Μορφολογία επινεφριδίων ως δείκτης μακροπρόθεσμου ελέγχου ασθενειών σε ενήλικες με κλασική ανεπάρκεια 21-υδροξυλάσης

Ιστορικό:Παρακολούθηση ενηλίκων μεκλασική ανεπάρκεια 21-υδροξυλάσης(21OHD) αποτελεί πρόκληση λόγω των διαφοροποιήσεων στις κλινικές και εργαστηριακές ρυθμίσεις. Επιπλέον, οι οδηγίες για την απεικόνιση των επινεφριδίων στο 21OHD δεν είναι ακόμη διαθέσιμες. Αξιολογήσαμε τη σχέση μεταξύ της μορφολογίας των επινεφριδίων και της κατάστασης ελέγχου της νόσου στην κλασική 21OHD.

Μέθοδοι:Αυτή η αναδρομική, συγχρονική μελέτη περιελάμβανε 90 ενήλικες ασθενείς με 21OHD και 270 υγιείς μάρτυρες αντιστοίχισης ηλικίας και φύλου. Αξιολογήσαμε τον όγκο, το πλάτος και την παρουσία του όγκου των επινεφριδίων χρησιμοποιώντας αξονική τομογραφία κοιλίας και αξιολογήσαμε τις συσχετίσεις του όγκου και του πλάτους των επινεφριδίων με την ορμονική κατάσταση. Διερευνήσαμε τη διαγνωστική απόδοση του όγκου και του πλάτους των επινεφριδίων για τον προσδιορισμό της καλά ελεγχόμενης κατάστασης σε ασθενείς με 21OHD (17 -υδροξυπρογεστερόνη [17-OHP]<10 ng/mL). 

Αποτελέσματα:Η μορφολογία των επινεφριδίων του 21Οι ασθενείς με OHD εμφάνισαν υπερτροφία(45,6%), φυσιολογικό μέγεθος (42,2%) και υποτροφία (12,2%). Όγκοι των επινεφριδίων ανιχνεύθηκαν σε 12 ασθενείς (13,3%). Ο όγκος και το πλάτος των επινεφριδίων των ασθενών με 21OHD ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από αυτά των μαρτύρων (18,2±12,2 mL έναντι 7,1±2.{17}} mL, 4,7±1,9 mm έναντι 3,3±{0,5 mm, Π<0.001 for both). The 17-OHP and androstenedione levels were highest in patients with adrenal hypertrophy, followed by those with normal adrenal glands and adrenal hypotrophy (P<0.05 for both). Adrenal volume and width correlated positively with adrenocorticotropic hormone, 17-OHP, 11β-hydroxytestosterone, progesterone sulfate, and dehydroepiandrosterone sulfate in both sexes (r=0.33–0.95, P<0.05 for all). For identifying well-controlled patients, the optimal cut-off values of adrenal volume and width were 10.7 mL and 4 mm, respectively (area under the curve, 0.82–0.88; P<0.001 for both). 

Συμπέρασμα:Ο όγκος και το πλάτος των επινεφριδίων μπορεί να είναι αξιόπιστες ποσοτικές παράμετροι για παρακολούθησηασθενείς με κλασική 21OHD.

Λέξεις-κλειδιά:Υπερπλασία επινεφριδίων, συγγενής;Επινεφριδιακός φλοιός; Όγκος επινεφριδίων; Ανδρογόνα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων είναι μιααυτοσωμική υπολειπόμενη νόσοςπου προκαλείται από διαταραχή της στεροειδογένεσης και η ανεπάρκεια 21-υδροξυλάσης (21OHD) ευθύνεται για περίπου το 95% των περιπτώσεων [1]. Δεδομένου ότι οι ενήλικες με 21OHD παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα ενζυμικής ανεπάρκειας και κλινικών χαρακτηριστικών, είναι δύσκολο να επιτευχθεί καταστολή ανδρογόνων επινεφριδίων και βέλτιστη αντικατάσταση στεροειδών ταυτόχρονα. Η υποθεραπεία οδηγεί σε περίσσεια ανδρογόνων και επινεφριδιακή ανεπάρκεια, ενώ η υπερβολική θεραπεία προκαλεί ιατρογενές σύνδρομο Cushing και μεταβολικό σύνδρομο, τα συστατικά του οποίου περιλαμβάνουν την παχυσαρκία και την υπέρταση [2,3]. Παραδοσιακά, η 17 -υδροξυπρογεστερόνη (17-OHP) μετρήθηκε ως ο θεραπευτικός δείκτης για τον ορμονικό έλεγχο. Σε πρόσφατες μελέτες, η ανδροστενεδιόνη, η 21-δεοξυκορτιζόλη και τα 11-οξυγονωμένα ανδρογόνα έχουν προταθεί ως αξιόπιστοι δείκτες για τον έλεγχο της νόσου. Ωστόσο, αυτές οι μετρήσεις ορμονών δεν είναι διαθέσιμες στην κλινική πράξη [4]. Επιπλέον, τα βέλτιστα επίπεδα στόχου αυτών των ορμονών δεν έχουν καθοριστεί καθώς το εύρος αναφοράς και ο χρόνος δειγματοληψίας ποικίλλουν [4]. Επομένως, χρειάζεται ένας άλλος δείκτης για τον έλεγχο της νόσου.

Ο όγκος των επινεφριδίων έχει χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση των διαστάσεων των φυσιολογικών επινεφριδίων και για τον χαρακτηρισμό συγκεκριμένων ασθενειών που μπορεί να επηρεάσουν το παρέγχυμα των επινεφριδίων [5-9]. Η απεικόνιση των επινεφριδίων δεν συνιστάται τακτικά σε ασθενείς με 21OHD [4], αλλά μπορεί να λαμβάνεται υπόψη σε ασθενείς με μακρύ ιστορικό ανεπαρκούς ελέγχου της νόσου, ασυνεπής θεραπεία ή ασθένειας που είναι δύσκολο να ελεγχθεί κατά κανόνα [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει τη συσχέτιση μεταξύ του όγκου των επινεφριδίων και της ορμονικής κατάστασης [11,12]. Ωστόσο, η κλινική σημασία του όγκου των επινεφριδίων σε ασθενείς με 21OHD δεν έχει αποδειχθεί καλά.

Συγκρίναμε τη μορφολογία των επινεφριδίων, συμπεριλαμβανομένου του πλάτους και του όγκου των άκρων, μεταξύ ασθενών με κλασική 21OHD και υγιών μαρτύρων. Επιπλέον, στόχος μας ήταν να συγκεντρώσουμε περισσότερα στοιχεία σχετικά με τη σχέση μεταξύ του όγκου των επινεφριδίων και των βιοχημικών παραμέτρων σε ασθενείς με 21OHD και να αξιολογήσουμε τη διαγνωστική αξία τουόγκος επινεφριδίωνσανμακροχρόνια ασθένειαδείκτης ελέγχου.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Πληθυσμός μελέτης

Η Επιτροπή Θεσμικής Αναθεώρησης του Εθνικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Σεούλ ενέκρινε αυτήν την αναδρομική μελέτη και παραιτήθηκε από την απαίτηση για ενημερωμένη συγκατάθεση (IRB αρ.: H-2004-147-1118). Μεταξύ Νοεμβρίου 2016 και Μαρτίου 2021, εντοπίσαμε 308 ασθενείς με 21HD που επισκέφτηκαν την ενδοκρινική κλινική του κέντρου μας. Μεταξύ αυτών, 95 ασθενείς πληρούσαν τα ακόλουθατα κριτήρια ένταξης: (1) age >18 ετών? (2) υποβλήθηκε σε αξονική τομογραφία κοιλίας (CT) για απεικόνιση επινεφριδίων. και (3) υποβλήθηκαν σε ορμονική αξιολόγηση την ίδια ημέρα με την αξονική τομογραφία. Αποκλείσαμε τρεις ασθενείς με μη κλασική 21OHD και δύο ασθενείς που υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη επινεφριδεκτομή. Αυτή η μελέτη περιελάμβανε ένα τελικό σύνολο 90 ασθενών (44 άνδρες και 46 γυναίκες, μέση ηλικία, 29,7±7,9 έτη).

Για συγκρίσεις τωνμορφολογία επινεφριδίωνκαιΕνταση ΗΧΟΥ, αυτή η μελέτη περιελάμβανε 270 μάρτυρες αντιστοίχισης ηλικίας και φύλου (135 άνδρες και 135 γυναίκες με μέση ηλικία 31,7±3,9 έτη) που υποβλήθηκαν σε αξονική τομογραφία κοιλίας για έλεγχο υγείας. Εξαιρέσαμε ασθενείς με μάζες των επινεφριδίων ή οποιεσδήποτε γνωστές ενδοκρινικές παθήσεις που μπορεί να επηρεάσουν τα επινεφρίδια τους.

Κλινικά και βιοχημικά δεδομένα

Εξετάσαμε τα ηλεκτρονικά ιατρικά αρχεία κάθε ασθενούς και ανακτήσαμε δεδομένα από την επίσκεψη για αξονική απεικόνιση. Ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) ορίστηκε ως το σωματικό βάρος διαιρεμένο με το τετράγωνο του ύψους (kg/m2). Μετρήσαμε την αρτηριακή πίεση χρησιμοποιώντας μια αυτοματοποιημένη τεχνική σε καθιστή θέση μετά από μια 20-λεπτή ανάπαυση.

Αξιολογήσαμε επίσης το τρέχον σχήμα γλυκοκορτικοειδών και φλουδροκορτιζόνης κάθε ασθενούς. Τα ημερήσια ισοδύναμα δόσης γλυκοκορτικοειδών υπολογίστηκαν ως εξής: υδροκορτιζόνη, 1; πρεδνιζολόνη/πρεδνιζόνη, 4; και δεξαμεθαζόνη, 70 [13]. Τα ισοδύναμα δόσης γλυκοκορτικοειδών και η δόση φλουδροκορτιζόνης διαιρέθηκαν με την επιφάνεια σώματος (BSA) για ομαλοποίηση.

Λαμβάνονταν δείγματα αίματος πρωινού νηστείας για εργαστηριακές εξετάσεις πριν οι ασθενείς λάβουν στεροειδή φάρμακα. Οι εργαστηριακές εξετάσεις περιελάμβαναν αδρενοκορτικοτροπική ορμόνη πλάσματος (ACTH), 17- OHP, ανδροστενεδιόνη, 11 -υδροξυτεστοστερόνη (11 -OHT), 11 -υδροξυ ανδροστενεδιόνη (11 -OHA), τεστοστερόνη, θειική προγεστερόνη (Preg-S), ολική τεστοστερόνη και δραστικότητα ρενίνης πλάσματος. Κατηγοριοποιήσαμε ασθενείς με 21OHD σε καλά ελεγχόμενες και κακώς ελεγχόμενες ομάδες σύμφωνα με τα επίπεδα 17-OHP [4] στον ορό, χρησιμοποιώντας ένα 17-επίπεδο OHP χαμηλότερο από 10 ng/mL ως διαχωριστικό για το φρεάτιο -ελεγχόμενη ομάδα που αντιστοιχεί σε επίπεδο διπλάσιο από το ανώτερο φυσιολογικό όριο [3].

Συμπεριλάβαμε την παχυσαρκία, την υπεργλυκαιμία, την υπέρταση και τη δυσλιπιδαιμία ως μεταβολικές νοσηρότητες, οι οποίες τροποποιήθηκαν από τα κριτήρια εναρμόνισης του μεταβολικού συνδρόμου [14]. Ο ορισμός κάθε μεταβολικής νοσηρότητας περιγράφεται στα συμπληρωματικά υλικά.

Πρωτόκολλο CT

Όλοι οι ασθενείς με 21OHD υποβλήθηκαν είτε σε αξονική τομογραφία κοιλίας χωρίς σκιαγραφικό (n=83) είτε με ενισχυμένη αντίθεση (n=7) χρησιμοποιώντας αξονικούς τομογράφους πολλαπλών ανιχνευτών (64 έως 128 κανάλια). Στην ομάδα ελέγχου, όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε αξονική τομογραφία κοιλίας με ενισχυμένη αντίθεση (n=270). Οι αξονικές τομογραφίες πραγματοποιήθηκαν σε ύπτια θέση με εύρος σάρωσης από την κορυφή του διαφράγματος έως το κάτω όριο της ηβικής σύμφυσης. Όλες οι σαρώσεις λήφθηκαν με ένα μόνο κράτημα της αναπνοής για να ελαχιστοποιηθούν τα τεχνουργήματα κίνησης και εσφαλμένης καταχώρισης. Οι λεπτομερείς ρυθμίσεις ήταν οι εξής: ευθυγράμμιση, 64×0.625 mm ή 128×0.6 mm; χρόνος περιστροφής σκελετού, 0,5 δευτερόλεπτα. pitch, 0.891 ή 0.65; πάχος φέτας, 3 mm. διάστημα ανακατασκευής, 3 mm. και μήτρα, 512×512.

Οι εικόνες λήφθηκαν με χρήση ενέργειας σωλήνων 80 έως 120 kVp και τεχνολογία αυτόματης διαμόρφωσης ρεύματος σωλήνα διαθέσιμη για κάθε προμηθευτή (Care Dose 4D, Siemens Medical Solutions, Erlangen, Γερμανία, Dose Right and Tube Current Modulation, Philips Medical Systems, Best, Ολλανδία, ή AutomA, GE Medical Systems, Milwaukee, WI, ΗΠΑ). Για αξονική τομογραφία ενισχυμένης αντίθεσης, λήφθηκαν εικόνες πύλης φάσης 70 δευτερόλεπτα μετά τη χορήγηση του μέσου αντίθεσης. Ιωδιούχο σκιαγραφικό σε συγκέντρωση 350 mgI/mL χορηγήθηκε στην περιφερική φλέβα του άνω άκρου μέσω αυτόματου εγχυτήρα ισχύος σε συνολική δόση 1,5 mL/kg σε 30 δευτερόλεπτα.

Απεικονιστική ανάλυση

Δύο ακτινολόγοι (TMK και SYK με 6 και 16 χρόνια εμπειρίας στην απεικόνιση του ουρογεννητικού συστήματος, αντίστοιχα) που είχαν τυφλωθεί στις σχετικές κλινικές πληροφορίες εξέτασαν όλες τις εικόνες CT χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αρχειοθέτησης εικόνων και επικοινωνίας (Infinitt, Infinitt Healthcare, Σεούλ, Κορέα).

Η μορφολογία των επινεφριδίων ταξινομήθηκε σε υπερτροφία, φυσιολογικό μέγεθος και υποτροφία σύμφωνα με πλάτος άκρου μεγαλύτερο ή ίσο με 5 mm, μεγαλύτερο ή ίσο με 2 mm<5 mm, and <2 mm, respectively [8]. We measured the widths of the adrenal limbs at the widest part of the medial or lateral limbs perpendicular to the long axis of the limb in both adrenal glands and calculated the average of those measurements (Fig. 1). The readers carefully examined whether adrenal masses were present. A diagnosis of myelolipoma was considered when the readers detected gross fat inside the mass; otherwise, it was considered an adenoma. In the case of a disagreement, a third radiologist (J.Y.C., 26 years of genitourinary imaging experience) who was also blinded to the patient's clinical information provided input.

Για ογκομετρική αξιολόγηση των επινεφριδίων, ένας ακτινολόγος (TMK) τμηματοποίησε χειροκίνητα το επινεφριδιακό παρέγχυμα σε κάθε πλευρά σε αξονικές εικόνες CT χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμο λογισμικό (MEDIP, Medical IP, Σεούλ, Κορέα). Για να κάνουμε ογκομετρικές μετρήσεις, σχεδιάσαμε χειροκίνητα το περιθώριο των επινεφριδίων όσο το δυνατόν πιο κοντά στην επιφάνεια του αδένα για να αποκλείσουμε τον παρακείμενο λιπώδη ιστό, το ήπαρ, την κάτω κοίλη φλέβα, τη σπλήνα και την παγκρεατική ουρά. Αποφύγαμε προσεκτικά τον όγκο γιατί θέλαμε να εστιάσουμε στον παρεγχυματικό όγκο. Ο συνολικός όγκος των επινεφριδίων υπολογίστηκε συνδυάζοντας και τις δύο πλευρές του όγκου του παρεγχύματος των επινεφριδίων. Κατατμήσαμε επίσης τους όγκους των επινεφριδίων ανεξάρτητα από το παρέγχυμα και ο συνολικός όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως το άθροισμα όλων των τμηματοποιημένων όγκων. Όλες οι διεργασίες πραγματοποιήθηκαν σε μια τυπική ρύθμιση κοιλιακού παραθύρου με πλάτος 300 και επίπεδο 40. Για να αξιολογηθεί η αξιοπιστία του ενδοπαρατηρητή, ένας άλλος ακτινολόγος (SYK) πραγματοποίησε πρόσθετες μετρήσεις 90 21 ασθενών με OHD με τον ίδιο τρόπο.

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ανάλυση σύνθεσης ολόκληρου του σώματος χρησιμοποιώντας ένα αποκλειστικό πρόγραμμα λογισμικού (DEEPCATCH, Medical IP). Το πρόγραμμα λογισμικού παρέχει πλήρως αυτόματη κατάτμηση των εξαρτημάτων του αμαξώματος με μέση ακρίβεια τμηματοποίησης 97% σε σύγκριση με τη χειροκίνητη τμηματοποίηση [15]. Η περιοχή τομής L3 (cm2) των σκελετικών μυών, του κοιλιακού σπλαχνικού λίπους και του υποδόριου λίπους προσδιορίστηκαν αυτόματα. Η συνολική επιφάνεια του κοιλιακού λίπους υπολογίστηκε αθροίζοντας τις περιοχές του κοιλιακού σπλαχνικού και του υποδόριου λίπους. Επιπλέον, η περίμετρος της μέσης (cm) μετρήθηκε αυτόματα στο επίπεδο της άνω άκρης του οστού του ισχίου. Ένας ενδοκρινολόγος (HNJ) επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της αυτόματης κατάτμησης. Συγκρίναμε τη σωματική σύνθεση των ασθενών με 21OHD μεταξύ των καλά ελεγχόμενων και των ανεπαρκώς ελεγχόμενων ομάδων.

Βιοχημικές αναλύσεις

Τα επίπεδα ACTH στο πλάσμα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανοσοραδιομετρική δοκιμασία (Cisbio Bioassays, Saclay, Γαλλία) με συντελεστές διακύμανσης εντός και μεταξύ της ανάλυσης (CVs) 3,7% και 3,8%. Τα κιτ CT ραδιοανοσοδοκιμασίας (RIA) (Asbach Medical Products GmbH, Obrigheim, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των επιπέδων 17- OHP και θειικής δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA-S) ορού. Τα CV εντός και μεταξύ των προσδιορισμών για τα επίπεδα 17-OHP ήταν 4,6% και 7,7%, αντίστοιχα, και τα αντίστοιχα CV για τα επίπεδα DHEA-S ήταν 3,6% και 6,5%. Τα επίπεδα ολικής τεστοστερόνης στον ορό μετρήθηκαν με κιτ TESTO-CT2 (Cisbio Bioassays). Τα CV εντός και μεταξύ των δοκιμασιών για την ολική τεστοστερόνη ήταν 3,1% και 5,2%, αντίστοιχα. Η δραστικότητα της ρενίνης στο πλάσμα μετρήθηκε με ένα κιτ PRA RIA (TFB Inc., White Lake, MI, USA), με CV εντός και εντός της ανάλυσης 3,8% και 6,7%, αντίστοιχα. Τα στεροειδή των επινεφριδίων, συμπεριλαμβανομένης της ανδροστενεδιόνης, 11 -OHT, 11 -OHA, τεστοστερόνης και Preg-S προσδιορίστηκαν ποσοτικά με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (LC-MS), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Με βάση τις επιμέρους συγκεντρώσεις στον ορό, υπολογίσαμε επίσης τη μεταβολική αναλογία 11 -υδροξυ τεστοστερόνης προς τεστοστερόνη (11 -OHT/T) για να υποδείξουμε τη δραστηριότητα της 11 -υδροξυλάσης των όρχεων.

Ορισμός μεταβολικής νοσηρότητας

Patients with a BMI >25 kg/m2 θεωρήθηκαν παχύσαρκοι. Η υπεργλυκαιμία, η οποία περιελάμβανε σακχαρώδη διαβήτη και προδιαβήτη, ορίστηκε ως η τιμή της αιμοσφαιρίνης A1c μεγαλύτερη από ή ίση με 5,7%, ένα επίπεδο γλυκόζης πλάσματος νηστείας μεγαλύτερο από ή ίσο με 100 mg/dL ή η χρήση οποιωνδήποτε από του στόματος αντιδιαβητικού φαρμάκου ή ινσουλινοθεραπεία. Η υπέρταση ορίστηκε ως συστολική αρτηριακή πίεση μεγαλύτερη ή ίση με 130 mm Hg και/ή διαστολική αρτηριακή πίεση μεγαλύτερη ή ίση με 85 mm Hg ή η χρήση οποιωνδήποτε αντιυπερτασικών φαρμάκων. Η δυσλιπιδαιμία ορίστηκε ως ένα μη φυσιολογικό λιπιδικό πάνελ (ολική χοληστερόλη μεγαλύτερη από ή ίση με 240 mg/dL, χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη χοληστερόλη μεγαλύτερη ή ίση με 160 mg/dL, τριγλυκερίδια μεγαλύτερα ή ίσα με 150 mg/dL ή υψηλή λιποπρωτεΐνη πυκνότητας χοληστερόλη<40 mg/dL) or the use of lipid-lowering agents.

Στατιστική ανάλυση

Για συγκρίσεις ομάδων, χρησιμοποιήσαμε το ακριβές τεστ Fisher για τις κατηγορικές μεταβλητές και το ανεξάρτητο τεστ t ή το τεστ Mann-Whitney U για συνεχείς μεταβλητές, ανάλογα με την περίπτωση. Το τεστ Kruskal–Wallis με ανάλυση Conover post hoc πραγματοποιήθηκε για να συγκριθεί η 17-OHP και η ανδροστενεδιόνη μεταξύ των ασθενών 21OHD σύμφωνα με τη μορφολογία των επινεφριδίων. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις υποομάδας του συνολικού όγκου των επινεφριδίων σύμφωνα με τον φαινότυπο, την κανονικότητα της εμμήνου ρύσεως και την παρουσία όγκων των επινεφριδίων. Χρησιμοποιήσαμε συντελεστές συσχέτισης Spearman για ανάλυση συσχέτισης, για τους οποίους οι μη φυσιολογικά κατανεμημένες μεταβλητές (όλες οι βιοχημικές παράμετροι και ο όγκος των επινεφριδίων) μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά.

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση χαρακτηριστικών λειτουργίας του δέκτη για να αξιολογηθεί η διαγνωστική ακρίβεια του όγκου και του πλάτους των επινεφριδίων για τη διάκριση ασθενών με 21OHD μεταξύ του φυσιολογικού πληθυσμού, καθώς και για την πρόβλεψη της καλά ελεγχόμενης ομάδας και ασθενών με τουλάχιστον μία μεταβολική νοσηρότητα. Η συμφωνία μεταξύ των παρατηρητών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον συντελεστή συσχέτισης εντός της τάξης (ICC), με τιμές ICC<0.4, 0.4–0.6, 0.6–0.8, and >Το 0.8 ερμηνεύεται ως ένδειξη κακής, μέτριας, καλής και εξαιρετικής συμφωνίας, αντίστοιχα. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το SPSS έκδοση 25 (IBM, Armonk, NY, ΗΠΑ) και τις τιμές P του<0.05 were considered statistically significant.