Επιδράσεις κατά της γήρανσης και της αναστολής της τυροσινάσης του βουτανολικού εκχυλίσματος άνθους Cassia Fistula Μέρος 1

Αφηρημένη

Ιστορικό: Φυσικά προϊόντα από φυτικές πηγές έχουν χρησιμοποιηθεί σε ποικίλες καλλυντικές εφαρμογές ως πηγή διατροφής και ως λευκαντικός παράγοντας. Τα άνθη του Cassia fistula L, της οικογένειας Fabaceae, έχουν χρησιμοποιηθεί ως παραδοσιακό φάρμακο για δερματικές παθήσεις και επούλωση πληγών και έχει αναφερθεί ότι διαθέτουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Διερευνήθηκε η αντιγηραντική επίδραση του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula σε ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και μπορεί να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου, να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες και επίσης έχει μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο Desert Cistanche Benefits

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Μέθοδοι: Ολοκληρώθηκε η εκχύλιση με βουτανόλη των ανθέων του C. fistula και οι δραστικές ενώσεις ταξινομήθηκαν. Η κυτταροτοξικότητα των ινοβλαστών αξιολογήθηκε με δοκιμασία SRB για επιλογή μη τοξικών δόσεων για περαιτέρω πειράματα. Η σύνθεση κολλαγόνου και υαλουρονικού οξέος (ΗΑ) στη συνέχεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ κολλαγόνου και ELISA, αντίστοιχα. Επιπλέον, αξιολογήθηκε επίσης η ενζυμική δραστηριότητα, συμπεριλαμβανομένης της κολλαγενάσης, της μήτρας μελλοπρωτεϊνάσης-2 (MMP-2) και της τυροσινάσης.

Αποτελέσματα: Βρέθηκε ότι το εκχύλισμα λουλουδιών δεν επηρέασε την ανάπτυξη των ινοβλαστικών κυττάρων του δέρματος (IC50 > 200 ug/mL). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το εκχύλισμα λουλουδιών αύξησε σημαντικά τη σύνθεση κολλαγόνου και ΗΑ με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το εκχύλισμα λουλουδιών (50–200 ug/mL) ανέστειλε επίσης σημαντικά τη δραστηριότητα της κολλαγενάσης και της MMP-2. Επιπλέον, αυτό το εκχύλισμα λουλουδιών θα μπορούσε να αναστείλει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης που προκαλεί υπερμελάγχρωση, η οποία προκαλεί τη γήρανση του δέρματος.

συμπεράσματα: Το εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula επέδειξε προληπτική δράση όταν χρησιμοποιείται για αντιγηραντικούς σκοπούς σε ινοβλάστες του ανθρώπινου δέρματος και μπορεί να είναι η κατάλληλη επιλογή για καλλυντικά προϊόντα που στοχεύουν στην παροχή λευκαντικών αποτελεσμάτων και τα οποία χαρακτηρίζονται ως προϊόντα περιποίησης δέρματος προσώπου κατά της γήρανσης .

Λέξεις-κλειδιά: κολλαγενάση, σύνθεση κολλαγόνου, γλυκοζαμινογλυκάνη, υαλουρονικό οξύ, μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάση

Ιστορικό

Η γήρανση του δέρματος είναι μια περίπλοκη βιοχημική εξέλιξη που προκύπτει από πολλούς μεμονωμένους ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες όπως η ηλικία, οι ορμόνες και η έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία [1]. Η εξέλιξη εμφανίζεται στην επιδερμική και στο δερματική στιβάδα και σχετίζεται κυρίως με την αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [2]. Τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποδόμηση του ECM είναι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) όπως οι ζελατινάσες (MMP-2) και η κολλαγενάση [3]. Το δέρμα χάνει την αντοχή του σε εφελκυσμό λόγω της επίδρασης της υποβάθμισης της ECM από τα MMP. Σε αυτή τη διαδικασία, εμφανίζεται η ρυτίδωση του δέρματος και η τραχύτητα και η ξηρότητα προκύπτουν επίσης αξιοσημείωτα μαζί με ορισμένες ανωμαλίες της χρωστικής, όπως η υπο- ή η υπερμελάγχρωση [2, 4]. Για τη θεραπεία της υπερμελάγχρωσης, έχουν διερευνηθεί οι αναστολείς τυροσινάσης. Η τυροσινάση είναι ένα ένζυμο περιορισμού του ρυθμού που μετατρέπει την τυροσίνη σε μελανίνη [5]. Οι αναστολείς τυροσίνης διαδραματίζουν επομένως σημαντικό ρόλο ως παράγοντες λεύκανσης του δέρματος [6] ενώ η σύνθεση υαλουρονικού οξέος (ΗΑ) ρυθμίζει την ενυδάτωση του δέρματος και την εμφάνιση ρυτίδων. Το ΗΑ, μια μη θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη (GAG), αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαριτών, συμπεριλαμβανομένου του D-γλυκουρονικού οξέος και της Ν-ακετυλο-Δγλυκοζαμίνης [7]. Το ΗΑ ρυθμίζει επίσης την επιδιόρθωση των ιστών, συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης της απόκρισης του ανοσοποιητικού συστήματος με την ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων και ως απόκριση στον τραυματισμό των ινοβλαστών [8-10].

Φυσικά προϊόντα που παρασκευάζονται από φυτικές πηγές όπως η Glycyrrhiza glabra [11] ή το πράσινο τσάι [12] έχουν χρησιμοποιηθεί σε καλλυντικές εφαρμογές ως πηγή διατροφής και ως λευκαντικός παράγοντας. Ένας σημαντικός αριθμός αποδεικτικών στοιχείων έχει επισημάνει τα ευεργετικά αποτελέσματα των φυτοχημικών που χορηγούνται από το στόμα ή τοπικά από εκχυλίσματα φυτών, ειδικά στη βελτίωση των δερματικών παθήσεων. Μερικά παραδείγματα των ευεργετικών επιδράσεων είναι ότι η γήρανση του δέρματος και η φλεγμονή του δέρματος μπορούν να μειωθούν. Το C. fistula (χρυσό ντους), η οικογένεια Fabaceae, βρίσκεται σε πολλές ασιατικές χώρες όπως η Ταϊλάνδη, η Κίνα, η Μιανμάρ και η Ινδία. Σε προηγούμενες μελέτες, το εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula βρέθηκε να έχει αντιοξειδωτικές, αντικαρκινικές, αντιβακτηριακές, αντιμυκητιακές και αντιδιαβητικές ιδιότητες [13, 14]. Η επίδραση του C. fistula στην ιατρική της Αγιουρβέδα είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη θεραπεία διαφόρων διαταραχών όπως, δερματικές παθήσεις, λέπρα, αιματέμεση, κνησμός και διαβήτης [15, 16]. Διάφορα μέρη του C. fistula έχουν επιδείξει φαρμακολογικές ιδιότητες [17]. Τα λουλούδια, οι σπόροι, τα φρούτα και ο πολτός έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία δερματικών παθήσεων συμπεριλαμβανομένης της λέπρας [18]. Ο πολτός έχει αναγνωριστεί για τις αντιδιαβητικές του ιδιότητες [15] και έχει χρησιμοποιηθεί σε τονωτικό που έχει εφαρμοστεί σε θεραπείες ουρικής αρθρίτιδας και ρευματισμών [19]. Τα φύλλα και οι ώριμοι λοβοί χρησιμοποιούνται παραδοσιακά ως καθαρτικό [20, 21]. Τα φαινολικά και τα φλαβονοειδή φυτοχημικά του C. fistula έχουν επίσης αναφερθεί ότι είναι χρήσιμα στη θεραπεία δερματικών παθήσεων [14]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, μας ενδιαφέρει ο ρόλος του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula σε καλλυντικές εφαρμογές. Τα προληπτικά αποτελέσματα της υποβάθμισης της ECM μαζί με τα ένζυμα γήρανσης του δέρματος που περιλαμβάνουν δραστηριότητες κολλαγενάσης και MMP{13}}, καθώς και τυροσινάση, έχουν εξεταστεί. Επιπλέον, έχει προσδιοριστεί η σύνθεση κολλαγόνου και ΗΑ.

Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Το Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), η ζελατίνη DQ και η πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη παρέχονται από την Gibco (Grand Island, ΝΥ, ΗΠΑ). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) προμηθεύτηκε από την Thermo Scientific (ΗΠΑ). Το κιτ χρώσης κολλαγόνου Sirius Red/Fast Green αγοράστηκε από την Chondrex, Inc. (Redmond, WA, ΗΠΑ). Το αντιδραστήριο σουλφοροδαμίνης Β, το υαλουρονικό οξύ και η τυροσινάση μανιταριού ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ).

Φυτικά υλικά

Τα άνθη του C. fistula ελήφθησαν από τη Lampang Herb Conservation, στην επαρχία Lampang, στην Ταϊλάνδη. Ένας αριθμός δείγματος κουπονιού (023197) πιστοποιήθηκε από τον Wannaree Charoensup, Βοτανολόγο στο ερμπάριο της Flora of Thailand, Faculty of Pharmacy, Chiang Mai University, Ταϊλάνδη.

Παρασκευή εκχυλίσματος λουλουδιού συριγγίου Κασσίας

Τα άνθη του C. fistula ξηράνθηκαν σε ένα ευάερο δωμάτιο και στη συνέχεια 500 g αποξηραμένων ανθέων αλέστηκαν σε σκόνη. Μετά από αυτό, η σκόνη εμποτίστηκε σε 50 τοις εκατό αιθανόλη και στη συνέχεια ανακινήθηκε στις 70 rpm για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, τα δείγματα στη συνέχεια διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού για να διαχωριστεί το υπόλειμμα. Το υπόλειμμα εμποτίστηκε σε 50 τοις εκατό αιθανόλη και ανακινήθηκε στις 70 rpm για 24 ώρες και αυτό το στάδιο επαναλήφθηκε 2 φορές. Τα διηθημένα δείγματα συνενώθηκαν μαζί και εξατμίστηκαν με περιστροφικό εξατμιστήρα κενού (BUCHI, Ελβετία) για να ληφθούν τα κλάσματα νερού. Στο υδατικό κλάσμα προστέθηκε εξάνιο σε αναλογία εξανίου 2:1. Τα δείγματα ανακινήθηκαν και αφέθηκαν να διαχωριστούν για 30 λεπτά. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε δύο κλάσματα, τα οποία ήταν κλάσματα εξανίου και νερού. Στη συνέχεια, το κλάσμα νερού συλλέχθηκε και προστέθηκε 10 τοις εκατό άνθρακας για μια περίοδο 30 λεπτών με ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού και σελίτη για να διαχωριστεί ο άνθρακας. Τα δείγματα αναμίχθηκαν με κορεσμένη βουτανόλη σε αναλογία κορεσμένης βουτανόλης 2:1 και τα δείγματα αφέθηκαν να διαχωριστούν σε περίοδο 12 ωρών και αυτό το στάδιο επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε δύο κλάσματα, τα οποία περιελάμβαναν κλάσματα νερού και βουτανόλης. Προστέθηκε περαιτέρω νερό στα κλάσματα βουτανόλης σε ίσο όγκο και αυτά τα κλάσματα αφέθηκαν να εξατμιστούν μέσω της χρήσης ενός περιστροφικού εξατμιστήρα κενού. Τα εξατμισμένα δείγματα λυοφιλοποιήθηκαν για να ληφθεί η σκόνη εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula.

Ποσοτικοποίηση της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικό εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula με χρήση φασματοφωτόμετρου ορατού με υπεριώδη ακτινοβολία

Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη στο εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Folin-Ciocalteu. Εν συντομία, 0.4 mL εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula αναμίχθηκαν με 0.3 mL αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteau 10 τοις εκατό και επωάστηκαν σε σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά . Στη συνέχεια, 0.3 mL διαλύματος ανθρακικού νατρίου προστέθηκαν και το διάλυμα επωάστηκε περαιτέρω στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η απορρόφηση αξιολογήθηκε στα 765 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο ορατό με υπεριώδη ακτινοβολία. Η συγκέντρωση της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινολικά υπολογίστηκε και συγκρίθηκε με μια τυπική καμπύλη για το γαλλικό οξύ (GA) στα 0-20 ug/mL. Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά αναφέρθηκε ως χιλιοστόγραμμα ισοδυνάμων GA ανά γραμμάριο C. fistula. εκχύλισμα λουλουδιών (mg GAE/g εκχύλισμα).

Ποσοτικοποίηση φαινολικών ενώσεων σε εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula χρησιμοποιώντας ανάλυση HPLC

Διάφοροι τύποι φαινολικών ενώσεων σε εκχυλίσματα λουλουδιών C. fistula αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση HPLC και στη συνέχεια συγκρίθηκαν με τυπικό γαλλικό οξύ, κατεχίνες, πρωτοκατεχουϊκό οξύ, βανιλικό οξύ, χλωρογενικό οξύ, φερουλικό οξύ και κουμαρικό οξύ. Τα εκχυλίσματα λουλουδιών διαλύθηκαν σε 50 τοις εκατό αιθανόλη και αξιολογήθηκαν περαιτέρω με HPLC (Agilent Technologies, CA, USA) χρησιμοποιώντας στήλη C18 ανάστροφης φάσης (WATER, ΜΑ, ΗΠΑ). Η κινητή φάση αποτελούνταν από μεθανόλη (Α) και 0.1 τοις εκατό τριφθοροξικό οξύ (TFA) σε νερό (Β) με συνθήκες βαθμίδωσης. Ο ρυθμός ροής ορίστηκε στο 1,0 mL/min και το μήκος κύματος ανίχνευσης καταγράφηκε στα 280 με ανιχνευτή UV. Τα επίπεδα συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων υπολογίστηκαν και συγκρίθηκαν με την πρότυπη καμπύλη λαμβάνοντας υπόψη τις τυπικές συγκεντρώσεις και τις περιοχές κορυφής (mg/g εκχύλισμα).

Ποσοτικοποίηση της συνολικής περιεκτικότητας σε φλαβονοειδή στο εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula χρησιμοποιώντας χρωματομετρικό προσδιορισμό

Η συνολική περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή προσδιορίστηκε με τροποποιημένη χρωματομετρική ανάλυση χλωριούχου αργιλίου (AlCl3), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, 0.25 mL εκχυλίσματος λουλουδιών αναμίχθηκαν με 0.125 mL 5 τοις εκατό νιτρώδους νατρίου (NaNO2) και το διάλυμα επωάστηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 0.125 mL 10 τοις εκατό AlCl3 αναμίχθηκαν στο μίγμα και αυτό διατηρήθηκε στο σκοτάδι για 5 λεπτά. Μετά από αυτό, προστέθηκε 1 mL υδροξειδίου του νατρίου (NaOH) και το διάλυμα επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 510 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο ορατό με υπεριώδη ακτινοβολία. Η συνολική περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή υπολογίστηκε και συγκρίθηκε με τις τυπικές τιμές κατεχίνης και εκφράστηκε ως mg ισοδύναμου κατεχίνης ανά γραμμάριο εκχυλίσματος (mg CE/g εκχυλίσματος).

Κυτταρικές καλλιέργειες

Οι πρωτογενείς ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος απομονώθηκαν άσηπτα από μια κοιλιακή ουλή μετά από μια χειρουργική επέμβαση που περιελάμβανε καισαρική τομή στο χειρουργικό τμήμα του νοσοκομείου CM Maharaj, Πανεπιστήμιο Chiang Mai (Chiang Mai, Ταϊλάνδη) (Κωδικός μελέτης: BIO-2558-03549 εγκεκριμένο από την ιατρική Επιτροπή Δεοντολογίας της Έρευνας, Πανεπιστήμιο Chiang Mai). Το λίπος αφαιρέθηκε από το αρχικό υλικό και εμποτίστηκε σε DMEM που περιείχε αντιπενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Μετά από αυτό, το δέρμα βυθίστηκε σε DMEM που περιείχε 1 τοις εκατό πρωτεάση (Dispase, Gibco, Grand Island, ΝΥ, ΗΠΑ) για 48 ώρες στους 4 βαθμούς. Τα επιδερμικά στρώματα αφαιρέθηκαν και οι φυσιολογικοί ινοβλάστες απομονώθηκαν από το χόριο. Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 50 U/mL πενικιλλίνη και 50 ug/mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε επωαστήρα υγροποιημένου 5% CO2 στους 37 βαθμούς.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Η δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula έναντι κυττάρων ινοβλαστών δέρματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β (SRB) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα (8x103 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις (0–200 ug/mL) εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula για 48 ώρες. Μετά από 48 ώρες, 10 τοις εκατό (β/ο) Τριχλωροξικό οξύ (TCA) προστέθηκε στα κύτταρα και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 βαθμούς για 1 ώρα. Το μέσο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με νερό βρύσης βραδείας ροής. Προστέθηκε 0,057 τοις εκατό (w/v) διάλυμα SRB (100 μL) σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα SRB απομακρύνθηκε και στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν 4 φορές με 1 τοις εκατό (ο/ο) οξικό οξύ και αφέθηκαν να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Η βαφή διαλύθηκε με 10 mM διάλυμα βάσης Tris (ρΗ 10,5) και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 510 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας.

Δοκιμασία σύνθεσης κολλαγόνου

Το συνολικό ενδοκυτταρικό κολλαγόνο στα κύτταρα ινοβλαστών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης κολλαγόνου Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc, Redmond, WA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα ινοβλαστών δέρματος σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων για 24 ώρες στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με το μέσο DMEM χωρίς ορό για 24 ώρες. Το μέσο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula (0-150 ug/mL) για 48 ώρες. Μετά από 48 ώρες, το καλλιεργημένο μέσο απομακρύνθηκε. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με σταθεροποιητικό Kahle για 10 λεπτά. Το σταθεροποιητικό αφαιρέθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS. Το διάλυμα βαφής Sirius Red/Fast Green προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η χρωστική αφαιρέθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν τέσσερις φορές με νερό DI ή έως ότου το υγρό ήταν άχρωμο. Τέλος, προστέθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm και 605 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο ορατό με υπεριώδη ακτινοβολία.

Δοκιμασία δραστικότητας κολλαγενάσης

Η δραστικότητα της κολλαγενάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία φθορογόνου DQ™-ζελατίνης όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [24]. Εν συντομία, διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula (0–200 ug/mL) προστέθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Ένα U/ml κολλαγενάσης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο (100 μL/φρεάτιο). Μετά από αυτό, προστέθηκαν 15 μg/mL ζελατίνης (DQ ζελατίνη) και τα μίγματα επωάστηκαν για 10 λεπτά. Ο ρυθμός πρωτεόλυσης προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης σε διαστήματα 2 λεπτών για 20 λεπτά χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 528 nm. Η ενζυμική δραστηριότητα υπολογίστηκε εξετάζοντας την κλίση της γραμμικής παλινδρόμησης μεταξύ του χρόνου και της απορρόφησης σε μια περίοδο 2-6 λεπτών.

ανάλυση δραστηριότητας MMP-2

Η δραστηριότητα MMP{{0}} προσδιορίστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Κύτταρα ινοβλαστών καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό DMEM για 24 ώρες. Μετά από αυτό, το υπερκείμενο της καλλιέργειας συλλέχθηκε. Το υπερκείμενο της καλλιέργειας υποβλήθηκε σε 10 τοις εκατό πηκτές πολυακρυλαμιδίου που περιείχαν 0.1 τοις εκατό w/v ζελατίνη υπό μη αναγωγικές συνθήκες. Τα πηκτώματα πλύθηκαν δύο φορές με 2,5 τοις εκατό ο/ο Triton X-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να αφαιρεθεί το SDS. Η πλάκα γέλης κόπηκε σε φέτες που αντιστοιχούσαν στις λωρίδες και στη συνέχεια οι φέτες τοποθετήθηκαν σε διαφορετικές δεξαμενές και επωάστηκαν με ένα ρυθμιστικό ενεργοποίησης (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) που περιείχε διάφορες συγκεντρώσεις C εκχύλισμα λουλουδιών συριγγίου (0–200 ug/mL) στους 37 βαθμούς για 18 ώρες. Μετά από αυτό, μια λωρίδα των πηκτών πλύθηκε και χρωματίστηκε με Coomassie Brillant Blue R (0,1 τοις εκατό w/v) και στη συνέχεια αποχρωματίστηκε σε 30 τοις εκατό μεθανόλη και 10 τοις εκατό οξικό οξύ. Η δραστηριότητα MMP-2 εμφανίστηκε ως καθαρή ζώνη σε μπλε φόντο. Οι ζώνες πέψης ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα Image J.

Δοκιμασία σύνθεσης Υαλουρονικού Οξέος (ΗΑ) με ELISA

Η επίδραση του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula στη σύνθεση ΗΑ προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα κύτταρα ινοβλαστών (5.0 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίου για 24 ώρες στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία σε μέσο χωρίς ορό για 6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula (0–200 ug/mL) για 48 ώρες. Το καλλιεργημένο μέσο συλλέχθηκε και η σύνθεση ΗΑ μετρήθηκε με ELISA. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 και 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η συγκέντρωση ΗΑ στο καλλιεργημένο υπερκείμενο που αποκτήθηκε από τα επεξεργασμένα κύτταρα ινοβλαστών υπολογίστηκε και συγκρίθηκε με την τυπική καμπύλη του ΗΑ.

Δοκιμασία αναστολής τυροσινάσης

Η δοκιμασία αναστολής τυροσινάσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula προστέθηκαν σε 96-πλάκα φρεατίου. Η αντίδραση διεξήχθη σε ρυθμιστικό διάλυμα νατρίου (ρΗ 6,4) που περιείχε 100 U/mL τυροσινάση μανιταριού. Υπόστρωμα L-DOPA (1 mM) προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης και στη συνέχεια επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αλλαγή της απορρόφησης στα 490 nm μετρήθηκε κάθε 1,5 λεπτό για 15 λεπτά χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Το ποσοστό αναστολής της τυροσινάσης υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο:

Δοκιμασία αντιοξειδωτικής δράσης

Η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 1, 1-διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλ (DPPH) - δραστικότητα ελεύθερης ρίζας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Διάφορες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος λουλουδιών (0–100 ug/mL) παρασκευάστηκαν σε μεθανόλη. 1 mL 0,002 τοις εκατό DPPH προστέθηκε σε 1 mL του διαλύματος εκχυλίσματος λουλουδιών και το μίγμα διατηρήθηκε στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 517 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Η ποσοστιαία αναστολή υπολογίστηκε και συγκρίθηκε με την τυπική βιταμίνη Ε (1–100 ug/mL) χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

Η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων λουλουδιών C. fistula επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ABTS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Το κατιόν ρίζας ABTS [2, 2'-αζινο-δις (αιθυλοβενζθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ)] παρασκευάστηκε με ανάμιξη 7 mM μητρικού διαλύματος ABTS με 2,45 mM υπερθειικό κάλιο (K2S2O8) (1/1, ν/ν). Το μίγμα επωάστηκε στο σκοτάδι για 12-16 ώρες μέχρι να ολοκληρωθεί η αντίδραση. Η ανάλυση διεξήχθη σε 990 μL διαλύματος ABTS και 10 μL εκχυλίσματος λουλουδιών (0–4 ug/mL). Μετά από 6 λεπτά, η απορρόφηση καταγράφηκε αμέσως στα 734 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Η ποσοστιαία αναστολή της δραστικότητας ABTS του εκχυλίσματος λουλουδιών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική ανάλυση αναλύθηκε με το λογισμικό Prism έκδοσης 6.0 χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με τη δοκιμή Dunnett. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε σε * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 ή **** p < 0,001 ή **** p < 0,0001.

Αποτελέσματα

Φυτοχημικός χαρακτηρισμός εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula

Μετά το στάδιο που περιελάμβανε λυοφιλοποίηση των δειγμάτων, το εκχύλισμα λουλουδιών C. fistula ζυγίστηκε και υποβλήθηκε περαιτέρω σε φυτοχημικές και βιολογικές μελέτες. 18.08 g εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula ελήφθησαν από 500 g πρώτης ύλης και η εκατοστιαία απόδοση του εκχυλίσματος λουλουδιών ήταν 3,62. Το δακτυλικό αποτύπωμα HPLC των εκχυλισμάτων λουλουδιών C. fistula προσδιορίστηκε με ανάλυση HPLC (Εικ. 1). Το προφίλ HPLC που έδειξε την κορυφή των φαινολικών ενώσεων επισημάνθηκε ως προς τα μεμονωμένα συστατικά σε κάθε χρόνο κατακράτησης. Ο χαρακτηρισμός των φαινολικών ενώσεων του εκχυλίσματος λουλουδιών C. fistula παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικό περιεχόμενο στο εκχύλισμα λουλουδιών ήταν 275,32 ± 14,21 mg εκχυλίσματος GAE/g. Τα παράγωγα υδροξυβενζοϊκού οξέος, συμπεριλαμβανομένου του βανιλικού οξέος και του πρωτοκατεχχουϊκού οξέος, βρέθηκαν να είναι {{20}},95 ± 0.09 και 2,56 ± 0. 42 mg/g εκχυλίσματος, αντίστοιχα, ενώ το γαλλικό οξύ καταγράφηκε σε εκχύλισμα {{30}},60 ± 0,02 mg/g. Τα παράγωγα υδροξυκινναμωμικού οξέος, συμπεριλαμβανομένου του κουμαρικού οξέος, του φερουλικού οξέος και του χλωρογενικού οξέος, ανιχνεύθηκαν στα 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 και 0,83 ± 0,03 mg/g εκχυλίσματος, αντίστοιχα. Η περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή ήταν 27,62 ± 3,56 mg εκχυλίσματος CE/g. Η κατεχίνη, ως παράγωγο φλαβονόλης, μετρήθηκε σε 1,10 ± 0,{43}} mg/g εκχυλίσματος.

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】