Τα προσκολλημένα και αιωρούμενα κύτταρα νεφρού μωρού χάμστερ έχουν διαφορετικό ρεπερτόριο κυτταροσκελετών και επιφανειακών υποδοχέων

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Βερόνικα Ντιλ¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Αφηρημένη

Καλλιέργεια ζωικών κυττάρων, με μεμονωμένα κύτταρα να αναπτύσσονται μέσαεναιώρημα, ιδανικά σε ένα χημικά καθορισμένο περιβάλλον, αποτελεί βασικό πυλώνα της βιοφαρμακευτικής παραγωγής. Το συνθετικό περιβάλλον στερείται εξωγενών αυξητικών παραγόντων και συνήθως απαιτεί μια χρονοβόρα διαδικασία προσαρμογής για την επιλογή κυτταρικών κλώνων που πολλαπλασιάζονται σεεναιώρημασε υψηλούς αριθμούς κυττάρων. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διευκολύνουν την προσαρμογή και που λαμβάνουν χώρα μέσα στο κύτταρο είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ειδικά για κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αντιγόνου ιού όπως κύτταρα νεφρού μωρού χάμστερ (BHK), ο περιορισμός της ανάπτυξης του ιού μέσω της εξέλιξης ανεπιθύμητων κυτταρικών χαρακτηριστικών είναι εξαιρετικά ανεπιθύμητος. Η σύγκριση μεταξύ κολλητά αναπτυσσόμενων κυττάρων ΒΗΚ και κυττάρων αιωρήματος με διαφορετικάευαισθησίαστον ιό του αφθώδους πυρετού αποκάλυψαν διαφορές στην έκφραση των κυτταρικών υποδοχέων όπως οι ιντεγκρίνες και οι θειικές ηπαράνη και στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Μεταγραφικές αναλύσεις και ανάπτυξηκινητικήκατέδειξε την ποικιλομορφία των κυτταρικών γραμμών BHK και επιβεβαίωσε τη σημασία των καλά χαρακτηρισμένων γονικών κυτταρικών κλώνων και του προσεκτικού ελέγχου για να διασφαλιστεί ότι τα βασικά κυτταρικά χαρακτηριστικά δεν θα χαθούν κατά την προσαρμογή.

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

1. Εισαγωγή

Η τεχνολογία ζωικής κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για την παραγωγή αντιγόνου ιού στην παραγωγή εμβολίων, αλλά πιο πρόσφατα οι πλατφόρμες παραγωγής βακτηρίων ή ζυμομυκήτων για ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες άλλαξαν και σε συστήματα κυττάρων θηλαστικών [1, 2]. Σημαντικά και στα δύο πλαίσια είναι τα κύτταρα νεφρού μωρού χάμστερ (BHK), που προέρχονται από το συριακό χρυσό χάμστερ (Mesocricetus auratus). Αρχικά, τα κύτταρα ΒΗΚ ήταν μια προσκολλητικά αναπτυσσόμενη, εξαρτώμενη από άγκυρα κυτταρική σειρά θηλαστικών με μοτίβο ανάπτυξης ινοβλαστών σε τυπικές συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας συμπεριλαμβανομένου του εμβρυϊκού βόειου ορού (FBS) [3, 4]. Η προσαρμογή των προσκολλημένων κυττάρων ΒΗΚ σεεναιώρημαΗ ανάπτυξη σε μέσα χωρίς ορό σε συνδυασμό με συνθήκες καλλιέργειας μεγάλης κλίμακας είναι μια ιστορία επιτυχίας για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (π.χ. παράγοντας VIII) με υψηλές αποδόσεις [1, 2]. Επιπλέον, τα κύτταρα BHK είναι ευαίσθητα σε ένα ευρύ φάσμα ιών, συμπεριλαμβανομένου του ιού του αφθώδους πυρετού (FMD) [5]. Για να καλυφθεί η αυξανόμενη ζήτηση για εμβόλια αφθώδους πυρετού σε πολλά μέρη του κόσμου, πρέπει να παράγονται μεγάλες ποσότητες αντιγόνου όσο το δυνατόν φθηνότερα, κάτι που μπορεί να επιτευχθεί αυξάνοντας τις βιώσιμες κυτταρικές πυκνότητες στην κυτταρική πλευρά και μειώνοντας το κόστος μέσω της απλοποίησης της επεξεργασίας προς τα πάνω και κατάντη. του αντιγόνου στην πλευρά παραγωγής [6]. Τα μέσα χωρίς ζωικά συστατικά (ACFM) μειώνουν τον κίνδυνο μόλυνσης από τυχαίους παράγοντες και επιπλέον απλοποιούν τη διαδικασία όταν δεν χρειάζεται να συμπληρωθεί ορός [6, 7]. Ωστόσο, η προσαρμογή των κυττάρων να αναπτύσσονται σε εναιώρημα χωρίς ορό και σε ACFM είναι μια χρονοβόρα και σταδιακή διαδικασία [6, 8]. Τα κύτταρα BHK φθάνουν εύκολα σε κυτταρικές πυκνότητες 3,5×106 κύτταρα/mL σε εναιώρημα, αλλά η προσαρμογή ενέχει πάντα τον κίνδυνο ανάπτυξης ανεπιθύμητων κυτταρικών ιδιοτήτων σε σύγκριση με τον αρχικό πληθυσμό που μπορεί να οδηγήσει σε κακή απόδοση ανάπτυξης, ανεπαρκείς κυτταροειδικές αποδόσεις ή ογκογενή στοιχεία [5, 7]. Με τη σειρά τους, αλλαγές στα κύτταρα μπορεί να οδηγήσουν σε απροσδόκητες παραλλαγές του ιού κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πολιτισμικής προσαρμογής. Ειδικά για την παραγωγή αντιγόνου εμβολίου, μια αλλαγή στα χαρακτηριστικά του ιού και στην αντιγονικότητα είναι εξαιρετικά ανεπιθύμητη. Τα κύτταρα BHK ήδη διαφέρουν ως προς την ευαισθησία τους και τη δυνατότητά τους να διαδώσουν ορισμένα στελέχη του ιού του FMDV [9]. Προφανώς, η αλλαγή από την εξαρτώμενη από την αγκύρωση ινοβλαστική ανάπτυξη μέσω συσσωμάτωσης και σχηματισμού σφαιροειδών σε κύτταρα που αναπτύσσονται ανεξάρτητα σε εναιώρηση θα συνοδεύεται από σημαντικές αλλαγές στο ίδιο το κύτταρο [4, 6]. Η απώλεια της σηματοδότησης της ιντεγκρίνης λόγω της διακοπής της επαφής εξωκυτταρικής μήτρας-κυττάρου οδηγεί σε αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης της μεμβράνης και στην οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης που είναι ένας σημαντικός αποδέκτης της σηματοδότησης που μεσολαβεί η ιντεγκρίνη [6, 10]. Ταυτόχρονα, αυτές οι ιντεγκρίνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μόλυνση από FMDV επειδή είναι ο υποδοχέας του FMDV στον φυσικό ξενιστή και ο κύριος υποδοχέας στην κυτταροκαλλιέργεια [11].

Μια βαθύτερη κατανόηση των κυτταρικών διαφορών μεταξύ των κολλητά αναπτυσσόμενων κυττάρων HK και των κυττάρων στοεναιώρημαθα ανοίξει νέες δυνατότητες για την κυτταρική μηχανική και θα απλοποιήσει την επιλογή κατάλληλων κυτταρικών κλώνων για την παραγωγή αντιγόνου εμβολίου.

Σε αυτή τη μελέτη, προσκολλημένα αυξανόμενα κύτταρα BHK και προσαρμοσμένα σε ACFMεναιώρημαΤα κύτταρα ΒΗΚ εξετάστηκαν σε σχέση με την έκφραση κυτταρικών υποδοχέων όπως οι ιντεγκρίνες και οι θειικές ηπαράνη (HS), την ικανότητά τους να παρουσιάζουν πρωτεΐνες στην κυτταρική επιφάνεια και την οργάνωση του κυτταρικού σκελετού ακτίνης. Οι αναλύσεις μεταγραφών και η κινητική ανάπτυξης παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την ποικιλομορφία των δοκιμασμένων κυτταρικών γραμμών BHK.

Το cistanche μπορεί να θρέψει τα νεφρά και να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1 Κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Οι κύριες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν δύο προσκολλημένα παράγωγα κλώνου 13 BHK-21 (από την American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, που φυλάσσονται ως CCLV-RIE 164 και 179 στη Συλλογή των Κυτταρικών Γραμμών στην Κτηνιατρική , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Germany· εν συντομία: BHK164 ή BHK179) και τοεναιώρημακυτταρικές σειρές BHK21C13-2P (BHK-2P) που παρέχονται από την European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) και BHK-InVitrus (BHK-InV, που αναφέρεται επίσης ως "γραμμή #8" όπως στην προηγούμενη δημοσίευσή μας [12]· Sigma-Aldrich, St. Louis, ΗΠΑ).

Για την αυξητική κινητική, χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές: BHK-2P διατηρήθηκε είτε στο Minimal Essential Medium (GMEM) της Γλασκώβης με 10 τοις εκατό FBS ("γραμμή #2") είτε προσαρμοσμένη στο ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) σε δύο διαφορετικές διαδικασίες (γραμμές #4 και #5), συν άλλες τέσσεριςεναιώρημακυτταρικές σειρές: BHK21C13 προσαρμοσμένες στην ανάπτυξη σεεναιώρημαμε τη σταδιακή απόσυρση του ορού (γραμμή #3), του BHK21-C (γραμμή #6), του BHK21-Hektor (γραμμή #7) και της παραγωγής BHK (γραμμή #9) [12]. Όλα αυτά τα κύτταρα παρέχονται από την Merck KGaA.

Όλα τα κύτταρα BHK-21 που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη προέρχονται τελικά από την κυτταρική σειρά BHK-21 κλώνου 13 των Macpherson και Stoker [13]. Ο όρος "κυτταρική γραμμή" χρησιμοποιείται χαλαρά. δεν είναι και οι έντεκα σειρές BHK-21 που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη και δεν είναι πραγματικά ξεχωριστές κυτταρικές γραμμές παρά παράγωγα που καλλιεργούνται υπό διαφορετικές συνθήκες. Για ευκολότερη αναφορά, η αρίθμηση των γραμμών διατηρείται συνεπής με την αρίθμηση στην προηγούμενη δημοσίευσή μας [12].

Η κυτταρική γραμμή #1 από την προηγούμενη δημοσίευση δεν συμπεριλήφθηκε στην παρούσα μελέτη και επομένως αυτός ο αριθμός δεν χρησιμοποιείται. Αντίθετα, οποιαδήποτε αναφορά σε κελιά BHK-2P που δεν αναφέρει τους αριθμούς γραμμής #2, #4 ή #5 είναι στην κύριαεναιώρημακυτταρική γραμμή BHK21C13-2P (ECACC84111301) που παρουσιάστηκε στην αρχή αυτής της ενότητας.

Οι προσκολλημένες κυτταρικές σειρές ωοθηκών κινέζικου χάμστερ (Cricetulus griseus) (CHO) CHO-K1 (ATCCCCL-61, που φυλάσσονται ως CCLV-RIE 134) και CHO677 (CRL 2244, κατέχονται ως CCLV-RIE 1524) καθώς και IB-RS Χρησιμοποιήθηκαν -2 κύτταρα (Instituto Biolog'gico-Rim Suı´no-2, που φυλάσσονται ως CCLV-RIE 103) και νεφρικά κύτταρα βοοειδών Madin-Darby (εν συντομία: MDBK, που φυλάσσεται ως CCLV-RIE261) ως μάρτυρες σε πειράματα κυτταρομετρίας ροής.

Οι συνθήκες καλλιέργειας ήταν 37 ˚C, 5 τοις εκατό CO2 και γιαεναιώρημακύτταρα 320 rpm σε βιοαντιδραστήρες TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Ελβετία) σε σχετική υγρασία 80 τοις εκατό. Όλες οι προσκολλημένες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Minimum Essential Medium Eagle (MEM) συμπληρωμένο με άλατα Hanks και Earle (Sigma-Aldrich) με 10 τοις εκατό FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές εναιωρήματος προσαρμόστηκαν για να αναπτυχθούν σε μέσο Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) εκτός από την κυτταρική γραμμή #2, η οποία καλλιεργήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

Οι μετρήσεις της κυτταρικής πυκνότητας και βιωσιμότητας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μπλε τρυπανίου (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και έναν αυτόματο μετρητή κυττάρων (μοντέλο TC20, Bio-Rad).

2.2 Ανάλυση καμπύλης ανάπτυξης κυττάρων αιωρήματος

Οι αναλύσεις της καμπύλης ανάπτυξης διεξήχθησαν ως πειράματα παρτίδας, που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν, δύο φορές ξεχωριστά, με πυκνότητα σποράς 0,6×106 κύτταρα/mL. Η πυκνότητα βιώσιμων κυττάρων (VCD) και η βιωσιμότητα σε ποσοστό μετρήθηκαν καθημερινά έως και έξι ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων.

Οι ειδικοί για το κύτταρο υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εξισώσεις που δίνονται από το [14]:

X: VCD (ανά mL); t: χρονικά σημεία δειγματοληψίας (ώρα). n και n-1: δύο διαδοχικά σημεία δειγματοληψίας.

Αριθμός κυτταρικής διαίρεσης (cd):

2.3 Κυτταρομετρία ροής

Οι κυτταρομετρικές αναλύσεις ροής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το όργανο κυτταρομετρίας ροής FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με βάση τα μοτίβα διασποράς προς τα εμπρός και τα πλάγια. Για τη χρώση με ακτίνη, μετρήθηκε απευθείας η διάμεση ένταση φθορισμού στο κανάλι Alexa 488. Για όλες τις κηλίδες αντισωμάτων, το ποσοστό των κυττάρων Alexa 488 ή θετικών σε ΡΕ προσδιορίστηκε με μια πύλη διαστήματος της οποίας το κατώτερο όριο ορίστηκε με βάση έναν έλεγχο ισοτύπου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

2.3.1 Χρώση αντισωμάτων υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας.

επιφάνεια. Τα κύτταρα MDBK χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος για την έκφραση του v 3, τα κύτταρα IB-RS-2 χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος για την έκφραση του v 8 και τα κύτταρα CHO-K1 χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος για την έκφραση του HS . Τα κύτταρα CHO677 δεν εκφράζουν καμία από τις ιντεγκρίνες που δοκιμάστηκαν ούτε HS και επομένως χρησίμευσαν ως αρνητικός έλεγχος σε όλα τα πειράματα. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: για το ν 3, συζευγμένος με ΡΕ κλώνος LM609 (αραίωση 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); για το v 8, πρωτογενές αντίσωμα 11E8, κλώνος 68, IgG2a ποντικιού (αραίωση 1:100) (παραχωρείται ευγενικά από τον Dr. StephenNishimura) με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG2a (αραίωση 1:1000) συζευγμένο με Alexa Fluor 488Ther ) για HS, κλώνος 10E4, IgM ποντικιού (αραίωση 1:200) (Amsbio, Abingdon, UK) με δευτερεύουσα αλυσίδα αντισωμάτων κατσίκας αντι-ποντικού IgM mu (αραίωση 1:2000) συζευγμένη με Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Camb) . Μόνο ένα πρωτεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε κάθε πείραμα.

Τα κύτταρα του εναιωρήματος πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα προσκολλημένα κύτταρα αποσπάστηκαν χρησιμοποιώντας 10 mM EDTA σε PBS και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS. Μετά το πλύσιμο, τα κύτταρα διηθήθηκαν μέσω ενός φίλτρου κυττάρων (νάιλον πλέγμα, 70 μm διάμετρος πόρων, VWR, Radnor, ΗΠΑ) για να αφαιρεθούν οι κυτταρικές μάζες και ρυθμίστηκαν σε 1×106 κύτταρα/mL πριν από 1 μL LIVE/ Η χρώση νεκρών κυττάρων DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) προστέθηκε σε εναιώρημα κυττάρων 1 mL για 30 λεπτά. Αυτό το βήμα και όλα τα επόμενα βήματα πραγματοποιήθηκαν προστατευμένα από το φως και στους 4 ˚C. Το πρωτογενές αντίσωμα επωάστηκε για 30 λεπτά και το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε για 20-30 λεπτά. Ένα στάδιο πλύσης με 2 mL ρυθμιστικού διαλύματος FACS (PBS, 0,1 τοις εκατό αζίδιο του νατρίου, 0,1 τοις εκατό BSA) και φυγοκέντρηση στα 300 × g, 5 λεπτά, 4 ˚C πραγματοποιήθηκε μετά από όλα τα στάδια. Τέλος, τα χρωματισμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS 300 μL.

2.3.2 Χρώση ακτίνης.

Η νηματώδης ακτίνη χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Phalloidin-iFluor 488 (ab176753, Abcam), που παρασκευάστηκε σύμφωνα με το φύλλο δεδομένων. Τα κύτταρα BHK179, BHK-2P και BHK-InV αποσπάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και στερεώθηκαν με φορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και 1×106 σταθεροποιημένα κύτταρα διαπερατήθηκαν με 0,1 τοις εκατό Triton X-100 (Sigma-Aldrich) σε PBS, ακολουθούμενη από επώαση σε RT για 3 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS (φυγοκέντρηση στα 300 χ g, 5 λεπτά) προτού προστεθεί το παρασκευασμένο αποθεματικό διάλυμα φαλλοιδίνης, αραιώθηκε 1:1000 σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS και επωάστηκαν για 20 λεπτά atRT. Τέλος, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα FACS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS 300 μL. Τα χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν απευθείας με μικροσκόπιο φθορισμού και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση FACS.

2.3.3 Πειράματα επιμόλυνσης.

Κύτταρα BHK164 και BHK-2P επιμολύνθηκαν είτε με EGFP-N1, ένα πλασμίδιο που εκφράζει ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) (Clontech), είτε σε άλλη σειρά πειραμάτων με pVSV-G, ένα πλασμίδιο που εκφράζει την πρωτεΐνη G των φυσαλίδων Ιός της στοματίτιδας Indiana (VSV), χρησιμοποιώντας Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν ολίγοις, 2 ug πλασμιδικού DNA και 1,875 μL ή 3,75 μLof λιποφεκταμίνης αραιωμένα σε μέσο Cellvento™ BHK200 αναμίχθηκαν και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά για να επιτραπεί ο σχηματισμός συμπλόκου. Στη συνέχεια, αυτά τα μείγματα μεταφέρθηκαν σε κύτταρα σε{13}τρυβλία φρεατίων (περίπου 4×105 κύτταρα/mL) και το μέσο προστέθηκε μέχρι 200 ​​μL. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ˚C για 24 ώρες.

Για ανάλυση FACS, ολόκληρο το περιεχόμενο των φρεατίων συλλέχτηκε μετά από 24 ώρες. Τα επιμολυσμένα με pEGFP κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα FACS 300 μL. Ένα αντίγραφο κυττάρων επιμολυσμένων με pVSV-G διαπερατήθηκε με PBS με 0,1 τοις εκατό (ν/ν) TritonX-100 για 5 λεπτά σε RT πριν από τη χρώση με αντισώματα, ενώ το άλλο παρέμεινε μη διαπερατό. Η χρώση αντισωμάτων διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω με πολυκλωνικό ορό κουνελιού VSV 274/E (αραίωση 1:500, που παρέχεται ευγενικά από τον Dr. Stefan Finke) και δευτερεύον αντισώματα κατσίκας κατά κουνελιού (Η συν L) συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (αραίωση 1: 1000· Thermo Fisher Scientific).

2.4 Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 07.04 για Windows (GraphPad Software, La Jolla, ΗΠΑ). Η συνήθης μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης έγινε με το post-hottest του Tukey για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Το όριο για τη στατιστική σημασία ορίστηκε σε τιμή p 0,001.

2.5 Μεταγραφική ανάλυση

2.5.1 Εκχύλιση RNA, προετοιμασία βιβλιοθήκης και αλληλούχιση.

Τρεις ανεξάρτητες παρτίδες από καθεμία από τις προσκολλημένες κυτταρικές σειρές BHK179 και τις κυτταρικές σειρές εναιωρήματος BHK-2P και BHK-InV χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μεταγραφώματος. Κατά μέσο όρο, 8,3×105 κύτταρα BHK179, 1,6×107 BHK-2Pcells και 1,4×107 κύτταρα BHK-InV υποβλήθηκαν σε λύση σε αντιδραστήριο TRIzol (Thermo Fisher Scientific). Μετά από προσθήκη 0,2 όγκων τριχλωρομεθανίου στο κυτταρόλυμα, επώαση και φυγοκέντρηση, η υδατική φάση συλλέχθηκε και αναμίχθηκε με έναν όγκο 100 τοις εκατό αιθανόλης. Από αυτό, το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) με πέψη DNase επί στήλης με το σύνολο DNase χωρίς RNase (Qiagen) ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών. Το ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) προστέθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για όλα τα ακόλουθα βήματα. Στη συνέχεια, απομονώθηκε πολυαδενυλιωμένο mRNA από 1–3 ug ολικού RNA υψηλής ποιότητας χρησιμοποιώντας το κιτ Dynabeads mRNA DIRECT Micro (ThermoFisher Scientific). Το mRNA στη συνέχεια κατακερματίστηκε και χρησιμοποιήθηκε για σύνθεση cDNA και προετοιμασία βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας το TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αλληλουχία πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Heinrich-Pette, στο Αμβούργο, χρησιμοποιώντας τον εξοπλισμό NextSeq 500 (2x75 bp) και HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Στατιστική ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης.

Πραγματοποιήθηκε ποιοτικός έλεγχος των ακατέργαστων αναγνώσεων από κάθε βιβλιοθήκη αλληλουχίας χρησιμοποιώντας FastQC (έκδοση {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) με έμφαση στην κατανομή μήκους ανάγνωσης και τη μόλυνση του προσαρμογέα πριν και μετά τον προσαρμογέα περικοπή χρησιμοποιώντας Trim Galore (έκδοση 0.6.4_dev, Babraham Institute) και Cutadapt (έκδοση 2.10) [15]. Χρησιμοποιώντας το Salmon [16], οι κομμένες ακατέργαστες αναγνώσεις στη συνέχεια χαρτογραφήθηκαν σχεδόν στο γονιδίωμα του συριακού χρυσού χάμστερ.

Εν ολίγοις, οι αναφορές γονιδιώματος και μεταγραφής του GCF{{0}}.{1_MesAur1.0 ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) και συνδυάστηκαν με αλληλουχίες αναφοράς της ακίδας του ERCC στα χειριστήρια. Ένας δείκτης μεταγραφής με επίγνωση δόλωμα [17] κατασκευάστηκε για να επιτρέψει την επιλεκτική ευθυγράμμιση με τον Σολομό. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, χρησιμοποιήθηκαν δέκα αντίγραφα bootstrap και ενεργοποιήθηκε η αντιστάθμιση για συγκεκριμένες μεροληψίες ακολουθίας, προκαταλήψεις GC και πόλωση θέσης 5' ή 3'.

Στη συνέχεια, τα δεδομένα ποσοτικοποίησης για τους μάρτυρες spike-in ERCC συσχετίστηκαν με τη θεωρητική συγκέντρωσή τους, προκειμένου να εντοπιστούν προβλήματα κατά την προετοιμασία του δείγματος.

Επιπλέον, τα ειδικά για το γονίδιο δεδομένα ποσοτικοποίησης φιλτραρίστηκαν αρχικά (μόνο γονίδια που εμφανίζονται σε περισσότερα από ένα αντίγραφα με περισσότερες από 15 μετρήσεις), κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τακτοποιημένο μετασχηματισμό καταγραφής (rlog) και χρησιμοποιήθηκαν για διερευνητική ανάλυση δεδομένων, π.χ. με PCA. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια ταυτοποιήθηκαν και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μονοπατιού χρησιμοποιώντας το DESeq2 [18]. Τα δεδομένα έκφρασης αναλύθηκαν για σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μεταξύ των ζευγών κυτταρικής σειράς BHK-2P και BHK179, BHK-InV και BHK-2P και BHK-InV και BHK179. Στη συνέχεια, η προκύπτουσα δυαδική λογαριθμική (log2) αλλαγή πτυχής προσαρμόστηκε χρησιμοποιώντας τις συναρτήσεις "lfcShrink" και "apglm" στο DESeq2 προκειμένου να αντισταθμιστεί το χαμηλό ή μεταβλητό πλήθος ανάγνωσης που μπορεί να οδηγήσει σε υπερεκτίμηση της διακύμανσης [19].

Τα κριτήρια για ένα σημαντικά διαφορετικά εκφραζόμενο γονίδιο ορίστηκαν σε μια μέγιστη προσαρμοσμένη τιμή {{0}}.05 και μια ελάχιστη απόλυτη τιμή της αλλαγής του συρρικνωμένου log2 στο 1. Διαδρομή και Τα κριτήρια για ένα σημαντικά διαφορετικά εκφρασμένο γονίδιο ρυθμίστηκαν σε μια μέγιστη προσαρμοσμένη τιμή 0,05 και μια ελάχιστη απόλυτη τιμή της αλλαγής του συρρικνωμένου log2 φορές 1. Η ανάλυση διαδρομής και εμπλουτισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση "εμπλουτισμός" στο προφίλ συστάδων (έκδοση 3.16.0).

Το cistanche μπορεί να θρέψει τα νεφρά και να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

3. Αποτελέσματα

3.1 Η ευαισθησία μιας κυτταρικής σειράς για FMDV είναι ανεξάρτητη από τον ατομικό ρυθμό ανάπτυξης και τον αριθμό κυτταρικής διαίρεσης

Πειράματα παρτίδας με εννέα διαφορετικές κυτταρικές σειρές εναιωρήματος ΒΗΚ διεξήχθησαν σε περίοδο έξι ημερών και η πυκνότητα βιώσιμων κυττάρων (VCD) και η βιωσιμότητα μετρήθηκαν καθημερινά. Με βάση προηγούμενες παρατηρήσεις ότι οι κυτταρικές σειρές διέφεραν ως προς την ευαισθησία τους στον ορότυπο FMDV Ασία{{0}} [12], εξετάστηκε εάν ένας αυξημένος κυτταρικός μεταβολισμός και ρυθμός ανάπτυξης συνδέεται με μειωμένη ευαισθησία για μόλυνση με αυτό ιός (Πίνακας 1). Δύο από τις τρεις ευπαθείς κυτταρικές σειρές αιωρήματος BHK είναι αργά αναπτυσσόμενα κύτταρα με μικρούς αριθμούς κυτταρικής διαίρεσης (cd) 0,60 (#3) και 0,70 (#9), ενώ η τρίτη ευαίσθητη κυτταρική σειρά (#8) έχει τον υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης και cd (μ=0.035, cd=1.62) μεταξύ όλων των δοκιμασμένων κυτταρικών σειρών.

Η απόσυρση του ορού και η προσαρμογή στην ανάπτυξη του ACFM δεν είχαν επίδραση στην ευαισθησία στον FMDV στο σύνολο των εξεταζόμενων κυτταρικών σειρών μας. Η κυτταρική γραμμή #2 είναι ο αργά αναπτυσσόμενος, εξαρτώμενος από τον ορό πρόδρομος των κυτταρικών γραμμών BHK-2P, που διατηρείται σε εναιώρηση με GMEM με εμβρυϊκό βόειο ορό. Κατά τη διάρκεια της προσαρμογής στην ανάπτυξη σε ACFM, τα κύτταρα επιλέχθηκαν για υψηλό VCD, συνδεδεμένο με υψηλό ρυθμό ανάπτυξης και cd. Όπως η κύρια κυτταρική σειρά BHK-2P που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη, οι κυτταρικές γραμμές #4 και #5 προέρχονται επίσης από την κυτταρική σειρά #2, αλλά διαφέρουν ως προς τον τρόπο προσαρμογής στο ACFM. Όλες οι κυτταρικές σειρές BHK-2P που διατηρήθηκαν στο ACFM έδειξαν πολύ παρόμοιο προφίλ ανάπτυξης. Η ευαισθησία για τον ορότυπο FMDV Ασία-1 δεν αποκτήθηκε από καμία από αυτές τις κυτταρικές σειρές κατά τη διάρκεια της προσαρμογής στο ACFM, πιθανώς επειδή η αρχική σειρά #2 ήταν ήδη ανθεκτική. Παρομοίως, δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην ευαισθησία για την κυτταρική σειρά αιωρήματος #3. Όταν αναπτύχθηκαν με προσκόλληση (βλ. κυτταρική γραμμή #1 στο [12]), τα κύτταρα ήταν ευαίσθητα στον FMDV Asia-1 και διατήρησαν αυτό το χαρακτηριστικό κατά την προσαρμογή στην ανάπτυξη σε εναιώρημα. Ταυτόχρονα, δεν απέκτησαν το προφίλ ταχείας ανάπτυξης άλλων κυττάρων αιωρήματος.

3.2 Τα κύτταρα αιωρήματος παρουσιάζουν λιγότερους πρωτογενείς υποδοχείς αλλά περισσότερους δευτερεύοντες υποδοχείς για FMDV στην επιφάνειά τους από τα προσκολλημένα κύτταρα BHK

Το πρώτο βήμα για να μολύνει επιτυχώς ένας ιός ένα κύτταρο είναι η δέσμευση του ιικού σωματιδίου σε μόρια υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια. Για να αναλυθούν οι διαφορές μεταξύ κολλητά αναπτυσσόμενων κυττάρων ΒΗΚ και κυττάρων ΒΗΚ σε εναιώρημα, δοκιμάστηκαν αντισώματα σε κυτταρικούς υποδοχείς που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση της εξωκυτταρικής μήτρας και είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη μόλυνση από FMDV. Οι ιντεγκρίνες v 3 και v 8 εξετάστηκαν ως αντιπροσωπευτικοί κυτταρικοί υποδοχείς που αναγνωρίζουν το μοτίβο δέσμευσης RGD (Arg-Gly-Asp) και αλληλεπιδρούν με τα συστατικά του ορού και την εξωκυτταρική μήτρα, αλλά χρησιμοποιούνται επίσης από τον FMDV ως φυσικούς κύριους υποδοχείς του. Καμία από τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές αιωρήματος (BHK-InV και BHK-2P) δεν εξέφρασε ιντεγκρίνη v 3 ή v 8 στην κυτταρική επιφάνεια. Ενώ η διαφορά μεταξύ του προσκολλημένου BHK και του εναιωρήματος BHK δεν ήταν σημαντική για την ιντεγκρίνη v 8 (Σχήμα 1β), ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό του προσκολλημένου BHK179 εξέφρασε ιντεγκρίνη v 3 σε σύγκριση με τις κυτταρικές σειρές εναιωρήματος BHK-InV και BHK-2P ( Σχήμα 1α).

Υψηλές ποσότητες HS παρουσιάστηκαν στην επιφάνεια και των δύο κυτταρικών σειρών εναιωρήματος. Η έκφραση του HS ήταν πολύ αποκλίνουσα μεταξύ των επαναλαμβανόμενων καλλιεργειών των προσκολλημένων κυττάρων BHK179. Σε σύγκριση με τις κυτταρικές σειρές εναιωρήματος, λιγότερα κύτταρα στις καλλιέργειες BHK179 ήταν HS-θετικές, παρόλο που η διαφορά δεν ήταν σημαντική στο προκαθορισμένο επίπεδο σημαντικότητας (Σχήμα 2).

Η χρώση και η μικροσκοπική ανάλυση αποκάλυψαν μεγάλες διαφορές στη διάταξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης μεταξύ προσκολλημένων και αιωρούμενων κυττάρων (Εικόνα 3). Τα νημάτια ακτίνης στα προσκολλημένα κύτταρα BHK179 κατανέμονται ομοιόμορφα σε ολόκληρο το κύτταρο με ένα λεπτό δικτυωτό σχέδιο (Εικ. 3a), ενώ τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε εναιώρημα είχαν διάχυτη χρώση ακτίνης (Σχήμα 3b). Είναι ενδιαφέρον ότι η ποσότητα της νηματώδους ακτίνης ήταν διαφορετική μεταξύ των αιωρούμενων κυτταρικών σειρών BHK-InV και BHK-2P. Η διάμεση ένταση φθορισμού (MFI) μετά τη χρώση με φαλλοιδίνη ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα BHK-InV σε σύγκριση με το BHK-2P, γεγονός που υποδηλώνει υψηλότερη περιεκτικότητα σε νηματώδη ακτίνη σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 3γ).

3.3 Τα κύτταρα αιωρήματος διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης αλλά όχι ως προς την ικανότητά τους να εμφανίζουν επιφανειακές πρωτεΐνες

Λόγω των διαφορών στη διαμόρφωση της ακτίνης μεταξύ προσκολλημένων και εναιωρημένων κυττάρων, τα κύτταρα εξετάστηκαν σε σχέση με τη δυνατότητα μεταφοράς τους και την ικανότητα να παρουσιάζουν πρωτεΐνες στην επιφάνειά τους. Γενικά, η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, μετρούμενη από την έκφραση του EGFP, μειώνεται σε κύτταρα εναιωρήματος (Σχήμα 4α). Όταν χρησιμοποιείται μια χαμηλή δόση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό προσκολλημένων κυττάρων εξέφρασε EGFP σε σύγκριση με τα κύτταρα εναιωρήματος. Όταν χρησιμοποιήθηκε μια υψηλή δόση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, ένα υψηλότερο ποσοστό κυττάρων εναιωρήματος επιμολύνθηκε επιτυχώς, αν και η διαφορά μεταξύ υψηλών και χαμηλών δόσεων δεν ήταν σημαντική. Για να απαντηθεί το ερώτημα εάν τα κύτταρα εναιωρήματος εξακολουθούν να είναι ικανά να παρουσιάζουν πρωτεΐνες όπως κυτταρικούς υποδοχείς στην επιφάνειά τους, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη VSV G (Σχήμα 4b). Μία σειρά κυττάρων ήταν διαπερατή πριν από τη χρώση για να ληφθεί υπόψη η πιθανότητα ότι η πρωτεΐνη G εκφραζόταν αλλά δεν εμφανιζόταν στην κυτταρική επιφάνεια. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην ικανότητα έκφρασης και παρουσίασης της πρωτεΐνης VSV G μεταξύ προσκολλημένων και εναιωρημάτων κυττάρων, ούτε όταν χρησιμοποιείται μια χαμηλή ή υψηλή δόση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης.

3.4 Η ανάλυση μεταγραφών αποκαλύπτει διαφορές στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την εξωκυτταρική μήτρα μεταξύ των κυττάρων αιωρήματος

Πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση μεταγραφώματος για να διερευνηθούν περαιτέρω οι διαφορές μεταξύ των κολλητικώς αναπτυσσόμενων κυττάρων ΒΗΚ και των κυττάρων ΒΗΚ σε εναιώρημα και για να διευκρινιστεί γιατί τα κύτταρα εναιωρήματος διαφέρουν ως προς την ευαισθησία τους στον FMDV. Μια προσκολλημένη κυτταρική σειρά BHK (BHK179) καλλιεργημένη σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με FBS καθώς και μια ταχέως αναπτυσσόμενη κυτταρική σειρά ευαίσθητη σε FMDV (BHK-InV) και μια ταχέως αναπτυσσόμενη ανθεκτική κυτταρική σειρά (BHK-2P), και τα δύο προσαρμοσμένα στο ACFM, επιλέχθηκαν για την ανάλυση.

Μια ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) τόνισε τη στενή σχέση μεταξύ των βιολογικών αντιγράφων των μεμονωμένων κυτταρικών σειρών (Εικ. 5α). Όλα τα αντίγραφα της ίδιας κυτταρικής σειράς βρίσκονται κοντά μεταξύ τους στο διάγραμμα με ελάχιστες ενδείξεις για επιδράσεις από παρτίδα σε παρτίδα. Το πρώτο κύριο συστατικό (που αντιστοιχεί στο 81 τοις εκατό της διακύμανσης στο κανονικοποιημένο σύνολο δεδομένων) ερμηνεύτηκε ως η μεταγραφική διαφορά μεταξύ των κυττάρων που αναπτύσσονται σε εναιώρημα και των κυττάρων που αναπτύσσονται σε προσκόλληση, ενώ το δεύτερο κύριο συστατικό (15 τοις εκατό της διακύμανσης) αντιπροσώπευε τη διαφορά μεταξύ των αιωρούμενες κυτταρικές σειρές BHK-2P και BHK-InV, που πιθανώς σχετίζονται με την ευαισθησία στη μόλυνση από FMDV. Μαζί, τα δύο πρώτα κύρια στοιχεία μπόρεσαν να εξηγήσουν το 96 τοις εκατό της διακύμανσης που βρέθηκε στο σύνολο δεδομένων, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ανάλυση μεταγραφώματος εντόπισε σχετικές διαφορές μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών.

Ο μικρότερος αριθμός διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων βρέθηκε κατά τη σύγκριση του BHK-InV με το BHK-2P (590 ρυθμισμένα προς τα πάνω, 304 ρυθμισμένα προς τα κάτω). Παρόμοιοι αριθμοί παρατηρήθηκαν στη σύγκριση είτε του BHK-2P είτε του BHK-InV μεμονωμένα με το BHK179 (1527 και 1519 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω· 1308 και 943 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, αντίστοιχα) (Εικ. 5β). Όταν οι δύο κυτταρικές σειρές εναιωρήματος (BHK-InV και BHK-2P) συνδυάστηκαν και συγκρίθηκαν με την προσκολλημένη κυτταρική σειρά BHK179, 1814 γονίδια εκφράστηκαν διαφορικά. Ενώ τα 411 γονίδια εκφράζονται αποκλειστικά διαφορετικά κατά τη σύγκριση του BHK179 με το BHK-InV, σχεδόν τα διπλάσια (701 γονίδια) εκφράζονται αποκλειστικά διαφορετικά μεταξύ BHK179 και BHK-2P. Μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών εναιωρήματος, μόνο 104 γονίδια εκφράστηκαν αποκλειστικά διαφορετικά.

Κατά τη σύγκριση του συνόλου των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων των ευαίσθητων σε FMDV κυτταρικών σειρών BHK179 και BHK-InV με την ανθεκτική σε FMDV κυτταρική σειρά BHK-2P, ένα υποσύνολο 553 γονιδίων βρέθηκε να εκφράζεται διαφορετικά και στις δύο συγκρίσεις ( Εικ. 5γ). Καθώς αυτά τα γονίδια ενδέχεται να εμπλέκονται στην ευαισθησία στον FMDV, διεξήχθη μια ανάλυση εμπλουτισμού του όρου GO και αποκάλυψε ότι πολλά από αυτά τα γονίδια σχετίζονται με τα κυτταρικά συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), τις κυτταρικές μεμβράνες και τις συνδέσεις κυττάρου-κυττάρου (Εικ. 5δ) .

Δεδομένου ότι παρατηρήσαμε διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών που σχετίζονται με τις αλληλεπιδράσεις ECM, το μεταγραφικό αναλύθηκε εκ νέου με έμφαση στην έκφραση των ιντεγκρινών v 1, v 3, v 6, v 8, καθώς και της ακτίνης, όλα δυνητικά σχετικά με την ευαισθησία στη μόλυνση από FMDV (Εικ. 5ε). Με εξαίρεση το ACTA2, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την ακτίνη μεταξύ των κυττάρων BHK-InV και BHK-2P σε επίπεδο mRNA. Οι κανονικοποιημένοι αριθμοί γονιδίων για όλα τα εξεταζόμενα γονίδια που σχετίζονται με την ακτίνη ήταν σημαντικά υψηλότερες στην προσκολλημένη κυτταρική σειρά BHK179 από ότι στις κυτταρικές σειρές εναιωρήματος (Σχήμα S1).

Και οι τρεις κυτταρικές σειρές εξέφρασαν παρόμοιες ποσότητες μεταγραφών ITGAV, που κωδικοποιούσαν την υπομονάδα ιντεγκρίνης v αλλά έδειξαν διαφορική έκφραση για τις υπομονάδες ιντεγκρίνης. Αναλυτικά, οι αιωρούμενες κυτταρικές σειρές BHK-2P και BHK-InV εξέφρασαν σημαντικά λιγότερο ITGB1, ITGB3 και ITGB6 σε σύγκριση με την προσκολλημένη κυτταρική σειρά BHK179. Τα ITGB3 και ITGB8 εκφράστηκαν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ των αιωρούμενων κυτταρικών σειρών BHK-2P και BHK-InV. Είναι ενδιαφέρον ότι το ITGB8 ήταν το μόνο κωδικοποιητικό γονίδιο υπομονάδας ιντεγκρίνης που υπερεκφραζόταν σε μεγάλο βαθμό και στις ευαίσθητες σε FMDV κυτταρικές σειρές BHK179 και BHK-InV σε σύγκριση με την ανθεκτική σε FMDV κυτταρική σειρά BHK-2P (Εικ. 5e).

Το cistanche μπορεί να θρέψει τα νεφρά και να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

4. Συζήτηση

Η προσαρμογή των κυττάρων να αναπτύσσονται σε εναιώρημα και σε μέσα χωρίς ορό είναι μια χρονοβόρα και σταδιακή αλλά απαραίτητη διαδικασία στη βιοτεχνολογία για τη δημιουργία κυτταρικών σειρών υψηλής απόδοσης που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αντισωμάτων, αντιγόνων εμβολίου ή άλλων πρωτεϊνών [1, 8 ]. Πράγματι, αυτή η διαδικασία είναι πάντα γεμάτη με τον κίνδυνο τα κύτταρα να αποκτήσουν ανεπιθύμητες ιδιότητες σε σύγκριση με το αρχικό κυτταρικό υλικό [7]. Στην περίπτωση παραγωγής αντιγόνου εμβολίου, η ευαισθησία της κυτταρικής σειράς για τον ιό στόχο είναι μείζονος σημασίας. Για τον ιό του αφθώδους πυρετού (FMDV), είναι γνωστό φαινόμενο ότι ορισμένες κυτταρικές σειρές BHK είναι ανθεκτικές στη μόλυνση ή χάνουν την ευαισθησία τους κατά την επαναλαμβανόμενη υποκαλλιέργεια [20-22]. Επιπλέον, οι αντιγονικές ιδιότητες του ιού μπορεί να ποικίλλουν ανάλογα με το κύτταρο ξενιστή [9].

Τα κύτταρα αιωρήματος αναπτύσσονται ανεξάρτητα από μια επιφάνεια και καταπίνονται από θρεπτικά μέσα πλούσια σε οξυγόνο, επιτρέποντάς τους να αναπτυχθούν γρήγορα. Ο γρήγορος πολλαπλασιασμός των κυττάρων είναι ένα απαραίτητο χαρακτηριστικό για την κλιμάκωση της καλλιέργειας σε μεγάλους όγκους εύκολα και σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η αφαίρεση του ορού από το μέσο είναι απαραίτητη για τη μείωση του κόστους, του κινδύνου μόλυνσης και για την απλούστευση των διαδικασιών μείωσης της κλίμακας [23, 24].

Η ανάλυση κατά παρτίδες ανάπτυξης διαφορετικών κυτταρικών σειρών εναιωρήματος ΒΗΚ είχε σκοπό να καθορίσει εάν η επιλογή προς έναν ταχέως αναπτυσσόμενο κυτταρικό πληθυσμό σε συνθήκες χωρίς ορό είναι επιζήμια για τη διάδοση του FMDV. Στην πραγματικότητα, δύο από τις τρεις ευπαθείς κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν αργά, αλλά η ευαισθησία τους στον FMDV βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη από τον αυξητικό μεταβολισμό τους. Είναι πιο πιθανό ότι η ευαισθησία στον FMDV έχει ήδη χαθεί (ή διατηρείται) κατά την αρχική προσαρμογή στην ανάπτυξη σε αναστολή. Η αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια και η απόσυρση του ορού στα ακόλουθα στάδια προσαρμογής στην ανάπτυξη του εναιωρήματος οδηγεί σε αλλαγές στο επίπεδο έκφρασης των επιφανειακών πρωτεϊνών και των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταροσκελετό [7].

Οι ιντεγκρίνες είναι μια σημαντική οικογένεια υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας που είναι ενσωματωμένοι στην κυτταρική μεμβράνη και μεσολαβούν στη σηματοδότηση από κύτταρο σε κύτταρο καθώς και μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ του κυττάρου και της επιφάνειας μέσω της δέσμευσης συστατικών εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [10, 25 ]. Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η οργάνωση του κυτταροσκελετού και η μετατόπιση των μορίων του εκκολαπτόμενου υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη εξαρτώνται από τις ιντεγκρίνες [25]. Για πολλές ιντεγκρίνες, η δέσμευση του ECM, καθώς και η δέσμευση των προσδεμάτων που παρέχονται στα κύτταρα μέσω της προσθήκης ορού στο μέσο καλλιέργειας, διαμεσολαβείται από το μοτίβο RGD [6, 25] και είναι πιθανό να αλλάξει όταν η το κύτταρο αλλάζει από προσκολλημένη σε εναιωρημένη ανάπτυξη. Η αναγνώριση του μοτίβου RGD από τις ιντεγκρίνες χρησιμοποιείται επίσης από το FMDV για την έναρξη της ενδοκυττάρωσης του σωματιδίου του ιού που προκαλείται από υποδοχείς [26]. Το μοτίβο RGD στο VP1 του FMDV είναι εξαιρετικά διατηρημένο [27] και οι ιντεγκρίνες v 1, v 3, v 6 και v 8 είναι γνωστοί υποδοχείς που χρησιμοποιούνται από τον FMDV in vivo και in vitro [28-31]. Επειδή οι ύποπτες διαφορές στο πρωτεώμα της κυτταρικής επιφάνειας μεταξύ προσκολλημένων και αιωρούμενων κυττάρων μπορεί επίσης να είναι κρίσιμες για τις διαφορές στην ευαισθησία στη μόλυνση από FMDV, χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα που συνδέονται με την ιντεγκρίνη v 3 και v 8 για τη χρώση μιας προσκολλημένης κυτταρικής σειράς BHK καθώς και ευαίσθητη και ανθεκτική κυτταρική σειρά BHK σε εναιώρημα. Δεν πραγματοποιήθηκε χρώση v 6 επειδή έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι αυτή η ιντεγκρίνη δεν εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων BHK [32], παρόλο που το ITGB6 mRNA είναι ανιχνεύσιμο. Ομοίως, παρά το υψηλό επίπεδο έκφρασης ITGB8 mRNA που ανιχνεύθηκε στα κύτταρα BHK179 και BHK-InV, η ιντεγκρίνη v8 δεν φαίνεται να εμφανίζεται στην επιφάνεια των κυττάρων ΒΗΚ γενικά. Το Integrin v 3 βρέθηκε σε μικρό βαθμό στην προσκολλημένη κυτταρική σειρά, αλλά όχι στις κυτταρικές σειρές εναιωρήματος.

Εκτός από τις ιντεγκρίνες, η δέσμευση συνδέτη, τα συμβάντα εσωτερίκευσης και η ενδοκυτταρική σηματοδότηση μπορούν να προκληθούν από πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HS) [33] και η απόκτηση του HS ως δευτερεύοντος υποδοχέα συχνά παρατηρείται μετά από επαναλαμβανόμενη διέλευση του FMDV σε καλλιέργεια [34]. Η ειδική χρώση αντισωμάτων αποκάλυψε άφθονο HS και στις δύο κυτταρικές σειρές εναιωρήματος και σε μικρότερο βαθμό επίσης στα προσκολλημένα κύτταρα ΒΗΚ. Οι μεταλλάξεις στο γονιδίωμα του FMDV, που οδηγούν σε αλλαγές στις πρωτεΐνες του ιικού καψιδίου για να επιτρέψουν τη χρήση του HS ως υποδοχέα, είναι γνωστό ότι εξασθενούν τον ιό στον φυσικό ξενιστή [35]. Η διαθεσιμότητα του HS μπορεί επομένως να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την αλλαγή της αντιγονικότητας της ανεξαρτησίας του FMDV της κυτταρικής σειράς στην οποία έχει προσαρμοστεί ο ιός.

Επειδή η κυτταρική αποκόλληση συνδέεται με αλλαγές στον συσταλτικό μηχανισμό ακτίνης-μυοσίνης [7] και η καλλιέργεια κυττάρων σε εναιώρημα επιφέρει διαφορετικές απαιτήσεις για επιβίωση, π.χ. αντίσταση σε υψηλή διατμητική τάση λόγω ανάδευσης του υγρού καλλιέργειας [6], ο σκελετός της ακτίνης έχει μεγάλου ενδιαφέροντος σε αυτή τη μελέτη. Η μικροσκοπική ανάλυση αποκάλυψε μια διαμορφωτική αναδιάταξη του κυτταροσκελετού από μια δικτυωτή κατανομή σε προσκολλημένα αναπτυσσόμενα κύτταρα σε μια πυκνή σφαιρική δομή σε συνθήκες εναιώρησης. Αυτός μπορεί να είναι ένας μηχανισμός προσαρμογής στην προαναφερθείσα υψηλή διατμητική τάση και είναι επίσης γνωστό ότι συμβαίνει σε κύτταρα CHO στις ίδιες συνθήκες [6]. Αλλά είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση των περισσότερων γονιδίων ακτίνης μεταξύ των κυττάρων BHK-InV και BHK-2P σε επίπεδο mRNA, σημαντικά περισσότερη νηματώδης πρωτεΐνη ακτίνης ανιχνεύθηκε στο ευαίσθητο σε FMDV BHK -InV σε σχέση με το ανθεκτικό σε FMDV BHK-2P. Αυτό μπορεί να συνδέεται με διαφορετικούς ρυθμούς πολυμερισμού της σφαιρικής ακτίνης σε νηματώδη ακτίνη.

Τουλάχιστον στα προσκολλημένα κύτταρα, η είσοδος του FMDV εξαρτάται από τη δυναμική της ακτίνης. Η είσοδος του ιού προκαλεί βολάν ακτίνης και μια διακοπή του δικτύου νημάτων ακτίνης μέσω της μετατροπής της νηματώδους ακτίνης σε σφαιρική ακτίνη έχει περιγραφεί στο πρώιμο στάδιο της μόλυνσης [36-38]. Κρίνοντας από το κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα (CPE) που παρατηρείται σε προσκολλημένα κύτταρα BHK όταν μολυνθεί με FMDV, ο κυτταροσκελετός περνά από έντονες αναδιατάξεις σε πολλά από τα συστατικά του [38]. Τέτοιο CPE δεν παρατηρείται σε κύτταρα εναιωρήματος λόγω του ήδη σφαιρικού τους σχήματος, αλλά η αυξημένη περιεκτικότητα σε ακτίνη μπορεί να δώσει κάποιο πλεονέκτημα στον ιό. Λόγω των διαφορών στον κυτταροσκελετό ακτίνης, διεξήχθησαν πειράματα διαμόλυνσης για να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μεταξύ εναιωρήματος και προσκολλημένου ΒΗΚ και να προσδιοριστεί εάν ο πυκνός κυτταροσκελετός των κυττάρων εναιωρήματος εμποδίζει την παρουσίαση πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια. Είναι κοινή γνώση ότι οι αιωρούμενες κυτταρικές σειρές είναι πολύ δύσκολο να διαμολυνθούν, γεγονός που προκαλείται από τη μειωμένη σύνδεση του συμπλέγματος διαμόλυνσης στην κυτταρική μεμβράνη και στη συνέχεια τη μειωμένη πρόσληψη του ωφέλιμου φορτίου DNA [39]. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τα πειράματά μας. Όμως, παρόλο που η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης μειώθηκε στα κύτταρα BHK-2P σε σύγκριση με την προσκολλημένη κυτταρική σειρά BHK, δεν υπήρχε διαφορά στην ικανότητα εμφάνισης της επιμολυσμένης πρωτεΐνης VSV G στην κυτταρική επιφάνεια. Μια διαφορά στο ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων παρατηρήθηκε μεταξύ των πλασμιδίων έκφρασης pEGFP-N1 και pVSV-G σε κύτταρα BHK-2. Αυτό δεν διερευνήθηκε περαιτέρω, αλλά μπορεί να προκληθεί από ένα διαφορετικό όριο ανίχνευσης μεταξύ της ανοσοφθορισμού χρώσης που χρησιμοποιείται για την οπτικοποίηση του VSV-G και του έμφυτου φθορισμού του EGFP.

Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεταγραφώματος για να δώσει περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις μεταγραφικές διαφορές μεταξύ προσκολλημένων και εναιωρούμενων κυττάρων ΒΗΚ από τη μία πλευρά και μεταξύ ευαίσθητων σε FMDV και ανθεκτικών σε FMDV κυτταρικών σειρών BHK από την άλλη. Τα αποτελέσματά μας συμβαδίζουν με άλλες μελέτες μεταγραφικών αλλαγών σε κύτταρα CHO, MDCK ή HEK κατά τη μετάβαση από την ανάπτυξη προσκολλημένης σε εναιώρημα. Γενικά, οι περισσότερες αλλαγές σχετίζονται με την κυτταροσκελετική δομή, τον κυτταρικό μεταβολισμό και τις αλληλεπιδράσεις των συστατικών της ECM και ρυθμίζονται προς τα πάνω για τα κύτταρα αιωρήματος [7, 40, 41]. Παραδόξως, το ανθεκτικό σε FMDV κύτταρο αιωρήματος BHK-2P έδειξε μείωση της ρύθμισης αυτών των συνόλων γονιδίων, γεγονός που μπορεί επίσης να εξηγήσει τα μειωμένα επίπεδα ακτίνης στο BHK-2P σε σύγκριση με τα κύτταρα BHK-InV. Η ειδική ανάλυση της έκφρασης της υπομονάδας ιντεγκρίνης αποκάλυψε παρόμοια επίπεδα μεταγραφών υπομονάδας V ιντεγκρίνης και στις τρεις κυτταρικές σειρές. Η υψηλότερη έκφραση σε όλες τις κυτταρικές σειρές βρέθηκε για την υπομονάδα ιντεγκρίνης 1. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η ιντεγκρίνη 1 μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερή με δέκα διαφορετικές αλυσίδες και εκφράζεται συστατικά από τα περισσότερα κύτταρα θηλαστικών [6, 42]. Ομοίως, η υπομονάδα V είναι σε θέση να σχηματίσει ένα ετεροδιμερές με πέντε διαφορετικές αλυσίδες, αλλά οι 6 και 8 εμφανίζονται μόνο στην κυτταρική επιφάνεια σε συνδυασμό με το V [42]. Αυτό αντικατοπτρίζεται με ακρίβεια από την παρατηρούμενη αφθονία μεταγραφών των μεμονωμένων υπομονάδων ιντεγκρίνης. Η αυξημένη μεταγραφή του 3 σε προσκολλημένα κύτταρα συσχετίζεται επίσης καλά με το υψηλότερο σήμα για την ιντεγκρίνη v 3 στα πειράματα χρώσης αντισωμάτων. Από την άλλη πλευρά, οι παρατηρούμενες διαφορές στα επίπεδα mRNA ITGB3 και ITGB8 μεταξύ BHK-2P και BHK-InV δεν αντικατοπτρίστηκαν στην επιφανειακή χρώση. Δεν μπορέσαμε να λύσουμε εάν αυτό οφειλόταν απλώς σε ανόμοια ευαισθησία μεταξύ των μεθόδων ποσοτικοποίησης του mRNA και της πρωτεΐνης ή ενδεικτικό ενός μετα-μεταγραφικού μπλοκ έκφρασης πρωτεΐνης ή επιφανειακής παρουσίασης [43]. Συνολικά, οι αιωρούμενες κυτταρικές σειρές BHK-2P και BHK-InV εξέφρασαν σημαντικά λιγότερο mRNA ITGB1, ITGB3 και ITGB6 σε σύγκριση με την προσκολλημένη κυτταρική σειρά.

5. ΣυμπεράσματαΣε

Συμπερασματικά, είναι κρίσιμης σημασίας για την προετοιμασία των κυττάρων αιωρήματος να χρησιμοποιηθεί ένας γονικός κυτταρικός κλώνος με γνωστά χαρακτηριστικά και να ελέγχεται προσεκτικά ο προκύπτων κυτταρικός πληθυσμός κατά τη διαδικασία προσαρμογής για να διασφαλιστεί ότι η κυτταρική σειρά διατηρεί βασικά χαρακτηριστικά, σε αυτήν την περίπτωση , την ευαισθησία στον FMDV. Επιπλέον, θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σύγχρονες μέθοδοι όπως η ανάλυση FACS και η μεταγραφική για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των κυτταρικών σειρών παραγωγής.

Το cistanche μπορεί να θρέψει τα νεφρά και να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Patrick Zitzow για την εξαιρετική τεχνική υποστήριξή του.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Εννοιολόγηση:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Επίσημη ανάλυση:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Απόκτηση χρηματοδότησης:Aline Zimmer, Martin Beer.

Ερευνα:Βερόνικα Ντιλ.

Μεθοδολογία:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Διαχείριση έργου:Martin Beer.Πηγές: Aline Zimmer.

Εποπτεία:Michael Eschbaumer.

Οραματισμός:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Συγγραφή – πρωτότυπο προσχέδιο:Βερόνικα Ντιλ.

Συγγραφή – κριτική και επιμέλεια:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Merten OW. Πρόοδοι στην κυτταροκαλλιέργεια: εξάρτηση από αγκυροβόληση. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Ανασυνδυασμένες θεραπευτικές πρωτεΐνες: πλατφόρμες παραγωγής και προκλήσεις. Biotechnol J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Ανάπτυξη και συντήρηση κυττάρων νεφρού μωρού χάμστερ (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; Κεφάλαιο 4:Παράρτημα 4Η. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Προσαρμογή κυττάρων ΒΗΚ που παράγουν μια ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σε μέσα χωρίς ορό και σε μέσο χωρίς πρωτεΐνη. Κυτταροτεχνολογία. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Προσαρμογή κυττάρων BHK-21 στην ανάπτυξη σε καλλιέργεια αναδευτήρα και επακόλουθη πρόκληση από τον ιό της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Σημασία της αλληλεπίδρασης μεταξύ ιντεγκρίνης και κυτταροσκελετού ακτίνης στην προσαρμογή σε εναιώρημα των κυττάρων CHO. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Υ, Scharfenberg Κ, Rapp Ε, Reichl U. Παρακολούθηση αλλαγών στο πρωτεόμιο κατά τη σταδιακή προσαρμογή μιας κυτταρικής σειράς MDCK από την προσκόλληση στην ανάπτυξη σε εναιώρημα. Εμβόλιο. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin Ν, Henriques Μ, Oliveira R, et al. Ο αντίκτυπος της προσαρμογής των κυττάρων σε συνθήκες χωρίς ορό στο προφίλ γλυκοζυλίωσης ενός μονοκλωνικού αντισώματος που παράγεται από κύτταρα ωοθηκών κινέζικου χάμστερ. Ν Biotechnol. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID: 23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Επιλογή κυττάρων ξενιστών αντιγονικών παραλλαγών του ιού του αφθώδους πυρετού. J Gen Virol. 1989; 70 (Σημ. 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Αλληλεπιδράσεις ιντεγρίνης-ακτίνης. Cell ΜοΙ Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt Β. Ανάλυση έκφρασης υποδοχέα ιντεγκρίνης ιού αφθώδους πυρετού σε ιστούς από αφελή και μολυσμένα βοοειδή. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Adaption of FMDV Asia-1 to Suspension Culture: Cell Resistance is Overcome by Virus Capsid Alterations. Ιούς. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Μετασχηματισμός πολυώματος κυτταρικών κλώνων χάμστερ — μια έρευνα γενετικών παραγόντων που επηρεάζουν την κυτταρική ικανότητα. Ιολογία. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden Τ, Kallel Η. Μια διεργασία καλλιέργειας κυττάρων μικροφορέα για τον πολλαπλασιασμό του ιού της λύσσας σε κύτταρα Vero που αναπτύσσονται σε έναν αναδευόμενο βιοαντιδραστήρα υπό συνθήκες πλήρως απαλλαγμένες από ζώα. Εμβόλιο. 2007; 25(19):3879–89.

15. Ο Martin M. Cutadapt αφαιρεί τις ακολουθίες προσαρμογέων από τις αναγνώσεις ακολουθίας υψηλής απόδοσης. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon παρέχει γρήγορη και με επίγνωση μεροληψίας ποσοτικοποίηση της έκφρασης μεταγραφής. Μέθοδοι Nat. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava Α, Malik L, Sarkar Η, Zakeri Μ, Almodaresi F, Soneson C, et al. Η μεθοδολογία ευθυγράμμισης και χαρτογράφησης επηρεάζουν την εκτίμηση της αφθονίας των μεταγραφών. Genome Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Μετριασμένη εκτίμηση της αλλαγής πτυχής και της διασποράς για δεδομένα RNA-seq με DESeq2. Genome Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Προηγούμενες διανομές βαριάς ουράς για δεδομένα μέτρησης ακολουθίας: αφαίρεση του θορύβου και διατήρηση μεγάλων διαφορών. Βιοπληροφορική. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Παραλλαγή στην ευαισθησία των πληθυσμών BHK και των κλωνοποιημένων κυτταρικών γραμμών σε τρία στελέχη του ιού του αφθώδους πυρετού. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.