grΓλώσσα
Σπίτι / Η γνώση / Περιεχόμενο

Η γνώση

Αλλαγές στη μετάφραση πρωτεϊνών και στις καταβολικές διεργασίες καρβοξυλικού οξέος στη διαβητική νεφρική νόσο

Jul 05, 2024

Περίληψη: Διαβητική νεφρική νόσο (DKD)παραμένει η κύρια αιτία τηςνεφρική νόσο τελικού σταδίουπαρά τις δεκαετίες σπουδών. Αλλαγές στοσπειράματα και νεφρικά σωληνάριακαι οι δύο συμβάλλουν στηνπαθογένεια της DKDαν και η πλειονότητα των ερευνητικών προσπαθειών έχει επικεντρωθεί στο σπείραμα. Επιδιώξαμε να εξετάσουμε τη διαφορική υπογραφή έκφρασης της ανθρώπινης DKD στο σπείραμα και στο εγγύς σωληνάριο και να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματά μας στο μοντέλο διαβήτη ποντικού db/db. Μια ανάλυση δικτύου μεταγραφογράμματος δεδομένων RNAseq από μικροτεμαχισμένο με λέιζερ (LMD) ανθρώπινο σπείραμα και εγγύς σωληνάριο DKD καινεφρεκτομή αναφοράςΤα δείγματα αποκάλυψαν εμπλουτισμένες οδούς, συμπεριλαμβανομένων υποδοχέων που μοιάζουν με ροδοψίνη, οσφρητικής σηματοδότησης και ριβοσώματος (μετάφραση πρωτεϊνών) στο εγγύς σωληνάριο των δειγμάτων βιοψίας ανθρώπινης DKD. Η οδός μετάφρασης εμπλουτίστηκε επίσης στο σπείραμα. Αυξημένη μετάφραση σεδιαβητικό νεφρόΤο s επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας πολυριβοσωμικό προφίλ στο μοντέλο διαβήτη ποντικού db/db. Χρησιμοποιώντας μεμονωμένη αλληλουχία πυρηνικού RNA (RNA-Seq) νεφρών από ποντικούς db/db, δώσαμε προτεραιότητα σε πρόσθετες οδούς που προσδιορίστηκαν στην ανθρώπινη DKD. Η κορυφαία επικαλυπτόμενη οδός που εντοπίστηκε στις ομάδες εγγύς σωληναρίου snRNAseq ποντικού και στο εγγύς σωληνάριο ανθρώπινης LMDτο διαμέρισμα ήταν καταβολισμός καρβοξυλικού οξέος. Χρησιμοποιώντας υπερ-απόδοση υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας, η οδός καταβολισμού λιπαρών οξέων βρέθηκε επίσης ότι δεν ρυθμίζεται στο μοντέλο ποντικιού db/db. Ο μεταβολίτης Acetyl-CoA ρυθμίστηκε προς τα κάτω σε ποντικούς db/db, ευθυγραμμιζόμενος με την ανθρώπινη διαφορική έκφραση των γονιδίων ACOX1 και ACACB. Συνοπτικά, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι οι εγγύς σωληναριακές αλλοιώσεις στη μετάφραση πρωτεΐνης καικαταβολισμός καρβοξυλικού οξέοςείναι βασικά χαρακτηριστικά τόσο στον άνθρωπο όσο καιποντικίσιο DKD. 



Λέξεις-κλειδιά:υπογραφή γονιδιακής έκφρασης. μονή αλληλουχία πυρηνικού RNA.μεταβολομική; ριβοσωμικό προφίλ

1

ΝΕΑ ΒΟΤΑΝΑ ΓΙΑΔΙΑΒΗΤΙΚΟΣ ΝΕΦΡΟΣ


1. Εισαγωγή

Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) επηρεάζει πάνω από 400 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως [1] και πάνω από 30 εκατομμύρια στις ΗΠΑ [2]. Η διαβητική νεφρική νόσος (DKD) είναι μια από τις πιο σοβαρές επιπλοκές του ΣΔ, επηρεάζοντας 19 εκατομμύρια ανθρώπους στις Ηνωμένες Πολιτείες [3] και είναι η κύρια αιτίανεφρική νόσο τελικού σταδίου(ΕΣΚΔ) [4]. Η DKD θεωρείται κλασικά ως σπειραματική νόσος. Ωστόσο, η εστίαση αποκλειστικά στην σπειραματική παθολογία ως την κύρια θέση της βλάβης παραβλέπει βασικές βιολογικές αλλοιώσεις στο διάμεσο σωληνάριο που συμβάλλουν στην παθοφυσιολογία της DKD [5]. Πράγματι, η πρόγνωση και η εξέλιξη της DKD συχνά παράλληλης σωληναριακής ατροφίας και η έκταση της διάμεσης νόσου [6,7]. Περαιτέρω στοιχεία σε αυτό το σημείο είναι στοιχεία ότι η στόχευση του εγγύς σωληναρίου με αναστολείς SGLT2 επιβραδύνει την εξέλιξη της DKD [8].

Οι κυτταρικοί μηχανισμοί που οδηγούν στην ανάπτυξη και εξέλιξη της DKD είναι ομολογουμένως περίπλοκοι. Το διαβητικό περιβάλλον χαρακτηρίζεται από μεταβολικές ανωμαλίες, φλεγμονές, οξειδωτικό στρες και αλλαγές στην ομοιόσταση των πρωτεϊνών. Όλες αυτές οι διαταραχές συμβάλλουν στο στρες των κυττάρων και στην ανάπτυξη της DKD. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η τροποποιημένη μετάφραση, το θεμελιώδες βήμα στη γονιδιακή έκφραση που δημιουργεί λειτουργικές πρωτεΐνες, είναι σημαντική τόσο για την απόκριση όσο και για τη συμβολή στο στρες των κυττάρων [9,10]. Οι αλλαγές στη μετάφραση συμβάλλουν σε ανισορροπίες στην ομοιόσταση των πρωτεϊνών και επηρεάζουν την ανθρώπινη υγεία και ασθένειες [11-14].

Η ανάκριση δειγμάτων βιοψίας ανθρώπινου νεφρού χρησιμοποιεί τακτικά μικροσκοπία φωτός, ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης και ανοσοαντιδράσεις για να μπορέσει ο παθολόγος να δώσει διάγνωση και πρόγνωση. Ωστόσο, αυτά τα διαγνωστικά εργαλεία έχουν περιορισμούς στην αποκάλυψη των μοριακών μηχανισμών που κρύβουν τη νεφρική νόσο, συμπεριλαμβανομένης της DKD. Κατά συνέπεια, ζωικά μοντέλα ΣΔ έχουν χρησιμοποιηθεί ιστορικά για τη μελέτη των παθοφυσιολογικών μηχανισμών της DKD. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα μοντέλα δεν προσομοιώνει κατάλληλα την ανθρώπινη DKD [15]. Αν και οι πρόσφατες προσπάθειες για την εφαρμογή πιο προηγμένων τεχνικών μοριακής ανάκρισης σε δείγματα βιοψίας ανθρώπινου νεφρού είναι ενθαρρυντικές [16], πιστεύουμε ότι η χρήση ζωικών μοντέλων παράλληλα με τον ανθρώπινο νεφρικό ιστό παραμένει μια σημαντική πειραματική προσέγγιση για την παροχή μοναδικών γνώσεων σχετικά με τα μοριακά θεμέλια της DKD.

Επιδιώξαμε να εξετάσουμε τη διαφορική υπογραφή έκφρασης της ανθρώπινης DKD στο σπείραμα και στο εγγύς σωληνάριο. Υποθέσαμε ότι η εγγύς σωληναριακή μεταγραφική υπογραφή, εκτός από αυτή του σπειράματος, καθορίζει επίσης τα αποτελέσματα της DKD. Αντιμετωπίσαμε αυτήν την υπόθεση διερευνώντας δείγματα βιοψίας ανθρώπινου νεφρού με μικροτομή λέιζερ σπειραματικών και εγγύς σωληναριακών περιοχών για τον εντοπισμό οδών που σχετίζονται με την DKD και την εξέλιξή της. Στη συνέχεια, βασικές οδοί επιβεβαιώθηκαν σε ένα μοντέλο διαβητικού ποντικού χρησιμοποιώντας μια πολυτροπική προσέγγιση προσδιορισμού αλληλουχίας ενός πυρηνικού RNA (RNA-Seq), πολυριβοσωμικού προφίλ και μεταβολομικής. Εκτός από τις διαταραχές στη μετάφραση πρωτεϊνών, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν τον πιθανό ρόλο του μεταβολισμού του καρβοξυλικού οξέος ως βασικό παράγοντα στην εξέλιξη της διαβητικής νεφρικής νόσου.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Ανθρώπινα Υποκείμενα

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικής Αναθεώρησης της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Ιντιάνα (IRB αρ. 190657223). Ελήφθησαν είκοσι επτά δείγματα νεφρών από την Κοινοπραξία Kidney Precision Medicine Project και την Biopsy Biobank Cohort της Ιντιάνα [17]. Οι βιοψίες νεφρού ήταν ενδεικτικές βιοψίες για πρωτεϊνουρία ή μείωση της νεφρικής λειτουργίας σε άτομα με σακχαρώδη διαβήτη. Ελήφθησαν δεκαοκτώ δείγματα από ενήλικες με διαβητική νεφρική νόσο και χωρίς δεύτερη σπειραματική βλάβη. Εννέα δείγματα αναφοράς χωρίς ιστολογικές ενδείξεις DKD ελήφθησαν από μη νεοπλασματικό παρέγχυμα δειγμάτων νεφρεκτομής ή νεκρών δοτών. Από τον ηλεκτρονικό φάκελο υγείας εξήχθησαν κλινικές και ιστοπαθολογικές μεταβλητές. Ο εκτιμώμενος βασικός ρυθμός σπειραματικής διήθησης (eGFR) ορίστηκε ως η τιμή που βρίσκεται πλησιέστερα στην ημερομηνία της βιοψίας, εκτός εάν μειωθεί κατά 20% ή μεγαλύτερη η παραπομπή βιοψίας με καταβύθιση του eGFR. Σε αυτό το σενάριο, ένας eGFR εντός 1 έτους πριν από τη βιοψία και πριν από τη μείωση κατά 20% ορίστηκε ως βάση για τους υπολογισμούς της εξέλιξης.


2.2. Μικροτομή λέιζερ ανθρώπινου ιστού νεφρού και RNA-αλληλουχία

Κρυοτομές πάχους 12 μm κόπηκαν από κατεψυγμένα μπλοκ ιστού που διατηρήθηκαν σε μέσο Βέλτιστης Θερμοκρασίας Κοπής, προσκολλήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες μεμβράνης πολυφαινυλενοσουλφιδίου (PPS) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο Rapid Stain όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,19]. Μια ελάχιστη περιοχή 500,000 μm2 τεμαχίστηκε για σπειραματικά και εγγύς σωληναριακά διαμερίσματα χρησιμοποιώντας το παλμικό λέιζερ UV στο Leica LMD6500 και έναν αντικειμενικό φακό 20×. Ο αποκομμένος ιστός συλλέχθηκε σε έναν αποστειρωμένο σωλήνα χωρίς RNAse που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης RNA και το RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν Agilent 2100 Bioanalyzer.

Η αλληλουχία πραγματοποιήθηκε στο Κέντρο Ιατρικής Γονιδιωματικής του Πανεπιστημίου της Ιντιάνα. Το ριβοσωμικό RNA εξαντλήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο RiboGone-Mammalian Kit (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Το πρωτόκολλο SMARTer Universal Low Input RNA Kit v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για σύνθεση cDNA και κατασκευή βιβλιοθήκης. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με διαμόρφωση ζευγαρωμένου άκρου 2 × 75 bp στο Illumina HiSeq 4000 χρησιμοποιώντας το κιτ HiSeq 3000/4000 PE SBS και τα δεδομένα αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα hg38 χρησιμοποιώντας STAR. Μοναδικά χαρτογραφημένες αναγνώσεις αλληλουχίας εκχωρήθηκαν στα γονίδια του γονιδιώματος αναφοράς hg38 χρησιμοποιώντας το Rsubread featureCounts [20,21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY



2.3. Εγκρίσεις Μελέτης Ζώων

Όλα τα πρωτόκολλα για τα ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου της Ιντιάνα και συμμορφώνονται με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Για τον προσδιορισμό της μαζικής αλληλουχίας RNA, το πολυριβοσωματικό προφίλ και τη μεταβολομική, το στέλεχος αρσενικών ποντικών C57BL/6J (#000664, ποντίκια ελέγχου υποβάθρου/C57) και B6.BKS–Leprdb/J (#000697, db ποντίκια) ελήφθησαν από το εργαστήριο Jackson ( Bar Harbor, ME, ΗΠΑ). Τα ποντίκια ήταν ηλικίας 9-12 εβδομάδων και ζύγιζαν ~30 g (ποντίκια C57) ή 40-50 g (ποντίκια db). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα νεφρά συλλέχθηκαν (n=4 ή 5 ανά ομάδα).


2.4. Απομόνωση ιστού νεφρού ποντικού και μαζική ανάλυση αλληλουχίας RNA

Τα νεφρά καταψύχθηκαν και το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ QIAGEN RNeasy Plus Midi με στήλη αφαίρεσης γονιδιωματικού DNA. Η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν Agilent 2100 Bioanalyzer. Το Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή βιβλιοθήκης. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με διαμόρφωση ζευγαρωμένου άκρου 2 × 75 bp στο Illumina HiSeq 4000 χρησιμοποιώντας το κιτ HiSeq 3000/4000 PE SBS και τα δεδομένα αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα mm10 χρησιμοποιώντας STAR. Μοναδικά χαρτογραφημένες αναγνώσεις αλληλουχίας εκχωρήθηκαν στα γονίδια αναφοράς του γονιδιώματος mm10 με χρήση μετρήσεων χαρακτηριστικών Rsubread.



2.5. Απομόνωση ιστού νεφρού ποντικού και αλληλουχία μονοπυρηνικού RNA

Ποντίκια ηλικίας 5, 8, 11, 16 και 20 εβδομάδων αξιολογήθηκαν (n=5 συνολικά, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Ετεροζυγώτες από το ίδιο στέλεχος χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι υποβάθρου (n=3). Η λευκωματίνη ούρων μετρήθηκε με κιτ ELISA λευκωματίνης ποντικού (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA) και η κρεατινίνη ούρων μετρήθηκε με κιτ προσδιορισμού κρεατινίνης QuantiChrom (Bioassay System, DICT{13}}, Hayward , CA, ΗΠΑ). Στον πάγο, ένα μέρος κάθε νεφρού προστέθηκε σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης Nuclei EZ συμπληρωμένο με 2% αναστολέα πρωτεάσης (Thermofisher) και 1% Superase (Thermofisher). Μετά το άλεσμα, προστέθηκε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος και ο ιστός ομογενοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον μύλο ιστών KONTES Dounce (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Το ομογενοποιημένο προϊόν αναμίχθηκε ήπια με 2 mL ρυθμιστικού και επωάστηκε σε πάγο για 5 λεπτά. Το ομογενοποιημένο προϊόν διηθήθηκε μέσω φίλτρου 40 μm και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρυθμιστικό λύσης συμπληρωμένο με 1% Superbase, και στη συνέχεια διηθήθηκε ξανά μέσω30 µm φίλτρο, και στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε PBS συμπληρωμένο με 2% BSA και 1%Superase. Αυτό το εναιώρημα στη συνέχεια διηθήθηκε μέσω 5µm φίλτρο και τη συγκέντρωσηπροσαρμόστηκε σε 1-3 εκατομμύρια πυρήνες/mL πριν από την υποβολή για αλληλούχιση.
Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA μεμονωμένου πυρηνικού 30 πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστημιακό Κέντρο Ιατρικής Γονιδιωματικής του Πυρήνα της Ιντιάνα χρησιμοποιώντας το σύστημα μονοκυττάρων Chromium έκδοση 3 (10× Genomics, San Francisco, CA, USA) και το NovaSeq6000 sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA). Το Cell Ranger 4.0 χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία αρχείων FASTQ ειδικά για δείγμα και οι αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς mm10 χρησιμοποιώντας STAR. Το Seurat v 3.0.1 χρησιμοποιήθηκε για την ενσωμάτωση δειγμάτων χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες μετρήσεις ποιοτικού ελέγχου: περιελάμβανε αριθμούς γονιδίων μεταξύ 200-3000 και ποσοστό μιτοχονδριακού γονιδίου μικρότερο από 50%. Συνολικά, 58.405 κύτταρα διατηρήθηκαν για κατάντη ανάλυση. Η τυπική προεπεξεργασία, η επιλογή χαρακτηριστικών, η μείωση των διαστάσεων (20 κύρια στοιχεία), η αναγνώριση των αγκυρώσεων μεταξύ των δειγμάτων και η ολοκλήρωσηεκτελούνται σύμφωνα με τις μεθόδους αγκύρωσης Seurat v3.Τα συμπλέγματα σχολιάστηκαν με βάσηκοινοί δείκτες γονιδιακής έκφρασης [22] και χρησιμοποιώντας την Εξερεύνηση των Κυττάρων Νεφρού [23]. 

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY


2.6. Απομόνωση ιστών νεφρού ποντικού και πολυριβοσωμικό προφίλ

Τα ποντίκια ελέγχου υποβάθρου και db θυσιάστηκαν σε ηλικία 9 και 12 εβδομάδων. Η καρδιακή αιμάτωση μέσω της αριστερής κοιλίας πραγματοποιήθηκε με 6 mL κυκλοεξιμίδης (100 μg/mL σε PBS). Οι συλλεχθέντες νεφροί τοποθετήθηκαν αμέσως σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που αποτελείται από 1% Triton X-100, 0,1% δεοξυχολικό άλας, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, δισκίο κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης χωρίς EDTA (Roche, Penz , Γερμανία), 50 μg/mL κυκλοεξιμιδίου και RNAsin (αραίωση 1:500). Οι ιστοί ομογενοποιήθηκαν στους 4◦C χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή ιστού Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Γαλλία). Τα ομογενοποιήματα ιστού επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 9600 χ g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο προστέθηκε στην κορυφή μιας βαθμίδωσης σακχαρόζης που δημιουργήθηκε από το BioComp Gradient Master (10% σακχαρόζηπάνω από 50% σακχαρόζη σε 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2και 50 mg/mLκυκλοεξιμίδιο) και φυγοκεντρήθηκε στους 284,000× g για 2 ώρες στις 4◦Γ. Οι κλίσεις συγκομίστηκαναπό την κορυφή σε μια θεριζοαλωνιστική μηχανή Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Καναδάς),και η περιεκτικότητα σε RNA των εκλουσμένων ριβοσωμικών κλασμάτων παρακολουθούνταν συνεχώς με υπεριώδη ακτινοβολίααπορρόφηση στα 254 nm.



2.7. Μεταβολομική

Για να αξιολογηθούν οι μεταβολομικές υπογραφές, παρασκευάστηκαν δείγματα ελέγχου υποβάθρου και ποντικών db (n=5 ανά ομάδα) χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο σύστημα MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε μεταβολική ανάλυση στη Metabolon Inc. Εν συντομία, κατεψυγμένοι ιστοί νεφρών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με την τυπική μέθοδο εξαγωγής Metabolon σύμφωνα με το εταιρικό πρωτόκολλο. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν σε υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης Waters ACQUITY (UPLC) με στήλη C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 μm) και Thermo Scientific Q-Exactive υψηλής ανάλυσης/ακριβείας φασματόμετρο μάζας σε διασύνδεση με πηγή θερμαινόμενου ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (HESI-II) και αναλυτή μάζας Orbitrap που λειτουργούσε σε ανάλυση μάζας 35,000.

Τα ακατέργαστα δεδομένα εξήχθησαν, αναγνωρίστηκαν με κορυφές και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία QC χρησιμοποιώντας υλικό και λογισμικό Metabolon (Durham, NC, USA). Οι κορυφές ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την περιοχή κάτω από την καμπύλη. Τυπικές στατιστικές αναλύσεις με τεστ t δύο δειγμάτων Welch πραγματοποιήθηκαν στο ArrayStudio σε δεδομένα μετασχηματισμένα με λογαριθμικό έλεγχο.




2.8. Διαφορική γονιδιακή έκφραση, ανάλυση μονοπατιού και στατιστική

Τα δεδομένα έκφρασης ανθρώπινης LMD και νεφρού ιστού ποντικού από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA κανονικοποιήθηκαν κατά ποσοστάσια και η διαφορική έκφραση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια ακριβή δοκιμή στο edgeR με τιμές p < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά μετά την ψευδή Benjamini-Hochberg ψευδή. διόρθωση πολλαπλών δοκιμών με ρυθμό ανακάλυψης (FDR). Για δείγματα νεφρού ποντικού που υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας snRNA, η διαφορική έκφραση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμή Wilcoxon Rank Sum με προσαρμοσμένες τιμές p Bonferroni < 0.05 που θεωρούνται στατιστικά σημαντικές. Ωστόσο, στο χειρόγραφο παρέχονται μη διορθωμένες τιμές p. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης διερευνήθηκαν για εμπλουτισμένα μονοπάτια στο Gene Ontology, Kegg και Reactome χρησιμοποιώντας μια ανάλυση δικτύου μεταγραφογράμματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19,24-26]. Εν συντομία, όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη, ανεξάρτητα από την τιμή p, ταξινομούνται από δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Ένας αλγόριθμος Monte Carlo χρησιμοποιήθηκε για τη ομαδοποίηση γονιδίων από κοινές βιολογικές λειτουργίες. Η σημασία προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας ένα τεστ t Welch με δύο ουρές μετά από 500 τυχαίες μεταθέσεις για την εκτίμηση του ποσοστού ψευδούς ανακάλυψης με τιμές p < 0,05 που θεωρούνται στατιστικά σημαντικές. Εφόσον μόνο ένα υποσύνολο γονιδίων εκφράζεται σε οποιοδήποτε δεδομένο κύτταρο για δεδομένα snRNA-seq, η μέθοδος μεταγραφογράμματος δεν είναι εφικτή για αυτόν τον τύπο δεδομένων. Η ανάλυση μονοπατιού για το snRNA-seq περιλάμβανε εμπλουτισμό γονιδίων διαφορικά εκφραζόμενων σε Gene Ontology, Kegg και Reactome σύμφωνα με την ακριβή δοκιμή του Fisher, χωρίς να ληφθούν υπόψη οι αλληλεπιδράσεις δικτύου πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Όλες οι κεντρικές σωληναριακές κυτταρικές ομάδες σε όλα τα χρονικά σημεία συγχωνεύτηκαν για να ταυτοποιηθούν εμπλουτισμένα γονίδια μεταξύ ποντικών ελέγχου και db. Το σύμπλεγμα μεμονωμένων ποδοκυττάρων συγχωνεύτηκε επίσης σε χρονικά σημεία. Αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε σε δεδομένα ανθρώπινου RNA-seq επίσης κατά την αξιολόγηση της επικάλυψης με το σύνολο δεδομένων snRNA-seq. Οι διορθωμένες με FDR τιμές p για μονοπάτια χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της επικάλυψης μεταξύ ταιριαζόμενων υποτμημάτων. PAM (διαμερισμός γύρωmedoids) χρησιμοποιήθηκε για τη ομαδοποίηση δειγμάτων ανθρώπινων διαβητικών σύμφωνα με τα γονίδια που εμπλέκονται σε κάθε επικαλυπτόμενη οδό. Τα διαφορικά κλινικά χαρακτηριστικά προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Wilcoxon Rank Sum μεταξύ ομαδοποιημένων ομάδων.














Μπορεί επίσης να σας αρέσει