Αντιοξειδωτικές επιδράσεις των φαινυλαιθανοειδών από το Cistanche Deserticola

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong/ Shigetoshi Kadota", Tadato Tani, 6 και Tsuneo Namba"

Το εκχύλισμα ακετόνης-Η2Ο (9:1) από το στέλεχος του Cistanche deserticola έδειξε ισχυρή δράση σάρωσης ελεύθερων ριζών. Από αυτό το εκχύλισμα απομονώθηκαν εννέα κύριες φαινυλαιθανοειδείς ενώσεις. Ταυτοποιήθηκαν με NMR ως ακτεοσίδης, ισοακτεοσίδης, 1^ακετυλακτεοσίδης, τουμπουλοσίδης Β, εχινακοσίδης, τουμπουλοσίδης Α, συριγγαλίδη Α 3z-a-ραμνοπυρανοσίδη, κιστανοσίδη Α και σιστανοζίτης F. Όλες αυτές οι ενώσεις εμφάνισαν ισχυρότερες δραστικότητες από την ελεύθερη ρίζα. -τοκοφερόλη σε ρίζα 1,1 -diphenyI-2-picrylhydrazy 1 (DPPH) και ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου που δημιουργείται από ξανθίνη/οξειδάση ξανθίνης (XOD) (Oj). Μεταξύ των εννέα ενώσεων, ο ισοακτεοσίδης και ο τουμπουλοσίδης Β, του οποίου το καφεοϋλικό τμήμα βρίσκεται στη θέση d' της γλυκόζης, έδειξαν ανασταλτική δράση στο XOD. Μελετήσαμε περαιτέρω τις επιδράσεις αυτών των φαινυλαιθανοειδών στην υπεροξείδωση των λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου που προκαλείται από ενζυματικές και μη ενζυματικές μεθόδους. Όπως ήταν αναμενόμενο, καθένα από αυτά εμφάνισε σημαντική αναστολή τόσο στο ασκορβικό οξύ/Fe2 plus όσο και στο ADP/NADPH/Fe3 συν επαγόμενη υπεροξείδωση λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου, τα οποία ήταν πιο ισχυρά από την α-τοκοφερόλη ή το καφεϊκό οξύ. Η αντιοξειδωτική δράση βρέθηκε να ενισχύεται από την αύξηση του αριθμού των φαινολικών υδροξυλομάδων στο μόριο.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche deserticola; φαινυλαιθανοειδή;αντιοξειδωτικό; Ρίζα DPPH (1,1 -διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλ). ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου; υπεροξείδωση των λιπιδίων

στέλεχος Cistanche deserticola

Το στέλεχος του Cistanche spp. (Cistanche Herba, οικογένεια Orobanchaceae) είναι ένα τονωτικό στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική που χρησιμοποιείται για την ανεπάρκεια των νεφρών που χαρακτηρίζεται από ανικανότητα, αίσθηση κρύου στην οσφυϊκή χώρα και τα γόνατα, γυναικεία στειρότητα και δυσκοιλιότητα λόγω ξηρότητας του εντέρου στη γεροντική.Από αυτά τα φυτά έχει απομονωθεί ένας αριθμός συστατικών, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλο-εθμοειδών (μερικές φορές ονομαζόμενες φαινυλοπροπανοειδή),2) των ιδιοειδών3* και των πολυσακχαριτών4). Οι Sato et al5} ανέφεραν ότι ορισμένα φαινυλαιθανοειδή από αυτό το ακατέργαστο φάρμακο έδειξαν προστατευτική δράση έναντι των μειώσεων τόσο της σεξουαλικής όσο και της μαθησιακής συμπεριφοράς σε κρεμασμένα ποντίκια με στρες. Τα φαινυλαιθανοειδή είναι τα κύρια συστατικά αυτών των φυτών και θεωρείται ότι συμβάλλουν στις διάφορες δράσεις αυτού του φαρμάκου.6)

Τα φαινυλαιθανοειδή είναι ευρέως διανεμημένα στο φυτικό βασίλειο και ορισμένα έχουν βρεθεί ότι έχουν τη δράση κατά της ανοξίας, 7) κατά του νεοπλάσματος, 8) αναστολής ενζύμων, 9* αντιφλεγμονής, 10) αντινεφρίτιδας, 1 n αντιμικροοργανισμών και ανοσορύθμιση.12) Μελέτες σχετικά με την αντιοξειδωτική δράση ορισμένων φαινυλαιθανοειδών από το Pedicularis αναφέρθηκαν επίσης,13 -15), αλλά δεν βρέθηκε αναφορά που να ασχολείται με την αντιοξειδωτική δράση των φαινυλαιθανοειδών από τα είδη Cistanche.

Είναι ευρέως αναγνωρισμένο ότι οι ελεύθερες ρίζες εμπλέκονται κρίσιμα σε διάφορες παθογένειες όπως ο καρκίνος, οι καρδιαγγειακές διαταραχές, η αρθρίτιδα, η φλεγμονή, καθώς και στις εκφυλιστικές διεργασίες που σχετίζονται με τη γήρανση.16™18) Στον έλεγχο μας για αντιγηραντικούς παράγοντες από φυσικούς πόρους , βρήκαμε ότι καθένα από τα εκχυλίσματα CHC13 (C), EtOAc (E), ακετόνη (Α), ακετόνη-Η2Ο (9:1) (ΑΗ) και νερό (Η) του στελέχους του Cistanche deserticola παρουσίασε ισχυρή DPPH δραστικότητα καθαρισμού ριζών (Εικ. 1), μεταξύ των οποίων, η ισχυρότερη παρουσίασε το εκχύλισμα ακετόνης—Ηβ.(9:1) (ΑΗ). Το εκχύλισμα ακετόνης-Η2Ο (9:1) περιείχε υψηλή αναλογία φαινυλαιθανοειδών, τα οποία πιθανώς ήταν ενεργά συστατικά των επιδράσεων δέσμευσης ελεύθερων ριζών. Απομονώσαμε τα κύρια φαινυλαιθανοειδή από αυτό το εκχύλισμα και μελετήσαμε τις αντιοξειδωτικές επιδράσεις τους με τη σάρωση τους στη ρίζα DPPH και στη ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου που παράγεται από ξανθίνη/XOD και την αναστολή τους του ασκορβικού οξέος/Fe2 plus και ADP/NADPH/Fe3 συν επαγόμενη υπεροξείδωση λιπιδίων στο ήπαρ αρουραίου μικροσώματα.

Cistanche deserticola

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Αντιδραστήρια Πολυαμίδιο C-200 (75 一150/zm) και γέλη πυριτίου (Wakogel C-200, 75—150^m) σκόνη για χρωματογραφία στήλης, DPPH (1,1 -διφαινύλιο{{ 8}}πικρυλυδραζύλιο), ξανθίνη, XOD (οξειδάση ξανθίνης), NBT (νιτρομπλε τετραζόλιο), ADP, g-NADPH, καφεϊκό οξύ και α-τοκοφερόλη αγοράστηκαν από την Wako Pure Chemicals, Osaka, Ιαπωνία. Η μαλοναλδεΰδη δις(διμεθυλακετάλη) ήταν από το Tokyo Kasei, Τόκιο, Ιαπωνία. Το BSA (αλβουμίνη ορού βοοειδών) και η αλλοπουρινόλη ήταν από το sigma, St. Louis, ΗΠΑ Άλλα χημικά ήταν αναλυτικής ποιότητας.

Όργανα Η απορρόφηση της υπεριώδους ακτινοβολίας μετρήθηκε σε αΦασματοφωτόμετρο εγγραφής Shimadzu UV-2200, φάσματα NMR μεταφέρθηκαν σε σύστημα JEOL GX-400 ή JEOL JNM-LA 400WB FT NMR.

Φυτικά Υλικά Ένα εμπορικό ακατέργαστο φάρμακο (που παράγεται στο Nei Monggol, αγοράστηκε στην αγορά ακατέργαστων φαρμάκων Bozhou, επαρχία Anhui, Κίνα, 1995· το δείγμα του κουπονιού, TMPW No. 15479 κατατέθηκε στο Museum of Materia Medica, Αναλυτικό Ερευνητικό Κέντρο Εθνομιατρικής, Έρευνα Ινστιτούτο για Wakan-Yaku, Ιατρικό και Φαρμακευτικό Πανεπιστήμιο Toyama) αναγνωρίστηκε ως στελέχη του Cistanche deserticola YC Ma συγκρίνοντας τους μορφολογικούς και ανατομικούς του χαρακτήρες με ένα αυθεντικό δείγμα που παρέχεται από τον καθηγητή Dawen Shi, Τμήμα Φαρμακογνωσίας, Shanghai Medical Uni versity, Κίνα.

Εκχύλιση και απομόνωση Το ακατέργαστο φάρμακο σε σκόνη (5,87 kg) εκχυλίστηκε διαδοχικά με CHC13 (12, 9 1x2) και EtOAc (9 1 x 3) σε θερμοκρασία δωματίου και ανέρρευσε με ακετόνη (9 1 x 3), ακετόνη-玦0 (9:1,91x3) και H2O (7.5 1x4) για να δώσουν τα εκχυλίσματα CHC13 (C) (28,7 g), EtOAc (E) ( 13,4 g), ακετόνη (Α) (95 g), ακετόνη-Η2Ο (9:1) (ΑΗ) (175 g) και Η2Ο (Η) (2,51 kg), αντίστοιχα. Ένα μέρος του lOOg του εκχυλίσματος ακετόνης-Η2Ο (9:1) υποβλήθηκε σε στήλη πολυαμιδίου C-200 (4{{50}}0 g) και εκλούστηκε με Η2Ο ({{41 }}) και μετά MeOH (5 1). Το έκλουσμα MeOH (20 g) φορτώθηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής (600 g) και εκλούστηκε με CHCl3-MeOH-H2O (8: 3:0.3) (5 1) για να δώσει 10 κλάσματα. Κάθε κλάσμα υποβλήθηκε σε στήλη Sephadex LH-20 και εκλούστηκε με διάφορες αναλογίες MeOH-H2O (0050 τοις εκατό). εννέα κύρια φαινυλαιθανοειδή 1 (607 mg), 2 (286 mg), 3 (43 mg), 4 (187 mg), 5 (1,1 g), 6 (100 mg), 7 (208 mg), 8 (168 mg) ελήφθησαν 9 (75 mg).

Ζώα Αρσενικά Std: Χρησιμοποιήθηκαν αρουραίοι Wistar (ηλικίας 8 εβδομάδων, 230 × 250 g). Τα ζώα αγοράστηκαν από το Shizuoka Laboratory Animal Center και τράφηκαν με εργαστηριακή τροφή με σφαιρίδια (Clea Japan) και έλαβαν νερό κατά βούληση.

Παρασκευή μικροσωμικού εναιωρήματος ήπατος αρουραίου Μικροσωμικό κλάσμα ήπατος αρουραίου παρασκευάστηκε με τη μέθοδο των Kiso et al.19) αλλά χωρίς προκατεργασία φαινοβαρβιτάλης. Μετά από νηστεία των ζώων για 24 ώρες, τα συκώτια εγχύθηκαν με ένα παγωμένο διάλυμα 0.9 τοις εκατό NaCl in situ, στη συνέχεια κόπηκαν σε λεπτά κομμάτια και ομογενοποιήθηκαν σε κρύο διάλυμα KC1 1,15 τοις εκατό (1.{{9} } ml/g υγρού βάρους ήπατος). Το ομογενοποίημα αραιώθηκε τέσσερις φορές με 1,15 τοις εκατό διάλυμα KC1 και φυγοκεντρήθηκε στα 8000 g για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το υπερκείμενο κλάσμα στη συνέχεια συλλέχθηκε και υπερφυγοκεντρήθηκε στα 105000 g για 60 λεπτά. Το σφαιρίδιο που ελήφθη επαναιωρήθηκε στον ίδιο όγκο διαλύματος KC1 1,15 τοις εκατό. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο των Lowry et χρησιμοποιώντας αλβουμίνη ως πρότυπο.

Προετοιμασία δείγματος Τα δείγματα που δοκιμάστηκαν διαλύθηκαν σε νερό ή αιθανόλη και αραιώθηκαν με νερό σε διάφορες συγκεντρώσεις. Οι τελικές συγκεντρώσεις αιθανόλης ήταν κάτω από 1 τοις εκατό σε όλα τα συστήματα προσδιορισμού εκτός από τη δοκιμασία δέσμευσης ριζών DPPH. Η αιθανόλη σε τελική συγκέντρωση κάτω από 1 τοις εκατό δεν έδειξε καμία επίδραση σε αυτά τα συστήματα προσδιορισμού.

DPPH Radical Scavenging Effect Το αποτέλεσμα σάρωσης αντιστοιχούσε στην ένταση της απόσβεσης της ρίζας DPPH, όπως περιγράφεται από τους Hatano et al.21) Πεντακόσια /Α από 60 卩m DPPH σε EtOH προστέθηκαν σε 500 /zl διαλύματος δείγματος και αφέθηκαν να αντιδράσουν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 520 nm. Για το τυφλό, χρησιμοποιήθηκε EtOH αντί του διαλύματος DPPH και για τον έλεγχο, χρησιμοποιήθηκε H2O αντί του διαλύματος δείγματος. Οι τιμές IC50 υπολογίστηκαν από γραμμές παλινδρόμησης όπου η τετμημένη αντιπροσώπευε τη συγκέντρωση της ελεγχόμενης ένωσης και η τεταγμένη τη μέση ποσοστιαία μείωση της ρίζας DPPH από τέσσερις ξεχωριστές δοκιμές.

Επιδράσεις στη δημιουργία ριζών ανιόντων υπεροξειδίου Η παραγωγή ανιόντων υπεροξειδίου στο σύστημα ξανθίνης/XOD προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μισό μέγεθος της μεθόδου των Imanari et al.22) Ένα μείγμα που αποτελείται από 900/zl από 0,05m Na2CO3 (pH 10,2), 50/il καθένα από 3mM ξανθίνη, 3mM EDTA, 1,5mg/ml BSA, 0,75 mM NBT και το δοκιμασμένο δείγμα προστέθηκε με 50 από 0,1 mg/ml XOD για να ξεκινήσει η αντίδραση. Μετά από επώαση για 30 λεπτά, η αντίδραση σταμάτησε με 50/1 6 mM CuCl2 και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm. Το διάλυμα ελέγχου παρασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο, αλλά αντί του διαλύματος δείγματος χρησιμοποιήθηκαν 50 / il H2O. Σε τυφλό διάλυμα, χρησιμοποιήθηκαν 50 /il H2O αντί του διαλύματος XOD. Οι τιμές IC50 υπολογίστηκαν από γραμμές παλινδρόμησης όπου η τετμημένη αντιπροσώπευε την λογαριθμική συγκέντρωση της ελεγχόμενης ένωσης και η τεταγμένη τη μέση επί τοις εκατό αναστολή της μείωσης του ΝΒΤ κατά τέσσερα σε εξαρτώμενες δοκιμές.

Ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα του XOD Οι ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα του XOD εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο των Hatano et al.* με ορισμένες τροποποιήσεις. Ένα μείγμα που αποτελείται από 600/11 ρυθμιστικού διαλύματος (0.1 m φωσφορικό διάλυμα, pH 7,5), 50 以 διαλύματος XOD (0,068 U/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα) και 50 μ 1 διαλύματος δείγματος προεπωάστηκε για 10 λεπτά στους 25 βαθμούς. Στη συνέχεια, 300 pl διαλύματος ξανθίνης (0,1 mM σε ρυθμιστικό) προστέθηκαν στο μίγμα και το προκύπτον διάλυμα επωάστηκε για 30 λεπτά στους 25 βαθμούς. Η ενζυμική αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 1 η HC1 (100/zl) και η απορρόφηση του μίγματος της αντίδρασης μετρήθηκε στα 295 nm. Η συγκέντρωση του ουρικού οξέος που σχηματίστηκε στο μίγμα υπολογίστηκε από την απορρόφηση, μετά την αφαίρεση της απορρόφησης του τυφλού διαλύματος που παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω, εκτός από το ότι το διάλυμα XOD υποκαταστάθηκε με 50/zl του ρυθμιστικού διαλύματος. Οι ανασταλτικές επιδράσεις στο XOD εκφράστηκαν με την εκατοστιαία αναστολή (%) του σχηματισμού ουρικού οξέος έναντι αυτού του ελέγχου, στον οποίο χρησιμοποιήθηκε νερό αντί του διαλύματος δείγματος. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ο γνωστός αναστολέας XOD, η αλλοπουρινόλη.

Ανασταλτικές επιδράσεις στην υπεροξείδωση των λιπιδίων σε μικροσωμάτια ήπατος αρουραίου Η υπεροξείδωση λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου που προκαλείται μη ενζυμικά από ασκορβικό/Fe2 plus και ενζυματικά επαγόμενη από ADP/NADPH/Fe3 plus μετρήθηκαν με τη μέθοδο των Kiso et al.19) με ορισμένες τροποποιήσεις .

α) Ασκορβικό οξύ/Fe2 συν επαγόμενη υπεροξείδωση λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου: Το μείγμα αντίδρασης αποτελείται από 390/11 από 100 mM KC1/45 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 pl μικροσωμικού κλάσματος σε 1,15 τοις εκατό KC1 (20 mg πρωτεΐνης/ml) ​​και 50 μΐ διαλύματος δείγματος. Μετά την προσθήκη 10/11 10 mM ασκορβικού οξέος/0,5 mM FeS04 και στη συνέχεια επώαση στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά, το μίγμα της αντίδρασης ψύχθηκε σε πάγο για να σταματήσει η αντίδραση. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων μετρήθηκε με τη μέθοδο θειοβαρβιτουρικού οξέος24) και εκφράστηκε ως παραγωγή MDA (μηλονοδιαλδεΰδης). Οτι

β) ADP/NADPH/Fe3 συν Επαγόμενη υπεροξείδωση λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου: Το μείγμα αντίδρασης περιείχε 290贝 100 mM KC1/45him Tris-HCl (pH 8,0), 50/il μικροσωμικού εναιωρήματος σε 1,15 τοις εκατό KC (20 mg πρωτεΐνης/ml) ​​και 50 以 δείγματος σε νερό. Πενήντα πρόσφατα παρασκευασθέντα 20 mM ADP, 50//I 1 mM NADPH και 10 2 mM FeCl3 προστέθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Μετρήθηκε η υπεροξείδωση των λιπιδίων και η IC50 υπολογίστηκε με την παραπάνω μέθοδο.

Οφέλη από το cistanche: προστατεύουν το συκώτι

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Προσδιορισμός Δομής Με άμεση σύγκριση των δεδομένων τους ^H-NMR και 13C-NMR με τη βιβλιογραφία,2* τα εννέα φαινυλαιθανοειδή ταυτοποιήθηκαν ως 2,-ακετυλολακτεοζίτης (1), κιστανοζίτης Α (2), τουμπουλοσίδης Α (3), εχινακοσίδης ( 4), ακτεοσίδη (5), συριγγαλίδη Α 3'-α-ραμνοπυρανοσίδη (6), τουμπουλοσίδη Β (7), ισοακτεοσίδη (8) και κιστανοζίτη F (9), αντίστοιχα (Εικ. 2). Ωστόσο, για την ακτεοσίδη, μια αντιπροσωπευτική ένωση φαινυλαιθανοειδών, αντιστοιχίσεις των σημάτων 13C-NMR των C{-3 και C-4 στο τμήμα αγλυκόνης, C-3, C{-4 , C{-5 και C-6 στο καφεϊκό τμήμα σε προηγούμενες αναφορές25) ήταν συγκεχυμένες. Με τη μέθοδο του 2D-NMR όπως HMBC και HMQC, εκχωρήσαμε ξεκάθαρα τα δεδομένα 13C-NMR της ακτεοσίδης ως τμήμα αγλυκόνης Cl: 131,49, C-2: 117,14, C-3: 146,07, C {41}}: 144,62, C-5: 116,34, C-6: 121,29, Ca: 72,33, C# 36,54; τμήμα καφεοϋλίου Cl: 127,63, C-2: 115,26, C-3: 146,79, C-4: 149,78, C-5: 116,55, C-6: 123,2 , Ca: 168,33, Cg: 114,68, Cy: 148,04; ήμισυ γλυκόζης C-l': 104,16, C-2': 75,97, C-3': 81,66, C4: 70,39, C-5': 76,16, C-6' : 62,35; και τμήμα ραμνόζης: Cl: 102,99, C-2: 72,22, C{106}}: 72,05, C{109}}: 73,79, C-5: 70,58, C{115} : 18.46.

Οι σχέσεις δομής-δραστικότητας μελετήθηκαν για αυτά τα εννέα φαινυλαιθανοειδή από τη ρίζα τους DPPH και τις δραστηριότητες σάρωσης ριζών ανιόντος υπεροξειδίου που δημιουργούνται από ξανθίνη/XOD, ασκορβικό οξύ/Fe2 plus και ADP/NADPH/Fe3 συν επαγόμενη υπεροξείδωση λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου. Ως θετικές ουσίες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν το καφεϊκό οξύ και η α-τοκοφερόλη που είναι πολύ γνωστοί δεσμευτές ελεύθερων ριζών και αντιοξειδωτικά.

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>συριγγαλίδη A S'-a-rhamnopyranoside (6) (IC5O=5.52 /zm) > cistanoside F (9) (IC50=6.29 /im) > α-τοκοφερόλη (IC{{10 }}.2//m). Tubuloside B ⑺, echinacoside (4), 2/-acetylacetoside (1), tubuloside A (3), acteoside (5) and isoacteoside (8) (IC5O=2).99一3,49 /im), καθένα από τα οποία έχει τέσσερις ομάδες φαινολικού υδροξυλίου στο μόριο παρουσίασε ομοίως ισχυρότερη δραστικότητα από τον κιστανοζίτη Α (2) του οποίου το τμήμα 3-ΟΗ της αγλυκόνης μεθυλιώθηκε. Η συριγγαλίδη Α 3ζ-α-ραμνοπυρανοσίδη (6) που έχει μόνο μία ομάδα ΟΗ στο τμήμα αγλυκόνης έδειξε σχετικά ασθενή δραστικότητα. Το Cistanoside F (9), το οποίο έχει μόνο δύο υδροξυλομάδες που βρίσκονται στο τμήμα του καφεοϋλίου αλλά δεν έχει αγλυκόνη φαινυλαιθανόλης, εμφάνισε την πιο αδύναμη δράση.

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>κιστανοσίδη Α (2) (IC5O=3.69 jUm) > α-τοκοφερόλη (IC50 > 10 〃m).

Ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα XOD Μόνο ο ισοακτεοζίτης (8) και ο τουμπουλοσίδης Β (7), του οποίου το τμήμα καφεοϋλίου βρίσκεται στη θέση 6z της γλυκόζης, είχαν ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα του XOD και άλλων φαινυλαιθανοειδών, τα οποία έχουν τμήμα καφεοϋλίου στο ^- θέση της γλυκόζης, δεν έδειξε αποτελέσματα στις ελεγχόμενες συγκεντρώσεις (25 × 200 m) (Πίνακας 1). απομόνωσε εννέα κύριες φαινυλαιθανοειδείς ενώσεις από αυτό το εκχύλισμα και προσδιόρισε τις δομές τους με NMR. σύστημα ως tubuloside B (7)M2'-acetylakteoside (1) iso-acteoside (8) echinacoside (4) tubuloside A (3) M acteo side (5) > syringalide A 3'-a-rhamnopyranoside (6) > cistanoside A (2) > κιστανοζίτη F (9); σε σύστημα ADP/NADPH/Fe3 plus ως tubuloside B (7)2,-acetylakteoside (^^iso acteoside (8) acteoside (5) > tubuloside A (3) > echinaco side (4) > syringalide A 3z-a-rhamnopyranoside (6) > cistanoside A (2) > cistanoside F (9). Και οι δύο αυτές τάξεις ήταν παρόμοιες με αυτές στις παραπάνω δοκιμές καθαρισμού ελεύθερων ριζών, ειδικά στη δοκιμή σάρωσης ριζών DPPH. Ωστόσο, ο αριθμός των φαινολικών υδροξυλομάδων στο μόριο έπαιξε τον πιο σημαντικό ρόλο στην αναστολή της υπεροξείδωσης των λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου.

επιδράσεις του cistanche

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Δοκιμάσαμε τις δραστηριότητες σάρωσης ελεύθερων ριζών των διαφόρων εκχυλισμάτων διαλυτών του στελέχους του Cistanche deserticola σε ρίζα DPPH και βρήκαμε ότι το εκχύλισμα ακετόνης-Η2Ο (9:1) παρουσίαζε την ισχυρότερη δράση. Για να βρούμε τα ενεργά συστατικά της δραστηριότητας δέσμευσης ελεύθερων ριζών, απομονώσαμε εννέα κύριες φαινυλαιθανοειδείς ενώσεις από αυτό το εκχύλισμα και προσδιορίσαμε τις δομές τους με NMR.

Οι αντιοξειδωτικές επιδράσεις αυτών των φαινυλαιθανοειδών αξιολογήθηκαν από τη δράση δέσμευσης ελεύθερων ριζών και τη δραστικότητα αντι-λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η ευρέως γνωστή α-τοκοφερόλη χρησιμοποιήθηκε ως ουσία θετικού ελέγχου. Όπως τοΗ λιποφιλικότητα της α-τοκοφερόλης μπορεί να επηρεάσει τις δραστηριότητές της στα παρόντα συστήματα ανάλυσης, εκτός από τον προσδιορισμό καθαρισμού ριζών DPPH, λάβαμε το καφεϊκό οξύ ως άλλη ουσία θετικού ελέγχου.

Αρχικά, πραγματοποιήσαμε δοκιμές στις δραστηριότητες σάρωσης ελεύθερων ριζών. Και τα 9 φαινυλαιθανοειδή που δοκιμάστηκαν εμφάνισαν αναμφίβολα ισχυρότερες δράσεις σάρωσης ριζών DPPH και ανιόντων υπεροξειδίου από την α-τοκοφερόλη, αλλά μερικά ήταν ισχυρότερα και άλλα ήταν πιο αδύναμα από το καφεϊκό οξύ. Η δραστικότητα δέσμευσης ριζών αυξήθηκε με την αύξηση του αριθμού των φαινολικών υδροξυλομάδων. Ο ατελής παραλληλισμός των δραστηριοτήτων σάρωσης ριζών DPPH και ανιόντων υπεροξειδίου πιστεύεται ότι οφείλεται στους διαφορετικούς χαρακτήρες μεταξύ των ειδών ριζών και ορισμένων άλλων παραγόντων που εμπλέκονται σε αυτά τα δύο συστήματα αντίδρασης,21,26) για τη ρίζα DPPH είναι μια χημικά επαγόμενη ρίζα που αντιδρά με καθαριστές ριζών με απλό χημικό τρόπο, ενώ η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου παράγεται από ξανθίνη/XOD, μια ενζυμική αντίδραση.

Εάν τα φαινυλαιθανοειδή αναστέλλουν τη ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου που δημιουργείται από ξανθίνη/XOD, η αναστολή μπορεί να θεωρηθεί ως αποτέλεσμα της δραστικότητας δέσμευσης ριζών ανιόντος υπεροξειδίου ή (και) της αναστολής τους του ενζύμου XOD,23), γι' αυτό πραγματοποιήσαμε μια δοκιμή τους. ανασταλτικές επιδράσεις της οξειδάσης της ξανθίνης. Είναι ενδιαφέρον ότι, επιλεκτικά, μόνο ο ισοακτεοζίτης (8) και ο τουμπουλοσίδης Β (7), του οποίου η ομάδα καφεοϋλίου βρίσκεται στη θέση 6/-της γλυκόζης, επέδειξαν αναστολή. Έδειξαν μια επίδραση σε συγκέντρωση 25-200jtiM σε 3,4xlO^3U/ml (10 κανάτα/ml) XOD, αν και η δράση ήταν ασθενέστερη από την αλλοπουρινόλη. άλλες ενώσεις, των οποίων το τμήμα καφεοϋλίου βρίσκεται στη θέση της γλυκόζης, δεν έδειξαν ανασταλτική δράση. Αυτό το αποτέλεσμα παρείχε την πρώτη αναφορά της ανασταλτικής δράσης των φαινυλαιθανοειδών στο ένζυμο XOD. Οι Chan et al21) ανέφεραν ότι το καφεϊκό οξύ και ορισμένα από τα ανάλογα του είχαν ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα XOD, ωστόσο, δεν βρήκαμε τέτοια επίδραση του καφεϊκού οξέος υπό τις παρούσες συνθήκες αντίδρασης. Σε αυτή τη δοκιμή, η συγκέντρωση XOD ήταν παρόμοια με εκείνη στη δοκιμή επίδρασης στη δημιουργία ριζών ανιόντων υπεροξειδίου (4,3 /zg/ml), αλλά η συγκέντρωση των ενώσεων ήταν πολύ υψηλότερη από ό,τι στην τελευταία. Ως εκ τούτου, η αναστολή της γενιάς Oj από αυτά τα φαινυλαιθανοειδή οφείλεται στη ριζική δράση καθαρισμού τους, αλλά όχι στην ανασταλτική τους δράση του ενζύμου XOD.

Είναι γνωστό ότι η αλυσιδωτή αντίδραση των ελεύθερων ριζών οδηγεί τελικά σε υπεροξείδωση λιπιδίων.28,29) Ως εκ τούτου, μελετήσαμε αυτές τις φαινυλαιθανοειδείς ενώσεις για τις επιδράσεις τους στην υπεροξείδωση των λιπιδίων σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου που προκαλείται από το ενζυματικό σύστημα ADP/NADPH/Fe3 plus και που προκαλείται από το μη ενζυματικό σύστημα ασκορβικό οξύ/Fe2 plus . Όλες αυτές οι ενώσεις έδειξαν ισχυρότερα αποτελέσματα αντι-λιπιδικής υπεροξείδωσης από το καφεϊκό οξύ και την α-τοκοφερόλη και στα δύο συστήματα. Είναι γενικά αποδεκτό ότι και τα δύο συστήματα καταλύονται από ιόντα σιδήρου, είτε Fe2 plus είτε Fe3 plus, που εμπλέκονται με λιπιδικές υπεροξυλικές ρίζες,30,31) και ότι η ρίζα υδροξυλίου ΟΗ παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο στην υπεροξείδωση των λιπιδίων,32 _34) αν και η έναρξη της ΟΗ έχει αμφισβητηθεί σε ορισμένες αναφορές.35祁6) Από την άλλη πλευρά, η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου OJ, η οποία είναι το πρωταρχικό προϊόν της επίθεσης e_ στο O2 στην αλυσίδα των ριζών, είναι μάλλον ανεπαρκής αντιδραστική ρίζα και δεν έχει ως αποτέλεσμα την ίδια την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Αν και αυτά τα φαινυλαιθανοειδή έδειξαν ασθενέστερη σαρωτική δράση στη ρίζα ανιόντων υπεροξειδίου από το καφεϊκό οξύ, έδειξαν πολύ ισχυρότερη αντιλιπιδική υπεροξείδωση από το τελευταίο. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι, όπως και ορισμένες άλλες αρωματικές πολυφαινόλες που διασπούν την αλυσίδα, μπορεί να αναστείλουν την παραπάνω λιπιδική υπεροξείδωση σε μικροσώματα ήπατος αρουραίου χηλώνοντας ιόντα Fe2 plus ή Fe3 plus, και επίσης με σάρωση της ρίζας υπεροξειδίου Oj για τη διάσπαση της ριζικής αλυσιδωτής αντίδρασης .37,38) Επιπλέον, μπορούν επίσης να καθαρίσουν πιο τοξικά είδη ριζών όπως οι ρίζες υδροξυλίου και οι ρίζες λιπιδίου υπεροξυλίου για να διακόψουν άμεσα την υπεροξείδωση των λιπιδίων σε υψηλότερη ισχύ από το καφεϊκό οξύ.38,39)

Li et al. μελέτησε ορισμένους φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίτες, συμπεριλαμβανομένου του ακτεοσίδη (βερμπασκοσίδη) (5), ισοακτεοσίδη (ισοβερβασκοσίδη) (1) και εχινακοσίδη (4) από την Pedicularis για την αναστολή της αυτοοξείδωσης του λινολεϊκού οξέος στα μικκύλια, ένα μη βιολογικό σύστημα,13. για την προστασία τους από την οξειδωτική αιμόλυση in vitro, 14''1 και επίσης για τις επιδράσεις καθαρισμού τους στο υπεροξείδιο που παράγεται από NBT/PMS/NADH και την αναστολή της υπεροξείδωσης των λιπιδίων που προκαλείται από ασκορβικό οξύ/Fe2 συν σε μικροσώματα ήπατος ποντικού.15) Μια παρόμοια δραστηριότητα -Σχέση δομής παρατηρήθηκε στις αναφορές των Li et al. και τα αποτελέσματά μας. Δηλαδή, οι δραστηριότητες των φαινυλαιθανοειδών για την αναστολή της υπεροξείδωσης των λιπιδίων εξαρτώνται κυρίως από τον αριθμό και τη στερική θέση των φαινολικών υδροξυλομάδων.15) Με βάση τη στερεοχημεία τους, οι φαινολικές υδροξυλομάδες του τμήματος καφεοϋλίου στον ακτεοζίτη (5), τουμπουλοσίδη Α ( 3) και η εχινακοσίδη (4), που έχουν το καφεοΰλιο στη θέση 4z της γλυκόζης, θα σχημάτιζαν ευκολότερα δεσμό υδρογόνου με τις υδροξυλομάδες του ραμνοσυλίου από εκείνες του ισοακτεοσιδίου (8) και του τουμπουλοσιδίου Β (7), που έχουν το καφεοϋλιο στη θέση 6'- της γλυκόζης. Έτσι, οι τελευταίες διατήρησαν περισσότερες ελεύθερες φαινολικές υδροξυλομάδες από τις πρώτες και ως εκ τούτου εμφάνισαν ισχυρότερη αντιλιπιδική υπεροξείδωση. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η 2z-ακετυλίωση αυτών των φαινυλαιθανοειδών, αν και ελαφρώς, ενίσχυσε την αντιοξειδωτική τους δράση. Για παράδειγμα, ο ακτεοσίδης (5) και ο ισοακτεοσίδης (8), όταν το 2'- ακετυλιώθηκε σε 2/-ακετυλακτεοζίτη (1) και τουμπουλοσίδη Β (7), αντίστοιχα, έδειξαν ισχυρότερες δραστηριότητες και στα τέσσερα συστήματα προσδιορισμού. Λόγω της υπεροχής της στερεοχημείας και της 2'-ακετυλίωσης, η τουμπουλοσίδη Β (7) εμφάνισε την ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση μεταξύ των δειγμάτων που δοκιμάστηκαν. Ίσως λόγω της αντικατάστασης ενός τρίτου τμήματος σακχάρου στη θέση 6', αυτή η συσχέτιση δεν ταίριαζε καλά στην περίπτωση του τουμπουλοσιδίου Α (3) ή της εχινακοσίδης (4). Ωστόσο, στο σύστημα ADP/NADPH/Fe3 plus, η τουμπουλοσίδη Α ⑶ εξακολουθούσε να παρουσιάζει ισχυρότερη αντιλιπιδική υπεροξείδωση από την εχινακοσίδη (4).

Επιπλέον, η σειρά δραστικότητας σάρωσης ριζών DPPH έδειξε καλύτερο παραλληλισμό με εκείνη της υπεροξείδωσης αντι-λιπιδίων από ό,τι η τάξη της δραστικότητας σάρωσης ριζών ανιόντος υπεροξειδίου. Αυτό απέδειξε ξανά ότι ο προσδιορισμός δέσμευσης ριζών DPPH είναι μια βολική και αξιόπιστη μέθοδος για αντιοξειδωτική δοκιμασία,26) αν και η ρίζα DPPH είναι μια χημικά επαγόμενη ρίζα ενώ η ρίζα ανιόντων υπεροξειδίου θα μπορούσε να είναι μια βιολογικά ενδογενής ρίζα.

Συμπερασματικά, και τα εννέα φαινυλαιθανοειδή εμφάνισαν σημαντικές δραστηριότητες σάρωσης ελεύθερων ριζών και επιδράσεις κατά της υπεροξείδωσης των λιπιδίων στην παρούσα μελέτη. Η αντιοξειδωτική δράση ενισχύθηκε από την αύξηση του αριθμού των φαινολικών υδροξυλομάδων στο μόριο. Όπως μπορούμε να φανταστούμε, οι αντιοξειδωτικές επιδράσεις αυτών των φαινυλεθαινοειδών που αποδεικνύονται εδώ μπορεί να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη δράση του φαρμάκου Cistanchis Herba και μπορεί να εξηγήσουν εν μέρει τους μηχανισμούς της δράσης ορισμένων φαινυλοαιθανοειδών κατά των νεοπλασμάτων,8* φλεγμονής10) και της νεφρίτιδας. 1 n στο οποίο εμπλέκονται σοβαρά οι ελεύθερες ρίζες.

Cistanche Echinacoside: Αντιοξειδωτική

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1) Namba T., «The Encyclopedia of Wakan-Yaku (Traditional Sino-Japanese Medicines) with Color Pictures,5, Vol. II, Hoikusha, Tokyo, 1994, σελ. 16—17.

2) α) Kobayashi Η,, Karasawa Η., Miyase Τ., Fukushima S., Chem. Pham. BulL, 32, 3009-3014 (1984); β) Idem, ό.π., 32, 3880-3885 (1984); γ) Idem, ό.π., 33, 1452-1457 (1985); δ) Karasawa Η., Kobayashi Η., Takizawa Ν., Miyase Τ., Fukushima S., Yakugaku Zasshi, 106, 562-566 (1986); ε) Idem, ό.π., 106, 721-724 (1986); /) Kobayashi Η., Oguchi Η., Takizawa Ν., Miyase Τ., Ueno Α., Usmanghani Κ., Ahmad Μ., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309 一3314 (1987); ζ) Yoshizawa F., Deyama T., Takizawa N., Usmanghani K., Ahmad M., ό.π., 38, 1927-1930 (1990).

3) α) Kobayashi Η, Komatsu J., Yakugaku Zasshi, 103, 508 一511 (1983); β): Kobayashi Η., Karasawa Η., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1729-1734 (1984); γ) Idem, ό.π., 33, 3645-3650 (1985).

4) Naran R., Ebringerova Α., Hromadkova Ζ., Patoprsty V., Phytochemistry, 40, 709-715 (1995).

5) Sato T., Kozima S., Kobayashi K., Kobayashi H., Yakugaku Zasshi. 105, 1131-1144 (1985).

6) Jin XL, Zhang QR, China J. Chinese Materia Medica, 19, 695-697 (1994).

7) Yamahara J., Kitani Τ., Kobayashi Η., Kawahara Υ., Yakugaku Zasshi, 110, 932-935 (1990).

8) α) Pettit G. R・, Numata Α., Takemura Τ., Ode RH, Narula Α, S., Schmidt JM, Cragg GM, Pase CP, J. Nat. Prod., 53, 456-58 (1990); β) Saracoglu Ι., Inoue Μ., Calis Ι., Ogihara Y., Biol. Pharm, Bull., 18, 1396-1400 (1995).

9) Andary C., '4 Caffeic Acid Glycoside Esters and Pharmacology/ ed. του Scalbert A., Polyphenolic Phenomena, INRA Editions, Παρίσι, 1993, σελ. 237—245.

10) Murai Μ., Tamayama Υ., Nishibe S., Planta Med.. 61, 479—80 (1995).

11) Hayashi Κ., Nagamatsu Τ., Ito Μ., Hattori Τ., Suzuki Υ., Jpn. J. Pharmacol., 66, 47 一52 (1994).

12) α) Molnar J., Gunics G., Mucsi Ι., Koltai Μ., Petri L, Shoyama Υ., Matsumoto Μ., Nishioka L, Acta Microbiol. Hung.. 36, 425-32 (1989); β) Sasaki Η., Nishimura Τ., Morota Τ., Chin Μ., Mitsuhashi Η" Komatsu Υ., Maruyama Η., Tu GR, He W., Xiong YL, Planta Med., 55, 4582462 (1989).

13) Li J., Wang PF, Zheng RL, Liu ZM, Jia 乙 J., Planta Med., 59, 315-317 (1993).

14) Zheng RL, Wang PF, Li J., Liu Ζ. Μ, Jia ZJ, Chem. Phys. Λιπίδια. 65, 151-154 (1993).

15) Li J., Zheng RL, Liu 乙 Μ., Jia 乙 J., Acta Pharmacol. Sinica, 13, 427T30 (1992).

16) Barber DA, Harris SR, American Pharmacy. 34, 26 一35 (1993).

17) Elstner EF, Klin Wochenschr, 69, 949-956 (1991).

18) Martin GR, Danner DB, Holbrook NJ, Ann. Rev. Med., 44, 419-29 (1993).

19) Kiso Υ., Tohkino Η., Hattori Μ., Sakamoto Τ., Namba Τ., Planta Med.. 50, 298-302 (1984).

20) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol. Chem.. 193, 265-275 (1951).

21) Hatano T., Edamatsu R., Hiramatsu M., Mori A., Fujita Y., Yasuhara T" Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 37, 2016一2021 (1989).

22) Imanari T., Hirota M., Miyazaki M., Igaku No Ayumi, 101, 496-497 (1977).

23) Hatano Τ., Yasuhara Τ, Yoshihara R., Agata L, Noro Τ., Okuda Τ., Chem. Pharm. Bull., 38, 1224-1229 (1990).

24) Ohkawa Η., Ohishi Ν., Yagi Κ., Anal. Biochem., 95, 351 一358 (1979).

25) α) Lahloub Μ, F., Zaghloul ΑΜ, El-Khayat SA, Afifi MS, Sticher Ο., Planta Med.. 57, 481-85 (1991); β) Nishimura H., Sasaki H., Inagaki N., Chin M. (Zhen 乙 X.), Mitsuhashi H., Phytochemistry. 30, 965-969 (1991); γ) Budzianowski J., Skrzypczak L., ibid, 38, 997-1001 (1995),

26) Marsden SB, Nature (Λονδίνο), 181, 1199—1200 (1958).

27) Chan WS, Wen PC, Chiang HC, Anticancer Res., 15, 703 一 708, (1995).

28) Janero DR, Burghardt Β., Biochem, Pharmacol.. 37, 3335 一3342 (1988).

29) Buettner GR, Arch. Biochem. Biophys., 300, 535 一543 (1993).

30) Herbert V., Shaw S., Jayatilleke Ε., Stopler-Kasdan Τ., Stem Cells, 12, 289-303 (1994).

31) Aust SD, Miller DM, Samokyszyn VM, Methods Enzymol., 186, 457-463 (1990).

32) Kubota S., Ikegami Υ., Kurokawa Τ., Sasaki R., Sugioka Κ., Nakano Μ., Biochem. Biophys. Res, Commun., 108, 1025 一1031 (1982).

33) Yagi Κ., Ishida Ν., Komura S., Ohishi Ν., Kusai Μ., Kohno Μ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 183, 945 一951 (1992).

34) Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ, Cell. 75, 241-251 (1993).

35) Bucher JR, Tien Μ., Aust AD, Biochem. Biophys. Res, Commun., Ill, 777-784 (1983).

36) Yoshida Τ., Otake Η., Aramaki Υ., Hara Τ., Tsuchiya S., Hamada Α., Utsumi Η., Biol. Pharm. Bull.. 19, 779-782 (1996).

37) Afanas5 EVIB, Dorozhko A. L, Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch L A., Biochem. Pharmacol., 38, 1763-1769 (1989).

38) Robak J., Gryglewski RJ, Biochem. Pharmacol.. 37, 837-841 (1988).

39) Chimi H., Morel I., Lescoat G., Pasdeloup N・,Cillard P., Cillard J., Toxicology in Vitro, 9, 695一702 (1995)