Μεταφορά οργανικών κατιόντων με ενισχυμένη διάτμηση κορυφής σε ανθρώπινο OCT2/MATE1-Μεταμολυνθέντα κύτταρα νεφρού σκύλου Madin-Darby περιλαμβάνει ανίχνευση βλεφαρίδων

Για περισσότερες πληροφορίες:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz και Shuvo Roy

Τμήματα Βιομηχανικής και Θεραπευτικών Επιστημών (AJ, PS, DLK, SR) και Παιδιατρικής (PRB),

University of California San Francisco (UCSF), San Francisco, California;

και Τμήμα Ιατρικής, Τμήμα Νεφρολογίας, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου Vanderbilt, Νάσβιλ, Τενεσί (NF, WF)

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Ενεργή μεταφορά απόνεφρώντα εγγύς σωληνάρια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διάθεση του φαρμάκου. Κατά την ανάπτυξη του φαρμάκου, εκτιμήσεις γιανεφρώνη απέκκριση είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό της δόσης. Οι νεφρικοί βιοαντιδραστήρες που αναπαράγουν φυσιολογικά ξαδέρφια του νεφρού, όπως το διατμητικό στρες που προκαλείται από τη ροή, μπορεί να προβλέψουν καλύτερα in vivo τη συμπεριφορά του φαρμάκου από ότι τα τρέχοντα in vitro μοντέλα. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο της διατμητικής τάσης στην ενεργό μεταφορά του ιωδιούχου 4-(4-(διμεθυλαμινο)-στυρυλ)-Ν-μεθυλοπυριδίνιο (ASP plus ) από τον σκύλο Madin-Darbyνεφρόκύτταραπου εκφράζει εξωγενώς τους ανθρώπινους μεταφορείς οργανικών κατιόντων μεταφορέα οργανικών κατιόντων 2 (OCT2) και την πρωτεΐνη εξώθησης πολλαπλών φαρμάκων και τοξινών 1 (MATE1). Κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε παράλληλη πλάκα υπό συνεχή έγχυση μέσων σχημάτισαν μια σφιχτή μονοστιβάδα με υψηλό φράγμα στην ινουλίνη. Σε απόκριση στα αυξανόμενα επίπεδα διατμητικής τάσης (0.2-2 dynes/cm), τα κύτταρα παρουσίασαν αντίστοιχη αύξηση στη μεταφορά του ASP συν , φτάνοντας τη μέγιστη 4.2-πλάσια αύξηση στο 2. dynes/cm2 σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες. Αυτή η μεταφορά ανεστάλη με ιμιπραμίνη, υποδεικνύοντας ότι υπήρχε ενεργή μεταφορά υπό συνθήκες διατμητικής τάσης. Τα κύτταρα που εκτέθηκαν σε διατμητική τάση 2 dynes/cm² έδειξαν επίσης αύξηση στην έκφραση RNA τόσο των επιμολυσμένων ανθρώπων όσο και του ενδογενούς OCT2 (3.7- και 2.0- φορές, αντίστοιχα). Η αφαίρεση των βλεφαρίδων με θειικό αμμώνιο εξάλειψε τις επιδράσεις της διάτμησης στην ASP συν μεταφορά σε 0,5 dynes/cm² χωρίς καμία επίδραση στη μεταφορά ASP συν υπό στατικές συνθήκες. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διατμητική τάση επηρεάζει την ενεργό μεταφορά των οργανικών κατιόντων μέσανεφρώνσωληνοειδήςεπιθηλιακά κύτταρα με τρόπο που εξαρτάται από τις βλεφαρίδες.

Cistanche is good for renal function

Εισαγωγή

Παρά τις σημαντικές προόδους στις προκλινικές μεθόδους για την επιλογή των βέλτιστων υποψηφίων φαρμάκων, η ανάπτυξη φαρμάκων παραμένει μια μακρά και δαπανηρή διαδικασία που έχει πολύ χαμηλή απόδοση νέων μοριακών οντοτήτων που διατίθενται στο εμπόριο (Watkins, 2011). Ένα σημαντικό έλλειμμα προκλινικών μοντέλων είναι η αδυναμία πρόβλεψης της κάθαρσης και της τοξικότητας στον άνθρωπο. Περίπου το 30 τοις εκατό των φαρμάκων που είναι επιτυχείς σε προκλινικές μελέτες αποτυγχάνουν στους ανθρώπους ως αποτέλεσμα απρόβλεπτων τιμών κάθαρσης ή τοξικότητας (Kola and Landis, 2004).

Ο νεφρός είναι ένας ιδιαίτερα σημαντικός στόχος για μοντελοποίηση κυτταροκαλλιέργειας in vitro, επειδή είναι υπεύθυνος για την αποβολή περισσότερων από το ένα τρίτο όλων των φαρμάκων και των περισσότερων μεταβολιτών (Morrissey et al., 2013). ονεφρώνΤο εγγύς σωληνάριο είναι σημαντικό για τη δοκιμή φαρμάκων κατά την ανάπτυξη, επειδή εκτελεί το μεγαλύτερο μέρος της ενεργού μεταφοράς υποψήφιων φαρμάκων και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο σε τοξικούς τραυματισμούς (Giacominiet al., 2010). ονεφρώνσωληνάριοείναι μια μονοστοιβάδα επιθηλιακών κυττάρων με διήθημα που ρέει στην κορυφή της επιφάνειας. Μια βασική μεμβράνη βρίσκεται κάτω από το σωληνοειδές επιθήλιο και τα παρακείμενα περισωληνάρια τριχοειδή επιτρέπουν την επαναρρόφηση του νερού και των χαιρετισμών. Το μικροπεριβάλλον του εγγύς σωληναρίου, ιδιαίτερα η διατμητική τάση ρευστού και οι ογκοτικές βαθμίδες της κορυφής, δεν αναπαράγονται πλήρως με τις συμβατικές τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας. Οι βιοαντιδραστήρες επιθηλιακών κυττάρων που καταγράφουν σημαντική in vivo φυσιολογία μπορεί να βελτιώσουν την ακρίβεια των προβλέψεων κάθαρσης και τοξικότητας που προέρχονται από in vitro προσδιορισμούς (Pfaller and Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδεικνύουν ότι η μορφολογία και η λειτουργικότητα των κυττάρων του εγγύς σωληναρίου μπορεί να ποικίλουν ανάλογα με το περιβάλλον ανάπτυξης, όπως το πορώδες της επιφάνειας ανάπτυξης, η έκθεση σε υγρό και στις δύο πλευρές ή/και η διατμητική τάση ρευστού. Προηγούμενη εργασία από τους Essig και Friedlander (2003), καθώς και από το εργαστήριό μας (Ferrell et al.2010), έχει δείξει ότι η αναδιάταξη που προκαλείται από τη ροή του σωληνωτού υγρού στον κορυφαίο κυτταροσκελετό ακτίνης των εγγύς σωληναριακών κυττάρων (Ferrell et al., 2010) . Στη συνέχεια, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι το διατμητικό στρες επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης και τον εντοπισμό πολλαπλών προσλήψεων και μεταφορέων εκροής, συμπεριλαμβανομένου του αντιμεταφορέα νατρίου-υδρογόνου 3. Na/K-ATPase, μεταφορείς γλυκόζης, επιθηλιακό κανάλι νατρίου και τους υποδοχείς ενδοκυττάρωσης, μεγαλίνη και τουμπουλίνη (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). Άλλες εργασίες έχουν δείξει ότι η διατμητική ροή σε ένα σωληνωτό σύστημα βιοαντιδραστήρα προσανατολίζεται και επιμηκύνεταινεφρώνσωληνοειδήςκύτταρα κατά μήκος της διαδρομής ροής (Venzac et al. 2018). Τα στοιχεία in vitro υποδεικνύουν ότι ορισμένες αλλαγές στη δομή του κυτταροσκελετού και στη λειτουργία μεταφοράς πιθανότατα σχετίζονται με τη μηχανοαισθητήρια λειτουργία των βλεφαρίδων (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014). Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν εξετάσει την επίδραση της διατμητικής τάσης στους μεταφορείς φαρμάκων στα νεφρικά κύτταρα. Επιπλέον, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση διαφορετικών ρυθμών διάτμησης στη λειτουργικότητα των κυττάρων, ιδιαίτερα με παρατεταμένη έκθεση σε διατμητική τάση. Οι περισσότερες μελέτες έχουν εξετάσει έναν ενιαίο ρυθμό διατμητικής τάσης και έχουν πραγματοποιήσει μόνο βραχυπρόθεσμα πειράματα (1-6 ώρες), καθιστώντας δύσκολη τη διάκριση μεταξύ των πραγματικών επιπτώσεων της διάτμησης και της απόκρισης κυτταρικής τάσης σε απότομες αλλαγές στο μικροπεριβάλλον (Duan et al.2010· Jang et al2013: Maggiorani et al.2015).

Εδώ, ένας μικρορευστικός βιοαντιδραστήρας χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την επίδραση των διαβαθμισμένων επιπέδων διατμητικής τάσης στονεφρώνμεταφορείς φαρμάκων εγγύς σωληναριακών κυττάρων Μεταφορέας οργανικών κατιόντων 2 (OCT2) και πρωτεΐνη εξώθησης πολλαπλών φαρμάκων και τοξινών 1 (MATE1). Αποδεικνύουμε ότι η αύξηση της διατμητικής τάσης κορυφής οδηγεί σε αύξηση της μεταφοράς οργανικών κατιόντων και της έκφρασης μεταφορέα και ότι οι βλεφαρίδες εμπλέκονται σε αυτή την κυτταρική απόκριση στη διατμητική τάση.

Υλικά και μέθοδοι

Κατασκευή και συναρμολόγηση συσκευών. Έχουμε δημοσιεύσει προηγουμένως το σχέδιό μας για έναν βιοαντιδραστήρα παράλληλης πλάκας που παρέχει μια διαδρομή ροής ρευστού ρυθμιζόμενου ύψους στην κορυφαία πλευρά των κυττάρων και μια στατική δεξαμενή στη βασική πλευρά (Brakeman et al., 2016). Για την εργασία που παρουσιάζεται εδώ, προσαρμόσαμε τον προηγούμενο σχεδιασμό μας για να δημιουργήσουμε μια συσκευή πολυπλεξίας με τέσσερις ξεχωριστές διαδρομές ροής για να επιτρέψουμε τη δοκιμή τεσσάρων βιολογικών συνθηκών ταυτόχρονα (Εικ.1). Κάθε συσκευή αποτελείται από τρία στρώματα: μια βάση με μια κορυφαία δεξαμενή 5-ml, μια μεσαία πλάκα για να συγκρατεί το ένθετο Snapwell（Costar, Corning, Corning, NY）με επιφάνεια κυψέλης 1,12 cm² και μια επάνω πλάκα που περιέχει μια βασική πλευρική δεξαμενή 1-έως 2-ml. Τα πιάτα

κατασκευάστηκαν από πολυσουλφόνη για να επιτραπεί η αποστείρωση με αυτόκαυστο. Τα παρεμβύσματα σιλικόνης κομμένα με λέιζερ ύψους 500- έως 1000-um τοποθετήθηκαν μεταξύ κάθε σετ πλακών για να σφραγίσουν τα διαμερίσματα υγρού και στην κορυφαία πλευρά για να καθορίσουν το ύψος του καναλιού. Ο βιοαντιδραστήρας συναρμολογήθηκε χρησιμοποιώντας βίδες. Η δεξαμενή πολυμέσων και η παγίδα φυσαλίδων ήταν ενσωματωμένη στήλη. Οι είσοδοι και οι έξοδοι συνδέθηκαν χρησιμοποιώντας αγκαθωτές συνδέσεις σε σωλήνες σιλικόνης Masterflex LS14 με εσωτερική διάμετρο 1,6-mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Η ροή του υγρού και επομένως η κορυφαία διατμητική τάση ρυθμίστηκαν και ελέγχθηκαν από μια περισταλτική αντλία (Cole Parmer).

Κυτταρική καλλιέργεια και ροή. Κύτταρα MDCK που επιμολύνθηκαν είτε με έναν κενό φορέα είτε με ένα ζεύγος μεταφορέων πρόσληψης και εκροής (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) παρέχονται από τον Dr. Martin Fromm (Erlangen, Γερμανία) και καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο απαραίτητο μέσο με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Earle's (UCSF Cell Culture Facility) με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (UCSF Cell Culture Facility). Πεντακόσια μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο υγρομυκίνης (UCSF Cell Culture Facility) και 100 mg/h ml γενετικίνης (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) προστέθηκαν στο μέσο για τα διπλά επιμολυνθέντα κύτταρα. Για πειράματα ροής, κύτταρο hOCT2/hMATE1 MDCK επιστρώθηκαν στην κάτω πλευρά των ενθέτων Snapwell (Corning) σε πυκνότητα 300,000 κύτταρα/φρεάτιο (250,{000 κύτταρα/cm"), αναπτύχθηκαν υπό στατικές συνθήκες μέχρι τη συρροή. και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε Η ροή του κορυφαίου μέσου αυξήθηκε σε 7 ημέρες από 0,1 σε 1-6mlmin έως ότου επιτευχθεί η επιθυμητή διατμητική τάση και στη συνέχεια αφέθηκε σταθερή για 72 ώρες πριν από τον πειραματισμό. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό στατικές συνθήκες για τον ίδιο χρόνο με τους ελέγχους .

Ανοσοφθορισμός. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (Thermo Fisher Scientific), διαπερατήθηκαν με 0,1 τοις εκατό Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) και αποκλείστηκαν με αλβουμίνη ορού βοοειδών (Sigma-Aldrich). Στη συνέχεια επωάστηκαν με αραίωση 1:50 μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού με επισήμανση Alexa 488 zonula occludens-1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) ή πρωτογενούς μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού με ακετυλιωμένη τουμπουλίνη (Life Technologies) για 60 λεπτά. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με το αντίσωμα α-τουμπουλίνης στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον 561 αντίσωμα κατσίκας κατά ποντικού (Life Technologies) και φαλλοιδίνη (Thermo Fisher Scientific) για χρώση με F-ακτίνη. Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματικό ομοεστιακό μικροσκόπιο Nikon (Τόκιο, Ιαπωνία) με αντικειμενικό φακό λαδιού 40x.

Απόδοση φραγμού. Η ινουλίνη, ένα πολυμερές 5000 Da, είναι ένας πολύ γνωστός δείκτης του ρυθμού σπειραματικής διήθησης και είναι δείκτης της διαρροής του εγγύς σωληναρίου in vivo (Sohtell et al, 1983):

Η ινουλίνη με σήμανση FITC (Sigma-Aldrich) προστέθηκε στα κορυφαία μέσα και αφέθηκε να ρέει μέσω των συσκευών. Τα δείγματα συλλέγονταν από τη βασική δεξαμενή κάθε 24 ώρες και αναλύονταν για περιεκτικότητα ινουλίνης χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών φθορισμού Genios Pro (Tecan, Mannedorf, Ελβετία). Η λειτουργία φραγμού της μονοστιβάδας κυττάρων υπολογίστηκε από τα επίπεδα ινουλίνης που μετρήθηκαν στο κορυφαίο και στο βασικό διαμέρισμα όπως περιγράφεται στην εξίσωση 1. Εδώ, Κεφάλαιο είναι η συγκέντρωση της ινουλίνης στο κορυφαίο διαμέρισμα και C Mal είναι η συγκέντρωση στο βασικό διαμέρισμα. Η διαρροή ινουλίνης υπολογίστηκε ως η συγκέντρωση στο βασικό διαμέρισμα (δότης) διαιρεμένη με την περιοχή των κυττάρων μετά από 24 ώρες.

ASP συν Μεταφορές. Τα μετατραπέντα γονίδια μεταφορείς προκλήθηκαν με 10 mM-βουτυρικό Na (Sigma-Aldrich) 24 ώρες πριν από ένα πείραμα μεταφοράς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Konig et al, 2011). Όταν ήταν απαραίτητο, τα κύτταρα επωάστηκαν με έναν αναστολέα (500μM ιμιπραμίνη ή 1 mM σιμετιδίνη (Sigma-Aldrich)) στη βασική πλευρά για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από την προσθήκη 25μM 4-(4-διμεθυλαμινο) στυρυλ-Ν-μεθυλοπυριδίνιο (ASP plus) (Life Technologies) και επώαση για 1 ώρα. Συλλέχθηκαν δείγματα από τα κορυφαία και βασικά μέσα. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με παγωμένο αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα τρεις φορές και λύθηκαν για μέτρηση της ASP συν συσσώρευση και μεταφορά. Πειράματα μεταφοράς πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα σε κύτταρα υπό διατμητική τάση και καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες. Η συγκέντρωση ASP συν ποσοτικοποιήθηκε σε συσκευή ανάγνωσης πλακών φθορισμού Genios Pro (Tecan) σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 590 nm.

Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 1 τοις εκατό SDS-10 Μ NaOH ενώ αναδεύονταν όλη τη νύχτα. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τυπικό κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA Pierce (Thermo Fisher). Όπου ήταν κατάλληλο, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη κανονικοποιήθηκε στην περιοχή ανάπτυξης των κυττάρων.

Έκφραση RNA. Το RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα κιτ εξαγωγής RNA RNeasy (Qiagen, Hilden, Γερμανία) και δημιουργήθηκε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ script (Bio-Rad, Hercules, CA). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των OCT2 και MATE1 ανθρώπου και σκύλου και P-γλυκοπρωτεΐνη σκύλου (P-GP) με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Tagman και ανιχνευτές (Applied Biosystems) στο όργανο Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Η ριβοσωμική πρωτεΐνη S18 (RS{7}}) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος καθαριότητας. Η επίδραση της διατμητικής τάσης στην έκφραση του μεταφορέα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 4ACt χρησιμοποιώντας επίπεδα μεταφορέα που εκφράζονται σε σχέση με το RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen and Livak, 2008). Το P-GP χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο των συνολικών επιδράσεων της διατμητικής τάσης στην έκφραση του μεταφορέα.

Deciliation. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή και στη συνέχεια επωάστηκαν απουσία ή παρουσία 30 mM θειικού αμμωνίου (Fluka AG) για 24 ώρες πριν από τη μέτρηση του ASP συν μεταφορά (Oxergard et al 2009). Η παρουσία βλεφαρίδων προσδιορίστηκε με απεικόνιση της α-τουμπουλίνης όπως περιγράφεται ήδη εδώ.

Στατιστική. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν με τουλάχιστον δύο τεχνικές επαναλήψεις σε κάθε πείραμα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD και παρουσιάζονται γραφικά ως διαγράμματα πλαισίου και μουστάκι. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μη ζευγαρωμένη μονόδρομη ή αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης και μια τιμή P του<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Αποτελέσματα

Μορφολογία Κυττάρου και Λειτουργία Φραγμού. Η πρόσφατη ανάλυση του Immunofluo των κυττάρων που τοποθετήθηκαν υπό ροή αποκάλυψε ομοιόμορφο σχηματισμό μονοστοιβάδας με την πρωτεΐνη σφιχτής σύνδεσης, zonula occludens-1, που εντοπίζεται στις σφιχτές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων τόσο σε στατικές όσο και σε συνθήκες ροής (Εικ. 2, A-C). Η ποσοτικοποίηση της συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη έδειξε έως και 1.{4}}πλάσια αύξηση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη ανά τετραγωνικό εκατοστό της μονοστιβάδας ως απόκριση στη διατμητική τάση (Εικ. 2D). Στη συνέχεια, μετρήσαμε τη διαπερατότητα της ινουλίνης, ενός δείκτη διαρροής εγγύς σωληναρίου, κατά μήκος της μονοστιβάδας. Οι συσκευές διατήρησαν ποσοστό απόδοσης φραγμού 97,9 τοις εκατό 6 1.42 τοις εκατό για 7 ημέρες καλλιέργειας κάτω από έως και 2 dynes/cm2 διατμητική τάση (Εικ. 2Ε), με αποτέλεσμα έναν τελικό ρυθμό διαρροής ινουλίνης την ημέρα 6 του { {15}}.13–0.69 mg/cm2 την ημέρα.

Επίδραση της διατμητικής τάσης στη μεταφορά οργανικών κατιόντων. Η μεταφορά του ASP plus, ενός αυτοφθορισμού υποστρώματος των OCT2 και MATE1, μετρήθηκε για 1 ώρα σε διαφορετικά επίπεδα διατμητικής τάσης (0).2-2 dynes/cm²). Κύτταρα MDCK που εκφράζουν εξωγενώς hOCT2 και hMATE1 εμφάνισαν 4,{9}}πλάσια αύξηση στο ASP συν μεταφορά σε απόκριση σε διατμητική τάση 2 dynes/cm² όπως αντανακλάται σε μέτρα τόσο της κυτταρικής συσσώρευσης (Εικ. 3Α) όσο και της διακυτταρικής μεταφοράς (Εικ. 3Β). Η επίδραση της διατμητικής τάσης στο ASP συν συσσώρευση ή διακυτταρική μεταφορά ήταν παρόμοια υπό διατμητική τάση 0,5 και 2 dynes/cm². Για να προσδιοριστεί εάν η μεταφορά του ενεργού ASP plus αυξήθηκε, η μεταφορά του ASP plus από κύτταρα που εκτέθηκαν σε 0.2 dynes/cm διατμητικής τάσης μετρήθηκε με ή χωρίς προεπεξεργασία με 500 uM ιμιπραμίνη, ένα OCT{{20} } και MATE1-ειδικός αναστολέας. Η μεταφορά ASP συν αναστέλλεται από την ιμιπραμίνη 60,3 τοις εκατό ± 15,8 τοις εκατό υπό συνθήκες διατμητικής τάσης σε σύγκριση με 47,6 τοις εκατό ± 19,7 τοις εκατό υπό στατικές συνθήκες (Εικ. 3C).

Για την περαιτέρω κατανόηση αυτής της παρατήρησης, η επίδραση της διατμητικής τάσης στην έκφραση του ανθρώπινου OCT2 (διαμολυσμένο), του OCT2 του σκύλου (ενδογενές) και του σκύλου P-GP (ενδογενές) μετρήθηκε σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε διαφορετικά επίπεδα διάτμησης για 72 ώρες μετά από αργή αύξηση της διάτμησης για 7 ημέρες (Εικ. 4). Σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες, τα κύτταρα MDCK που εκτέθηκαν σε διάτμηση έδειξαν αυξημένη έκφραση του επιμολυσμένου ανθρώπου και του ενδογενούς OCT2 (έως 3.7- και 2.0-φορές, αντίστοιχα), χωρίς σημαντική επίδραση, χωρίς σημαντικό αποτέλεσμα. στην έκφραση του επιμολυσμένου MATE1 ή της ενδογενούς P-GP.

Ο ρόλος της Cilia στην απάντηση στη διάτμηση. Η απεικόνιση έδειξε ότι τα διπλά επιμολυνθέντα κύτταρα MDCK εκφράζουν βλεφαρίδες τόσο σε στατικές όσο και σε συνθήκες ροής (Εικ. 5, Α και Ε). Η έκθεση των κυττάρων σε 30 mM θειικό αμμώνιο για 24 ώρες προκάλεσε πλήρη απώλεια βλεφαρίδων (Εικ. 5, C και G). Είναι σημαντικό ότι η εξασθένιση δεν είχε μεγάλες επιπτώσεις στις συνδέσεις κυτταρικής μεμβράνης, όπως μετρήθηκε με απεικόνιση της F-ακτίνης, η οποία αγκυρώνει πρωτεΐνες σφιχτής σύνδεσης στις συνδέσεις κυτταρικής μεμβράνης στα επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 5.D και HD (Stevenson και Begg. 1994). Αν και υπάρχει κάποια πάχυνση της χρώσης με F-ακτίνη σε αυτές τις εικόνες, αυτό δεν ήταν ένα σταθερό εύρημα, και επομένως δεν ποσοτικοποιήσαμε αυτό το αποτέλεσμα. Η αποβολή δεν είχε καμία επίδραση στη μεταφορά από κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες. εξάλειψε τις επιπτώσεις της διατμητικής τάσης στο ASP συν τη μεταφορά σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε 0,5 dynes/cm² διάτμησης (Εικ. 6).

Συζήτηση

Ο νεφρός παίζει κεντρικό ρόλο στην αποβολή των φαρμάκων από το ανθρώπινο σώμα. Είναι σημαντικό να μιμείται με ακρίβεια την πολυπλοκότητα της νεφρικής φυσιολογίας για τον in vitro έλεγχο φαρμάκων, ιδιαίτερα όσον αφορά τη ροή υγρών. Η διατμητική τάση από τη ροή του υγρού έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τη μορφολογία των κυττάρων και τους μεταφορείς ιόντων in vitro, αλλά λίγα είναι γνωστά για τις επιδράσεις στους μεταφορείς φαρμάκων (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016) . Επιπλέον, οι περισσότερες προηγούμενες μελέτες έχουν μετρήσει μόνο την επίδραση της βραχυπρόθεσμης διάτμησης (1-6 ώρες), η οποία είναι απίθανο να απομονώσει πλήρως τις επιδράσεις της διατμητικής τάσης από άλλες αποκρίσεις κυτταρικής καταπόνησης (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al.. 2015). Σε αυτές τις μελέτες, εστιάσαμε στις επιδράσεις της παρατεταμένης διατμητικής τάσης (7 ημερών) από τη ροή του υγρού στη μεταφορά του φαρμάκου για να μιμηθούν καλύτερα τη διατηρούμενη διατμητική τάση που αντιμετωπίζεινεφρώνσωληνοειδήςκύτταρα in vivo.

Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι μεταφορείς φαρμάκων ανταποκρίνονται σε παρατεταμένη διατμητική καταπόνηση μπορεί να βελτιώσει τις in vitro προβλέψεις του in vivo χειρισμού φαρμάκων από τους νεφρούς. Ακριβώς σχεδιασμένα in vitro μοντέλα νεφρού μπορεί να τυποποιήσουν τις προκλινικές δοκιμές και να μειώσουν τα ποσοστά αποτυχίας φαρμάκων.

Σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιήθηκε ένας παράλληλος μικρορευστικός βιοαντιδραστήρας για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της παρατεταμένης διατμητικής τάσης στη μεταφορά οργανικών κατιόντων από OCT2 και MATE1 σενεφρώνσωληνάριοκυτταρική γραμμή. Πολλές κυτταρικές σειρές λήφθηκαν υπόψη για αυτές τις μελέτες, συμπεριλαμβανομένων ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών όπως κύτταρα εγγύς ανθρώπινων σωληναρίων από την ομάδα Hopfer (Orosz et al, 2004) και RPTECs (CRL-4031:American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), αλλά τα διπλά επιμολυσμένα κύτταρα hOCT2/hMATE1 MDCK θεωρήθηκαν η καταλληλότερη επιλογή για αυτή τη μελέτη για διάφορους λόγους. Πρώτον, τα κύτταρα MDCK επιδεικνύουν σταθερά στιβαρή προσκόλληση στα ένθετα transwell, γεγονός που τους επιτρέπει να αντέχουν την αρχική πίεση της ροής του υγρού. Δεύτερον, αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν σφιχτές μονοστοιβάδες, οι οποίες αποτρέπουν τη διαρροή και είναι απαραίτητο για τη μελέτη της διακυτταρικής μεταφοράς υποστρωμάτων δεικτών. Τέλος, η εξωγενής έκφραση των μεταφορέων επιτρέπει τη βελτιωμένη ανίχνευση της ενεργού μεταφοράς και την επίδραση των διαταραχών.

Τα κύτταρα που τοποθετήθηκαν υπό ροή σχημάτισαν μια συρρέουσα μονοστιβάδα και εντόπισαν μια πρωτεΐνη σφιχτής σύνδεσης στην περιφέρεια του κυττάρου. Διατήρησαν επίσης μια λειτουργία υψηλού φραγμού όπως μετρήθηκε με τη διαπερατότητα της ινουλίνης. Η ικανότητα των επιθηλιακών κυττάρων να σχηματίζουν μια μονοστοιβάδα που αποτρέπει τις διαρροές υγρών και πρωτεϊνών είναι εξαιρετικά σημαντική για τη σωστή λειτουργία του σωληναρίου. Εδώ, η διαρροή μέσω των κυττάρων MDCK ήταν ελάχιστη σε λιγότερο από 1 ug/cm² την ημέρα και σημαντικά χαμηλότερη από αυτή μέσω των ανθρώπινων κυττάρων. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι οι μονοστοιβάδες ανθρώπινων νεφρικών κυττάρων έχουν 10-20 ug/cm² διαρροή ινουλίνης ανά ημέρα (Brakeman et al., 2016), υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι τα κύτταρα hOCT2/hMATE1 MDCK σχημάτιζαν μια ισχυρή μονοστιβάδα.

Η μεταφορά του ASP plus αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα hOCT2/hMATE1 MDCK που εκτέθηκαν σε διαφορετικά επίπεδα διατμητικής τάσης για 72 ώρες σε σύγκριση με τους στατικούς μάρτυρες. Το ASP plus απορροφάται από το OCT2 (SLC22A2) και εκρέει από το MATE1 (SLC47A1), δύο μεταφορείς οργανικών κατιόντων που λειτουργούν από κοινού για να διευκολύνουν τηννεφρώνέκκριση φαρμάκων που χρησιμοποιούνται συνήθως, όπως η μετφορμίνη και η σισπλατίνη (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Παρόμοιες επιδράσεις διατμητικής τάσης έχουν αναφερθεί για μεταφορείς ιόντων εγγύς σωληναρίου. Αυξήσεις στην πρόσληψη λευκωματίνης, στην επαναρρόφηση ιόντων και στην έκφραση και λειτουργία της μεγαλίνης και τουμπουλίνης έχουν αναφερθεί ως απόκριση στην αυξημένη διατμητική τάση (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Εκθεση τουνεφρώνΤα εγγύς σωληνάρια σε διατμητική τάση σχετίζεται επίσης με μειωμένη απόπτωση και ταχύτερη ανάρρωση από την οξεία τοξικότητα της σισπλατίνης και ενισχυμένη αναστολή της μεταφοράς οργανικών ανιόντων (Jang et al.2013). Δεδομένου ότι η διατμητική τάση από τη ροή του υγρού είναι συνεχώς παρούσα στο εγγύς σωληνάριο, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν συλλογικά τη χρήση περισσότερων φυσιολογικών συστημάτων μοντέλων in vitro για την πρόβλεψη της νεφρικής διάθεσης και της τοξικότητας του φαρμάκου. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στη λειτουργία του μεταφορέα μεταξύ 0.5 και 2.0 dynes/cm² διατμητικής τάσης. Προηγούμενες μελέτες από τους Essig και Friedlander (2003) είχαν βρει ότι απαιτείται ένα ελάχιστο επίπεδο διάτμησης 0,17 dynes/cm2 για να προκληθεί μεταβολή στη μορφολογία των κυττάρων και άλλες μελέτες έχουν μετρήσει τις επιπτώσεις στην φυσιολογία έως και 1 dyne/cm² (Duan et al., 2010). Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που διερευνά τις επιπτώσεις μιας σειράς υψηλότερων και παρατεταμένων επιπέδων διατμητικής τάσης στη λειτουργικότητα των νεφρικών μεταφορέων φαρμάκων και είναι πιθανό ότι το μέγεθος της βιολογικής διαφοράς μεταξύ των 0,5 και 2,0 dynes/cm² διατμητικής τάσης που έχουμε που αξιολογήθηκε δεν ήταν αρκετά μεγάλο για να επιτρέψει την αναγνώριση διαφορών μεταξύ αυτών των επιπέδων διατμητικής τάσης στις αναλύσεις μας. Αν και απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση, τα αποτελέσματά μας ρίχνουν φως στις απαιτούμενες συνθήκες για φυσιολογικά σχετικά μοντέλα και τις επιπτώσεις των αυξημένων επιπέδων διατμητικής καταπόνησης λόγω της νόσου στη νεφρική διαχείριση φαρμάκων.

Ένας από τους περιορισμούς των πειραματικών μας μεθόδων είναι ότι αντιμετωπίσαμε τη μεταφορά μόνο σε pH 7,4 χρησιμοποιώντας μέσα με pH 7,4 τόσο στην κορυφή όσο και στη βασική πλευρά, μιμούμενοι τις πειραματικές μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως για τα κύτταρα hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Μια κορυφαία προς τη βασική κλίση του pH μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία OCT2 και MATE1 και συνήθως υπάρχει μια βαθμίδα pH υπό φυσιολογικές συνθήκες (Muller et al., 2013). Ως εκ τούτου, οι μέθοδοι μας περιόρισαν την ικανότητά μας να αξιολογήσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ μιας κορυφαίας έως βασικής βαθμίδωσης του pH και της διατμητικής τάσης στη λειτουργία OCT2 και MATE1. Δεδομένου ότι χρησιμοποιήσαμε ένα σταθερό pHof7.4 σε όλες τις πειραματικές συνθήκες, αυτή η έλλειψη βαθμίδωσης pH είναι απίθανο να έχει επηρεάσει τα ευρήματά μας, αλλά δυνητικά περιορίζει την εφαρμογή των ευρημάτων μας στη μεταφορά OCT2 και MATE1 παρουσία βαθμίδωσης pH από κορυφή έως βασική.

Παραδόξως, η έκφραση mRNA του επιμολυσμένου ανθρώπου και του ενδογενούς OCT2 αυξήθηκε σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε όλα τα επίπεδα διατμητικής τάσης σε σύγκριση με τους στατικούς μάρτυρες. Αυτή η ανοδική ρύθμιση της έκφρασης του μεταφορέα ήταν ειδική, χωρίς μετρήσιμη επίδραση στην έκφραση της ενδογενούς P-GP ή στην επιμολυσμένη MATE1. Η ανοδική ρύθμιση της έκφρασης του μεταφορέα δίνει μια εικόνα του μηχανισμού πίσω από την αυξημένη μεταφορά και μπορεί να είναι αποτέλεσμα ενισχυμένης σταθερότητας mRNA ή αυξημένης μεταγραφής του mRNA. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τόσο οι επιμολυσμένοι όσο και οι ενδογενείς μεταφορείς ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, κάτι που είναι απροσδόκητο αφού το επιμολυσμένο OCT2 εκφράστηκε υπό έναν προαγωγέα κυτταρομεγαλοϊού και δεν θα πρέπει να υπόκειται σε ρυθμιστικούς μηχανισμούς έκφρασης ενδογενών γονιδίων. Αν και προκαλεί έκπληξη, αυτή η παρατήρηση δεν είναι πρωτόγνωρη. Έχει αναφερθεί παρόμοια επίδραση σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου με επιμολυσμένα με ΟΑΤ1 που εκτέθηκαν σε αιμάτωση, αλλά ο μηχανισμός για την αυξημένη έκφραση παραμένει ασαφής (Jansen et al., 2016). Σε μια άλλη μελέτη, η σηματοδότηση Nrf2 βρέθηκε ότι παίζει ρόλο στην αύξηση της ενδογενούς έκφρασης MATE2-K σε απόκριση στη διατμητική τάση (Fukuda et al., 2017). Περαιτέρω μελέτη επ' αυτού δικαιολογείται και θα αποτελέσει αντικείμενο μελλοντικών ερευνών.

Εντοπίσαμε επίσης ότι η εισαγωγή της κορυφαίας διατμητικής ροής αύξησε την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ανά τετραγωνικό εκατοστό κυττάρων. Αυτό το φαινόμενο ήταν το ίδιο μέγεθος και για τα δύο 0.5 και 2dynes/cm² διάτμησης, παρόμοια με το αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε για την έκφραση mRNA και τη μεταφορά ASP συν. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι η διατμητική τάση προκαλεί ψηλότερονεφρώνεπιθηλιακά κύτταρα, τα οποία θα οδηγούσαν σε μεγαλύτερο όγκο κυττάρων ανά τετραγωνικό εκατοστό και επομένως μια πιθανή αύξηση της πρωτεΐνης ανά τετραγωνικό εκατοστό· Ωστόσο, αυτό το φαινόμενο που δημοσιεύτηκε προηγουμένως ήταν μόνο μια μικρή παρατήρηση σε ένα μεγαλύτερο σύνολο δεδομένων και όχι ποσοτικά (Long et al., 2017). Η αύξηση της συνολικής πρωτεΐνης στα κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία κορυφαίας διατμητικής ροής μπορεί να αντιπροσωπεύει τη φυσιολογική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη για υγιήνεφρώνσωληνοειδήςεπιθηλιακά κύτταρα που μπορούν να επιτευχθούν μόνο με την έκθεση των κυττάρων σε κορυφαία διατμητική ροή. Επομένως, τα χαμηλότερα επίπεδα περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε στατική καλλιέργεια μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια ανώμαλη κυτταρική κατάσταση, όπως θα μπορούσε να συμβεί κλινικά σε καταστάσεις χαμηλής ροής διηθήματος στην κορυφή, όπως οξεία νεφρική βλάβη. Αυτό το φαινόμενο αξίζει περαιτέρω μελέτης.

Τα βλεφαρίδες είναι γνωστό ότι έχουν μηχανοαισθητικούς ρόλους στο εγγύς σωληνάριο (Raghavan and Weisz,2016). Επομένως, για να προσδιοριστεί εάν διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην αυξημένη μεταφορά μέσω OCT2 και MATE1-που αναφέρεται εδώ, μετρήθηκε η επίδραση της αφαίρεσης βλεφαρίδων στη λειτουργία του μεταφορέα. Ο πλήρης αποκλεισμός των εξαρτώμενων από τη διάτμηση αυξήσεων στο ASP συν μεταφορά με αφαίρεση βλεφαρίδων στις μελέτες μας είναι παρόμοιο με το αποτέλεσμα που βρέθηκε σε μελέτες των Raghavan et al. (2014), ο οποίος επέδειξε ανοδική ρύθμιση εξαρτώμενη από βλεφαρίδες στην ενδοκυττάρωση ως απόκριση στη ροή υγρού. Το θειικό αμμώνιο πιθανότατα έχει άλλες αχαρακτήριστες επιδράσεις στη συμπεριφορά και τη λειτουργικότητα των κυττάρων που μπορεί να επηρεάσουν έμμεσα τη μεταφορά διαλυμένης ουσίας. Παρά τις πιθανές επιδράσεις εκτός στόχου, αυτή η μέθοδος απόσβεσης δοκιμάζει το ρόλο της ακτινωτής αίσθησης στην κίνηση των οργανικών διαλυμένων ουσιών με τη μεσολάβηση του μεταφορέα. Ο μηχανισμός σηματοδότησης μεταξύ των μηχανοαισθητηριακών πρωτεϊνών στις βλεφαρίδες και του μεταφορέα είναι επί του παρόντος άγνωστος. Μια υπόθεση είναι ότι η λειτουργία των μεταφορέων οργανικών κατιόντων αλλάζει από αλλοιωμένη μεταφορά ιόντων. Η απομάκρυνση των βλεφαρίδων είναι γνωστό ότι μεταβάλλει την κινητικότητα της διαλυμένης ουσίας στα κύτταρα του εγγύς σωληναρίου, συγκεκριμένα μειώνοντας το Nat/K plus. Εντοπισμός μεμβράνης ATPase και τροποποίηση της παρακυτταρικής μεταφοράς (Overgaard et al.., 2009). Είναι πιθανό αυτό να έχει ως αποτέλεσμα αλλοιώσεις στη συνάρτηση MATE1, έναν αντιμεταφορέα που εξαρτάται από την κλίση H. Μια άλλη υπόθεση είναι ότι η αίσθηση της διατμητικής τάσης επηρεάζει την έκφραση των οργανικών μεταφορέων κατιόντων. Η διατμητική τάση ρυθμίζει τη λειτουργία MATE{11}}Κ μέσω της σηματοδότησης Nrf2 (Fukuda et al., 2017). Άλλοι μεταφορείς οργανικών κατιόντων μπορεί να ανταποκρίνονται παρόμοια στη διατμητική τάση, η οποία θα εξαλειφόταν όταν αφαιρεθούν οι μηχανοαισθητήρες βλεφαρίδες. Πολλά από αυτά είναι άγνωστα και χρήζουν περαιτέρω μελέτης. Είναι ενδιαφέρον ότι η απομάκρυνση των βλεφαρίδων δεν είχε σημαντική επίδραση στο ASP συν τη μεταφορά από κύτταρα που εκτέθηκαν σε 0,2 dynes/cm² διατμητική τάση, αλλά ένα ισχυρό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε όταν η διατμητική τάση αυξήθηκε σε 0,5 dynes/cm2. Αυτό υποδηλώνει ότι οι βλεφαρίδες αισθάνονται ένα επίπεδο διατμητικής τάσης κατωφλίου. Με τη σειρά τους, οι βλεφαρίδες σήματος αλλάζουν στην έκφραση και τη λειτουργία του μεταφορέα πριν αναμένονται μετρήσιμα αποτελέσματα στη μεταφορά. Συνολικά, η εξάρτηση της μεταφοράς οργανικών κατιόντων από την ακτινοβολία ανίχνευσης της διατμητικής τάσης παρέχει μια εικόνα για την εμπλεκόμενη οδό μηχανοαισθητηριακής σηματοδότησης και το ελάχιστο επίπεδο τάσης που μπορεί να απαιτείται για να πυροδοτήσει μια ισχυρή απόκριση στη διάτμηση.

Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η διατμητική τάση από τη ροή ρευστού έχει σημαντική επίδραση στη λειτουργία και την έκφραση του μεταφορέα οργανικών κατιόντων στα κύτταρα MDCK. Επιπλέον, η ανοδική ρύθμιση της μεταφοράς οργανικών κατιόντων εξαρτιόταν από την παρουσία βλεφαρίδων. Προτείνουμε ότι η κορυφαία διατμητική τάση είναι ένα σημαντικό συστατικό οποιασδήποτε in vitro μοντελοποίησηςνεφρώνσωληνοειδήςκύτταρα και είναι πιθανό να είναι ένα σημαντικό συστατικό για τη διαμόρφωση της νεφρικής εκκριτικής κάθαρσης και της νεφροτοξικότητας των φαρμάκων. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός με τον οποίο τα σήματα μηχανικής καταπόνησης αυξάνουν τη δραστηριότητα και την έκφραση του μεταφορέα είναι ακόμα ασαφής και απαιτεί περαιτέρω μελέτη.

βιβλιογραφικές αναφορές

Astashkina A, Mann B, and Grainger DW (2012) Μια κριτική αξιολόγηση μοντέλων κυτταροκαλλιέργειας in vitro για έλεγχο και τοξικότητα φαρμάκων υψηλής απόδοσης. Pharmacol Ther 134:82-106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, and Ciarimboli G (2006) Χαρακτηρισμός ρυθμιστικών μηχανισμών και καταστάσεων ανθρώπινου οργανικού κατιόντος μεταφορέα 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH, and Ferrell N (2016) Ένας αρθρωτός μικρορευστογενής βιοαντιδραστήρας με βελτιωμένη απόδοση για αξιολόγηση πολωμένων νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S, and Wang T (2010) Αλλαγές που προκαλούνται από διάτμηση του εντοπισμού και της έκφρασης του μεταφορέα μεμβράνης σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου ποντικού. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY, and Feraille E (2018) Η νεφρεκτομή ένωσης και η διατμητική τάση κορυφαίου υγρού μειώνουν την αφθονία ENaC στη συλλογή των κύριων κυττάρων του πόρου. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M and Friedlander G (2003) Σωληναριακή διατμητική τάση και φαινότυπος νεφρικών εγγύς σωληναριακών κυττάρων. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD, and Fissell WH (2010) Ένας μικρορευστικός βιοαντιδραστήρας με ενσωματωμένα ηλεκτρόδια μέτρησης διεπιθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης (TEER) για αξιολόγηση νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων. Biotechnol Bioeng 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT, and Fissell WH (2012) Χειρισμός λευκωματίνης από νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα σε μικρορευστοποιητικό βιοαντιδραστήρα. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT, and Fissell WH (2012) Ένας μικρορευστογενής βιοαντιδραστήρας για μελέτες επιθηλιακών κυττάρων υπό τάση διάτμησης υγρού. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M, and Kawamata Y (2017) Η διατμητική τάση υγρού διεγείρει την έκφραση MATE2-K μέσω ενεργοποίησης της οδού Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, et al.; International Transporter Consortium (2010) Μεταφορείς μεμβράνης στην ανάπτυξη φαρμάκων. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY, and Ingber DE (2013) Εγγύς σωληνάριο ανθρώπινου νεφρού σε τσιπ για μεταφορά φαρμάκων και αξιολόγηση νεφροτοξικότητας. Integr Biol 5:1119–1129.

Jansen J, Fedecostante Μ, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, et al. (2016) Τα βιομηχανικά νεφρικά σωληνάρια εκκρίνουν αποτελεσματικά τις ουραιμικές τοξίνες. Sci Rep 6:26715.

Kola I and Landis J (2004) Μπορεί η φαρμακευτική βιομηχανία να μειώσει τα ποσοστά φθοράς; Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C, and Fromm MF (2011) Διπλά επιμολυσμένα κύτταρα MDCK που εκφράζουν ανθρώπινα OCT1/MATE1 ή OCT2/MATE1: καθοριστικοί παράγοντες πρόσληψης και διακυτταρικής μετατόπισης οργανικών κατιόντων. Br J Pharmacol 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ, and Weisz OA (2017) Η κορυφαία ενδοκυττάρωση του εγγύς σωληνίσκου ρυθμίζεται από την τάση διάτμησης υγρού μέσω μιας οδού εξαρτώμενης από mTOR. ΜοΙ Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) Μεταβολή της επιθηλιακής οργάνωσης που προκαλείται από διάτμηση σε ανθρώπινα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L, and Giacomini KM (2013) Νεφρικοί μεταφορείς στην ανάπτυξη φαρμάκων. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K, and Fromm MF (2013) Ο ρόλος του μεταφορέα οργανικών κατιόντων OCT2 και των πρωτεϊνών εξώθησης πολλαπλών φαρμάκων και τοξινών MATE1 και MATE2-K για τις αλληλεπιδράσεις μεταφοράς και φαρμάκων της αντιιικής λαμιβουδίνης. Biochem Pharmacol 86:808-815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004) Δυνατότητα ανάπτυξης, αθανατοποίησης και διαφοροποίησης φυσιολογικών ενήλικων ανθρώπινων εγγύς σωληναριακών κυττάρων. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A, and Yeaman C (2009) Το Deciliation σχετίζεται με δραματική αναδιαμόρφωση των συνδέσεων των επιθηλιακών κυττάρων και των επιφανειακών περιοχών. ΜοΙ Biol Cell 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR, and Day MJ (2007) Ανάπτυξη και εφαρμογή πολλαπλών εσωτερικών αναλύσεων γονιδίου αναφοράς (housekeeper) για ακριβή ομαλοποίηση μελετών έκφρασης γονιδίου σκύλου. Vet Immunol Immunopathol 117:55-66.

Pfaller W and Gstraunthaler G (1998) Έλεγχος νεφροτοξικότητας in vitro--τι γνωρίζουμε και τι πρέπει να γνωρίζουμε. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD, and Weisz OA (2014) Ρύθμιση εξαρτώμενης από διάτμηση της κορυφαίας ενδοκυττάρωσης σε κύτταρα εγγύς νεφρικού σωληναρίου που μεσολαβούν από πρωτογενείς βλεφαρίδες. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V και Weisz OA (2016) Διακρίνοντας τον ρόλο των μηχανοαισθητήρων στη ρύθμιση της λειτουργίας των εγγύς σωληναρίων. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD and Livak KJ (2008) Αναλύοντας δεδομένα PCR σε πραγματικό χρόνο με τη συγκριτική μέθοδο C(T). Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B, and Ulfendahl Η (1983) FITC-ινουλίνη ως δείκτης νεφρικών σωληναρίων στον αρουραίο. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR και Begg DA (1994) Επιδράσεις που εξαρτώνται από τη συγκέντρωση της κυτοχαλασίνης D σε σφιχτές συνδέσεις και νήματα ακτίνης σε επιθηλιακά κύτταρα MDCK. J Cell Sci 107: 367–375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblad F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Μηχανική μικρών σωλήνων με αλλαγές στη διάμετρο για τη μελέτη της οργάνωσης των νεφρικών κυττάρων. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Οι επιστήμες της ασφάλειας των ναρκωτικών και το σημείο συμφόρησης στην ανάπτυξη φαρμάκων. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J, and Grillari-Voglauer R (2008) Το hTERT μόνο απαθανατίζει τα επιθηλιακά κύτταρα των εγγύς νεφρικών σωληναρίων χωρίς να αλλάζει τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y, and Giacomini KM (2013) Ανακάλυψη ισχυρών, εκλεκτικών αναστολέων εξώθησης πολλαπλών φαρμάκων και τοξινών 1 (MATE1, SLC47A1) μέσω του προφίλ συνταγογραφούμενων φαρμάκων και της υπολογιστικής μοντελοποίησης. J Med Chem 56:781-795.