτη αρνητική συσχέτιση (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (Εικόνα 4). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα σπειράματα με CD{11}θετικά ποδοκύτταρα έτειναν να εμφανίζουν μειωμένη έκφραση CCR2 όχι μόνο στα ποδοκύτταρα αλλά και στα γύρω κύτταρα, όπως τα βρεγματικά επιθηλιακά κύτταρα (Εικόνα 4). Η αντίστροφη συσχέτιση επιβεβαιώθηκε με αξιολόγηση της ανοσοφθορισμού συν-χρώσης για CD73/CCR2 σε κατεστραμμένα ποδοκύτταρα με ομοεστιακή μικροσκοπία (Spearman r=- 0,4478, p=0,0282), (Εικόνα 5). Για να αντιμετωπίσουμε την ενδεχόμενη συσχέτιση μεταξύ της θετικότητας CD73 και της (απώλειας) έκφρασης πρωτεΐνης ειδικής για τα ποδοκύτταρα, πραγματοποιήσαμε πρόσθετες πρόσφατες ανοσοφθορικές βαφές για νεφρίνη και ποδοκίνη και αξιολογήσαμε το πρότυπο έκφρασής τους σε ομάδες ελέγχου, MCD και FSGS (Εικόνα 6α) καθώς και συν-χρώση με CD73 σε δείγματα με αλλοίωση ποδοκυττάρου (Εικόνα 6β–ε). Δεν μπορέσαμε να εντοπίσουμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της μέσης έντασης φθορισμού της έκφρασης της ποδοκίνης ή της νεφρίνης στη μία πλευρά και της μέσης έκφρασης του CD73 στην άλλη (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 για ποδοκίνη και n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 για νεφρίνη).

Συζήτηση

Περιγράφουμε εδώ για πρώτη φορά την έκφραση του CD73 στην επιφάνεια τραυματισμένων ποδοκυττάρων στον άνθρωπονεφρική νόσο. Αναλύονταςνεφρώνβιοψίες από ασθενείς με εμφανή βλάβη των ποδοκυττάρων, όπως σε MCD, FSGS, MGN και αμυλοείδωση, αναφέρουμε σημαντική αύξηση της έκφρασης CD73 του ποδοκυττάρου σε κάθε μία από αυτές τις ομάδες σε σύγκριση με τον έλεγχονεφρά,ανεξάρτητα από την αιτιολογία της βλάβης των ποδοκυττάρων. Επιπλέον, αναφέρουμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CD73 και CCR2 από ποδοκύτταρα ομάδων βλάβης ποδοκυττάρων. Η ενισχυμένη ειδική για τα ποδοκύτταρα CCR2 έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί διαβήτηνεφρική βλάβησε ποντίκια [23]. Επιπλέον, ο αποκλεισμός του CCR2 σε ένα μοντέλο FSGS ποντικού που προκαλείται από την Αδριαμυκίνη έχει αναφερθεί ότι μειώνει την πρωτεϊνουρία και τη σπειραματική βλάβη [24]. Μια πρόσφατη μελέτη από τους Lee et al. - χρησιμοποιώντας επίσης ένα μοντέλο ποντικού - υποδεικνύει ότι η μείωση του CCR2 μπορεί να βελτιώσει την επαγόμενη από παχυσαρκία λευκωματουρία μέσω αποκλεισμού του οξειδωτικού στρες και της συσσώρευσης λιπιδίων [25]. Πράγματι, σε ένα in vitro σύστημα που χρησιμοποιεί μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSC) από περικαρδιακό ιστό ποντικού, έχει αποδειχθεί ότι τα CD{7}}υπερεκφραστικά MSCs υπαγορεύουν τις επανορθωτικές διεργασίες μέσω αντιφλεγμονώδους δραστηριότητας, μεταξύ άλλων παραγόντων που οφείλονται επίσης στην αναστολή του CCR {9}}θετική διήθηση μακροφάγων [ 13 ]. Ως εκ τούτου, υπό το φως των αποτελεσμάτων μας και των δημοσιευμένων δεδομένων, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η έκφραση του CD73 από τα ποδοκύτταρα μπορεί να δράσει προστατευτικά σενεφρική βλάβη, πιθανώς μέσω μονοπατιών που εξασθενούν το CCR2. Η σηματοδότηση CCR2 σχετίζεται στενά με την προσκόλληση και την ενεργοποίηση των μακροφάγων [26, 27]. Καθώς τα μακροφάγα μπορεί να επηρεάσουν την παθογένεση της σχετιζόμενης με την ποδοκυτταροπάθειανεφρικές παθήσεις(όπως το πρωτογενές MGN, όπου η διήθηση των CD68 plus , CCR2 plus μακροφάγων έχει αναγνωριστεί ως σημαντικός δείκτης τελικού σταδίουΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ[28]), περαιτέρω μελέτες συσχέτισης μεταξύ του περιεχομένου μονοκυττάρων/μακροφάγων, της προέλευσης (διήθηση έναντι του κατοίκου), των προφίλ ενεργοποίησης (M1—προφλεγμονώδη έναντι Μ2—εναλλακτικά ενεργοποιημένη) και της έκφρασης CD73 στον άνθρωποΝεφρική Νόσοςείναι απαραίτητο να ελέγξουμε τη συμφωνία των αποτελεσμάτων μας με προηγούμενα δεδομένα από μοντέλα ποντικών.

Σε ένα φλεγμονώδες μικρό περιβάλλον που μπορεί να παρατηρηθεί σε υποξία, ισχαιμία-επαναιμάτωση ή βλάβη του αυτοάνοσου ιστού, πολλαπλά κύτταρα απελευθερώνουν μέλη του πουρινεργικού συστήματος σηματοδότησης, κυρίως με τη μορφή προφλεγμονώδους ATP ή ADP [29, 30]. Σε αυτές τις ρυθμίσεις, η εξω-νουκλεοτιδάση CD73 και το προϊόν της αδενοσίνης είναι σημαντικοί παράγοντες για τη ρύθμιση και τη σίγαση της ανοσοαπόκρισης. Σε ζωικά μοντέλα, το CD73 έχει αποδειχθεί ότι είναι προστατευτικόνεφρόισχαιμική βλάβη επαναιμάτωσης και η ανεπάρκειά της προκάλεσε δυσλειτουργία των ποδοκυττάρων, που οδηγεί σε αυτοάνοση φλεγμονή καιΝεφρική Νόσος[21, 31]. Άλλα πειράματα in vivo σε ποντίκια με χρήση τραυματισμού επαναιμάτωσης ισχαιμίας αποκάλυψαν τη σημαντική αντιφλεγμονώδη επίδραση του CD73 που εκφράζεται από τα εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και την κρίσιμη δράση του σενεφρόπροστασία κατά τη διαβητική νεφροπάθεια μέσω σηματοδότησης υποδοχέα αδενοσίνης-ενδοθηλίου Adora2b [20,32]. Οι ποδοκυτταροπάθειες είναι η πιο συχνή ομάδα σπειραματικών αλλοιώσεων που οδηγούν σε πρωτεϊνουρία. Η MCD, μια πρωτότυπη «πρωτοπαθής» ποδοκυτταροπάθεια, είναι η πιο κοινή αιτία νεφρωτικής πρωτεϊνουρίας σε παιδιά ηλικίας > 1 έτους [33, 34]. Οι τρέχουσες υποθέσεις σχετικά με την παθογένεση του MCD υποδηλώνουν σημαντικό ρόλο των κυτοκινών και άλλων ανοσομεσολαβητών στη διαταραχή της ακεραιότητας της βασικής μεμβράνης των ποδοκυττάρων-σπειραματικών [35-38]. Η ασυμφωνία μεταξύ της απουσίας ορατών αλλαγών στο μικροσκόπιο φωτός και της σοβαρής πρωτεϊνουρίας είναι το χαρακτηριστικό γνώρισμα της MCD. Η υπερδομική απόδειξη της βλάβης των ποδοκυττάρων με ηλεκτρονική μικροσκοπία είναι επομένως απαραίτητη προϋπόθεση για τη διάγνωση της MCD μέχρι σήμερα. Αυτός ο διαγνωστικός αλγόριθμος τονίζει τη σημασία περαιτέρω διαγνωστικών εργαλείων πρώτης γραμμής από αυτή την άποψη. Η εξέταση της έκφρασης του CD73, ειδικά σε συνθήκες περιορισμένης διαθεσιμότητας ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, μπορεί επομένως να βοηθήσει στη διαφοροποίηση μεταξύ σπειραματικής (δηλαδή, ποδοκυτταροπαθητικής) και εξωσπειραματικής (π.χ. σωληναριακή ή παραπρωτεϊναιμική) πηγών πρωτεϊνουρίας. Η σύγκριση μεταξύ ανοσοϊστοχημείας και ανοσοφθορισμού στη μελέτη μας θα μιλούσε υπέρ του τελευταίου.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Αρκετές δημοσιεύσεις έχουν τεκμηριώσει πειστικά την ανώμαλη κατανομή και απώλεια ειδικών για τα ποδοκύτταρα πρωτεϊνών σε διάφοραΝεφρική Νόσοςρυθμίσεις που περιλαμβάνουν τραυματισμό των ποδοκυττάρων και πρωτεϊνουρία, όπως αναθεωρήθηκαν πρόσφατα [39]. Στη μελέτη μας, εντός της ομάδας βλάβης των ποδοκυττάρων, δεν μπορέσαμε να εντοπίσουμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έντασης του φθορισμού ποδοκίνης/νεφρίνης και της έντασης της έκφρασης CD73. Ωστόσο, ειδικοί περιορισμοί αποκλείουν την παθοφυσιολογική ερμηνεία της ποδοκίνης/νεφρίνης έναντι των στατιστικών δεδομένων CD73. Πρώτον, για την αξιολόγηση της έντασης του φθορισμού επιλέξαμε τα ποδοκύτταρα χρησιμοποιώντας τις δυνατότητες τεχνικής μεγέθυνσης και ανάλυσης της ομοεστιακής μικροσκοπίας. Αν και αυτές οι συνθήκες επιτρέπουν εύκολα την ανίχνευση σωμάτων ποδοκυττάρων, οι κύριες διεργασίες και ιδιαίτερα οι διεργασίες του ποδιού παραμένουν ασαφείς, επομένως πιθανώς να μην έχουν επισημανθεί/αναλυθεί. Δεύτερον, η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του CD73 και των ειδικών για τα ποδοκύτταρα πρωτεϊνών σε ολόκληρα σπειράματα δεν μπορεί να δικαιολογηθεί: αν και η αξιολόγηση της ποδοκίνης και της νεφρίνης σε αυτό το επίπεδο θα ήταν θεμιτή (καθώς είναι λογικό να υποθέσουμε ότι κανένα άλλο σπειραματικό κύτταρο δεν εκφράζει αυτές τις πρωτεΐνες) αυτό δεν μπορεί να αξιώνεται για το CD73 το οποίο εκφράζεται εν μέρει τουλάχιστον από ενδοθηλιακά κύτταρα. Τρίτον, η αξιολόγηση της μέσης έντασης φθορισμού και μόνο ως ανεξάρτητος δείκτης τραυματισμού των ποδοκυττάρων είναι αμφισβητήσιμη, καθώς δεν καλύπτει το παθολογικό, κοκκώδες πρότυπο κατανομής της ποδοκίνης και της νεφρίνης εντός του σπειράματος, το οποίο θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε ξεκάθαρα στο Σχήμα 6. Επομένως, είμαστε απρόθυμοι να αποδώσουμε την απουσία συσχέτισης CD73-podocin και CD73-νεφρίνης στην ανάλυσή μας σε αποκλίνουσες μοριακές οδούς αυτών των δεικτών. Περαιτέρω μελέτες σε ποδοκύτταρα in vitro και σε ζώα είναι απαραίτητες για τη διερεύνηση ενδεχόμενης παρεμβολής μεταξύ αυτών των καταρρακτών σηματοδότησης.

Συνολικά, αναγνωρίζοντας το μικρό μέγεθος δείγματος ως τον κύριο περιορισμό της μελέτης μας, επιδεικνύουμε εδώ συνεπή υπερέκφραση CD73 από τραυματισμένα ποδοκύτταρα και προτείνουμε το CD73 ως νέο διαγνωστικό δείκτη ποδοκυτταροπάθειας. Σε ασθένεια ελάχιστης αλλαγής, τα αποτελέσματά μας μπορεί να βοηθήσουν στον εντοπισμό κατεστραμμένων ποδοκυττάρων και να οδηγήσουν σε μια λιγότερο χρονοβόρα και χρονοβόρα διαγνωστική διαδικασία. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας συμβαδίζουν με δημοσιευμένα δεδομένα από πειραματικές προσεγγίσεις σε ποντίκια και προτείνουν μια προστατευτική αλληλεπίδραση μεταξύ CD73 και CCR2 στον άνθρωποΝεφρική Νόσος. Περαιτέρω πολυκεντρικές μελέτες με μεγαλύτερες κοόρτες ασθενών είναι απαραίτητες για την αντιμετώπιση μηχανισμών σηματοδότησης CD73 στον άνθρωπονεφρότης νόσου και της προγνωστικής της αξίας. Ομοίως, θα χρειαζόταν μεγαλύτερος αριθμός κοόρτης για να δημιουργηθεί μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ της σοβαρότητας της νόσου και της έκφρασης CD73.

Υλικό και μέθοδοι

Κοόρτη ΜελέτηςΣυνολικά 49 βιοψίες που συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη από 49 διαφορετικούς ασθενείς διαγνώστηκαν μεταξύ 1ης Ιανουαρίου 2018 και 31ης Δεκεμβρίου 2019 στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Μανχάιμ, στο Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης. Περαιτέρω κριτήρια επιλογής ήταν μια αντιπροσωπευτική βιοψία με δυνατότητα διενέργειας τριπλής διάγνωσης με ανοσοϊστοχημεία και ΕΜ, επαρκείς κλινικές πληροφορίες, σαφής διάγνωση και επαρκές υλικό για αυτή τη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς ήταν ενήλικες και Καυκάσιοι. Οι έρευνες περιελάμβαναν 39 βιοψίες από ασθενείς με τραυματισμό των ποδοκυττάρων ποικίλης αιτιολογίας (7 βιοψίες από ασθενείς με πρωτοπαθή εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση—FSGS· 8 από νόσο ελάχιστης μεταβολής—MCD· 12 από ασθενείς με μεμβρανώδη σπειραματονεφρίτιδα—MGN· 12 από ασθενείς με αμυλοειδίτιδα). Οι αρνητικοί έλεγχοι ήταννεφρόβιοψίες από 10 ασθενείς χωρίς βλάβη των ποδοκυττάρων και χωρίς πρωτεϊνουρία (6 ασθενείς με ήπια νεφροσκλήρωση, 2 ασθενείς με διάμεση νεφρίτιδα και 2 ασθενείς χωρίς παθολογικές αλλαγές). Όλες οι προαναφερθείσες βιοψίες συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση της έκφρασης CD73 του ποδοκυττάρου. για το CCR2, μετά τον αποκλεισμό τμημάτων παραφίνης με ανεπαρκή αριθμό μη σκληρωτικών σπειραμάτων (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">

Ιστολογία, Ανοσοϊστοχημεία, Ανοσοφθορισμός και Ηλεκτρονική ΜικροσκοπίαΟι σειριακές τομές 1 μm έγιναν σε ενσωματωμένες σε παραφίνηνεφρόβιοψίες και χρώση με αιματοξυλίνη/ηωσίνη (H/E), περιοδικό οξύ-Schiff (PAS), χρώση τριχρωμίου Masson καθώς και τυπική ανοσοϊστοχημεία ρουτίνας για διαγνωστικούς σκοπούς. Ανοσοϊστοχημική και ανοσοφθοριστική χρώση βιοψιών ενσωματωμένων σε παραφίνη μονιμοποιημένη με φορμαλίνη διεξήχθη με το χέρι χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινου CD73 κουνελιού (κλώνος D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt am Main, Γερμανία) και μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ποντικού (7κλώνος CCR2; Abcam, Cambridge, UK), πολυκλωνικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα κουνελιού στη νεφρίνη (Abcam, Cambridge, UK) και αντίσωμα κατά της ανθρώπινης ποδοκίνης κουνελιού (Sigma, Saint Louis, MO, ΗΠΑ), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Όλες οι βιοψίες συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση της έκφρασης του ποδοκυττάρου CD73 με ανοσοϊστοχημεία. για το CCR2, τομές παραφίνης με ανεπαρκή αριθμό μη σκληρωτικών σπειραμάτων (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

Μικροσκοπία φωτός και Μορφομετρικές ΑναλύσειςΗ λήψη και η ανάλυση της εικόνας έγιναν χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο σάρωσης PreciPoint M8 με Olympus PlanCN 40 × /0.65 και το λογισμικό MicroPoint (έκδ. 5 Μαΐου 2016; PreciPoint, Freising , Γερμανία). Η ημιποσοτική αξιολόγηση της επιφανειακής έκφρασης του ποδοκυττάρου CD73 στην ανοσοϊστοχημική χρώση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια κλίμακα βαθμολόγησης 0-3 (0-καμία έκφραση, 1-εστιακή τμηματική θετικότητα (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 τοις εκατό ποδοκύτταρα θετικά σε<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 τοις εκατό σπειράματα). Τα θετικά και αρνητικά ποδοκύτταρα CD73 αναλύθηκαν για συνέκφραση CCR2 χρησιμοποιώντας ένα ημιποσοτικό σύστημα βαθμολόγησης που βασίζεται στην ένταση (0-καμία έκφραση, 1-ασθενής έκφραση, 2-μέτρια έκφραση και 3-ισχυρή έκφραση, σύμφωνα με βιοψία-εσωτερικό θετικό έλεγχο CCR2- ενδοθήλιο και διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος). Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους (SP και ZP) με τυφλό τρόπο.

Συνεστιακή μικροσκοπίαΟι εικόνες CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) και πυρήνων (DAPI) ποδοκυττάρων αποκτήθηκαν διαδοχικά με το μηχανοκίνητο ομοεστιακό μικροσκόπιο Olympus FV1000 εξοπλισμένο με HeNe 594 nm, Αργόν 488 nm και σωλήνες φωτοπολλαπλασιαστή 405 nmlaser και φωτοπολλαπλασιαστή (PMTs) UV που ελέγχονται από το λογισμικό FluoView, με χρήση του αντικειμενικού φακού UPlanSApo 60 × /1,35. Οι εικόνες 12-bit με πλαίσια 512 × 512 pixel και μέγεθος pixel 0,41 μm για επισκόπηση και 0,10 μm για υψηλή ανάλυση αποκτήθηκαν διατηρώντας σταθερές όλες τις ρυθμίσεις στο μικροσκόπιο. Οι εικόνες υποβλήθηκαν σε περαιτέρω ημιαυτόματη επεξεργασία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μακροεντολή ImageJ που αναπτύχθηκε εσωτερικά (ημερομηνία πρόσβασης: 15 Δεκεμβρίου 2020). Σύντομα, οι εικόνες τμηματοποιήθηκαν για μεμονωμένα ποδοκύτταρα, εφαρμόστηκε ο ουδός και μετρήθηκε η μέση ένταση, αναλύθηκε στατιστικά και σχεδιάστηκε. Όλες οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σταθερές ρυθμίσεις και εμφανίστηκαν με το ίδιο ψευδόχρωμο εξίσου γραμμικά προσαρμοσμένο για μεμονωμένα κανάλια σε συγχωνευμένες εικόνες

Στατιστικές αναλύσειςΟι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPadPrismv. 8.4.3 λογισμικό (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ΗΠΑ). Όλα τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM. Οι στατιστικές διαφορές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ζεύγη ή μη ζευγαρωμένη t-test καθώς και ανάλυση συσχέτισης Pearson, όπως υποδεικνύεται.