Το κατάλληλο επίπεδο άσκησης εξασθενεί τη δυσβίωση του εντέρου και την αύξηση του βαλερικού οξέος για τη βελτίωση της νευροπλαστικότητας και της γνωστικής λειτουργίας μετά από χειρουργική επέμβαση σε ποντίκια Μέρος 4

Προφίλ της μικροχλωρίδας του εντέρου

Συλλέχθηκαν φρέσκα κόπρανα από ποντίκια για τον προσδιορισμό του προφίλ της μικροχλωρίδας του εντέρου. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε κλουβί σε αυτόκλειστο για τη συλλογή περιττωμάτων και τους αφέθηκαν να αφοδεύσουν ελεύθερα. Τα κόπρανα συλλέχθηκαν αμέσως στους αποστειρωμένους σωλήνες Eppendorf σε ξηρό πάγο και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία. Το DNA των βακτηρίων εξήχθη με ένα κιτ απομόνωσης εδάφους Power Lyzer Power σύμφωνα με τα προηγούμενα πρωτόκολλά μας [11].

Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι το μικροβίωμα του εντέρου έχει πολύ σημαντικό αντίκτυπο στη μνήμη μας. Ακριβώς, τα βακτήρια στη μικροχλωρίδα του εντέρου μπορούν να επηρεάσουν το νευρικό σύστημα του ανθρώπινου εγκεφάλου, μεταβάλλοντας έτσι τη λειτουργία της μνήμης του. Αυτό είναι ένα εκπληκτικό εύρημα γιατί σημαίνει ότι μπορούμε να ενισχύσουμε τη μνήμη μας αλλάζοντας το μικροβίωμα του εντέρου μας.

Λοιπόν, ως κάποιος που προσπαθεί να βελτιώσει τη μνήμη του, τι μπορείτε να κάνετε για να βελτιώσετε το μικροβίωμα του εντέρου σας; Η απάντηση είναι απλή: επικεντρωθείτε σε μια ισορροπημένη διατροφή. Μια ισορροπημένη διατροφή όχι μόνο βοηθά στη ρύθμιση της ισορροπίας της μικροχλωρίδας του εντέρου σας, αλλά βελτιώνει επίσης όλες τις πτυχές της λειτουργίας του σώματος.

Πρώτον, πρέπει να επικεντρωθούμε σε μια διαφοροποιημένη διατροφή που είναι πλούσια σε διαιτητικές ίνες. Μια δίαιτα πλούσια σε φυτικές ίνες μπορεί να βοηθήσει στη διατήρηση της ποικιλομορφίας του μικροβιώματος του εντέρου σας, έναν βασικό παράγοντα για την προώθηση της καλής υγείας. Ταυτόχρονα, πρέπει επίσης να διασφαλίσουμε ότι καταναλώνουμε αρκετή πρωτεΐνη υψηλής ποιότητας και υγιή λίπη στα γεύματά μας. Αυτά τα θρεπτικά συστατικά μπορούν να προάγουν τη λειτουργία της μνήμης και την αγωγιμότητα των νεύρων.

Επιπλέον, η τακτική άσκηση και η μείωση του στρες μπορούν επίσης να προάγουν την ισορροπία και την ποικιλομορφία στο μικροβίωμα του εντέρου. Είτε πρόκειται για βαθιά αναπνοή, διαλογισμό ή γιόγκα, αυτοί είναι όλοι αποτελεσματικοί τρόποι για να μειώσετε το άγχος. Η άσκηση μπορεί να βελτιώσει τη συσταλτικότητα του εντέρου, να αυξήσει τη ζωτικότητα του εντέρου και να προωθήσει την κυκλική αποτοξίνωση, συμβάλλοντας έτσι στην προώθηση της ισορροπίας και της ποικιλομορφίας της εντερικής μικροχλωρίδας.

Συνολικά, δεν πρέπει να επικεντρωνόμαστε μόνο στη διατροφή και τη σωματική μας υγεία αλλά και στη μικροχλωρίδα του εντέρου μας. Η αλλαγή των διατροφικών μας συνηθειών και η μείωση του στρες μπορεί να προωθήσει την ισορροπία και την ποικιλομορφία στη μικροχλωρίδα του εντέρου μας, κάτι που μπορεί να μας βοηθήσει να βελτιώσουμε τη μνήμη και τη λειτουργία του νευρικού συστήματος. Ας προσέξουμε λοιπόν μαζί την υγεία του εντέρου μας και ας βελτιώσουμε τη μνήμη και τη φυσική μας κατάσταση!

Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό υλικό που έχει πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche deserticola προέρχεται από τα πολλά ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με διάφορους τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Οι βιβλιοθήκες αλληλουχίας της υπερμεταβλητής περιοχής V3–V4 προετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του συστήματος Illumina MiSeq. Εν συντομία, 12,5 ng DNA χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο DNA για την πρώτη 16 S rRNA PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: F: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGNGGCWGCAG-3'και R: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAT'{10}CC.
Στη συνέχεια, τα αμπλικόνια καθαρίστηκαν με σφαιρίδια AMPure XPmagnetic και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για Index PCR χρησιμοποιώντας το κιτ Nextera XTIndex. Το κιτ ανάλυσης Qubit dsDNA HS και η TapeStation υψηλής ευαισθησίας D1000ScreenTape (Agilent, Blacksburg, VA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των προϊόντων PCR και την κανονικοποίηση της ποσότητας για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης.

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε σε όργανο Illumina MiSeq από το κιτ αντιδραστηρίων MiSeq v2 (500 κύκλοι). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό MiSeqReporter Metagenomics v2.5.1.3 (Illumina, San Diego, CA, USA). Οι ζευγαρωμένες αναγνώσεις που λήφθηκαν με αλληλουχία διπλού τερματικού συνδέθηκαν σε μια ακολουθία μέσω του λογισμικού Pandaseq. Λήφθηκαν οι μεγάλες αναγνώσεις με περιοχές υψηλής μεταβλητής.

Οι αναγνώσεις των οποίων η μέση βαθμολογία phred στο παράθυρο (μέγεθος 5 bp, μήκος βήματος 1 bp) ήταν μικρότερη από 20 περικόπηκαν. Οι αναγνώσεις που περιείχαν διφορούμενο "N" ή με μήκος < 220 bp απορρίφθηκαν. Μετά τον ποιοτικό έλεγχο των αρχικών δεδομένων, Οι ακολουθίες υψηλής ποιότητας χωρίς χίμαιρες ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την αφθονία από μεγάλες έως μικρές και στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν με ομοιότητα 97% σε Επιχειρησιακές Ταξονομικές Μονάδες (OTU). Κάθε OTU θεωρήθηκε ότι αντιπροσωπεύει ένα είδος. Για να αποφευχθεί η απόκλιση της ανάλυσης που προκαλείται από τα διαφορετικά μεγέθη των δεδομένων προσδιορισμού αλληλουχίας δειγμάτων, ο αριθμός των Reads σε OTU εισήχθη σύμφωνα με τον ελάχιστο αριθμό αλληλουχίας που ταιριάζει με το OTU όταν το βάθος προσδιορισμού αλληλουχίας ήταν επαρκές. Η άλφα ποικιλομορφία αναλύθηκε με τυχαία ισοπέδωση.

Το ARead εξήχθη από κάθε OTU ως αντιπροσωπευτική ακολουθία. Η αντιπροσωπευτική αυτή αλληλουχία συγκρίθηκε με τη βάση δεδομένων έργου ριβοσωμικής βάσης δεδομένων. Τα είδη ταξινομήθηκαν για κάθε OTU και λήφθηκαν πίνακες αφθονίας ειδών για επακόλουθη ανάλυση. Η επιλογή OTU πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Uclust στην πλατφόρμα λογισμικού QIIME v1.9.1.

Για την ανάλυση της ποικιλότητας των ειδών σε ένα δείγμα χρησιμοποιήθηκε η ποικιλότητα άλφα, συμπεριλαμβανομένου του δείκτη Chao1 και του δείκτη κάλυψης αγαθών. Η ανάλυση βήτα ποικιλότητας χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν οι διαφορές στην ποικιλότητα των ειδών μεταξύ των δειγμάτων και χαρακτηρίστηκε από ανάλυση κύριας συντεταγμένων (PCoA) με βάση την απόσταση Bray–Curtis. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δοκιμάστηκαν με ανάλυση ομοιότητας (ANOSIM).

Προφίλ πλάσματος SCFA

Οι συγκεντρώσεις SCFA στο πλάσμα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας 7890-5977 γασχρωματογραφίας (GC-MS, Agilent, Blacksburg, VA, USA). Δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν από ποντίκια σε χρονικά σημεία που περιγράφονται παραπάνω, αποθηκεύτηκαν στους -8{ {20}} βαθμούς γρήγορα και στη συνέχεια αποψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για επεξεργασία. Εν συντομία, ένα δείγμα πλάσματος 100 μΙ αναμίχθηκε με στροβιλισμό με 900 ουλεθανόλη (που περιείχε 0,5% HCl, V/V). Εφαρμόστηκε επεξεργασία με υπερήχους για 40 λεπτά και στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 14,000 RPM για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο των δειγμάτων μετρήθηκε με ανάλυση GC-MS σε anAgilent 7890-5977 GC-MS με ιονισμό κρούσης ηλεκτρονίων και Τριχοειδής στήλη DB-FFAP (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).

Ποσοτικοποίηση φλοιικού βαλερικού οξέος

Η ποσότητα του βαλερικού οξέος στον εγκεφαλικό φλοιό που συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την τελευταία ενδοπεριτοναϊκή ένεση βαλερικού οξέος προσδιορίστηκε με μια μέθοδο παρόμοια με αυτή που αναφέρθηκε πριν [51, 52]. Εν συντομία, 0.1 g εγκεφαλικού φλοιού ξεπλυθεί σε 500 μl υδατικού ακετονιτριλίου. Το υπερκείμενο εκχυλίστηκε με 8 ml ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης (εξάνιο: διαιθυλαιθέρας=1:1) και φυγοκεντρήθηκε στα 1800 g για 5 λεπτά. 7,5 ml υπερκειμένου συλλέχθηκαν, αναμίχθηκαν με 93 μΐ 20 mMKOH σε μεθανόλη και ξηράνθηκαν στους 40 βαθμούς υπό αέριο άζωτο. Το ξηρό υπόλειμμα ανασυστάθηκε σε 50 μΙ 2,5% 18-Στεφάνι-6 σε ακετονιτρίλιο και περαιτέρω παραγωγοποιήθηκε με 9-χλωρομεθυλανθρακένιο σε ακετονιτρίλιο με την προσθήκη υδροξειδίου τετραμεθυλαμμωνίου.

Τέλος, 30 μl διαλύματος παραγωγοποίησης φορτώθηκε στη στήλη Acclaim C18 (3 μm, 4,6 × 100 mm, Thermo Scientific) και διαχωρίστηκε σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης Ultimate 3000 (HPLC, Thermo Scientific) εξοπλισμένη με ανιχνευτή ορατού UV. Η κορυφή του παραγονοποιημένου βαλερικού οξέος ανιχνεύθηκε σε μήκος κύματος 254 nm.{10}}Αιθυλβουτυρικό οξύ (2-EA) προστέθηκε ως εσωτερικός έλεγχος αναφοράς. Η περιοχή κορυφής του βαλερικού οξέος μετρήθηκε ως mAU*min και Η περιοχή κορυφής κάθε δείγματος κανονικοποιήθηκε με αυτήν του 2-EA στο δείγμα. Τα τελικά αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως αναλογίες της ομάδας βαλερικού οξέος προς την ομάδα NS.

Συγκομιδή εγκεφαλικού ιστού

Τα ποντίκια ζυγίστηκαν και αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο στις 6 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες, 96 ώρες και 7 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση και εγχύθηκαν με 4 βαθμό NS για συλλογή εγκεφαλικού ιστού. Αυτοί οι ιππόκαμποι χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση ELISA ή προσδιορισμό RNA. Ολόκληρος ο εγκέφαλος στο Bregma −3 έως −6 mm χρησιμοποιήθηκε για χρώση ανοσοφθορισμού. Όλες οι διαδικασίες ανατομής πραγματοποιήθηκαν σε πάγο.

Παρασκευή βιβλιοθήκης mRNA και αλληλουχία Illumina Hiseq

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >1 εβδομάδα. Ο καθαρισμός RNA, η αντίστροφη μεταγραφή, η κατασκευή βιβλιοθήκης και ο προσδιορισμός αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν στο WuXi NextCODE στη Σαγκάη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Illumina).

Οι εστιασμένες σε mRNA βιβλιοθήκες αλληλουχίας από ολικό RNA παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ παρασκευής δειγμάτων RNA TruSeq® Illumina. Το PolyA mRNA καθαρίστηκε από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια συνδεδεμένα με ολιγο-d και στη συνέχεια κατακερματίστηκε με ρυθμιστικό θραυσματοποίησης. Λαμβάνοντας αυτά τα μικρά θραύσματα ως εκμαγεία, συντέθηκε cDNA πρώτης έλικος χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση και τυχαίους εκκινητές, ακολουθούμενο από σύνθεση cDNA δεύτερου κλώνου. Στη συνέχεια, το συντιθέμενο cDNA υποβλήθηκε σε τελική επιδιόρθωση, φωσφορυλίωση και προσθήκη βάσης «Α» σύμφωνα με το πρωτόκολλο κατασκευής βιβλιοθήκης της Illumina.

Προσαρμογείς αλληλουχίας Illumina προστέθηκαν στα θραύσματα cDNA. Μετά την ενίσχυση PCR για εμπλουτισμό DNA, τα AMPure XPBeads (Beckman) χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό των θραυσμάτων-στόχων των 200–300 bp. Μετά την κατασκευή της βιβλιοθήκης, έγινε η ανάλυση φθορόμετρου Qubit 3.0 dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific). χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των συγκεντρώσεων των βιβλιοθηκών αλληλουχίας που προέκυψαν, ενώ η κατανομή μεγέθους αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent). Η αλληλουχία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Illumina ακολουθώντας πρωτόκολλα που παρέχονται από την Illumina για 2 × 150 αλληλουχία ζευγαριού άκρου στο WuXangiiCO, China.

Έκφραση mRNA του ιππόκαμπου με ποσοτική αντίδραση αλυσίδας πολυμεράσης (Q-PCR)

Ο ιππόκαμπος συλλέχτηκε 24 ώρες μετά την επέμβαση από την ομάδα ελέγχου, ομάδα άσκησης, ομάδα χειρουργικής επέμβασης, ομάδα Exe+Sur, ομάδα Trans-Control+Sur, ομάδα Trans-Exe+Sur, ομάδα Exe+Sur+NS και Exe+Sur+ Η ομάδα Val τοποθετήθηκε σε υγρό άζωτο για 1 ώρα και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε σε καταψύκτη στους -80 βαθμούς για όχι περισσότερο από 3 ημέρες. Η εκχύλιση RNA, η αντίστροφη μεταγραφή από RNA σε cDNA και q-PCR πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράψαμε προηγουμένως [49, 53]. Εν συντομία, το RNA εκχυλίστηκε από το κιτ RNeasy Micro. Η αντίστροφη μεταγραφή ολοκληρώθηκε με τη χρήση 5X All-in-One MasterMix. Τέλος, ένα σύστημα CFX connect σε πραγματικό χρόνο (Bio-Rad) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτική ποσοτικοποίηση. Οι εκκινητές για qPCR ήταν: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG και C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTCTCAC. Η σχετική γονιδιακή έκφραση για το C3ar1 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το συγκριτικό κατώφλι του κύκλου γονιδίου ΔΔCt και την κανονικοποίηση του γονιδίου στο σπίτι. Τα επίπεδα mRNA για τα γονίδια-στόχους εκφράζονται ως αναδιπλούμενες αυξήσεις σε σχέση με τη σχετική ομάδα, αντίστοιχα.

Προσδιορισμός κυτοκινών και GDNF στον ιππόκαμπο

Το IL{{0}}, το IL-6, το C3 και το GDNF στον ιππόκαμπο ανιχνεύθηκαν με χρήση κιτ ELISA. Για τη δοκιμή των IL-1, IL,-6 και GDNF, οι εγκεφαλικοί ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε πάγο στο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιείχε 25 mM Tris-HCl με pH 7,6, 150 mMNaCl, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης που περιέχει 10 mg/ml απρωτινίνη, 5 mg/ml πεπστατίνη, 5 mg/ml λευπεπτίνη και 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο.

Για τη δοκιμή C3, οι εγκεφαλικοί ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε πάγο στο ρυθμιστικό διάλυμα PTR (παρέχεται στο κιτ). Το υπερκείμενο συλλέχτηκε για ανίχνευση ELISA αφού το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 13,000 g για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τον προσδιορισμό πρωτεΐνης BCA (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, UK). Τα IL-1, IL6, C3 και GDNF στο υπερκείμενο του εγκεφάλου ανιχνεύθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για ELISA και η ποσότητα τους σε κάθε δείγμα στον εγκέφαλο κανονικοποιήθηκε από τη συνολική περιεκτικότητά του σε πρωτεΐνη και εκφράστηκε ως pg/ mg πρωτεΐνης.

Western blotting

Το Western blotting πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Εν συντομία, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των δειγμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης BCA. Είκοσι μικρογραμμάρια από κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε ανάλυση Westernblotting χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα: κουνελιού πολυκλωνική αντι-μετασυναπτική πυκνότητα πρωτεΐνη 95 (PSD95) σε αραίωση 1:1000, πολυκλωνική αντι-συναψίνη κουνελιού 1 σε αραίωση 1:1000 και αραίωση κουνελιού αντι{0}}{1 σωληναριακό αντίσωμα σε αραίωση 1:1000. Οι εικόνες σαρώθηκαν με Image Master IIscanner (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικόImageQuant TL v2003.03 (GE Healthcare). Τα σήματα ζώνης των ενδιαφερομένων πρωτεϊνών κανονικοποιήθηκαν με εκείνα της αντίστοιχης τουμπουλίνης και εκφράστηκαν ως κλάσματα του δείγματος ελέγχου από τα ίδια πηκτώματα.

Ανοσοφθορισμός χρώση

Η επισήμανση με ανοσοφθορισμό και ο ποσοτικός προσδιορισμός της χρώσης εκτελέστηκαν όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [6, 54]. Εν συντομία, ο εγκέφαλος σταθεροποιήθηκε σε 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκε σε 30% σακχαρόζη όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς πριν καταψυχθεί σε ένωση βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής. Κορωνικά τμήματα πάχους 20-μm κόπηκαν διαδοχικά από το Bregma −3 έως −6 mm με χρήση κρυοστάτη και τοποθετημένο σε αντικειμενοφόρους μικροσκοπίου.

Αφού πλύθηκαν σε αλατούχο διάλυμα Tris-ρυθμιστικού διαλύματος (TBS), οι τομές αποκλείστηκαν σε 10% ορό γαϊδουριού συν 1% αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) σε TBS που περιείχε 0,3% triton-X100 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 4 βαθμοί κατά τη διάρκεια της νύχτας με τα ακόλουθα κύρια αντισώματα: μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-C3 κουνελιού (1:50), μονοκλωνικό αντίσωμα κατσίκας αντι-GFAP (1:200), μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-C3ar αρουραίου (1:50) και μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-Iba{{ 21}} αντίσωμα (1:200).

Οι τομές ξεπλύθηκαν σε TBS με 0.1% Triton-x 100. Το αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού γαϊδουριού συζευγμένο με Alexa Fluor 594 (1:200), αντίσωμα αντι-κατσίκας IgG γαϊδουριού συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (1:200) , αντίσωμα IgG αντι-αρουραίου γαϊδουριού συζευγμένο με AlexaFluor 594 (1:200) ή αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG γαϊδουριού συζευγμένο με AlexaFluor 647 (1:200) επωάστηκαν με τις τομές για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι.

Οι τομές πλύθηκαν σε TBS, επωάστηκαν με Hoechst 33342 (1:1000) για πυρηνική χρώση, ξεπλύθηκαν και τοποθετήθηκαν με μέσο στήριξης Vectashield (Η-1000· Vector Labs, Burlingame, CA). Εικόνες ανοσοχρώσης αποκτήθηκαν με z-stack με σύστημα μικροσκοπίας LSM710 (ZEISS) και ο αρνητικός έλεγχος που παραλείπει την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα συμπεριλήφθηκε σε όλα τα πειράματα.

Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6, 54]. Εν συντομία, απεικονίστηκε ολόκληρη η περιοχή της οδοντωτής έλικας (DG) που καλυπτόταν από 2-3 μη επικαλυπτόμενα πεδία από καθένα από τα έξι διαδοχικά τμήματα ιππόκαμπου ενός ποντικιού. Ο αριθμός των περιμετρικών εικονοστοιχείων με ένταση πάνω από ένα προκαθορισμένο επίπεδο κατωφλίου θεωρήθηκε ως θετικά χρωματισμένη περιοχή για έναν ενδιαφερόμενο δείκτη και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Image-pro συν 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, ΗΠΑ) και παρουσιάζεται ως ποσοστό θετικής περιοχής στη συνολική έκταση. Έξι μετρήσεις ανά ποντίκι στη συνέχεια υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για να αντικατοπτρίζουν το επίπεδο θετικής χρώσης. Όλες οι ποσοτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τυφλό τρόπο.

Χορήγηση BrdU και χρώση ανοσοφθορισμού

Επτά ημέρες μετά το χειρουργείο, στα ποντίκια χορηγήθηκαν 7 διαδοχικές ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις 80 mg/kg 5'-βρωμο-2'-δεοξυουριδίνης (BrdU) το μεσημέρι μία φορά την ημέρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 5 ημέρες αργότερα για τη συγκομιδή του ιππόκαμπου. Ο ιππόκαμπος σταθεροποιήθηκε σε 4% παραφορμαλδεΰδη 0.1 Μ ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα στους 4 βαθμούς για 24 ώρες και ενσωματώθηκε ινπαραφίνη. Τομές στεφανιαίου εγκεφάλου πάχους πέντε μικρών κόπηκαν διαδοχικά από Bregma -2 σε -4 mm. Η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε με επώαση τμημάτων με ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου που περιέχει 10 mM κιτρικό νάτριο, 0,05% Tween 20 (pH 6,0) στους 95–100 βαθμούς για 20 λεπτά.

Η μετουσίωση του DNA έγινε με επώαση με 1 Ν HCl σε πάγο για 3 λεπτά, 2 Ν HCL σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά και στους 37 βαθμούς για 6 λεπτά. Οι τομές αποκλείστηκαν με 5% ορό γαϊδουριού σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) που περιείχε 0.5%triton-X 100 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς με τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα: ραμμονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU (1:100) και μονοκλωνικό αντισώμα κατσίκας αντι-GFAP (1:200). Οι τομές επωάστηκαν με IgGantibody αντι-αρουραίου γαϊδουριού συζευγμένο με Alexa Fluor 594 (1:200) ή γαϊδουριού αντι-κατσίκα IgGantibody συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (1:200) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό δωμάτιο. Αφού πλύθηκαν σε PBS, οι τομές χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (1:1000), ξεπλύθηκαν και τοποθετήθηκαν με μέσο στερέωσης Vectashield (Vector Labs).

Οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού με κάμερα συσκευής συζευγμένης φόρτισης (High MagOlympus BX51) και σύστημα ομοεστιακής μικροσκοπίας LSM710 (ZEISS). Ο αρνητικός έλεγχος που παραλείπει την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα συμπεριλήφθηκε σε όλα τα πειράματα. Για κάθε εγκέφαλο ποντικού, χρησιμοποιήθηκαν έξι διαδοχικές ιπποκαμπικές τομές για μέτρηση κυττάρων. Μετρήθηκε ο αριθμός όλων των κυττάρων που χρωματίστηκαν θετικά για έναν ενδιαφερόμενο δείκτη ή ο συνδυασμός δύο δεικτών στην υποκοκκώδη ζώνη του ΓΔ κάθε τμήματος. Οι ποσοτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τυφλό τρόπο.

λεκές Golgi

Η χρώση Golgi πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ FD Rapid GolgiStainTM. Δεκαεννέα ημέρες μετά την επέμβαση, οι εγκέφαλοι 6 ποντικών σε κάθε ομάδα βυθίστηκαν σε διάλυμα εμποτισμού (διαλύματα Α και Β: 1:1) για 2 εβδομάδες και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο διάλυμα Γ για 3 ημέρες. Τομές στεφανιαίου εγκεφάλου σε πάχος 100 μm και περίπου -2,7 mm από το βρεγμά κόπηκαν σε δονητή (Microslicer® 10110, Ted Pella, Inc. Καλιφόρνια, ΗΠΑ).

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως[55, 56], περισσότεροι από 10 καλά εξατομικευμένοι νευρώνες στην περιοχή DG του ιππόκαμπου επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε ποντίκι και ελήφθησαν διαδοχικές οπτικές εικόνες σάρωσης πολλαπλών επιπέδων σε διάστημα 2,0 μma κατά μήκος του άξονα z (3DHISTECH, Πανοραμική MIDI, Ουγγαρία) με 20 ×στόχο. Τα αρχεία σάρωσης πολλαπλών επιπέδων αντικαταστάθηκαν για να γίνουν ένα καθαρό αρχείο σάρωσης που μπορεί να προβληθεί με το Caseviewer (3DHISTECH, Ουγγαρία) σε υπολογιστή. Ο συνολικός αριθμός διακλαδώσεων και το μήκος των δενδριτών μετρήθηκαν με λογισμικό Fiji (Fiji-win64, NIH, USA). Η πολυπλοκότητα των συνολικών δενδριτικών δέντρων (τομές) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Sholl. Μέτρηση της πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης, επιλέχθηκαν 5 νευρώνες από κάθε ζώο.

Πέντε τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία στους κορυφαίους ή βασικούς δενδρίτες φωτογραφήθηκαν από τα αρχεία σάρωσης. Οι αριθμοί της σπονδυλικής στήλης σε τμήματα των 40 μms μετρήθηκαν από έναν παρατηρητή που ήταν τυφλός στην ομαδική ανάθεση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο αριθμός των αγκάθων/10 μms τμήματα. Τα δεδομένα των αριθμών, του μήκους και των τομών των δενδριτικών κλάδων καθώς και της πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης από ένα ποντίκι υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για να αντικατοπτρίζουν το επίπεδο του ποντικιού.

Στατιστική ανάλυση

Ο υπολογισμός του μεγέθους του δείγματος για κάθε πείραμα δεν πραγματοποιήθηκε. Ο προσδιορισμός του μεγέθους του δείγματος βασίστηκε κυρίως στην εμπειρία μας: μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα που δοκιμάζουν τη μάθηση και τη μνήμη από εκείνα για βιοχημικές μελέτες. Όλα τα δεδομένα που συλλέχθηκαν συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Τα στοιχεία που λείπουν περιελάμβαναν τα ζώα που πληρούσαν προκαθορισμένα κριτήρια αποκλεισμού για την άσκηση και τα ζώα που πέθαναν πριν από την προβλεπόμενη περίοδο παρατήρησης. Ο αριθμός των ζώων που συνεισέφεραν δεδομένα για ανάλυση για κάθε πειραματική συνθήκη δηλώνεται infigure legends.

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (δεδομένα κανονικής κατανομής) ή διάμεσος ± εύρος διατεταρτημορίου (όχι δεδομένα κανονικής κατανομής) με την παρουσίαση μεμονωμένων δεδομένων ζώων στο γράφημα ράβδων και μέσο όρο ± SD στα γραμμικά διαγράμματα. Τα δεδομένα από τις προπονήσεις του BarnesMaze αναλύθηκαν με αμφίδρομη επαναλαμβανόμενη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από το τεστ Tukey.

Τα δεδομένα της μικροχλωρίδας του εντέρου αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα Προφίλ μικροχλωρίδας του εντέρου. Τα άλλα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey εάν ​​τα δεδομένα κατανεμήθηκαν κανονικά, με μονόδρομη ANOVA στην κατάταξη ακολουθούμενη από τη μέθοδο δοκιμής Tukey Student-Newman-Keuls εάν τα δεδομένα δεν κατανεμήθηκαν κανονικά, με αμφίδρομη ANOVA , με τεστ t ή τεστ αθροίσματος κατάταξης. Μια σημαντική διαφορά ορίστηκε ως P < 0.05 με βάση τον έλεγχο υποθέσεων με δύο ουρές.

Δεν πραγματοποιήθηκαν προσαρμογές για πολλαπλές συγκρίσεις. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SigmaStat (Systat Software, Inc., Point Richmond, CA, USA).

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Moller JT, Cluitmans Ρ, Rasmussen LS, Houx P, Rasmussen Η, Canet J, et αϊ. Μακροχρόνια μετεγχειρητική γνωστική δυσλειτουργία σε ηλικιωμένους Μελέτη ISPOCD1. Ερευνητές του ISPOCD. Διεθνής μελέτη της μετεγχειρητικής γνωστικής δυσλειτουργίας. Lancet.1998;351:857–61.

2. Monk TG, Weldon BC, Garvan CW, Dede DE, van der Aa MT, Heilman KM, κ.ά. Αναισθησιολογία. 2008; 108:18–30.

3. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B, Gaver V, Grocott H, Jones RH, et al. Διαμήκης αξιολόγηση της νευρογνωστικής λειτουργίας μετά από χειρουργική επέμβαση παράκαμψης στεφανιαίας αρτηρίας. Ν. Engl J Med. 2001; 344:395-402.

4. Hall M, Schwartzman A, Zhang J, Liu X. Στοιχεία περιπατητικής χειρουργικής από νοσοκομεία και κέντρα περιπατητικής χειρουργικής: 2010. Έκθεση Εθνικής Στατιστικής Υγείας 2017.

5. Li Y, Chen D, Wang Η, Wang Z, Song F, Li H, et al. Ενδοφλέβια έναντι πτητικών αναισθητικών επιδράσεων στη μετεγχειρητική γνωστική λειτουργία σε ηλικιωμένους ασθενείς που υποβάλλονται σε λαπαροσκοπική επέμβαση κοιλίας. Αναισθησιολογία. 2021; 134:381-94.

For more information:1950477648nn@gmail.com