Ειδική για το αλκοόλ Μεταγραφική Δυναμική Ανασυγκρότησης και Υποτροπής Μνήμης Μέρος 4

Εκτός από το Arc, βρήκαμε ότι τα επίπεδα mRNA του Egr1, αλλά όχι του Bdnf, αυξήθηκαν στο DH και στο mPFC με ανάκτηση μνήμης αλκοόλης.

Καθώς περνά ο καιρός, οι άνθρωποι αποκτούν σταδιακά μια νέα κατανόηση του μυστηρίου της λήθης. Σε αυτή τη διαδικασία, η ανάκτηση μνήμης νέας τεχνολογίας έχει γίνει σταδιακά ένα ερευνητικό hotspot.

Υπάρχει λοιπόν σχέση μεταξύ της ανάκτησης της μνήμης του αλκοόλ και της απόδοσης της μνήμης; Ελάτε να ρίξετε μια ματιά τώρα! Πρώτα απ 'όλα, πρέπει να είμαστε ξεκάθαροι: Η ανάκτηση μνήμης αλκοόλ δεν είναι μια ξεχωριστή τεχνολογία. Είναι μια τεχνολογία που επηρεάζει τους εγκεφαλικούς νευρώνες μέσω του αλκοόλ. Αυτή η διαδικασία μπορεί να ενεργοποιήσει ορισμένες αναμνήσεις στον εγκέφαλο, επιτρέποντάς μας να ανανεώσουμε αυτές τις αναμνήσεις.

Δεύτερον, πρέπει να γνωρίζουμε ότι η βελτίωση της μνήμης δεν μας επιτρέπει απλώς να «θυμόμαστε» περισσότερα πράγματα αλλά είναι μια διαδικασία ανάκτησης και αναδόμησης αναμνήσεων με διαφορετικούς τρόπους. Αυτή η διαδικασία μπορεί να μας βοηθήσει να εδραιώσουμε και να κατανοήσουμε καλύτερα τις γνώσεις που έχουμε μάθει, βελτιώνοντας έτσι τη μνήμη μας.

Επομένως, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι υπάρχει σχέση μεταξύ της ανάκτησης της μνήμης του αλκοόλ και της απόδοσης της μνήμης. Όταν χρησιμοποιούμε αυτήν την τεχνολογία για να ανασύρουμε προηγούμενες αναμνήσεις μετά την κατανάλωση αλκοόλ, υποβάλλουμε σε μια διαδικασία ενοποίησης αυτών των αναμνήσεων, βελτιώνοντας έτσι τη μνήμη μας σε κάποιο βαθμό.

Φυσικά, πρέπει επίσης να σημειώσουμε ότι η ανάκτηση μνήμης αλκοόλ δεν είναι μια μακροχρόνια και αξιόπιστη τεχνική για τη βελτίωση της μνήμης. Αν θέλουμε να έχουμε εξαιρετική μνήμη για μεγάλο χρονικό διάστημα, χρειάζεται να εδραιώνουμε και να βελτιώνουμε συνεχώς τη μνήμη μας μέσα από την καθημερινή μελέτη και τη ζωή, σε συνδυασμό με άλλες τεχνικές εκπαίδευσης μνήμης.

Σε αυτή τη διαδικασία, πρέπει να διατηρούμε μια αισιόδοξη στάση ανά πάσα στιγμή, για να διεγείρουμε καλύτερα τα μαθησιακά μας κίνητρα και τις δυνατότητες μνήμης. Επομένως, ας αντιμετωπίσουμε ενεργά την εκπαίδευση της μνήμης, ας είμαστε ο εαυτός μας αδιάκοπα και ας προχωρήσουμε με θάρρος στο δρόμο της συνεχούς βελτίωσης της μνήμης! Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το κρέας μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ τώρα για να βελτιώσετε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη

Η αυξημένη έκφραση του Egr1 mRNA έχει προηγουμένως εμπλακεί στην επανασυγκέντρωση των αναμνήσεων φόβου και φαρμάκων[19, 21, 48, 61], αυξάνοντας την πιθανότητα αυτός ο μεταγραφικός παράγοντας να παίζει επίσης ρόλο στην επανασύνδεση των αναμνήσεων αλκοόλ.

Ενώ ο ρόλος του Bdnf στην επανασύνδεση της μνήμης παραμένει αμφιλεγόμενος [19, 49], η επαγωγή του Bdnf είναι γνωστό ότι είναι κρίσιμη για την απόκτηση της μνήμης και τη μάθηση εξαφάνισης [19, 62]. Έτσι, η έλλειψη αλλαγής στην έκφραση Bdnf στη μελέτη μας θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι η διαδικασία ανάκτησης της μνήμης μας δεν ξεκίνησε τη μάθηση εξάλειψης παράλληλα με την ανάκτηση μνήμης.

Επιπλέον, πρόσφατα αναφέραμε ότι παρόλο που τα επίπεδα mRNA του Bdnf στο DH δεν αυξάνονται από την ανάκτηση μνήμης αλκοόλ από μόνη της, η έκφραση του αυξητικού παράγοντα ήταν αυξημένη όταν η ανάκτηση ακολουθείται από αποτρεπτική αντιμετώπιση που απέτρεψε την υποτροπή [44], υποδηλώνοντας έναν περίπλοκο ρόλο του Bdnf στη δυναμική της μνήμης του αλκοόλ.

Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι οι αυξήσεις στην έκφραση IEG δεν είναι μοναδικές για την επανασύνδεση των αναμνήσεων που σχετίζονται με το αλκοόλ.

Πράγματι, το ARC και το EGR1 είχαν προηγουμένως εμπλακεί στην ενοποίηση πολλών τύπων αναμνήσεων, συμπεριλαμβανομένων των αναμνήσεων φόβου [19, 46, 47, 62], των αναμνήσεων αναγνώρισης [21] και των αναμνήσεων που σχετίζονται με διαφορετικά φάρμακα κατάχρησης [20, 22, 61].

Ωστόσο, υπάρχουν επίσης αυξανόμενες ενδείξεις ότι ορισμένοι από τους θεματικούς μηχανισμούς στους οποίους βασίζεται η αναζήτηση αλκοόλ μπορεί να διαφέρουν από εκείνους που ελέγχουν την αναζήτηση φυσικής ανταμοιβής [5, 27, 28, 63]. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι μνήμες για διαφορετικές ανταμοιβές (και για διαφορετικά φάρμακα, ειδικότερα) υποβάλλονται σε διαφορετική επεξεργασία [29-32]. Τα ευρήματα της ανάλυσης RNAseq αποκάλυψαν πράγματι τη μοναδική μεταγραφική υπογραφή που προκαλείται από την ανάκτηση μνήμης αλκοόλ.

Συγκεκριμένα, βρήκαμε 44 γονίδια στο DH και ένα διαφορετικό σύνολο 9 γονιδίων σε αυτά PFC, τα οποία παρουσίασαν σημαντικές αλλαγές μετά την ανάκτηση αλκοολικής μνήμης. Μετά από περαιτέρω επικύρωση δεδομένων, εστιάσαμε σε ένα γονίδιο στο mPFC (Fkbp5) και σε τρία γονίδια στο DH(Adcy8, Scl8a3 και Neto1) και διαπιστώσαμε ότι η έκφρασή τους δεν επηρεάστηκε από την ανάκτηση αναμνήσεων που σχετίζονται με τη σακχαρόζη.

Αυτό υποδηλώνει ότι, σε αντίθεση με το Arc και το Egr1, αυτά τα 4 συγκεκριμένα γονίδια πιθανότατα δεν παίζουν γενικούς ρόλους στην επεξεργασία των αναμνήσεων ανταμοιβής, αλλά μπορεί μάλλον να παίζουν επιλεκτικούς ρόλους στην επεξεργασία των αναμνήσεων αλκοόλ.

Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά τα τέσσερα γονίδια είχαν προηγουμένως ενοχοποιηθεί για τη διαταραχή της χρήσης αλκοόλ και τη μάθηση και τη μνήμη. Έτσι, το Fkbp5 κωδικοποιεί την FK506 Binding Protein 5, έναν ρυθμιστή του νευροενδοκρινικού συστήματος του στρες [64].

Οι παραλλαγές FKBP5 ρυθμίζουν τη σοβαρότητα του συνδρόμου στέρησης αλκοόλ [65] και προβλέπουν την τάση για βαριά κατανάλωση αλκοόλ στους ανθρώπους [66-68]. Η διαγραφή του Fkbp5 φάνηκε να αυξάνει τη σοβαρότητα της στέρησης από το αλκοόλ [65] και την κατανάλωση αλκοόλ [67] σε ποντίκια, ενώ η φαρμακολογική αναστολή της πρωτεΐνης μείωσε τη μέτρια κατανάλωση αλκοόλ και την αποκατάσταση της CPP σε ποντίκια [69] και μείωσε την κατανάλωση αλκοόλ σε αρσενικούς αρουραίους [70].

Τα επίπεδα του Adcy8 mRNA, που κωδικοποιεί την αδενυλατεκυκλάση 8 (AC8) που καταλύει το σχηματισμό cAMP σε απόκριση στην εισροή ασβεστίου και πρόσφατα χαρακτηρίστηκε ως πιθανός ρυθμιστής της πρόσληψης αλκοόλ [28, 71], μειώθηκαν στα κύτταρα του αίματος από μακροχρόνια απέχοντες αλκοολικούς [72].

Η διαγραφή του Adcy8 είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι μειώνει την κατανάλωση αλκοόλ και αυξάνει την ευαισθησία στις κατασταλτικές επιδράσεις του αλκοόλ σε ποντίκια [73]. Επιπλέον, η χρόνια έκθεση σε αλκοόλ σε αρουραίους ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση του εγκεφάλου της οικογένειας φορέα 8 (ανταλλάκτης νατρίου/ασβεστίου), του μέλους 3 (NCX3), της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το Scl8a3 [74, 75].

Η κατανάλωση αλκοόλ σε αρουραίους συσχετίστηκε επίσης με μειωμένη έκφραση του Neto1[76] του εγκεφαλικού στελέχους, που κωδικοποιεί το τολλοειδή 1 της νευροπιλίνης (NRP1), ένα συστατικό του συμπλέγματος του NMDA-υποδοχέα [77].

Αυτή η πρωτεΐνη εμπλέκεται στη συναπτική οργάνωση και μετάδοση στον ιππόκαμπο [78] και απαιτείται για τη χωρική μάθηση και τη μνήμη [77].

Έτσι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η απλή ανάκτηση αναμνήσεων αλκοόλ, ακόμη και χωρίς καμία φαρμακολογική επίδραση του αλκοόλ, επηρεάζει την έκφραση αυτών των γονιδίων. Ωστόσο, ο συγκεκριμένος ρόλος τους στην επανενοποίηση της μνήμης του αλκοόλ και στην υποτροπή μένει να δοκιμαστεί.

Ένας περιορισμός της παρούσας μελέτης είναι ότι η ανάλυση RNA-seq διεξήχθη στους ιστούς mPFC και DH του όγκου, αντί για μεμονωμένα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με ανάκτηση μνήμης. Συγκεκριμένα, πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι οι μνήμες γενικά [79, 80] και ειδικότερα οι μνήμες που σχετίζονται με το αλκοόλ [32, 81, 82], κωδικοποιούνται μέσω της ενεργοποίησης νευρωνικών συνόλων που αποτελούνται από έναν μικρό αριθμό νευρώνων, οι οποίοι μπορούν να αναγνωριστούν μέσω δεικτών νευροενεργοποίησης. π.χ. cFOS) [80].

Πράγματι, παρόμοια μοτίβα ενεργοποίησης IEG (cFOS) με ανάκτηση ρυθμισμένου από χειριστή αλκοόλ και γλυκών αναμνήσεων ανταμοιβής βρέθηκαν στο mPFC και σε επιπρόσθετες μεσολιμβικές περιοχές στον εγκέφαλο του αρουραίου [32, 81]. Έτσι, είναι πιθανό ότι η επιλεκτική διεξαγωγή της δοκιμασίας RNA-seq στο νευρωνικό σύνολο που ενεργοποιείται με ανάκτηση μνήμης θα είχε πιο ακριβή αποτελέσματα.

Συνοπτικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ανάκτηση της μνήμης του αλκοόλ επάγει δύο παράλληλα προγράμματα μεταγραφής. Ένα πρόγραμμα, που μεταφέρεται μέσω κοινών μοριακών μηχανισμών μάθησης και μνήμης, συμπεριλαμβανομένων των IEG Arc και Egr1, εμπλέκεται στην ενοποίηση των αναμνήσεων, γενικά.

Το άλλο πρόγραμμα μεταγραφής, που ξεκίνησε με την ανάκτηση μνήμης αλκοόλ, είναι ελεγχόμενα από γονίδια που προωθούν ειδικά συμπεριφορές που σχετίζονται με το αλκοόλ. Αυτό το μοντέλο διπλής επεξεργασίας για μνήμες αλκοόλ αυξάνει την πιθανότητα ότι η ενοποίηση μνήμης για διαφορετικές μνήμες μπορεί να έχει παρόμοιους μοριακούς μηχανισμούς διπλής επεξεργασίας, με ορισμένα στοιχεία να μοιράζονται πολλές μνήμες και άλλα μοναδικά για κάθε τύπο μνήμης.

Αυτό το υποθετικό μοντέλο μένει να αξιολογηθεί ελέγχοντας εάν ο χειρισμός αυτών των γονιδίων επηρεάζει διαφορικά την επανασυγκέντρωση της μνήμης αλκοόλης και σακχαρόζης. Εάν ναι, θα πρότεινε ότι μπορεί να είναι δυνατό να στοχεύσουμε σε συγκεκριμένους μοριακούς στόχους ανταμοιβής για τη θεραπεία διαταραχών που σχετίζονται με παθογόνες αναμνήσεις, όπως ο εθισμός, αντί να διαταραχθούν σημαντικοί μοριακούς μηχανισμούς που είναι απαραίτητοι για πολλές λειτουργίες πέρα ​​από την επανενοποίηση της μνήμης του αλκοόλ.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ανατρέξτε στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες για λεπτομέρειες σχετικά με τη συσκευή, τα φάρμακα και τα αντιδραστήρια, το σχεδιασμό και την παρασκευή ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίου (ODN), τις αναλύσεις westernblot και qRT-PCR και την προετοιμασία της βιβλιοθήκης RNA-seq.

Των ζώων

Αρσενικά και θηλυκά ποντίκια C57BL/JRccHsd (25–30 g), που στεγάστηκαν 3–4/κλουβί εκτράφηκαν στην Πανεπιστημιακή Ζωική Εγκατάσταση του Tel-Aviv (Ισραήλ) και διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών (τα φώτα αναμμένα στις 7 π.μ.), με τροφή και νερό διαθέσιμο adlibitum.

Σε πειράματα που περιελάμβαναν ρύθμιση θέσης σακχαρόζης, η πρόσβαση στην τροφή περιορίστηκε για 6 ώρες πριν από τις προπονήσεις για να τονωθεί το κίνητρο των ποντικών να συλλέγουν σφαιρίδια σακχαρόζης. Αυτή η σύντομη διάρκεια στέρησης τροφής βασίζεται σε ευρήματα ότι κατά τη διάρκεια της ημέρας, μια νηστεία 2-6 ωρών δεν επηρεάζει τη συμπεριφορά σίτισης [83] και δεν προκαλεί σημαντική μετατόπιση των μεταβολικών δεικτών [84], ελαχιστοποιώντας έτσι τις επιπτώσεις του περιορισμού της τροφής. .

Τα ποντίκια ζυγίζονταν δύο φορές την εβδομάδα για έλεγχο απώλειας βάρους. Τα πρωτόκολλα Allexperimental εγκρίθηκαν και συμμορφώθηκαν με τις οδηγίες της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου του Τελ Αβίβ και τις οδηγίες του NIH (αριθμός διασφάλισης για την καλή διαβίωση των ζώων Α5010-01). Καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται.

Διαδικασίες συμπεριφοράς

Κλιματισμός χώρου

Προτίμηση θέσης με βάση το οινόπνευμα (CPP): Όλα τα ποντίκια συνηθίστηκαν σε καθημερινές ενέσεις φυσιολογικού ορού ενδοπεριτοναίου για 3 ημέρες.

Δοκιμή βασικής γραμμής (ημέρα 1): Την πρώτη ημέρα, η συρόμενη πόρτα ανασύρθηκε και τα ποντίκια αφέθηκαν να εξερευνήσουν ελεύθερα ολόκληρη τη συσκευή για 30 λεπτά. Προετοιμασία θέσης με αλκοόλ (ημέρες 2-9): Η εκπαίδευση ξεκίνησε 24 ώρες μετά τη δοκιμή γραμμής βάσης με μία συνεδρία χορηγείται ανά ημέρα για 8 ημέρες, με τη συρόμενη πόρτα κλειστή. Τις ημέρες 3, 5, 7 και 9, τα ποντίκια έλαβαν αλκοόλ (1,8 g/kg, 20% ν/ν· ip) και περιορίστηκαν αμέσως στο ζευγαρωμένο διαμέρισμα για 5 λεπτά.

Αυτή η δόση και η διάρκεια προετοιμασίας είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι παράγουν CPP που προκαλείται από το αλκοόλ [42, 85]. Τις εναλλακτικές ημέρες (δηλαδή, ημέρες 2, 4, 6 και 8), τα ποντίκια έλαβαν ένα αλατούχο διάλυμα και περιορίστηκαν στο ασύζευκτο διαμέρισμα για την ίδια διάρκεια όπως και την ημέρα προετοιμασίας αλκοόλ.

Τα ζευγαρωμένα διαμερίσματα αντισταθμίστηκαν. Δοκιμή προτίμησης θέσης 1 (ημέρα 10): Η δοκιμή προτίμησης θέσης ήταν όπως περιγράφηκε για τη δοκιμή βασικής γραμμής και χρησίμευσε για την ευρετηρίαση αλκοόλ-CPP [41]. Η προτίμηση ορίστηκε ως η αύξηση του ποσοστού του χρόνου που δαπανάται στο διαμέρισμα με σύζευξη αλκοόλ κατά τη διάρκεια της δοκιμής προτίμησης θέσης 1, σε σύγκριση με τη δοκιμή γραμμής βάσης.

Ανάκτηση μνήμης (ημέρα 11): Πριν από αυτό το στάδιο, τα ποντίκια ανατέθηκαν σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (ταιριασμένες για τις βαθμολογίες CPP και το φύλο). Κατά τη διάρκεια μιας συνεδρίας ανάκτησης μνήμης, τα ποντίκια περιορίστηκαν στο διαμέρισμα με το αλκοόλ για 3 λεπτά και στη συνέχεια επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους. Τα ποντίκια ελέγχου υποβλήθηκαν σε σύντομο χειρισμό. Δοκιμή προτίμησης θέσης 2 (ημέρα 12): Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε δοκιμή προτίμησης θέσης πανομοιότυπη με τη δοκιμή προτίμησης θέσης 1.

Σακχαρόζη CPP: Προεκπαίδευση σακχαρόζης (ημέρες 1-6): Τις ημέρες 1-3, τα ποντίκια συνήθιζαν να συλλέγουν 5-6 σφαιρίδια σακχαρόζης (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, ΗΠΑ) σε οικιακούς κλωβούς . Τις ημέρες 4-6, τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν να συλλέγουν 3 σφαιρίδια σε ένα άδειο κουτί από πλεξιγκλάς κατά τη διάρκεια 30-λεπτών συνεδριών. Τα ποντίκια που συνέλεξαν λιγότερα από έξι σφαιρίδια (από ένα σύνολο εννέα σφαιριδίων κατά τη διάρκεια των 3 ημερών) κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης σε σακχαρόζη αποκλείστηκαν από το πείραμα (2 ποντίκια από τα 32).

Δοκιμή βασικής γραμμής (ημέρα 7): Την έβδομη ημέρα, η συρόμενη πόρτα σε ένα θάλαμο CPP ανασύρθηκε και τα ποντίκια αφέθηκαν να εξερευνήσουν ολόκληρη τη συσκευή για 30 λεπτά. Μια αμερόληπτη προσέγγιση συσκευής/αμερόληπτης ανάθεσης, όπως περιγράφεται στη διαδικασία αλκοόλης-CPP, υιοθετήθηκε επίσης εδώ. Προετοιμασία θέσης σακχαρόζης (ημέρες 8-15): Η εκπαίδευση ξεκίνησε 24 ώρες μετά τη δοκιμή γραμμής βάσης με μία συνεδρία την ημέρα σε 8 ημέρες, με ολίσθηση κλειστή πόρτα. Τις ημέρες 9, 11, 13 και 15, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στο ζευγαρωμένο διαμέρισμα και ένα λεπτό αργότερα, τρία σφαιρίδια σακχαρόζης διασκορπίστηκαν στο δάπεδο.
Τα ποντίκια επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους 15 λεπτά αργότερα. Τις εναλλασσόμενες ημέρες (δηλαδή, ημέρες 8, 10, 12 και 14), τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στο ασύζευκτο διαμέρισμα για 15 λεπτά χωρίς παρεμβολές.

Τα ζευγαρωμένα διαμερίσματα αντισταθμίστηκαν. Δοκιμή προτίμησης θέσης 1 (ημέρα 16): Η δοκιμή προτίμησης θέσης ήταν όπως περιγράφηκε για τη δοκιμή γραμμής βάσης και χρησίμευσε για την ευρετηρίαση σακχαρόζης-CPP. Η προτίμηση ορίστηκε ως η αύξηση του ποσοστού του χρόνου που αφιερώθηκε στο διαμέρισμα με ζεύγη σακχαρόζης κατά τη διάρκεια της δοκιμής προτίμησης θέσης 1, σε σύγκριση με τη δοκιμή γραμμής βάσης. Ανάκτηση μνήμης (ημέρες 17): Η διαδικασία ανάκτησης μνήμης σακχαρόζης ήταν πανομοιότυπη με τη διαδικασία ανάκτησης μνήμης αλκοόλης (βλ. παραπάνω ).

Επικύρωση ολιγοδεοξυνουκλεοτιδίου (ODN).

Ο σχεδιασμός αντιπληροφοριακού τόξου ODN (AS-ODN) και κωδικοποιημένου ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) ακολούθησε τις οδηγίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [56, 86].

Λειτουργική επικύρωση Arc AS-ODN. Το τόξο AS-ODN (2 nmol/μl, 0.5 μl, 0.25 μl/λεπτό) εγχύθηκε στο DH σε ένα ημισφαίριο και SCR-ODN (2 nmol/μl, { {9}}.5 μl, 0.25 μl/λεπτό) εγχύθηκε στο άλλο ημισφαίριο (οι πλευρές αντισταθμίστηκαν). Δύο ή τέσσερις ώρες αργότερα, τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία εξερεύνησαν άγνωστο πλαίσιο (διαμέρισμα CPP, βλέπε περιγραφή συσκευής, παραπάνω) για 5 λεπτά για να προκαλέσουν έκφραση ARC που εξαρτάται από την καινοτομία. Τα ποντίκια υπέστησαν ευθανασία μία ώρα αργότερα (δηλαδή, 3 ή 5 ώρες μετά την έγχυση ODN), συλλέχθηκαν εγκεφαλικοί ιστοί και τα επίπεδα πρωτεΐνης ARC αξιολογήθηκαν με στυποανάλυση Western (Εικόνα S4).

Χειρουργική και ενδοιπποκαμπική μικροέγχυση Η χειρουργική επέμβαση και οι μικροεγχύσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως[42, 87].

Χειρουργική επέμβαση. Οι στερεοταξικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκαν με αναισθησία με ισοφλουράνιο. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ένα στερεοταξικό πλαίσιο (RWD Life Science, Shenzhen, Κίνα) και οι διμερείς οδηγοί σωληνίσκοι (C235G-2).6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) στόχευαν στο DH στο τις ακόλουθες συντεταγμένες (−2mm οπίσθια του βρεγμού, ±1,3mm μεσόπλευρα, −1,45mm κοιλιακή προς την επιφάνεια του κρανίου). Οι σωληνίσκοι στερεώθηκαν με οδοντικό ακρυλικό. Ταιριασμένα ανδρείκελα (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) εισήχθησαν στους καθοδηγητικούς σωληνίσκους και επιστρώθηκαν με κύπελλα σκόνης για να διατηρηθεί η θέση του εγχυτήρα καλυμμένη και καθαρή από υπολείμματα. Τα ποντίκια αφέθηκαν να αναρρώσουν για 7-10 ημέρες πριν από την προπόνηση με αλκοόλη-CPP.

Ενδοιπποκαμπικές εγχύσεις. Ακτινομυκίνη D (4 μg/μl, 0.5 μl ανά πλευρά,0.25 μl/λεπτό, σε DMSO) [19] ή ισοδύναμος όγκος φορέα μικροέγχυσης στο DH αμέσως μετά την ανάκτηση μνήμης . Η έγχυση της ακτινομυκίνης D στον ιππόκαμπο σε παρόμοια συγκέντρωση αποδείχθηκε ότι διαταράσσει την επανασυγκέντρωση της μνήμης [19]. Το τόξο AS-ODN ή το SCR-ODN ελέγχου (2nmol/μl, 0.5 μl/πλευρά, 0.25 μl/min· σε PBS) εγχύθηκε με μικροέγχυση στο DH 4 ώρες 2 ώρες πριν ή 4 ώρες μετά την ανάκτηση μνήμης.

Μετά την αφαίρεση της σκόνης και των εικονικών σωληνίσκων, η μικροέγχυση διεξήχθη σε 2 λεπτά σε ποντίκια που είχαν περιοριστεί σε εγρήγορση, χρησιμοποιώντας σωληνίσκους έγχυσης (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) που εκτείνονται 0.5 mm πέρα ​​από τον οδηγό άκρο σωληνίσκου. Οι κάνουλες έγχυσης αφέθηκαν στη θέση τους για επιπλέον 2 λεπτά. Μετά την έγχυση, οι εικονικοί σωληνίσκοι εισήχθησαν στους οδηγούς σωληνίσκους, ασφαλίστηκαν με το κύπελλο σκόνης και τα ζώα επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους. Οι θέσεις των σωληνίσκων επαληθεύτηκαν σε στεφανιαίες τομές πάχους 30 μm ιστού σταθεροποιημένου με παραφορμαλδεΰδη που χρωματίστηκε με κρεζυλοβιολέτα.

Ανάλυση δεδομένων

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >Το 75% του χρόνου σε οποιοδήποτε από τα διαμερίσματα κατά τη διάρκεια της δοκιμής Βασικής γραμμής αποκλείστηκαν από τη μελέτη (9 από 267). Η καθιέρωση CPP επιβεβαιώθηκε συγκρίνοντας τις βαθμολογίες της CPP μεταξύ της βασικής γραμμής και της δοκιμασίας CPP 1 και αναλύθηκε με ένα ζευγοποιημένο t-test. Δεδομένου ότι η έκφραση του CPP (δηλαδή, ο σχηματισμός μνήμης) απαιτείται για την ανάκτηση μνήμης, δεδομένα από ποντίκια που δεν εμφάνισαν CPP (ελάχιστη 5% αύξηση στην προτίμηση μεταξύ της γραμμής αναφοράς και της δοκιμής 1) εξαιρέθηκαν από το πείραμα (48 από 258).

Το Alcohol-CPP μετά από παρεμβολές στην επανασύνδεση της μνήμης αναλύθηκε με ένα ANOVA μικτού μοντέλου με έναν παράγοντα θεραπείας μεταξύ των ατόμων (ακτινομυκίνη D ή ODN) και έναν παράγοντα εντός των υποκειμένων της δοκιμής (δοκιμή CPP 1, δοκιμή CPP 2). Οι σημαντικές αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με τη δοκιμή post hoc aStudent–Newman–Keuls. Οι πυκνότητες των επιπέδων πρωτεΐνης Western blotimmuneactive ARC κανονικοποιήθηκαν σε εκείνα που αναλύθηκαν με GAPDH και αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA με παράγοντα Θεραπείας μεταξύ των υποκειμένων, ακολουθούμενη από τη δοκιμασία post hoc του Dunnett. Τα δεδομένα έκφρασης mRNA qRT-PCR κανονικοποιήθηκαν σε Gapdh και εκφράστηκαν ως ποσοστό της έκφρασης μιας ομάδας ελέγχου.

Τα δεδομένα από όλα τα γονίδια για κάθε περιοχή του εγκεφάλου αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA με παράγοντα Θεραπείας μεταξύ των υποκειμένων, ακολουθούμενη από δοκιμή Dunnett για κάθε γονίδιο, για σύγκριση με τα δεδομένα που ελήφθησαν από μια ομάδα ελέγχου (Χωρίς Ανάκτηση). Για RNA-seq, Συγκεντρώσαμε ιστούς από 3 ζώα για κάθε αντίγραφο και ετοιμάσαμε τον ακόλουθο αριθμό αντιγράφων: 3 για τον ραχιαίο ιππόκαμπο (DH)-χωρίς ανάκτηση, 2 για την ανάκτηση DH, 3 για τον προμετωπιαίο φλοιό (PFC)-χωρίς ανάκτηση και 2 για ( PFC)-ανάκτηση. Μετά την απομόνωση ολικού RNA με το Trizol, δημιουργήθηκαν βιβλιοθήκες αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που αναπτύξαμε [88].

Οι βιβλιοθήκες υποβλήθηκαν σε αλληλουχία ενός άκρου 50 bp με IlluminaHiseq 2000. Μετά την επιβεβαίωση της ποιότητας των δεδομένων αλληλουχίας από το FastQC, οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς mm9 χρησιμοποιώντας Bowtie2 [89] και σχολιάστηκε με Tophat2 [90].

Οι αναγνώσεις που χαρτογραφήθηκαν σε γονίδια ποσοτικοποιήθηκαν με το FeatureCounts [91]. Εξαιρέσαμε τα Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a και το μιτοχονδριακό χρωμόσωμα για να αποφύγουμε τον αριθμό των υπερενισχυμένων γονιδίων που θα μπορούσαν να παραβλέψουν την κανονικοποίηση της βιβλιοθήκης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [92]. Το DESeq2 [58] χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DEG) στην ομάδα Ανάκτησης, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου Χωρίς Ανάκτηση, με μια τιμή p-προσαρμοσμένης τιμής καθορισμού σημασίας (p(adj) < 0.05).

DATA AVAILABILITYRNA-seq δεδομένα είναι διαθέσιμα στο NCBI Gene Expression Omnibus στη διεύθυνση https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) με διακριτικό αναθεωρητή:knyfwwiorbutvuv.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Μεγάλες προκλήσεις για την παγκόσμια ψυχική υγεία. Φύση. 2011; 475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Φαρμακολογική θεραπεία της εξάρτησης από το αλκοόλ: στόχοι συμπτώματα και μηχανισμοί στόχοι. Pharmacol Therap. 2006; 111:855-76.

3. Sinha R. Νέα ευρήματα σχετικά με τους βιολογικούς παράγοντες που προβλέπουν την ευαισθησία στην υποτροπή του εθισμού. Curr Psychiatry Rep. 2011; 13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Αντιδραστικότητα σε ερεθίσματα που σχετίζονται με το αλκοόλ στο εργαστήριο και στο πεδίο: προγνωστικοί δείκτες λαχτάρας σε θεραπευόμενους αλκοολικούς. Εθισμός.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Η διαταραχή των αναμνήσεων που σχετίζονται με το αλκοόλ από την αναστολή του mTORC1 αποτρέπει την υποτροπή. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Ποτό, ναρκωτικά και διαταραχές: χειραγώγηση μνήμης για τη θεραπεία του εθισμού. Curr Opin Neurobiol. 2013; 23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Ένα ενιαίο πρότυπο για τη μνήμη: η υπόθεση για την επανασύνδεση. NatRev Neurosci. 2009; 10:224–34.

8. Dudai Y. Reconsolidation: το πλεονέκτημα της επανασυγκέντρωσης. Curr Opin Neurobiol. 2006; 16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Επανενοποίηση της μνήμης μετά την επανενεργοποίησή της. Behav.Brain Res. 1997; 84:241-6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Οι μνήμες φόβου απαιτούν πρωτεϊνική σύνθεση στην αμυγδαλή για επανασυγκράτηση μετά την ανάκτηση. Φύση. 2000; 406:722-6.

For more information:1950477648nn@gmail.com