Εμβόλιο αδενοϊού που περιέχει περικομμένο SARS-CoV-2 υπομονάδα Spike Protein S1 οδηγεί σε μια ειδική ανοσολογική απόκριση σε ποντίκια

Abstract:Η ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού και ασφαλούς εμβολίου για τη νόσο του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) είναι μια κρίσιμη προσέγγιση για τη διαχείριση της πανδημίας της σοβαρής οξείας αναπνευστικής νόσου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) υπό το φως των τρεχουσών συνθηκών. Σε αυτήν τη μελέτη, δημιουργήσαμε ένα συντομευμένο τμήμα του βελτιστοποιημένου γονιδίου ακίδας SARS-CoV-2 (2043 bp, που ονομάζεται S1) που ήταν σε θέση να κωδικοποιήσει μια περικομμένη πρωτεΐνη S1. Η πρωτεΐνη δοκιμάστηκε για να προσδιοριστεί εάν θα μπορούσε να προκαλέσει αποτελεσματική ανοσοποίηση σε ποντίκια κατά του SARS-CoV-2. Η παρουσία της πρωτεΐνης S1 επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό και στύπωμα Western. Ένα εμβόλιο αδενοϊού που φέρει το θραύσμα γονιδίου S1 (Ad-S1) χορηγήθηκε ενδομυϊκά σε ποντικούς τέσσερις φορές σε διάστημα 4 εβδομάδων. Η χυμική ανοσία της πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S1 αποδείχθηκε σε όλα τα ανοσοποιημένα ποντίκια. Ο ορός από ανοσοποιημένα ποντίκια έδειξε εξαιρετική αντι-μολυσματική δράση in vitro. Μια ισχυρή χυμική ανοσολογική απόκριση κατά του SARS-CoV-2 παρατηρήθηκε στα ποντίκια μετά τον εμβολιασμό με το Ad-S1, υποδηλώνοντας ότι το εμβόλιο αδενοϊού μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη εμβολίων κατά του SARS-CoV-2 και άλλων γενετικά διακριτών ιούς.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Λέξεις-κλειδιά: SARS-CoV-2; εμβόλια; αδενοϊικός φορέας; Γονίδιο S1; ασυλία, ανοσία

1. Εισαγωγή

Η νόσος του κορωνοϊού 2019 (COVID-19) συνδέεται συχνά με ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων και υψηλά ποσοστά θνησιμότητας [1] και αποτελεί σημαντική απειλή για τη δημόσια ασφάλεια παγκοσμίως. Από τις 15 Ιουλίου 2022, η πανδημία του COVID-19 παρέμεινε παγκοσμίως, με 557.917.904 επιβεβαιωμένα κρούσματα, συμπεριλαμβανομένων 6.358.899 θανάτων, που αναφέρθηκαν στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ). Επιπλέον, συνολικά 12.130.881.147 δόσεις εμβολίου έχουν χορηγηθεί έως τις 11 Ιουλίου 2022. Ως εκ τούτου, ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη εμβολίων για νέους κορωνοϊού (nCoV) είναι μεγάλης σημασίας και μία από τις κορυφαίες προτεραιότητες στον κόσμο για την υγεία. Η πρωτεΐνη S είναι ένας βασικός παράγοντας για την είσοδο του SARS-CoV-2 της σοβαρής οξείας αναπνευστικής νόσου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) στα κύτταρα ξενιστές [2,3]. Η πρωτεΐνη συνδέεται με τον υποδοχέα ξενιστή και επιτρέπει στον ιό να εισέλθει ομαλά στο κύτταρο ξενιστή [4]. Οι Ν-συνδεδεμένες γλυκάνες προεξέχουν από την επιφάνεια του τριμερούς και διακοσμούν εκτενώς την πρωτεΐνη S, επηρεάζοντας την αναδίπλωση της πρωτεΐνης S, τη χυμική ανοσία και την επεξεργασία της πρωτεάσης του κυττάρου ξενιστή [5]. Η πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S έχει χαμηλότερη πυκνότητα Ν-συνδεδεμένης γλυκάνης από άλλες πρωτεΐνες S που προκαλούνται από τον άνθρωπο παθογόνους κοροναϊούς [6]. Ως εκ τούτου, η πρωτεΐνη S μπορεί να είναι υψηλά ανοσογονική και είναι κύριος στόχος εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Η πρωτεΐνη S έχει τρεις δομικούς τομείς, μεταξύ των οποίων η περιοχή S1 είναι το πιο σημαντικό επιφανειακό αντιγόνο πρωτεΐνης S [4]. Λόγω της δυσκολίας παραγωγής μεγάλων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (η εξωκυτταρική περιοχή της πρωτεΐνης S είναι περίπου 1300 αμινοξέα) και του κινδύνου εξαρτώμενης από αντισώματα ενίσχυσης (ADE) της μόλυνσης, το S1 (περίπου 700 αμινοξέα) και η περιοχή δέσμευσης του υποδοχέα του (RBD, περίπου 200 αμινοξέα) θεωρούνται ευρέως ως οι πιο ελκυστικοί πιθανοί στόχοι για ένα εμβόλιο κατά του κορωνοϊού [7,8]. Ο ορότυπος 5 του ανθρώπινου αδενοϊού (HAdV-C5) χρησιμοποιείται ευρέως στη βασική ιολογία ως φορέας γονιδιακής θεραπείας και χορήγησης εμβολίου [9]. Το HAdV-C5 έχει φυσική ποικιλομορφία και μπορεί να παρασιτώσει τους περισσότερους ξενιστές, γεγονός που αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη πειραμάτων σε ζώα. Οι φορείς ανασυνδυασμένου αδενοϊού με ελαττώματα αντιγραφής και αντιγραφής που κατασκευάστηκαν από HAdV-C5 έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στη χορήγηση εμβολίων και στη γονιδιακή θεραπεία [9,10]. Επί του παρόντος, οι αδενοϊοί έχουν εγκριθεί ως εμβόλια κατά των οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων και έχουν γίνει πολλές δοκιμές τέτοιων εμβολίων, όπως για την ελονοσία και τον HIV-1 [9]. Σε αυτό το έγγραφο, περιγράφουμε ένα εμβόλιο φορέα αδενοϊού με ανεπαρκή αντιγραφή του SARS-CoV-2 και την προετοιμασία και την εφαρμογή του. Σε αυτή τη μελέτη, το εμβόλιο αδενοϊού κατασκευάστηκε ως εξής: ο φορέας ήταν ο ανθρώπινος αδενοϊός HAdV-C5 με ελαττωματική αναπαραγωγή με διαγραφή Ε1 και Ε3, το πλασμίδιο του σκελετού ήταν ανασυνδυασμένος αδενοϊός με pBHGlox∆E1,3Cre, η κυτταρική σειρά συσκευασίας ήταν κύτταρα HEK293. και το γονίδιο στόχος ήταν το περικομμένο γονίδιο πρωτεΐνης S1 του SARS-CoV-2. Η έκφραση της πρωτεΐνης S1 στο εμβόλιο ταυτοποιήθηκε με δοκιμές στυπώματος Western και ανοσοφθορισμού. Για να προσδιοριστεί η ποιότητα των ανοσολογικών αποκρίσεων που προκαλούνται από τα υποψήφια εμβόλια που βασίζονται σε ακίδα, η απόκριση αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό εξετάστηκε λεπτομερώς. Το ανοσοποιητικό όφελος του εμβολίου αξιολογήθηκε με δοκιμή αντισωμάτων δέσμευσης (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία [ELISA]) και δοκιμή αντισωμάτων εξουδετέρωσης. Τα ευρήματά μας παρέχουν τη βάση για την ανάπτυξη και την αξιολόγηση εμβολίων και θεραπειών για τον COVID-19 που βασίζονται στην πρωτεΐνη S1.

2. Υλικά και Μέθοδος

2.1. Κύτταρα και Ζώα

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές νεφρού πιθήκου HEK293 και Vero E6. Και οι δύο κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 2% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη στους 37 ◦C με 5% CO2 και κορεσμένη υγρασία. Είκοσι θηλυκά ποντίκια C57BL/6 (6–8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων Zhejiang, στην επαρχία Zhejiang. Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες με 10 ποντίκια σε κάθε ομάδα. Η μία ομάδα ανοσοποιήθηκε (100 μL ενδοπεριτοναϊκή ένεση) με φορέα Ad5 που εκφράζει την πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV{-2 (Ad5-S) και η άλλη με PBS (100 μL ενδοπεριτοναϊκή ένεση) ως έλεγχο. Η συνολική ποσότητα του ιού ήταν 5 x 109 VP Όλα τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με D0/D14 ενδομυϊκή ένεση [11,12]. Στο D14, λήφθηκε περιφερικό αίμα 100 μL, ο ορός διαχωρίστηκε και η δεύτερη ένεση δόθηκε δύο ώρες μετά τη συλλογή αίματος. Στο D28, συλλέχθηκε αίμα με οπισθοτροχιακή παρακέντηση και ο ορός διαχωρίστηκε. Τα δεσμευτικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν 3 ημέρες μετά από κάθε συλλογή αίματος, τα εξουδετερωτικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν 7 ημέρες μετά από κάθε συλλογή αίματος και οι κυτοκίνες ανιχνεύθηκαν 7 ημέρες μετά τη δεύτερη συλλογή αίματος. Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία. όλες οι δοκιμές διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις «Οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας» και εγκρίθηκαν από το Συμβούλιο Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Zhejiang Shuren.

2.2. Εμβόλια

Όλα τα στελέχη SARS-CoV-2 που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη συλλέχθηκαν από ασθενείς με COVID-19 με συναίνεση. Το State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease ανέπτυξε ένα εμβόλιο αδενοϊού (Vero cell, στέλεχος WuHan, αριθμός GISAID: EPI_ISL_415711) κατά του SARS-CoV-2 και στη συνέχεια το Το εμβόλιο κατασκευάστηκε σε περιβάλλον συμβατό με το επίπεδο βιοασφάλειας (BSL). Η προδιαγραφή του εμβολίου είναι 0,5 mL/δόση και περιέχει Tris, NaCl, ζαχαροκάλαμο, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, απόλυτη αιθανόλη και την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S1.

2.3. Κατασκευή ανασυνδυασμένου αδενοϊού

Η αλληλουχία πρωτεΐνης SARS-CoV-2 S1 (αρ. QRU91950.1) ελήφθη από την PubMed. Σύμφωνα με τον εκφυλισμό του γονιδίου, η βελτιστοποιημένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων κωδικονίου κατάλληλη για έκφραση κυττάρων θηλαστικών σχεδιάστηκε με βάση την προϋπόθεση ότι η αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης προϊόντος που κωδικοποιείται από την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S1 παρέμεινε αμετάβλητη. Το συνολικό μήκος ήταν 2043 bp. Η αλληλουχία προδρόμου 50 συντέθηκε με ενεργοποιητή ιστικού πλασμινογόνου (tPA) και η αλληλουχία που κωδικοποιεί SARS-CoV-2 S1 αμινοξύ 2–688 και η αλληλουχία πρόδρομου tPA απολινώθηκαν. Μια αλληλουχία Kozak και μια θέση περιορισμού SpeI προστέθηκαν μπροστά από το κωδικόνιο έναρξης και η θέση περιορισμού XbaI προστέθηκε μετά το κωδικόνιο τερματισμού. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των παραπάνω γονιδίων συντέθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε pUC18 από τη Sangon Biotech για να ληφθεί το κλωνοποιημένο πλασμίδιο του συνθετικού γονιδίου. Η συντιθέμενη αλληλουχία γονιδίου S1 και ο φορέας pDC316 υπέστησαν πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού SpeI και XbaI. Το θραύσμα στόχος και ο φορέας ανακτήθηκαν από το πήκτωμα και συνδέθηκαν για να σχηματίσουν ένα πλασμίδιο παλίνδρομου. Το πλασμίδιο του SARS-CoV-2 συσκευάστηκε με το πλασμίδιο σκελετού του συστήματος αδενοϊού AdMax pBHGloxd∆E1 και 3Cre με συνεπιμόλυνση κυττάρων HEK293. Το διάλυμα πρωτογενούς ιού λήφθηκε μετά από επαναλαμβανόμενη ψύξη-απόψυξη και φυγοκέντρηση, και ο ιός ενισχύθηκε και καλλιεργήθηκε μετά τον καθαρισμό της πλάκας.

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Προσδιορισμός Τίτλου Αδενοϊού

Κύτταρα HEK293 σε καλή υγεία επιλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν για να παρασκευαστεί ένα εναιώρημα κυττάρων 5.{2}} × 105 κυττάρων/mL, το οποίο σπάρθηκε σε ένα τρυβλίο 24-πηγαδιού (1 mL/φρεάτιο). ) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ◦C σε περιβάλλον 5% CO2. Το δείγμα αραιώθηκε σειριακά δεκαπλάσια και ένα αραιωμένο δείγμα (0.1 mL) από 10-5 έως 10-8 κύτταρα εμβολιάστηκε σε μια πλάκα 24-πηγαδιού . Στη συνέχεια, οι πλάκες εκτέθηκαν σε μόλυνση στους 37 ◦C με 5% CO2 για 48 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας αφαιρέθηκε, προστέθηκε προψυγμένη μεθανόλη (0,5 mL) και τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν στους -20 ◦C για 20 λεπτά. Μετά τη στερέωση, τα δείγματα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και μπλοκαρίστηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA, 0,2 mL) στους 37 ◦C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα πρωτογενή (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) και τα δευτερεύοντα (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) αντισώματα προστέθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα, κατά τη διάρκεια των οποίων χρησιμοποιήθηκε για πλύσιμο. Μετά την επώαση, προστέθηκε ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα εργασίας (0,2 mL) και επωάστηκε για 5-10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το διάλυμα εργασίας απορρίφθηκε, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και PBS (1 mL) προστέθηκε ξανά. Υπολογίστηκε ο μέσος αριθμός θετικών κυττάρων στο μικροσκοπικό πεδίο (κατ. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), όπου επιλέχθηκε μια κλίση με 5–50 θετικά κύτταρα στο οπτικό πεδίο και τουλάχιστον πέντε περιοχές επιλέχθηκαν τυχαία για μέτρηση . Υπολογίστηκε ο αριθμός των οπτικών πεδίων σε κάθε φρεάτιο της 24-πλάκας φρεατίου. Στη συνέχεια, ο τίτλος του ιού υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο Τύπο (1):

2.5. PCR σε πραγματικό χρόνο

Για να ανιχνεύσουμε την έκφραση mRNA κυττάρων HEK293 μετά από ιογενή μόλυνση, εξάγαμε το ενδιάμεσο RNA σύμφωνα με τις οδηγίες λειτουργίας του TRIZol (Invitrogen, Waltham, MA, ΗΠΑ). Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας TRIzol και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase I χωρίς RQ1 RNase (Promega, Madison, WI, USA) για την εξάλειψη του υπολειμματικού DNA. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) ελήφθη με αντίστροφη μεταγραφή του εκχυλισθέντος RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίων PrimerScript™ RT με κιτ γόμας gDNA (Takara, Kusatsu, Ιαπωνία). Θραύσματα DNA δημιουργήθηκαν με τους συγκεκριμένους εκκινητές Ρ1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) και Ρ2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​του γονιδίου στόχου (S1). Το γονίδιο ενισχύθηκε με τους εκκινητές P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) και P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) ως εσωτερικό μάρτυρα (GAPHD).

2.6. Western Blot

Το κυτταρόλυμα και το υπερκείμενο διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Τα στυπώματα οπτικοποιήθηκαν με εξοπλισμό απεικόνισης στυπώματος Western (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Εν συντομία, οι μεμβράνες μεταφέρθηκαν σε TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0.2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) με ξηρό γάλα σε σκόνη 5% χωρίς λιπαρά και ανακινείται σε σέικερ αποχρωματισμού σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι μεμβράνες της πειραματικής ομάδας και της ομάδας ελέγχου αφαιρέθηκαν από το διάλυμα σφράγισης και επωάστηκαν με το πρωτεύον αντίσωμα: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, κατ. #40591- T62, Sino Biological, Πεκίνο, Κίνα)] σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα ανακινήθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε αναδευτήρα αποχρωματισμού στους 4°C. Το στύπωμα ξεπλύθηκε με διάλυμα TBST και επωάστηκε για 2 ώρες με το δευτερεύον αντίσωμα [ανοσοσφαιρίνη G κατσίκας κατά κουνελιού (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, κατ. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Μετά το ξέπλυμα, οι κηλίδες επωάστηκαν για 1 λεπτό με ένα κιτ διαλύματος LumiBest ECL Substrate (κατ. #4AW011-100, 4A Biotech) και στη συνέχεια παρατηρήθηκαν σε συσκευή απεικόνισης.

2.7. Δοκιμασία ανοσοφθορισμού

Κύτταρα HEK293 (3 × 106/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίου. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό που περιείχε το γονίδιο S1 (Ad-S1). Μετά από 48 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS που περιείχε 2% BSA και σταθεροποιήθηκαν για 15 λεπτά με μεθανόλη που είχε προψυχθεί για 15 λεπτά στους -20 ◦C. Μετά από τρεις πλύσεις με 2% BSA σε PBS, τα κύτταρα διαπερατήθηκαν με 0,5% Triton X-100 για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 2 mL 2% BSA, το διάλυμα αποκλεισμού απορρίφθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Στη συνέχεια, 2 mL πρωτογενούς αντισώματος [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, κατ. #40591-T62, Sino Biological)] προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα ή 4 ◦C όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, το δείγμα ξεπλύθηκε τρεις φορές με 2% BSA για 5 λεπτά ανά έκπλυση. Στη συνέχεια, 2 mL δευτερεύοντος αντισώματος [κατσίκας αντι-κουνελιού IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, κατ. #550037, ZenBio)] προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με 2% BSA για 5 λεπτά ανά έκπλυση. 40, διάλυμα6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, κατ. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αντέδρασε για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Η ανάλυση παρατηρήθηκε με ένα σύστημα απεικόνισης EVOS™ M7000 (κατ. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Η πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S (1 μg/mL) επικαλύφθηκε όλη τη νύχτα σε 96-πλάκες φρεατίου (100 μL/φρεάτιο) με 0. 0Ρυθμιστικό διάλυμα διττανθρακικών 5 M. Μετά από πλύση με PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, προσθέστε νερό σε 1000 mL) πέντε φορές, προστέθηκε δεσμευτικό διάλυμα και επωάστηκε στους 37 ◦C για 1 ώρα. Το δείγμα ορού αραιώθηκε και προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο (100 μL/φρεάτιο). Μετά από 1 ώρα επώαση στους 37 ◦C, τα δείγματα πλύθηκαν με PBST πέντε φορές. Το πρωτεύον αντίσωμα [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, κατ. #40591-T62, Sino Biological)] προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα, στη συνέχεια τα δείγματα πλύθηκαν πέντε φορές με PBST, ακολουθούμενη από 1 ώρα επώαση στους 37 ◦C με συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας δευτερεύον αντίσωμα [κατσίκας αντι-κουνελιού IgG H&L (HRP) (1:10.000, κατ. #ab6721, abcam)] και πέντε πλένεται με PBST. Μετά την προσθήκη 3, 30, 5 και 50-τετραμεθυλ διφαινυλ ανυδρίτη για 5 λεπτά, η αντίδραση σταμάτησε με 2 Μ θειικό οξύ. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450 nm και 630 nm με ένα όργανο σήμανσης ενζύμου (Molecular Devices, SpectraMax 190) και στη συνέχεια προσαρμόστηκε σε μια τυπική καμπύλη.

Οφέλη από το σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

2.9. Προσδιορισμός Κυτοκίνης 

Η πλάκα (κατ. #T-k15048D-1, MSD) πλύθηκε τρεις φορές με 150 μL/ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και ένα παρασκευασμένο δείγμα 50 μL προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Στη συνέχεια, η πλάκα σφραγίστηκε με μια κολλητική πλάκα σφράγιση και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση για 2 ώρες. Στη συνέχεια, η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 150 μL/φρεάτιο και 25 μL διαλύματος αντισώματος ανίχνευσης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα σφραγίστηκε ξανά και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση για 2 ώρες. Στη συνέχεια, η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές με τουλάχιστον 150 μL/φρεάτιο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Προστέθηκαν 150 μL 2× ρυθμιστικού διαλύματος ανάγνωσης Τ (MSD) σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα αναλύθηκε σε ένα όργανο MSD.

2.10. Εξουδετερωτικό αντίσωμα

2.10.1. Δοκιμασία Εξουδετέρωσης Ψευδοϊού

Η δραστηριότητα εξουδετέρωσης ορού ποντικού δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα ψευδοϊικό σύστημα ιού φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV). Ο ορός απενεργοποιήθηκε σε λουτρό νερού για {{{0}},5 ώρες στους 56 ◦C και στη συνέχεια αραιώθηκε σειριακά στο απαιτούμενο εύρος. Τα κύτταρα HEK293 επιστρώθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού. Ο αραιωμένος ορός αναμίχθηκε με 200 CCID50 (η δόση του ιού που μπορεί να μολύνει το 50% της κυτταρικής καλλιέργειας)/100 μL του εναιωρήματος του ιού σε αναλογία 1:1 και τοποθετήθηκε σε επωαστήρα CO2 (37 ± 1 ◦C) για 2 h. Στη συνέχεια, 100 μL διαλύματος συντήρησης ιού που περιείχε 0,5% διπλό αντίσωμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και το εξουδετερωμένο μίγμα εμβολιάστηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού που περιείχε κύτταρα στα 100 μL ανά φρεάτιο, με δύο επαναλαμβανόμενα φρεάτια για κάθε αραίωση. Ταυτόχρονα, ορίστηκε ένας φυσιολογικός έλεγχος κυττάρων και τα κύτταρα επωάστηκαν σε επωαστήρα CO2 (37 ± 1 ◦C) για 96 ώρες. Στη συνέχεια, 200 CCID50/100 µL διαλύματος ιού αραιώθηκαν σε 10-1~10-3. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας στην πλάκα 96-πηγαδιού απορρίφθηκε, 150 μL του διαλύματος συντήρησης του ιού προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η αραίωση του διαλύματος του ιού εμβολιάστηκε σε συγκέντρωση 10-1~{33} } σε φρεάτια της 96-πλάκας φρεατίου (50 µL ανά φρεάτιο). Κάθε αραίωση επαναλήφθηκε σε 8 φρεάτια. ρυθμίστηκε ταυτόχρονα ένας φυσιολογικός έλεγχος κυττάρων, ακολουθούμενος από καλλιέργεια για 96 ώρες. Οι αλλαγές στο κυτταρικό CPE παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Ο φυσιολογικός κυτταρικός έλεγχος δεν πρέπει να έχει κυτταροπαθητικές αλλαγές και ο θετικός έλεγχος θα πρέπει να έχει αλλαγές CPE. Τα τελικά σημεία εξουδετέρωσης (αραιώσεις ορού που μετατράπηκαν σε λογάριθμους) υπολογίστηκαν με την παρατήρηση του CPE. Το οροαρνητικό/θετικό κριτήριο ήταν 1:12 ως θετικό/αρνητικό κριτήριο,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Δοκιμασία Ζωντανής Εξουδετέρωσης

Η δραστηριότητα εξουδετέρωσης ορού ποντικού αξιολογήθηκε με μια ζωντανή δοκιμή εξουδετέρωσης. Ο αραιωμένος ορός αναμίχθηκε με SARS-CoV-2 και επωάστηκε στους 37 ◦C για 1 ώρα. Το μίγμα προστέθηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού για να μολύνει τα κύτταρα Vero Ε6. Μετά από 72-h επώαση στους 37 ◦C, το κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα του ιού (CPE) παρατηρήθηκε υπό μεγέθυνση ×40 και υπολογίστηκε ο τίτλος εξουδετέρωσης (η αμοιβαία αραίωση ορού 50% που απαιτείται για την εξουδετέρωση της μόλυνσης από τον ιό). Οι παραπάνω διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όλες σε περιβάλλον βιοασφάλειας επιπέδου 3.

2.11. Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με t-test δύο δειγμάτων χρησιμοποιώντας το SPSS 26. Οι τιμές p Μικρότερες ή ίσες με 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Η κεντρική τάση μετρήθηκε με τον γεωμετρικό μέσο τίτλο (GMT).

3. Αποτελέσματα

3.1. Κατασκευή ανασυνδυασμένου αδενοϊού

Ελήφθη το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο παλίνδρομου αδενοϊού pAdeno-CMV-S1 με σωστή εισαγωγή. Το διάγραμμα δομής του φαίνεται στο Σχήμα 1. Ο ανασυνδυασμένος αδενοϊός περιείχε το γονιδίωμα HAdV-C5 χωρίς την περιοχή Ε1/Ε3. Ένα σχηματικό διάγραμμα του φορέα ανασυνδυασμένου αδενοϊού που λήφθηκε από τη διαμόλυνση πλασμιδίου παλίνδρομου και πλασμιδίου κυτταροσκελετού σε κύτταρα ΗΕΚ293 φαίνεται στο Σχήμα 1.

3.2. Χαρακτηρισμός Ανασυνδυασμένου Αδενοϊού

Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που περιέχει το γονίδιο στόχο ταυτοποιήθηκε με PCR (βλέπε Εικόνα 2Α για αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης γέλης). Αυτό ήταν ένα επαναλαμβανόμενο πείραμα. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag και S1-R acaataagtagggactgggtc και η αλληλουχία επιβεβαίωσε ότι η αλληλουχία ήταν σύμφωνη με το σχέδιο. Η έκφραση του SARS-CoV-2 S1 στα κύτταρα ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western (Εικόνα 2Β) και έμμεσο ανοσοφθορισμό (Εικόνα 2C). Ο χρωματισμός της ζώνης (~75 kDa) ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western και ήταν συνεπής με την αναμενόμενη θέση της ζώνης. Σε μεταγραφικό επίπεδο, η in vitro έκφραση του S1 ανιχνεύθηκε με PT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του S1 mRNA σε κύτταρα ΗΕΚ-293 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη στην ομάδα ελέγχου.

Εικόνα 1. Κατασκευή εμβολίου ανασυνδυασμένου αδενοϊού και πειραματική στρατηγική. (Α) Το pAdeno-CMV-S1 είναι ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο παλίνδρομου αδενοϊού που περιέχει το γονίδιο στόχο S1. Το pBHGlox∆E1,3Cre είναι το πλασμίδιο του σκελετού του αδενοϊού. Τα pBHGlox∆E1,3Cre και pAdeno-CMV-S1 εκχυλίστηκαν με κιτ εκχύλισης πλασμιδίου QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Πεκίνο, Κίνα). Μία ημέρα πριν από τη διαμόλυνση, κύτταρα ΗΕΚ293 διαβιβάστηκαν σε φιάλη κυτταροκαλλιέργειας 25 cm2. Το μέσο καλλιέργειας ήταν DMEM που περιείχε 5% FBS χωρίς αντιβιοτικά. Τη δεύτερη ημέρα, επιλέχθηκαν το 60-80% των κυττάρων και το διάλυμα επιμόλυνσης προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από 7 ημέρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα αποξέστηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα κύτταρα αναζωογονήθηκαν με PBS. Τα κύτταρα καταψύχθηκαν-απόψυξαν επανειλημμένα στους -80 ◦C και 37 ◦C. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο περιείχε το διάλυμα πρωτογενούς ιού. Το ανασυνδυασμένο στέλεχος αδενοϊού καθαρίστηκε, ενισχύθηκε και ελήφθη μετά από περαιτέρω επεξεργασία και ονομάστηκε Ad-S1. Το εμβόλιο εγχύθηκε ενδομυϊκά στα ποντίκια για μελέτες παρακολούθησης. (Β) Η απεικονιζόμενη χρονική κλίμακα ανοσοποίησης και λήψης αίματος.

3.3. Τίτλος αδενοϊού

Σε αυτό το πείραμα, υπολογίστηκε κατά μέσο όρο έξι θετικά κύτταρα σε πέντε μικροσκοπικά πεδία και ο ιός στο φρεάτιο αραιώθηκε 108 φορές. Με βάση τον τύπο που περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδος, ο τίτλος του αδενοϊού ήταν 4,74 × 1011 μονάδες σχηματισμού πλάκας (pfu)/mL (Εικόνα 2D).

3.4. Κυτταρική ανοσία μετά τον εμβολιασμό

Κατά τη διάρκεια της δοκιμαστικής περιόδου, υπήρξαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές στις κυτοκίνες ορού (p Λιγότερο ή ίσο με 0.05), οι οποίες έδειξαν κυρίως ότι η συγκέντρωση του χημειοελκυστικού κερατινοκυττάρου/ρυθμιζόμενης από την ανθρώπινη ανάπτυξη ογκογονιδίου (KC/GRO) ήταν μειώθηκαν και οι συγκεντρώσεις IFN- , IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } και TNF- αυξήθηκαν, ενώ η συγκέντρωση της IL-6 δεν άλλαξε σημαντικά (Εικόνα 3).

Εικόνα 2. Ταυτοποίηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 και προσδιορισμός του τίτλου του αδενοϊού. (Α) Ανίχνευση PCR του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου με το γονίδιο στόχο S1. (Β) Ανίχνευση Western blot του SARS-CoV-2. Τα κύτταρα HEK293 εκθετικής ανάπτυξης μολύνθηκαν με SARS-CoV-2 για 48 ώρες, στη συνέχεια η κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε και διαχωρίστηκε με SDS-PAGE. Η έκφραση του SARS-CoV-2 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western με IgG κατσίκας κατά κουνελιού. (Γ) Μικροσκοπία ανοσοφθορισμού κυττάρων ΗΕΚ-293 που έχουν μολυνθεί με Ad-S1 (πράσινο). Τα κύτταρα αντιχρωματίστηκαν με 40, 6-διαμιδινο- 2-φαινυλινδόλη (DAPI) για να κηλιδωθούν οι πυρήνες. Μπάρα κλίμακας 1000 μm. (Δ) Για τη μέτρηση χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία πλάκας. Μικρογραφίες που απεικονίζουν την αραίωση 10-5, 10-6, 10-7 και 10-8 (από αριστερά προς τα δεξιά).

Σχήμα 3. Το Ad-S1 επήγαγε αλλοιωμένα επίπεδα πλάσματος κυτοκινών τύπου 1/2, ιντερφερονών τύπου 1 και άλλων κυτοκινών. Τα αποτελέσματα ανιχνεύθηκαν με λήψη αίματος από τα ποντίκια 7 ημέρες μετά την πρώτη ανοσοποίηση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως γραφήματα διασποράς κουτιού και μουστάκι. Κάθε κύκλος αντιπροσωπεύει ένα μεμονωμένο άτομο. Οι τιμές p υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα t-test δύο δειγμάτων.

3.5. Ανίχνευση αντισωμάτων κατά του SARS-CoV-2 S1 μετά την ανοσοποίηση

Η ELISA αποκάλυψε ότι υπήρχαν ειδικά αντισώματα για τον SARS-CoV-2- στα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με το πρώτο και το δεύτερο Ad-S1, αλλά όχι σε εκείνα στα οποία έγινε ένεση με το καψίδιο αδενοϊού ελέγχου ή το διάλυμα PBS (Ad/PBS) (Εικόνα 4Α). Τίτλοι IgG 1:210 και 1:212 ανιχνεύθηκαν στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με Ad-S{10}}δύο εβδομάδες μετά την πρώτη και τη δεύτερη ανοσοποίηση, αντίστοιχα. Ο τίτλος αραίωσης στις 28 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (D28, GMT 2297.4) ήταν 6.{17}}φορές υψηλότερος από αυτόν στο D14 (GMT 378.9).

Σχήμα 4. Το Ad-S1 προκάλεσε υψηλούς τίτλους αντισωμάτων (Α) και δραστηριότητα εξουδετέρωσης (Β, C) σε ποντικούς. (Α) ELISA του SARS-CoV-2-ειδικού IgG ορού από ποντίκια που έχουν ανοσοποιηθεί με Ad-S1-. (Β) Ανάλυση των δραστηριοτήτων ψευδοϊού του ορού από τα ανοσοποιημένα ποντίκια Ad-S1-. (Γ) Ανάλυση των δραστηριοτήτων εξουδετέρωσης του ορού από τα ανοσοποιημένα ποντίκια Ad-S{10}

3.6. Δοκιμασία εξουδετέρωσης αντισωμάτων

Η πρόκληση SARS-CoV-2 των κυττάρων Vero E6 επέτρεψε την ανίχνευση εξουδετερωτικής δραστηριότητας στον ανοσοποιημένο ορό ποντικού (Εικόνα 4Β, Γ). Οι τίτλοι εξουδετέρωσης D14 και D28 των κυττάρων Ad-S1-ανοσοποιημένων Vero E6 έναντι πρόκλησης ζωντανού ιού SARS-CoV{{10}} in vitro ήταν 1:24,3 και 1:26,3, αντίστοιχα. Η δοκιμασία ψευδοϊού έδωσε παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα της δοκιμασίας ζωντανού ιού, με τίτλους εξουδετέρωσης έως 1:28,1 και 1:29,6 σε D14 και D28, αντίστοιχα. Ο τίτλος εξουδετέρωσης ψευδοϊού D28 (GMT 769.0) ήταν 2.{29}} φορές υψηλότερος από αυτόν του D14 (GMT 283.7).

4. Συζήτηση

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 έως<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Σε αυτήν τη μελέτη, κατασκευάσαμε ένα εμβόλιο ανασυνδυασμένου αδενοϊού SARS-CoV-2 που περιέχει την υπομονάδα SARS-CoV-2 S1 και το χαρακτηρίσαμε Ad-S1. Όπως και το CanSinoBIO, το οποίο έχει εγκριθεί για κυκλοφορία [28], χρησιμοποιήσαμε το HAdV-C5 σε αυτό το εμβόλιο. Ο αδενοϊός χρησιμοποιείται ευρέως στην ανασυνδυασμένη γονιδιακή θεραπεία και ως φορέας εμβολίου. Ωστόσο, το οροθετικό ποσοστό του HAdV-C5 είναι τόσο υψηλό όσο 75-80% στον φυσιολογικό πληθυσμό [29]. Αυτό σημαίνει ότι η ανοσία πριν από την αποθήκευση έναντι των φορέων HAdV-C5 μειώνει σημαντικά την επαγόμενη από το εμβόλιο ανοσία. Αναπτύχθηκε στο Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης στο Ηνωμένο Βασίλειο, το ChAdOx1 nCoV-19 χρησιμοποιεί φορέα αδενοϊού χιμπατζή που, αντίθετα, έχει χαμηλότερο οροθετικό ποσοστό στους ανθρώπους και όταν είναι θετικός, συνήθως παρουσιάζει χαμηλότερο τίτλο αντισωμάτων ορού [30] . Επομένως, φορείς αδενοϊού που μπορούν να αποφύγουν την προϋπάρχουσα ανοσία μπορούν να διερευνηθούν για να ενισχυθεί η προστατευτική αποτελεσματικότητα του εμβολίου αδενοϊού. Στην παρούσα μελέτη, η κατάσταση ορού των ποντικών πριν και μετά την ανοσοποίηση προσδιορίστηκε με ELISA και δοκιμές εξουδετέρωσης και έδωσε στοιχεία χυμικής ανοσίας για τα υποψήφια εμβόλια. Ο ορός που παρήχθη μετά από ενδομυϊκή ένεση του εμβολίου σε ποντίκια προστάτευσε αποτελεσματικά τα κύτταρα Vero E6 από τη μόλυνση από SARS-CoV-2 in vitro (Εικόνα 4). Ανιχνεύσαμε επίσης μια ισχυρότερη ανοσολογική απόκριση και καλύτερη προστασία στα ποντίκια μετά από μια δεύτερη ανοσοποίηση (Εικόνα 4). Τα πειραματικά μας αποτελέσματα είναι παρόμοια με τα κύρια πειραματικά αποτελέσματα.

Καθώς η έρευνα για το SARS-CoV-2 συνεχίζεται, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η καταιγίδα κυτοκινών που οφείλεται στη μόλυνση από SARS-CoV-2 μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή Τ-κυττάρων, καθιστώντας δύσκολο για τους ασθενείς να διατηρήσουν τη μακροπρόθεσμη ανοσία σε SARS-CoV-2 [31]. Επομένως, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί εάν το Ad-S1 μπορεί να προκαλέσει ανοσία που προκαλείται από Τ-κύτταρα σε ποντικούς. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις IFN- και IL-12 αυξήθηκαν και οι συγκεντρώσεις IL-4 μειώθηκαν στην ομάδα Ad-S1, υποδεικνύοντας ότι η επιβίωση και η ανάπτυξη των κυττάρων Th1 προκάλεσε το εμβόλιο στα ποντίκια. Η έκκριση IL-12, IL-10 και TNF- από τα κύτταρα Th1 αυξήθηκε ελαφρώς στην πειραματική ομάδα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Ad-S1 προκάλεσε αποτελεσματικά μια προκατειλημμένη Th1-απόκριση Τ-κυττάρων στα ποντίκια [32]. Η αυξημένη IL-5 έδειξε ότι τα κύτταρα Th2 συμμετέχουν επίσης στην ανοσοαπόκριση και παράγουν ορισμένα αποτελέσματα. Η συγκέντρωση KC/GRO στην πειραματική ομάδα μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου PBS, η οποία μπορεί να οφειλόταν στη μειωμένη χημειοταξία των ουδετερόφιλων που κατέστειλε τη φλεγμονώδη απόκριση και επέτρεψε τον ελαφρό έλεγχο των παρενεργειών του εμβολίου. Αυτό θα ήταν πιο ωφέλιμο για άτομα με ανοσοκαταστολή, όπως οι ηλικιωμένοι ή οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία. Li Μ., et αϊ. [29] ανέπτυξε ένα εμβόλιο αδενοϊού χρησιμοποιώντας το Ad68 ως φορέα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η in vivo εξουδετερωτική δραστηριότητα του SARS-CoV-2 μπορούσε να ανιχνευθεί εντός δύο εβδομάδων μετά την ενδομυϊκή ανοσοποίηση των ποντικών BALB/c και στη συνέχεια συνέχισε να αυξάνεται και ο τίτλος αντισωμάτων εξουδετέρωσης (PRNT ID50) έφτασε το 957,3 στις οκτώ εβδομάδες. Εν τω μεταξύ, στη μελέτη των Liu J., et al. [33], αναπτύχθηκαν εμβόλια που χρησιμοποιούν AdC6 και AdC68 ως φορείς. Τόσο οι αποκρίσεις δεσμευτικού όσο και εξουδετερωτικού αντισώματος μετά την ανοσοποίηση δημιουργήθηκαν 14 ημέρες μετά τη δόση, με τίτλο IgG 7108 (γεωμετρικός μέσος τίτλος, GMT· AdC6) και 5489 (GMT, AdC68). Ο τίτλος εξουδετέρωσης 50 (NT50) της δοκιμασίας εξουδετέρωσης ψευδοϊού ήταν 125 (GMT, AdC6) και 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Στην παρούσα μελέτη, τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με Ad-S1 είχαν τίτλους IgG 1:1010 και 1:122 που ανιχνεύθηκαν με ELISA δύο εβδομάδες μετά την πρώτη και τη δεύτερη ανοσοποίηση, αντίστοιχα. Ο τίτλος αραίωσης του ad-s1 ήταν 378,9 (GMT) στις 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό και 2297,4 (GMT) στις 28 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Στη δοκιμή αντισωμάτων εξουδετέρωσης, κύτταρα Vero E6 που ανοσοποιήθηκαν με Ad-S1 έδειξαν εξουδετέρωση 1:24,3 και 1:26,3 στα D14 και D28 έναντι πρόκλησης ζωντανού ιού SARS-CoV-2 in vitro, αντίστοιχα. Οι τίτλοι εξουδετέρωσης του ψευδοϊού στα D14 και D28 ήταν 283,7 (GMT) και 769,0 (GMT), αντίστοιχα. Έτσι, το εμβόλιο σε αυτή τη μελέτη ήταν πιο αποτελεσματικό όσον αφορά την ανοσολογική απόκριση στο μοντέλο ποντικού.

Λόγω του περιορισμού των πειραματικών συνθηκών, δεν πραγματοποιήσαμε ανάλυση ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής κηλίδας (ELISpot) των ανοσοκυττάρων της σπλήνας των πειραματικών ποντικών. Επιπλέον, τα πειράματα προστασίας από επίθεση του SARS-CoV-2 σε ποντίκια δεν ήταν δυνατό να πραγματοποιηθούν λόγω των περιορισμών του εργαστηρίου φυσικής προστασίας. Ωστόσο, προσδιορίσαμε ότι το εμβόλιο είχε υψηλή αποτελεσματικότητα σε μοντέλα ποντικών και μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ιδανικό εφεδρικό στέλεχος εμβολίου. Επιπλέον, η ανοσογονικότητα, η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα των υποψήφιων υποψηφίων εμβολίων SARS-CoV-2 θα πρέπει να εξετάζονται σε πρόσθετα ζωικά μοντέλα (π.χ. κουνέλια, πρωτεύοντα θηλαστικά, ρακούν, σκύλοι), καθώς τα μοντέλα ποντικιών ενδέχεται να μην αντιγράφουν πλήρως την ανθρώπινη ανοσολογική χαρακτηριστικά.

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

5. Συμπεράσματα

Τα δεδομένα που ελήφθησαν από τις προκλινικές μελέτες μας για το εμβόλιο του αδενοϊού έδειξαν ότι το εμβόλιο έχει επαρκή ασφάλεια και αποτελεσματικότητα. Επομένως, μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο και εφικτό προφυλακτικό εμβόλιο κατά της λοίμωξης SARS-CoV-2.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Τρουγάκος, Ι.Π. Σταματελόπουλος, Κ.; Τέρπος, Ε.; Τσιτσιλώνης, Ο.Ε. Αϊβαλιώτη, Ε.; Παρασκευής, Δ.; Καστρίτης, Ε.; Παυλάκης, Γ.Ν. Δημόπουλος, MA Insights για τον κύκλο ζωής του SARS-CoV-2, την παθοφυσιολογία και τις εξορθολογισμένες θεραπείες που στοχεύουν στις κλινικές επιπλοκές του COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gene of the month: Η νέα πρωτεΐνη ακίδας του κορωνοϊού 2019-nCoV/SARS-CoV-2. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, Μ.; Jeong, Β.; Paidi, RK; Pahan, K. Παλινδρόμηση του καρκίνου του πνεύμονα σε ποντίκια από ενδορινική χορήγηση του SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, Ρ.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, η πανδημία του κορωνοϊού: Μοριακές και δομικές γνώσεις. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, Α.; Naujokat, C. Δομικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης ακίδας του κορωνοϊού SARS-CoV{{2}: Στόχοι για εμβολιασμό. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Walls, AC; Tortorici, MA; Frenz, Β.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glycan κάλυψη και κάλυψη επιτόπου μιας πρωτεΐνης ακίδας κορωνοϊού που παρατηρήθηκε με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία. Nat. Struct. ΜοΙ. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Υ.; Wang, L.; Cao, Η.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 είναι ανώτερο από το RBD ως αντιγόνο εμβολίου υπομονάδας COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Θεοχαρίδης, TC; Conti, P. Έχετε υπόψη σας την πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2: Υπάρχουν περισσότερα από όσα φαίνονται. J. Biol. Κανονικός. Homeost. Πράκτορες 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, Χ.; Deng, Υ.; Chen, Η.; Lan, J.; Wang, W.; Ζου, Χ.; Hung, Τ.; Lu, Ζ.; Tan, W. Συστημική και βλεννογονική ανοσία σε ποντίκια που προκλήθηκε από μία μόνο ανοσοποίηση με εμβόλια που βασίζονται σε ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 5 ή 41 που φέρουν την πρωτεΐνη ακίδας του κορωνοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου Μέσης Ανατολής. Immunology 2015, 145, 476-484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, Κ.; Bunz, Ο.; Ehrhardt, Α. Σύγχρονη διανυσματολογία ανθρώπινου αδενοϊού για θεραπευτικές προσεγγίσεις. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, Κ.; Tu, XY; Liu, Μ.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια των εμβολίων COVID-19: Μια συστηματική ανασκόπηση. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, Μ.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, Β.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του εμβολίου ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) κατά του SARS-CoV-2: Μια ενδιάμεση ανάλυση τεσσάρων τυχαιοποιημένων ελεγχόμενων δοκιμών στη Βραζιλία, τη Νότια Αφρική και το Ηνωμένο Βασίλειο. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Υ.; Fang, Ζ.; Zhang, Η.; Zhang, Υ.; Chen, K. Ανάλυση της προστατευτικής αποτελεσματικότητας των εγκεκριμένων εμβολίων COVID-19 κατά των διάφορων μεταλλαγμένων. Εμπρός. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, Μ.; Güner, HR; Azap, Α.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια ενός αδρανοποιημένου εμβολίου SARS-CoV-2 ολόκληρου του ιού (CoronaVac): Ενδιάμεσα αποτελέσματα μιας διπλής τυφλής, τυχαιοποιημένης, ελεγχόμενης με εικονικό φάρμακο, δοκιμής φάσης 3 στην Τουρκία. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Υ.; Wang, Υ.; Wang, Η.; Yang, Υ.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, Μ.; Lou, Z. Ασφάλεια και ανοσογονικότητα ενός αδρανοποιημένου εμβολίου SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: Μια τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο, δοκιμή φάσης 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Υ.; Dai, L.; Wang, J.; He, Ρ.; Li, C.; Fang, Χ.; Wang, C.; Zhao, Χ.; Huang, Ε.; et al. Ασφάλεια και ανοσογονικότητα ενός ανασυνδυασμένου διαδοχικού επαναλαμβανόμενου εμβολίου διμερικής υπομονάδας πρωτεΐνης με βάση το RBD (ZF2001) κατά του COVID-19 σε ενήλικες: Δύο τυχαιοποιημένες, διπλά τυφλές, ελεγχόμενες με εικονικό φάρμακο, δοκιμές φάσης 1 και 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Το Mallapaty, S. Το εμβόλιο DNA της Ινδίας κατά του COVID είναι μια παγκόσμια πρώτη θέση - έρχονται κι άλλα. Nature 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, Α.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, Α.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Στόχοι των αντιδράσεων των Τ κυττάρων στον κορωνοϊό SARS-CoV-2 σε ανθρώπους με νόσο COVID-19 και σε άτομα που δεν έχουν εκτεθεί. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Υ.; Su, Β.; Guo, Χ.; Sun, W.; Deng, Υ.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, Χ.; Zheng, Υ.; Geng, C.; et al. Ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα κατά του SARS-CoV-2 Αναγνωρίστηκαν με Μονοκυτταρική Αλληλουχία Υψηλής Απόδοσης Κυττάρων Β Ασθενών σε Ανάρρωση. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. Immunity 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Υ.; Bi, Υ.; Xiao, Η.; Yao, Υ.; Liu, Χ.; Hu, Ζ.; Duan, J.; Yang, Υ.; Li, Ζ.; Li, Υ.; et al. Ένα νέο σκεύασμα εμβολίου συνδυασμού DNA και πρωτεϊνών κατά του COVID-19 παρέχει πλήρη προστασία έναντι του SARS-CoV-2 στους μακάκους ρέζους. Emerg. Μικρόβια μολύνουν. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; He, Y.; Zhou, Υ.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Η πρωτεΐνη ακίδας του SARS-CoV–ένας στόχος για ανάπτυξη εμβολίου και θεραπευτικής. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, Η.; Xie, Τ.; Long, R.; Li, Η.; Yang, Τ.; Yan, Μ.; Xie, Z. Ν-τελικά κολοβωμένη πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου του SARS-CoV-2 ως καλύτερος ορολογικός δείκτης από την πρωτεΐνη πλήρους νουκλεοκαψιδίου στην αξιολόγηση της ανοσογονικότητας του απενεργοποιημένου SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Το εμβόλιο SARS-CoV-2 mRNA-1273 προκαλεί περισσότερη εξουδετέρωση εστιασμένη στην RBD αλλά με ευρύτερη δέσμευση αντισωμάτων εντός της RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, Κ.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Η αξιολόγηση των κυτταρικών και ορολογικών αποκρίσεων στην οξεία λοίμωξη SARS-CoV-2 καταδεικνύει τη λειτουργική σημασία του τομέα δέσμευσης υποδοχέα. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. He, Y.; Zhou, Υ.; Liu, S.; Kou, Ζ.; Li, W.; Farzan, Μ.; Jiang, S. Τομέας δέσμευσης υποδοχέα της πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV επάγει εξαιρετικά ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα: Επίπτωση για την ανάπτυξη εμβολίου υπομονάδας. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324, 773-781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, Η.; Chen, Ρ.; Li, Υ.; Li, Ζ.; Fan, S.; Wu, Κ.; Li, Χ.; Chen, W.; Qin, Υ.; et al. Ανάπτυξη και εφαρμογή εμβολίου για ιούς φορείς κατά τη διάρκεια της πανδημίας COVID-19. Microorganisms 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, Τ.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Ανοσογονικότητα και ασφάλεια ενός εμβολίου-5-ανασυνδυασμένου τύπου αδενοϊού με φορέα COVID{-19 σε υγιείς ενήλικες ηλικίας 18 ετών και άνω: Μια τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο, φάση 2 δοκιμή. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, Μ.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, Η.; Shi, Χ.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, Η.; Wang, Ρ.; et al. Η ανοσοποίηση μιας δόσης με εμβόλιο βασισμένο σε αδενοϊό χιμπατζήδων προκαλεί παρατεταμένη και προστατευτική ανοσία κατά της λοίμωξης SARS-CoV-2. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, Μ.; Zhou, D. Ανάπτυξη νέων φορέων εμβολίων: αδενοϊικοί φορείς χιμπατζήδων. Βουητό. Εμβόλια Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, Ν.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, Η.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, Α.; Λευτέρη, Κ.; Osborn, Μ.; Bals, J.; et al. Απώλεια Bcl-6-Έκφραση βοηθητικών κυττάρων T ωοθυλακίων και βλαστικών κέντρων στον COVID-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, ΜΗ; Taubner, Α.; Άλμπρεχτ, Ι.; Λεπενιές, Ι.; Richter, Α.; Kamradt, Τ.; Radbruch, Α.; Το Chang, το HD IFN- και το IL-12 συνεργάζονται για να μετατρέψουν το in vivo παραγόμενο Th17 σε κύτταρα Th1/Th17. Ευρώ. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, Κ.; Xing, Μ.; Zhuo, Υ.; Guo, J.; Du, Μ.; Wang, Q.; Οποιος.; Li, J.; Gao, Ρ.; et al. Οι ετερόλογοι εμβολιασμοί πρωταρχικής ενίσχυσης με φορείς αδενοϊών χιμπατζήδων προκαλούν ισχυρή και προστατευτική ανοσία έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]