Επίδραση του Bixie Qianlie An Wan στο μονοπάτι TLR4/NF-κB/NLRP3 και στην πυρόπτωση στη χρόνια μη βακτηριακή προστατίτιδα

 

Περίληψη

Σκοπός:Για τη διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο το Bixie Qianlie An Wan αντιμετωπίζει τη χρόνια μη βακτηριακή προστατίτιδα (CNP) μέσω της διαμόρφωσης της πυρόπτωσης που προκαλείται από το μονοπάτι σηματοδότησης TLR4/NF-κB/NLRP3.
Μέθοδοι:Αρσενικοί αρουραίοι SD εγκλιματίστηκαν για 1 εβδομάδα. Δέκα αρουραίοι χρησίμευσαν ως τυφλό μάρτυρα και 10 ως μάρτυρας εικονικής λειτουργίας. Σαράντα αρουραίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός μοντέλου CNP με ενδοπροστατική ένεση 1% καραγενάνης. Το μόντελινγκ πέτυχε μέσα σε 1 εβδομάδα. Οι αρουραίοι-μοντέλοι χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες (n=10 η καθεμία): μοντέλα και ομάδες Bixie Qianlie An Wan χαμηλής, μεσαίας και υψηλής δόσης. Οι ομάδες φαρμάκων έλαβαν εναιωρήματα στα 2,7 g/kg·d, 5,4 g/kg·d, και 10,8 g/kg·d, αντίστοιχα. άλλες ομάδες έλαβαν αποστειρωμένο νερό με καθετήρα μία φορά την ημέρα για 30 ημέρες. Μετά την τελική χορήγηση, συλλέχθηκαν αίμα κοιλιακής αορτής και αμφοτερόπλευροι ιστοί προστάτη. Υπολογίστηκε ο δείκτης προστάτη. Ο ορός IL-1 , IL-18 και TNF- μετρήθηκαν με ELISA. Η φλεγμονώδης διήθηση του προστάτη αξιολογήθηκε με χρώση Η&Ε. Η κατανομή και η έκφραση του NLRP3 αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Η ένταση φθορισμού GSDMD ποσοτικοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό. Τα επίπεδα πρωτεΐνης των TLR4, MyD88, NF-κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1 και GSDMD ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western.
Αποτελέσματα:Ο δείκτης του προστάτη μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα μεσαίας δόσης (P<0.05). Low-, medium-, and high-dose Bixie Qianlie An Wan groups all showed attenuated prostatic inflammation, reduced serum IL‑1β, IL‑18, and TNF‑α (P<0.05), significantly decreased NLRP3 expression (P<0.05), and reduced GSDMD fluorescence intensity (P<0.05). Western blot showed downregulation of TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1, and GSDMD proteins in prostate tissue (P<0.05).
Συμπέρασμα: Το Bixie Qianlie An Wan μειώνει τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και βελτιώνει τη φλεγμονή του προστάτη σε αρουραίους CNP, πιθανότατα αναστέλλοντας την πυρόπτωση μέσω της διαμόρφωσης της οδού σηματοδότησης TLR4/NF-κB/NLRP3.

Λέξεις-κλειδιά:Bixie Qianlie An Wan;χρόνια μη βακτηριακή προστατίτιδα; κυτοκίνες; Μονοπάτι σηματοδότησης TLR4/NF‑κB/NLRP3. κυτταρική πυρόπτωση

 

Συμπλήρωμα Cistanche Pills με εκχύλισμα υψηλών προδιαγραφών

Οφέλη Cistanche για τη θεραπεία της προστατίτιδας

 

 

 

Φόντο

Η χρόνια μη βακτηριακή προστατίτιδα (CNP) είναι μια από τις πιο συχνές διαταραχές στους άνδρες μετά την εφηβεία. Συνιστάται εξατομικευμένη, πολυτροπική θεραπεία. Παρόλο που είναι διαθέσιμα φάρμακα, βιοανάδραση, θερμοθεραπεία και άλλες προσεγγίσεις, τα θεραπευτικά αποτελέσματα παραμένουν μη βέλτιστα, μειώνοντας ουσιαστικά την ποιότητα ζωής. Η αιτιολογία και η παθογένεση της CNP είναι πολύπλοκες και δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, καθώς περιλαμβάνουν λοίμωξη, αυτοάνοση, ενδοκρινική ανισορροπία, νευρική πλαστικότητα και ψυχοκοινωνικούς παράγοντες. Η φλεγμονή θεωρείται ευρέως ως κεντρική για την έναρξη και την εξέλιξη της CNP.

Η οδός TLR4/NF-κB διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, ρυθμίζοντας την παραγωγή προφλεγμονωδών παραγόντων και ενεργοποιώντας την κατάντη φλεγμονή. Το NF-κB ξεκινά τη μεταγραφή του pro-IL-1 και του pro-IL-18, προάγοντας την εξέλιξη της φλεγμονώδους νόσου και η ενεργοποίησή του σχετίζεται με τη φλεγμονώδη δραστηριότητα του NLRP3.

Οι τρέχουσες θεραπείες για το CNP είναι ποικίλες, ωστόσο η υποτροπή είναι συχνή και η θεραπεία δύσκολη. Το Bixie Qianlie An Wan είναι ένα παρασκεύασμα που χρησιμοποιείται για περισσότερα από 10 χρόνια για την παραδοσιακή κινεζική ιατρική μοτίβο νεφρικής ανεπάρκειας με υγρή θερμότητα και στάση αίματος στη χρόνια προστατίτιδα. Η προκαταρκτική κλινική εργασία έδειξε ότι μπορεί να βελτιώσει τις βαθμολογίες NIH-CPSI και να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, οι μηχανισμοί του παραμένουν ασαφείς. Αυτή η μελέτη διερευνά τις αλλαγές έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με TLR4/NF-κB/NLRP3 για να αποσαφηνίσει περαιτέρω τους πιθανούς μηχανισμούς του Bixie Qianlie An Wan στη θεραπεία της CNP.

Υλικά

Ζώα

Εξήντα αρσενικοί αρουραίοι SD (μέσο βάρος σώματος 205±30 g) ελήφθησαν από το Shandong Experimental Animal Center (Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd.), την άδεια παραγωγής SCXK(Lu) 2019-0003 και την άδεια χρήσης SYXK(Yu)2001. Τα ζώα στεγάστηκαν σε χωριστά κλουβιά στο Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής της Χενάν. Αριθμός έγκρισης δεοντολογίας: DWLL202306012.

Φάρμακα και αντιδραστήρια

 

Bixie Qianlie An Wan (νοσοκομειακό παρασκεύασμα, Επαρχιακό Νοσοκομείο Henan της TCM, βότανα φόρμουλας πιστοποιημένα από το Κέντρο Ε&Α προετοιμασίας TCM του νοσοκομείου). Για τους αναγνώστες στην ανάπτυξη φυτικών συμπληρωμάτων, σημειώστε: το κύριο λειτουργικό συστατικό που τονίζεται για μεταφραστική εξέταση εδώ είναι το Cistanche (αντικαθιστά την αρχική κύρια εστίαση βοτάνων για εφαρμογή).

Carrageenan (Shanghai Macklin Biochemical)

10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη (Βιοτεχνολογία ενζυμικής σύνδεσης της Σαγκάης)

Κιτ ELISA για IL‑18, IL‑1 , TNF‑ (Jiangsu Meimian Industrial; κατ. MM‑0047R1, MM‑0194R1, MM‑0180R1)

Κιτ χρώσης H&E (Shanghai Sunbio; κατ. ST2023)

Πρωτεύοντα αντισώματα: TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, GSDMD (Beijing Bioss; bs‑1021R, bs‑1047R, bs‑0982R, bs‑0982R, bs‑0982R, bs‑0982R, bs‑1‑R, bs‑201‑R, bs‑R, bs‑14287R); Caspase‑1 (Abcam/AIbo, ab179515)

Μέθοδοι

Μοντελοποίηση και διοίκηση

Ένα μοντέλο CNP προκλήθηκε με έγχυση διαλύματος καραγενάνης 1% (0,1 mL/αρουραίο, 50 μL σε κάθε ραχιαίο προστατικό λοβό) υπό ενδοπεριτοναϊκή αναισθησία (3% πεντοβαρβιτάλη νάτριο, 30 mg/kg). Η εικονική ομάδα έλαβε τον ίδιο όγκο φυσιολογικού ορού στις ίδιες θέσεις. Η ημερήσια δόση του Bixie Qianlie An Wan για ενήλικες είναι 30 g. χρησιμοποιώντας αναλογία μετατροπής επιφάνειας σώματος ανθρώπου προς αρουραίο 6,3 (ανά Φαρμακολογική Πειραματική Μεθοδολογία), οι ισοδύναμες δόσεις αρουραίου ορίστηκαν ως χαμηλές 2,7 g/kg·d, μέτρια 5,4 g/kg·d και υψηλές 10,8 g/kg·d. Το φάρμακο σε σκόνη εναιωρήθηκε φρέσκο ​​σε φυσιολογικό ορό καθημερινά. Από την 7η ημέρα μετά την επιτυχή μοντελοποίηση, οι αρουραίοι λάμβαναν καθετηριασμό μία φορά την ημέρα για 30 διαδοχικές ημέρες (φάρμακο ή αλατούχο διάλυμα ίσου όγκου).

 

Δειγματοληψία

Αφού καταγράφηκαν τα βάρη νηστείας, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν. Το αίμα της κοιλιακής αορτής συλλέχθηκε σε σωλήνες κενού, αφέθηκε να παραμείνει και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για 10 λεπτά. Ο ορός κατανεμήθηκε σε δείγματα και αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς. Οι ραχιαίοι προστατικοί λοβοί ανατέμθηκαν. Ο αριστερός λοβός σταθεροποιήθηκε σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη σε θερμοκρασία δωματίου. ο δεξιός λοβός καταψύχθηκε γρήγορα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς.

Χρώση H&E
Οι σταθεροποιημένοι ιστοί ξεπλύθηκαν και αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένων αιθανολών (75%, 85%, 95%, 100%), καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο, διηθήθηκαν με παραφίνη/ξυλόλιο, ενσωματώθηκαν και τεμαχίστηκαν στα 4 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με Η&Ε και εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός για την αξιολόγηση της ιστοπαθολογίας.

ELISA για κυτοκίνες ορού
Οδηγίες ανά κιτ, 100 μL/φρεάτιο δειγμάτων, πρότυπα και αραιωτικό προστέθηκαν στα τρυβλία, ακολουθούμενα από επώαση αντισωμάτων με επισήμανση (2 ώρες, RT, σκούρο), πέντε πλύσεις, επώαση HRP (1 ώρα), πλύσεις, ανάπτυξη TMB (30 λεπτά), διάλυμα διακοπής και μέτρηση A450. Υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές απορρόφησης.

 

Ανοσοϊστοχημεία για NLRP3

Οι τομές αποπαραφινώθηκαν, επανυδατώθηκαν, υποβλήθηκαν σε ανάκτηση θερμικού αντιγόνου, αποκλεισμό ενδογενούς υπεροξειδάσης (3% H2O2) και αποκλεισμό. Εφαρμόστηκε πρωτεύον αντίσωμα anti-NLRP3 (4 βαθμοί, ολονύκτια), ακολουθούμενο από δευτερεύουσα επώαση αντισωμάτων, ανάπτυξη DAB, αντιχρώση αιματοξυλίνης, διαβαθμισμένη αφυδάτωση αλκοόλης, τοποθέτηση ουδέτερης ρητίνης και απεικόνιση. ImageJ ποσοτικοποιημένη μέση οπτική πυκνότητα (MOD=IOD/Περιοχή).

Ανοσοφθορισμός για GSDMD
Οι αποπαραφινισμένες τομές υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου, αποκλεισμό ορού, επώαση πρωτογενούς και δευτερογενούς αντισώματος, πυρηνική αντιχρώση DAPI, απόσβεση αυτοφθορισμού, τοποθέτηση και απεικόνιση. Το κανάλι DAPI εμφανίζει πυρήνες (μπλε). Το κανάλι CY3 δείχνει θετικό σήμα (κόκκινο). ImageJ ποσοτικοποιημένο MOD (IOD/Περιοχή).

 

Western blot

Οι ιστοί του προστάτη ομογενοποιήθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Τα υπερκείμενα (12.000 r/min, 4 βαθμοί, 20 λεπτά) συλλέχθηκαν για SDS-PAGE (7,5% γέλες· 80 V 30 λεπτά μετά 120 V 50 λεπτά), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες, μπλοκαρίστηκαν με 5% TBST-γάλα (2 ώρες), επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα (5:50) 10 νύκτα. στους 4 βαθμούς, στη συνέχεια δευτερογενή αντισώματα (1-2 ώρες), που αναπτύχθηκαν με χημειοφωταύγεια και απεικονίστηκαν. Το GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. σχετική έκφραση=στόχος/GA PDH κλίμακα του γκρι.

 

Στατιστική

Χρησιμοποιήθηκε το GraphPad Prism 9.0. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SD. Οι συγκρίσεις ομάδων χρησιμοποίησαν μονόδρομη ANOVA με δοκιμές t ανεξάρτητα δείγματα. Π<0.05 was considered statistically significant.

 

Βασικά ευρήματα για τους κατασκευαστές συμπληρωμάτων βοτάνων

 

Το Bixie Qianlie An Wan μείωσε τις συστημικές προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1, IL-18, TNF-), βελτίωσε την ιστολογική φλεγμονή και μείωσε τη σηματοδότηση του φλεγμονώδους σήματος TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 και την πυρόπτωση που προκαλείται από τον εκτελεστή καρκινώματος του γονιδίου MD.

Μεταφραστική σημείωση: Δίνοντας έμφαση στο Cistanche ως το κύριο βοτανικό για τις εργασίες σύνθεσης, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη διερεύνηση συνθέσεων με επίκεντρο το Cistanche που στοχεύουν το TLR4/NF‑κB/NLRP3 για τον μετριασμό της φλεγμονής του προστάτη και της πυρόπτωσης.

 

Προεπισκόπηση επόμενου άρθρου

Σε ένα έγγραφο παρακολούθησης, αναλύουμε περαιτέρω τη συμβολή των εμπλουτισμένων με Cistanche κλασμάτων, των δεικτών δόσης-απόκρισης και ποιότητας και επικυρώνουμε τον αντιπυροπτωτικό μηχανισμό με αναστολείς οδού, παρέχοντας πρακτική καθοδήγηση για την ανάπτυξη συμπληρωμάτων με βάση το Cistanche.