Ένα διαγονιδιακό μοντέλο αποκαλύπτει τον ρόλο του Klotho στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και ανοίγει τον δρόμο για νέα θεραπεία με βάση το Klotho

Παρακαλώ πατήστεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Απλή περίληψη:Στόχος μας ήταν να μελετήσουμε το ρόλο της αντιγηραντικής πρωτεΐνης klotho και της εκκρινόμενης ισομορφής της, στο Ηνωμένο Βασίλειο, στον καρκίνο του παγκρέατος. Τρία in vivo μοντέλα, συμπεριλαμβανομένου ενός νέου γενετικού μοντέλου ποντικιού και αναλύσεων βιοπληροφορικής, υπέδειξαν το klotho ως κατασταλτικό όγκου στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου και αποκάλυψαν ένα μοναδικό πρότυπο υπερμεθυλίωσης klotho DNA σε όγκους του παγκρέατος. Αυτά τα αποτελέσματα έχουν σημαντική προγνωστική αξία και υποδηλώνουν περαιτέρω ότι μπορεί να χρησιμεύσει ως θεραπευτικός παράγοντας για το αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Περίληψη: Το Klotho είναι μια αντιγηραντική διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία μπορεί να αποβληθεί και μπορεί να λειτουργήσει ως ορμόνη. Τα συσσωρευμένα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το klotho είναι ένας κατασταλτικός όγκος σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών και προσδιορίζουν τον υποτομέα KL1 ως την ενεργό περιοχή της πρωτεΐνης για αυτή τη δραστηριότητα. Στόχος μας ήταν να μελετήσουμε τον ρόλο του klotho ως ογκοκατασταλτικό στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου (PDAC). Οι αναλύσεις βιοπληροφορικής των συνόλων δεδομένων The Cancer Genome Atlas (TCGA) αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης ασθενών με PDAC, των επιπέδων έκφρασης klotho και της μεθυλίωσης του DNA και κατέδειξαν ένα μοναδικό πρότυπο υπερμεθυλίωσης του klotho σε όγκους του παγκρέατος. Τα in vivo αποτελέσματα του klotho και του KL1 εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας τρία μοντέλα ποντικών. Χρησιμοποιώντας ένα νέο γενετικό μοντέλο, που συνδυάζει το knockdown του παγκρεατικού klotho με μια μετάλλαξη στο Kras, η έλλειψη klotho συνέβαλε στη δημιουργία PDAC και στη μείωση της επιβίωσης του ποντικού. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, η χορήγηση ιικών σωματιδίων που φέρουν ουρανό, μια ισομορφή ματισμένης κλοθο που περιέχει την περιοχή KL1, ανέστειλε τους όγκους του παγκρέατος.αγοράστε κιστανάκιΤέλος, η θεραπεία με διαλυτό ουρανό παρέτεινε την επιβίωση του Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Ποντίκια Trp53R172H/ plus (KPC), ένα μοντέλο που είναι γνωστό ότι ανακεφαλαιώνει το ανθρώπινο PDAC.βιοφλαβονοειδή,Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη παρέχει στοιχεία ότι το klotho είναι ένας κατασταλτικός όγκος στο PDAC. Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης klotho και μεθυλίωσης DNA θα μπορούσαν να έχουν προγνωστική αξία σε ασθενείς με PDAC και ότι η χορήγηση εξωγενούς sKL μπορεί να χρησιμεύσει ως μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία της PDAC.

Λέξεις-κλειδιά:klotho; KL1; sKL; ογκοκατασταλτικό? καρκίνος στο πάγκρεας; PDAC

1. Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι από τους πιο επιθετικούς καρκίνους, με 5-ετήσιο ποσοστό επιβίωσης 9 τοις εκατό . Η επίπτωση και η θνησιμότητα αυξάνονται, με 60.430 νέα κρούσματα και 48.220 θανάτους να αναμένονται το 2021 μόνο στις ΗΠΑ[1]. Το αδενοκαρκίνωμα του παγκρεατικού πόρου (PDAC) αντιπροσωπεύει το 85-90 τοις εκατό όλων των κακοήθων παγκρεατικών νεοπλασμάτων. Τα τρέχοντα μοντέλα υποδεικνύουν την ανάπτυξή του από καλοήθη παγκρεατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanlN)1-3 σε διηθητικό καρκίνωμα, μαζί με την απόκτηση γενετικών μεταλλάξεων. Η ενεργοποίηση του Kras θεωρείται το πρώτο βήμα προς την κακοήθεια [2] και σε μοντέλα ποντικών, οδηγεί στην ανάπτυξη του PanIN κατά 9 μήνες [3]. Αν και η εμφανής PDAC σε αυτά τα ποντίκια είναι σπάνια, στο μοντέλο KPC, που συνδυάζει τη μετάλλαξη Kras με την απώλεια του ογκοκατασταλτικού p53 [4], η PDAC αναπτύσσεται συνήθως σε ηλικία 3-6 μηνών [5].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Το Klotho (εδώ χρησιμοποιείται ως klotho) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι που εμπλέκεται στη ρύθμιση της γήρανσης [6]. Στα ποντίκια, η έλλειψη klotho οδηγεί σε ένα σύνδρομο που μοιάζει με επιταχυνόμενη γήρανση, ενώ η υπερέκφραση klotho παρατείνει τη διάρκεια ζωής [7,8]. Η εξωκυτταρική περιοχή klotho αποτελείται από δύο ομόλογες περιοχές, τις KL1 και KL2, οι οποίες μπορούν να αποκοπούν από τη μεμβράνη και να λειτουργήσουν ως κυκλοφορούσες ορμόνες [9-11]. Εκκρίνεται μια δεύτερη, διαφορικά ματισμένη κλοθο ισομορφή (Ηνωμένο Βασίλειο). Ο ουρανός είναι πανομοιότυπος με τον KL1, συν 15 επιπλέον αμινοξέα στο C-άκρο. Έχουν περιγραφεί διαφορετικές δραστηριότητες του klotho, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης της σηματοδότησης του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF)23 [12,13], της ρύθμισης του διαύλου ασβεστίου υποοικογένειας V (TRPV) 5 καναλιού δυνητικού υποδοχέα παροδικού υποδοχέα [14,15] και της αναστολής τα μονοπάτια της ινσουλίνης και του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF)-1 [8,16,17].

Το Klotho εκφράζεται κυρίως στους νεφρούς και τον εγκέφαλο, αλλά και σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του εξωκρινούς και ενδοκρινικού παγκρέατος [7,17-20]. Οι φυσιολογικές του δραστηριότητες στο πάγκρεας δεν έχουν ακόμη καθοριστεί. Ωστόσο, υπάρχουν στοιχεία για τη συμμετοχή του στη ρύθμιση της ομοιόστασης της γλυκόζης. Το Klotho προκαλεί παραγωγή και έκκριση ινσουλίνης in vitro και in vivo, μειώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε ποντίκια και εξαντλείται σε παγκρεατικές νησίδες ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2) [8,19-22]. Το Klotho είναι ένα ισχυρό ογκοκατασταλτικό σε πολυάριθμες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του γαστρεντερικού [16,17,23-30]. Αποσιωπάται επιγενετικά στον καρκίνο και τόσο το klotho όσο και ο Karl μειώνουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων in vitro και in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. Στον καρκίνο του παγκρέατος, η μείωση της klotho συσχετίζεται με την επιβίωση του ασθενούς. In vitro, το klotho μειώνει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος και αναστέλλει τις οδούς IGF-I και bFGF[17,34].

Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να αποκρυπτογραφήσουμε τον ρόλο του klotho ως καταστολέα όγκου στο PDAC χρησιμοποιώντας τρία in vivo μοντέλα. Χρησιμοποιώντας ένα νέο γενετικό μοντέλο, δείξαμε ότι η παγκρεατική klotho knockdown συνέβαλε στην ανάπτυξη PDAC και στη μείωση της επιβίωσης των μεταλλαγμένων ποντικών Kras. Σε ένα δεύτερο μοντέλο, δείξαμε ότι η χορήγηση ιικών σωματιδίων που φέρουν sKL ανέστειλε τους όγκους του παγκρέατος σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τέλος, η θεραπεία με διαλυτό ανασυνδυασμένο ουρανό παρέτεινε την επιβίωση των ποντικών KPC. Αυτά τα αποτελέσματα φανερώνουν τον ρόλο του koto ως σημαντικό παράγοντα στην ανάπτυξη της PDAC και προτείνουν την klotho ως θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία ασθενών με PDAC.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Ανάλυση TCGA με χρήση του προγράμματος περιήγησης Xena UCSC

Τα σύνολα δεδομένων RNAseg (IlluminaHiSeq) έκφρασης γονιδίου και μεθυλίωσης DNA (Methylation450k) για την κοόρτη The Cancer Genome Atlas (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Xena του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Santa Cruz(UCSC)http://xena.ucscedu/, πρόσβαση στις 19 Ιουλίου 2020)[35].κιστανάκιΧρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Xena, η συνολική επιβίωση και το διάστημα χωρίς εξέλιξη των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος αναλύθηκαν είτε σύμφωνα με τις εκφράσεις klotho είτε με τη μεθυλίωση του DNA KLOTHO και δημιουργήθηκαν γραφικές παραστάσεις Kaplan-Meier. Τα διπλά ατομικά δεδομένα αφαιρέθηκαν με φιλτράρισμα μόνο για πρωτογενείς όγκους. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, που δίνονται σε log2(x συν 1) μονάδες, χωρίστηκαν σε δύο ομάδες σύμφωνα με τη διάμεση τιμή. Τα δεδομένα μεθυλίωσης του DNA χωρίστηκαν σε δύο ομάδες σύμφωνα με τα κάτω και τα ανώτερα τεταρτημόρια.

Για τη μεθυλίωση του KLOTHO DNA ειδικής τοποθεσίας, αναλύθηκαν περαιτέρω δείγματα με χαμηλά ή υψηλά επίπεδα έκφρασης klotho, όπως ορίζονται από κατώτερα ή ανώτερα τεταρτημόρια, αντίστοιχα. Οι τιμές 36] για κάθε θέση μεθυλίωσης υπολογίστηκαν και η συσχέτιση με την έκφραση klotho στο αντίστοιχο δείγμα εξετάστηκε μέσω του συντελεστή συσχέτισης Pearson (r).

2.2. Χημικά, Αντισώματα και Κατασκευές

Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιελάμβαναν διαλυτή ανθρώπινη παραλλαγή ματίσματος klotho, που περιλαμβάνει αμινοξέα34-549(τομέας σκι, αριθμός πρόσβασης BAA24941.1), με μια 15-μοναδική αλληλουχία αμινοξέων στο C-άκρο({ {6}}· PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, ΗΠΑ). γλυκόζη (Floris, Misgav, Ισραήλ), ανθρώπινη ινσουλίνη (Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Den-mark), και λουσιφερίνη (122799· PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιελάμβαναν έλεγχο ισοτύπου IgG2a αρουραίου (02-9688· Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) και αντι- -ακτίνη (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) . Τα αντι-κλωθο αντισώματα που στρέφονται κατά του τομέα KL1 (KM2076) ήταν ένα ευγενικό δώρο από την Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία.

2.3. Παραγωγή και καθαρισμός φορέα AAV

Φορείς AAV9, μηδενικό κενό διάνυσμα και ουρανός (που περιέχει την εκκρινόμενη ισομορφή παραλλαγής συναρμογής klotho, αριθμός πρόσβασης BAA24941.1) παρήχθησαν και καθαρίστηκαν στις εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 2 του United Mixta UAB-VHIR και της μονάδας παραγωγής φορέα (VPU) Briefly , δημιουργήθηκαν φορείς χρησιμοποιώντας το σύστημα τριπλής επιμόλυνσης σε κύτταρα ΗΕΚ293. Μετά από 48 ώρες, οι φορείς AAV συλλέχθηκαν, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βενζονάση, καθαρίστηκαν σε βαθμίδωση ιωδιξανόλης και τιτλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PicoGreen [37]. Η διαγονιδιακή έκφραση οδηγήθηκε από έναν προαγωγέα CMV, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37].

2.4. Συντήρηση Ζώων

Η συντήρηση και τα πειράματα ποντικιών πραγματοποιήθηκαν στο Ιατρικό Κέντρο Sourasky (Τελ Αβίβ, Ισραήλ) και σύμφωνα με τους κανονισμούς και τα πρότυπα της Επιτροπής Περίθαλψης και Χρήσης του Ιατρικού Κέντρου Sourasky.

Τα στελέχη ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν για διαγονιδιακά μοντέλα ήταν όλα σε μικτό υπόβαθρο C57BL/6 και JVB/NJ. Τα ποντίκια Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus και LSL-Trp53R172H/ συν t ήταν ευγενικά δώρα από τον Δρ. Ziv Gil (Technion-Ινστιτούτο Τεχνολογίας Ισραήλ στο Rambam, Χάιφα, Ισραήλ).

2.5. Μοντέλα ποντικιών KLOTHO Knockdowm ειδικά για το πάγκρεας

Προκειμένου να στοχευτεί η καταστροφή του KLOTHO στο πάγκρεας του ποντικού, δημιουργήθηκαν ποντίκια που έφεραν αλληλόμορφα αλληλόμορφα KLOTHO (KLlox), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38].cistanche ΑυστραλίαΤα ποντίκια Keflex/flox διασταυρώθηκαν με ποντίκια Pdx1-Cre, που εκφράζουν την ανασυνδυάση Cre που ελέγχεται από τον υποκινητή του Pdxl, λαμβάνοντας έτσι το Pdx1-Cre. KL-/-ποντίκια. Το πάγκρεας KLOTHO knockdown επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημεία και επίπεδα mRNA, όπως περιγράφεται στη συνέχεια.

Για να δημιουργηθούν ποντίκια που φέρουν ελεγχόμενο από τον υποκινητή Pdxl knockdown KLOTHO και μεταλλαγμένη έκφραση Kras, ποντίκια LSL-KrasG12D/ plus [3], που φέρουν μια ακολουθία Lox-Stop-Lox ακολουθούμενη από ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο Kras, διασταυρώθηκαν με ποντίκια KLflox/flox. Αυτά τα ποντίκια διασταυρώθηκαν περαιτέρω με ποντίκια Pdx1-Cre, αποδίδοντας Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια. Τα LSL-KrasG12D/ plus διασταυρώθηκαν επίσης με ποντίκια Pdx1-Cre ξεχωριστά και αυτό το Pdx1-Cre; Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια KrasG12D/ plus. Τα ποντίκια εξετάζονταν καθημερινά για σημάδια ταλαιπωρίας, συμπεριλαμβανομένης της δύσπνοιας, των μεγάλων αλλαγών στο βάρος και των μεγάλων όγκων (πάνω από 1 cm), και εκείνα που πληρούσαν τα κριτήρια που όρισε η επιτροπή δεοντολογίας θυσιάστηκαν. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για επιβίωση, με τον θάνατο να ορίζεται είτε αυθόρμητα είτε με σημεία που απαιτούν θυσία. Λόγω της ταχείας πέψης του παγκρεατικού ιστού από τα παγκρεατικά υγρά, μπορούσαμε να εξετάσουμε μόνο το πάγκρεας των ποντικών που είχαν θυσιαστεί. Οι ιστοί συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν σε φορμαλδεΰδη για 24 ώρες, η οποία στη συνέχεια αντικαταστάθηκε από 70 τοις εκατό αιθανόλη.

2.6. Μελέτες Ξενομοσχεύματος Όγκων Ποντικών

Θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια (με φόντο BALB/c), ηλικίας {{0}} εβδομάδων, αγοράστηκαν από την Envigo RMS (Ιερουσαλήμ, Ισραήλ). Τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν σε ερμάρια στρωτής ροής υπό συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα. Την πρώτη ημέρα του πειράματος, κύτταρα MIA PaCa-2 που εκφράζουν σταθερά m-Cherry/λουσιφεράση εμβολιάστηκαν υποδορίως(sc) στα πλευρά τους (n=21), κύτταρα 1 × 10 μοιρών σε 100 μL των 5 επί τοις εκατό FCS DMEM μέσο). Δέκα ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου, εγχύθηκε ενδομυϊκά μια υψηλή δόση (5× 1011 GC/mL, n=7) ή μια χαμηλή δόση (5× 1010 GC/mL, n=6) ανθρώπινου AAV (im). Το AAV-null χρησίμευσε ως έλεγχος (5×1010 GC/mL, n=8). Οι όγκοι μετρήθηκαν με ψηφιακό παχύμετρο τρεις φορές την εβδομάδα και ο όγκος υπολογίστηκε με τον τύπο υπολογισμού του ελλειψοειδούς όγκου (0,5×μήκος × πλάτος2). Την ημέρα 20 του πειράματος, οι όγκοι αξιολογήθηκαν in vivo παρακολουθώντας τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του κυττάρου MIA PaCa-2 με ένεση 150 ug/mL λουσιφερίνης ενδοπεριτοναϊκά και η ένταση της λουσιφεράσης μετρήθηκε με Biospase.

Την ίδια μέρα, το πείραμα τελείωσε και τα ποντίκια υπέστησαν ευθανασία. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν με ψηφιακό παχύμετρο. Το αίμα συλλέχθηκε πριν από την ευθανασία και τα επίπεδα της ανθρώπινης klotho μετρήθηκαν στον ορό χρησιμοποιώντας ELISA (IBL, Minneapolis, MN, USA). Πενήντα μικρολίτρα ορού ανά δείγμα (εις διπλούν) χρησιμοποιήθηκαν για ELISA και η ανάλυση διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συσχέτιση μεταξύ του βάρους των όγκων και των επιπέδων του ανθρώπινου klotho αίματος εξετάστηκε μέσω του συντελεστή συσχέτισης Pearson.

2.7. Μοντέλα ποντικιών KPC

Η δημιουργία ποντικών KPC έγινε με διασταύρωση ποντικών LSL-Trp53R172H/ plus [5] που φέρουν μια αλληλουχία Lox-Stop-Lox, ακολουθούμενη από ένα αλληλόμορφο ρ53 σημείου μετάλλαξης που λειτουργεί ως μηδενική μετάλλαξη, με ποντίκια LSL-KrasG12D/ συν t. Αυτά διασταυρώθηκαν περαιτέρω με ποντίκια Pdx1-Cre, με αποτέλεσμα το Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Trp53R172H/ συν ποντίκια. Τα ποντίκια ταιριάστηκαν ανάλογα με το φύλο, την ηλικία και το βάρος και τυχαία έλαβαν θεραπεία με ενδοπεριτοναϊκές (IP) ενέσεις διαλυτού ανθρώπινου δέρματος (15 mg/kg, δύο φορές την εβδομάδα) ή μάρτυρα φορέα (n =6) για ομάδα επεξεργασμένη με ουρανό· n =7 για την ομάδα ελέγχου). Η θεραπεία συνεχίστηκε για έως και 30 εβδομάδες. Τα ποντίκια εξετάζονταν καθημερινά για σημάδια ταλαιπωρίας, συμπεριλαμβανομένης της δύσπνοιας, των μεγάλων αλλαγών στο βάρος και των μεγάλων όγκων (πάνω από 1 cm), και εκείνα που πληρούσαν τα κριτήρια που όρισε η επιτροπή δεοντολογίας θυσιάστηκαν. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για επιβίωση, με τον θάνατο να ορίζεται είτε αυθόρμητα είτε με σημεία που απαιτούν θυσία.

2.8. Γονοτυποποίηση

Ελήφθησαν ουρές ποντικού σε ηλικία 3 εβδομάδων για γονότυπο. Το DNA εκχυλίστηκε με επώαση της ουράς σε διάλυμα αλκαλικής λύσης, αποτελούμενο από 250 μΜ NaOH και 2 μΜ δινάτριο EDTA (pH 12.0), για 30-60 λεπτά στους 95 βαθμούς. , ακολουθούμενη από εξουδετέρωση με 0.4 mM Tris HCL (ρΗ 5,0). Το DNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR για τους διαφορετικούς γονότυπους, χρησιμοποιώντας REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Οι εκκινητές ήταν σε τελική συγκέντρωση 1000 ηΜ. Οι κύκλοι και οι εκκινητές PCR περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα S1. Τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 1,5 τοις εκατό και χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο.

2.9. Ανάλυση ανοσοϊστοχημείας (IHC).

Οι ιστοί στερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και οι ενσωματωμένοι ιστοί τεμαχίστηκαν σειριακά. Οι τομές είτε χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η&Ε) και εξετάστηκαν μικροσκοπικά από έμπειρο παθολόγο, είτε χρωματίστηκαν με IHC, όπως περιγράφεται. Για το klotho IHC, τμήματα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, πάχους 4 um, αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν. Η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ζεστό λουτρό (95 μοίρες) για 20 λεπτά σε ρυθμιστικό κιτρικού ρΗ 6,0. Μετά από ψύξη για 30 λεπτά, οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξεπλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-triton (TBS-T).οφέλη από το cistancheΣτη συνέχεια, διεξήχθη αποκλεισμός ενδογενούς υπεροξειδάσης για 10 λεπτά σε 3 τοις εκατό Η, Ο/μεθανόλη. Μετά το ξέπλυμα σε TBS-T, οι τομές αποκλείστηκαν για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας 5 τοις εκατό BSA σε TBS-T και αργότερα επωάστηκαν όλη τη νύχτα με klotho πρωτογενές αντίσωμα στους 4 βαθμούς. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με ZytoChem Plus (HRP) One-Step Polymer anti-Mouse/Rabbit/Rat (ZUC053, Zytomed Systems, Βερολίνο, Γερμανία). Το IgG2a αρουραίου χρησίμευσε ως έλεγχος ισοτύπου.

2.10. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Παγκρέατα από θυσία Pdxl-Cre. Τα ποντίκια ελέγχου KL-/- και KLflox/flox αποκόπηκαν, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό . Μετά την ομογενοποίηση του παγκρέατος, παρασκευάστηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης RNA (Sigma) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, ΗΠΑ). Το cDNA ενισχύθηκε για κλοθο και -ακτίνη (ως έλεγχος φόρτωσης) χρησιμοποιώντας REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma). Η PCR βελτιστοποιήθηκε στις 94 μοίρες για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από κύκλους 30 δευτερολέπτων στους 94 βαθμούς, τη δεκαετία του '90 σε 52,5 μοίρες και 20 δευτερολέπτων στους 72 βαθμούς (45 κύκλοι για την κλωθο, 25 κύκλους για την -ακτίνη) και 10 λεπτά σε 72 μοίρες για επέκταση, χρησιμοποιώντας εκκινητές klotho 12,5 pmol (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'και R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') και 5 pmol-ακτίνης εκκινητές (F,5' -TGTTACCACTGGGACGACA-3'και R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). Τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε γέλες αγαρόζης 1,5 τοις εκατό που χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Η ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ΗΠΑ.

2.11.Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD ή SEM, όπως αναφέρεται. Οι συνεχείς μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ t εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Όλες οι δοκιμές σημαντικότητας ήταν δύο ουρών και μια τιμή p μικρότερη ή ίση με 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η συσχέτιση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον συντελεστή συσχέτισης Pearson (r). Η ανάλυση επιβίωσης έγινε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank.

3. Αποτελέσματα

3.1. Τα επίπεδα έκφρασης Klotho και μεθυλίωσης DNA σε όγκους του παγκρέατος συσχετίζονται με την επιβίωση ασθενών με καρκίνο

Η κοόρτη του καρκίνου του παγκρέατος (PAAD) του προγράμματος περιήγησης γονιδιώματος του καρκίνου (TCGA) εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Xena του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Santa Cruz(UCSC)[35]. Οι αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψαν μειωμένη συνολική επιβίωση (OS) και διάστημα χωρίς εξέλιξη (PFI) για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος με όγκους χαμηλής έκφρασης klotho, σε σύγκριση με υψηλό (n=89 για κάθε ομάδα· Εικόνα 1A, B). Η εξέταση των δεδομένων μεθυλίωσης έδειξε μια συμβατή τάση παρεμποδισμένης OS και PFI σε ασθενείς που είχαν όγκους με υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης DNA KLOTHO, σε σύγκριση με χαμηλά (n=45 και n=46, αντίστοιχα· Εικόνα 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος (Εικόνα 2Γ-Ε).

3.2. Γενιά παγκρεατικών ποντικών KLOTHO Knockdown

Τα ποντίκια KLOTHO νοκ-άουτ χωρίς όρους πεθαίνουν σε ηλικία περίπου 8-9 εβδομάδων [7], επομένως δεν μπορούν να χρησιμεύσουν ως μοντέλα για την ανάπτυξη καρκίνου. Ως εκ τούτου, στοχεύσαμε να στοχεύσουμε το knockdown KLOTHO στο πάγκρεας ποντικών. Για τον σκοπό αυτό, τα ποντίκια Pdx1-Cre διασταυρώθηκαν με ποντίκια που έφεραν αλληλόμορφα αλληλόμορφα KLOTHO, KLlox/lox [38], λαμβάνοντας έτσι το Pdx1-Cre; Ποντίκια KL-/- (Εικόνα 3Α, Β). Τα επίπεδα RNA και πρωτεΐνης επικύρωσαν το knock-down του παγκρεατικού klotho (Εικόνα 3C-E). Pdx1-Cre; Τα ποντίκια KL-77εμφάνισαν μια ελαφρά αύξηση στο βάρος με την πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 3F), αλλά δεν υπήρχαν διαφορές στη γλυκόζη ορού ή στην ανοχή στην ινσουλίνη και στη γλυκόζη (Εικόνα S1).

Εικόνα 3. Δημιουργία παγκρεατικών ποντικών KLOTHO knockdown. (Α)Σχηματικό διάγραμμα του αλληλόμορφου KLflox: Τοποθεσίες LoxP πλαισιώνουν το εξόνιο 2 του KLOTHO, οδηγώντας στη στοχευμένη καταστροφή του στο πάγκρεας του Pdx1-Cre; KL-/-ποντίκια. Ο επάνω πίνακας εμφανίζει αλληλόμορφο με έλικα, το κάτω πλαίσιο δείχνει τα αναμενόμενα αποτελέσματα του ανασυνδυασμού Cre. (Β) Αντιπροσωπευτικό πήκτωμα που δείχνει προϊόντα PCR γονότυπου KLOTHO ποντικού: KL plus / plus (WT; 370 bp), KLl/ plus (470 και 370 bp) και KLflox/flox (470 bp). (C,D) Το παγκρεατικό RNA εξήχθη από Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) και ποντίκια ελέγχου (n=4). Τα επίπεδα Klotho mRNA προσδιορίστηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR και ποσοτικοποιήθηκαν. Το αντιπροσωπευτικό πήκτωμα δείχνεται (τα πρωτότυπα μη κομμένα στυπώματα είναι διαθέσιμα στο Σχήμα S2). (Ε) Αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημική κλωθο χρώση παγκρέατος που αποκόπηκε από Pdx1-Cre; KL-/- και ποντίκια ελέγχου. Μεγέθυνση: X20. W/O, χωρίς. (ΣΤ) Βάρος ποντικών και στις δύο ομάδες (n=5ανά ομάδα). Αναλύθηκε με χρήση επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ANOVA.p=0.01. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Control, ποντίκια KLflox/flox. Τα ποντίκια που φιλοξενούν παγκρεατικό KLOTHO knockdown και μεταλλαγμένη έκφραση Kras δημιουργήθηκαν με διασταύρωση Pdx1-Cre με LSL-KrasG12D/ συν [3] ποντίκια (Pdx1-Cre· KrasG12D/ plus ποντίκια) και περαιτέρω διασταύρωση τους με Ποντίκια KLflox/lox (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια). Οι αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αρσενικούς ποντικούς. Τα θηλυκά ποντίκια αποκλείστηκαν, λόγω υψηλού ποσοστού πρωκτικών βλαβών και στα δύο Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus και Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές βλεννογονοδερματικών θηλωμάτων σε τέτοια ποντίκια [3].

3.3.Η απώλεια του παγκρεατικού Klotho συμβάλλει στη μειωμένη επιβίωση σε ποντίκια

Δεν υπήρχε διαφορά στην επιβίωση του Pdx1-Cre; ποντίκια KL-/-, σε σύγκριση με τον έλεγχο). Προχωρήσαμε στη μελέτη της επίδρασης του συνδυασμένου knockdown του παγκρέατος KLOTHO και της μετάλλαξης Kras στην επιβίωση παρακολουθώντας τα ποντίκια για 65 εβδομάδες. Ο θάνατος επήλθε είτε αυθόρμητα είτε με ευθανασία όταν εμφανίστηκαν σημάδια σοβαρής ταλαιπωρίας ή επιβάρυνσης όγκου που απαιτούσε θυσία. Survival of Pdx1-Cre; Το KL-/-;KrasG12D/ συν ποντίκια (n =21) ​​μειώθηκε, σε σύγκριση με τον έλεγχο Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ποντίκια (n=18;p= 0.02; Εικόνα 4Α). Έτσι, μέχρι την ηλικία των 22 εβδομάδων, το 100 τοις εκατό (18/18) του Pdx1-Cre; Τα ποντίκια KrasGi2D/ plus ήταν ζωντανά, σε σύγκριση με το 71 τοις εκατό (15/21) του Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια. Δεν σημειώθηκαν σημαντικές αλλαγές στο βάρος μεταξύ των ομάδων (Εικόνα 4Β).

Σχήμα 4. Η παγκρεατική KLOTHO knockdown συμβάλλει στη μειωμένη επιβίωση και επάγει PDAC in vivo. (Α) Καμπύλες Kaplan-Meier του Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) σε σύγκριση με τον έλεγχο Pdx1-Cre;KrasGi2D/ συν (n=18)mice.p{10}}.02.( Β) Βάρος ποντικών και στις δύο ομάδες (n=19 ανά ομάδα). (CE) Το πάγκρεας αποκόπηκε από το Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (n=7, μέση ηλικία 36 εβδομάδες)και έλεγχος Pdx1-Cre; KrasGi2D/ συν (n=8, μέση ηλικία 49 εβδομάδες) ποντίκια κατά τη θυσία. (Γ) Σύγκριση μεταξύ της παθολογικής αξιολόγησης του παγκρέατος που έχει χρωματιστεί με Η&Ε και των δύο ομάδων. (D) Αντιπροσωπευτική χρώση H&E του παγκρέατος που συλλέχθηκε από 24-ποντίκια εβδομάδων. Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (δεξιά): πλήρης απώλεια κυτταρικής πολικότητας, σημαντική πυρηνική ατυπία και εκβλάστηση κυτταρικών συστάδων στον αυλό του πόρου, μαζί με άφθονη ίνωση και κερατίνη. Έλεγχος Pdx1-Cre; KrasG12D/ συν (αριστερά): χωρίς αλλοιώσεις. Μεγέθυνση: ×10.(Ε) Αντιπροσωπευτικές αλλοιώσεις PanIN και των δύο ομάδων. Μεγέθυνση: ×10.

3.4. Η Klotho Συνεργάζεται στην Ανάπτυξη του PDAC In Vioo

Με βάση προηγούμενες μελέτες που έδειχναν την ανάπτυξη PDAC σε ποντίκια που φιλοξενούν τόσο τη μετάλλαξη Kras όσο και την απώλεια της ογκοκατασταλτικής δραστηριότητας [4], εξετάσαμε το Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus πάγκρεας ποντικιού για βλάβες. Λόγω της ταχείας πέψης του παγκρεατικού ιστού από τα παγκρεατικά υγρά, μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε μόνο το πάγκρεας των ποντικών που είχαν θυσιαστεί. Δείγματα Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​και έλεγχος Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n =8) ποντίκια υποβλήθηκαν σε παθολογική αξιολόγηση (μέση ηλικία θανάτου: 36 και 49 εβδομάδες, αντίστοιχα). Το PDAC αναγνωρίστηκε σε δύο Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια, αλλά σε κανένα από τα Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ποντίκια, ενώ το PanN2 σημειώθηκε σε δύο από τα Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus ποντίκια και σε τέσσερα από τα Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ποντίκια (Εικόνα 4Γ). Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες (Εικόνα 4D-E).

3.5. Η θεραπεία με sKL αναστέλλει τους όγκους του παγκρέατος και παρατείνει την επιβίωση in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Εικόνα 5F-G).

Το δεύτερο μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε για το σκοπό αυτό ήταν το μοντέλο KPC. Τα ποντίκια ταιριάστηκαν ανάλογα με το φύλο, την ηλικία και το βάρος και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εγχύσεις διαλυτού ανθρώπινου sKL ή φορέα ελέγχου για έως και 30 εβδομάδες. Ο θάνατος επήλθε είτε αυθόρμητα είτε με ευθανασία όταν εμφανίστηκαν σημάδια σοβαρής ταλαιπωρίας ή επιβάρυνσης όγκου που απαιτούσε θυσία. Η επιβίωση των ποντικών που έλαβαν sKL αυξήθηκε, σε σύγκριση με τον έλεγχο (ρ=0.005· Εικόνα 5Η).

Εικόνα 5. Η θεραπεία με sKL μειώνει την τοπική ανάπτυξη όγκου και παρατείνει την επιβίωση in vivo. (AG) Αθυμικά γυμνά ποντίκια BALB/c εμβολιάστηκαν με κύτταρα MIA PaCa-2 που εκφράζουν σταθερά m-Cherry/λουσιφεράση (1× 10 μοίρες κύτταρα ανά ποντίκι). Δέκα ημέρες αργότερα, τα ποντίκια ενέθηκαν με υψηλή δόση AAV-sKL(5×1011 GC/mL,n=7), χαμηλή δόση AAV-sKL (5×1010 GC/mL, n{{13} }), ή ελέγχου AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8).(Α) Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε in vivo με ψηφιακό παχύμετρο. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες βιοαπεικόνισης της δραστηριότητας της λουσιφεράσης των τοπικών όγκων. (Γ) Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης των όγκων μετρήθηκε με μετρήσεις ανά λεπτό. (Δ)Αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκων που συλλέγονται την ημέρα της θυσίας. (Ε)Βάρος συγκομιδών όγκων. (ΣΤ) Επίπεδα ανθρώπινου klotho αίματος. *Π<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη καθιερώνει το ρόλο του klotho ως ογκοκατασταλτικό στην PDAC. Οι αναλύσεις βιοπληροφορικής αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης των ασθενών με PDAC και των επιπέδων έκφρασης klotho και μεθυλίωσης DNA και κατέδειξαν ένα μοναδικό πρότυπο υπερμεθυλίωσης του KLOTHO σε όγκους του παγκρέατος. Χρησιμοποιώντας ένα νέο μοντέλο ποντικιού, δείξαμε ότι το παγκρεατικό klotho knockdown συνεργάζεται με τη μετάλλαξη Kras για τη μείωση της επιβίωσης και τη δημιουργία PDACin Vivo. Επιπλέον, το L ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων που προέρχονται από παγκρεατικά κύτταρα σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος και παρέτεινε την επιβίωση των ποντικών KPC.

Το Klotho αποσιωπάται επιγενετικά μέσω της υπερμεθυλίωσης του προαγωγέα σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Αυτό έχει επίσης αναφερθεί σε μικρές κοόρτες σε PDAC, καθώς και σε μια συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης των ασθενών με PDAC και των επιπέδων έκφρασης klotho και μεθυλίωσης DNA [17,34]. Σύμφωνα με την αξιολόγησή μας του OS, καθώς και του PFI χρησιμοποιώντας δεδομένα που περιελάμβαναν 178 δείγματα PDAC, έδειξε θετική συσχέτιση με την έκφραση klotho και αντίστοιχη αρνητική συσχέτιση με μεθυλίωση DNA KLOTHO. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν περαιτέρω ότι η έκφραση klotho μπορεί να ρυθμιστεί με μεθυλίωση DNA και ενισχύουν την ιδέα ότι αυτές οι παράμετροι θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν για την αξιολόγηση της πρόγνωσης των ασθενών με PDAC.

Προηγούμενες μελέτες μεθυλίωσης του KLOTHO DNA στο PDAC [17,34] βασίστηκαν σε περιορισμένο υποσύνολο ασθενών και πειράματα in vitro και δεν ανέλυσαν το πρότυπο μεθυλίωσης συγκεκριμένων θέσεων σε ολόκληρο το γονίδιο KLOTHO. Η τρέχουσα ανάλυση, με βάση το προαναφερθέν εκτενές σύνολο δεδομένων, αποκάλυψε ότι τρεις συγκεκριμένες τοποθεσίες, δύο από τις οποίες βρίσκονται σε ένα CpGisland στο τελευταίο εξόνιο του KLOTHO, δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές της έκφρασης klotho μέσω υπερμεθυλίωσης. Βρήκαμε προηγουμένως ότι μία από αυτές τις θέσεις, το cg23282559, είναι επίσης υπερμεθυλιωμένη στον καρκίνο του παχέος εντέρου [25]. Δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί εάν αυτές οι θέσεις παίζουν ρόλο στη ρύθμιση του κλωθίου και σε άλλες κακοήθειες.

Το Klotho είναι γνωστό ότι εκφράζεται στο πάγκρεας. Ωστόσο, ο ρόλος του στη φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία του παγκρέατος είναι ακόμη άγνωστος. Ενώ τα ποντίκια με έλλειψη klotho εμφανίζουν μειωμένη παραγωγή ινσουλίνης, μαζί με μια δραματική αύξηση στην ευαισθησία στην ινσουλίνη [22], η υπερέκφραση της klotho σε ποντίκια έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη ινσουλίνη αίματος νηστείας, συνοδευόμενη από αντίσταση στην ινσουλίνη [8]. Παραδόξως, το μοντέλο ποντικιού που παρουσιάστηκε σε αυτή τη μελέτη, το οποίο φιλοξενούσε παγκρεατικό klotho knockdown, δεν έδειξε εμφανή φαινότυπο διαβήτη ή αλλοιωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη. Επιπλέον, δεν υπήρξε καμία επίδραση στη μορφολογία του παγκρέατος, στο σχηματισμό όγκου ή στην επιβίωση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια παγκρεατικού klotho μπορεί να αντισταθμιστεί από τις περιφερικές επιδράσεις της συστηματικής klotho ή από άλλους μηχανισμούς. Επιπλέον, η ανάπτυξη διαβήτη είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία εξαρτάται όχι μόνο από το πάγκρεας, αλλά και από το ήπαρ, τους μύες και τους λιπώδεις ιστούς. Όπως και στο δικό μας μοντέλο, το klotho ήταν νοκ ντάουν κυρίως στο πάγκρεας, μπορεί να εξηγήσει την έλλειψη διαβήτη σε αυτό το μοντέλο ποντικιού.

Σε συμφωνία με τα κλινικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται, Pdx1-Cre; KL-/-; Τα ποντίκια KrasG12D/ plus είχαν μειωμένη διάρκεια ζωής σε σύγκριση με τον έλεγχο Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus ποντίκια (48 έναντι 60 εβδομάδων, αντίστοιχα). Αν και δεν μπορέσαμε να εξετάσουμε παθολογικά όλο το πάγκρεας του ποντικιού, παρατηρήθηκε υψηλότερο ποσοστό εμφανούς PDAC στο Pdx1-Cre; KL-7-; KrasG12D/ plus ποντίκια, σε σύγκριση με τον έλεγχο Pdx1-Cre; KrasG2D/ plus ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τη σημασία της klotho στην ανάπτυξη παγκρεατικών κακοηθειών και στην επιβίωση in vivo. Ο φαινότυπος του Pdx1-Cre; Τα ποντίκια KL-/-: KrasGl2D/ plus είναι λιγότερο έντονα, σε σύγκριση με μοντέλα που συνδυάζουν απώλεια άλλων ογκοκατασταλτών με μεταλλάξεις Kras. Για παράδειγμα, τα ποντίκια KPC έχουν μέση επιβίωση μόνο 5 μήνες[5]. Πιθανόν αυτό να οφείλεται σε μερική αντιστάθμιση της απώλειας τοπικού κλώθου από την κυκλοφορία του κλώθου. Εναλλακτικά, η υπολειμματική έκφραση της klotho στο πάγκρεας μπορεί να έχει επηρεάσει τον φαινότυπο. Η επίτευξη πλήρους στοχευμένης αποσιώπησης του klotho σε μελλοντικές μελέτες θα επέτρεπε την καλύτερη κατανόηση του ρόλου του σε διαφορετικούς ιστούς, καθώς και την αντιστάθμιση μεταξύ των τοπικών και συστημικών επιδράσεων του klotho.

Παρουσιάσαμε δύο μοντέλα που καταδεικνύουν τις θεραπευτικές δυνατότητες του klotho. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, οι ενέσεις καρκίνου του παγκρέατος ενός ιικού δερματικού φορέα ήταν εξαιρετικά αποτελεσματικές, όχι μόνο στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου αλλά και στη μείωση του μεγέθους των όγκων. Η θεραπεία ξεκίνησε όταν οι όγκοι ήταν ήδη ορατοί και εγκατεστημένοι, μοιάζοντας με τον χρόνο έναρξης της θεραπείας στους περισσότερους ασθενείς. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για γονιδιακή θεραπεία, παρακάμπτοντας έτσι σημαντικά εμπόδια στη σταθερότητα και την αποτελεσματική παροχή φαρμάκων που βασίζονται σε πρωτεΐνες και πεπτίδια. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ του βάρους του όγκου και των επιπέδων του ανθρώπινου klotho στο αίμα. Περαιτέρω έρευνα των επιπέδων klotho στο αίμα σε σχέση με την επίδρασή του μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη του ποιος θα ωφεληθεί από τη θεραπεία με klotho ή SQL, καθώς και στη διατήρηση των επιπέδων εντός του θεραπευτικού παραθύρου.

Η ανάπτυξη θεραπειών με βάση την κλωθο είναι ένας στόχος που επιδιώκουν πολλές ερευνητικές ομάδες, καθώς και φαρμακευτικές εταιρείες. Όσον αφορά τη θεραπεία του καρκίνου, υπάρχουν αρκετοί δρόμοι που διερευνώνται. Κάποιος μπορεί να αυξήσει τα ενδογενή επίπεδα της klotho εκμεταλλευόμενοι τους επιγενετικούς μηχανισμούς που έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την έκφραση της klotho. Έχει αναφερθεί ότι ο υποκινητής klotho είναι σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένος σε πολλούς καρκίνους και είναι επίσης συνάρτηση της ηλικίας. Έτσι, οι ενώσεις που αναστέλλουν τις μεθυλ τρανσφεράσες του DNA θα μπορούσαν να γίνουν θεραπευτικός στόχος για την αύξηση της έκφρασης της klotho. Από την άλλη πλευρά, μπορεί κανείς να αυξήσει τα επίπεδα προσθέτοντας εξωγενώς klotho, για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας γονιδιακή θεραπεία ή παροχή μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης klotho. Εδώ, αναφέραμε την εισαγωγή της ενεργού περιοχής του klotho (L) χρησιμοποιώντας το σύστημα AAVexpression, το οποίο είχε ως αποτέλεσμα ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα σε ένα μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος.

Στη συνέχεια, δείξαμε ότι η θεραπεία με διαλυτό ουρανό παρέτεινε την επιβίωση των ποντικών KPC, ενός μοντέλου που είναι γνωστό ότι ανακεφαλαιώνει το ανθρώπινο PDAC. Αυτό κατέδειξε την επίδραση του ουρανού σε ένα περιβάλλον ξενιστή και εγγενούς όγκου με ανοσολογικό ικανό, υποστηρίζοντας περαιτέρω την πιθανή χρήση του SSL σε κλινικές συνθήκες.

5. Συμπεράσματα

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη αναγνώρισε το klotho ως έναν ισχυρό ογκοκατασταλτικό στο PDAC. Τα τρέχοντα θεραπευτικά σχήματα για το PDAC δεν είναι επαρκή και η χορήγηση εξωγενούς sKL μπορεί να χρησιμεύσει ως νέα στρατηγική για τη θεραπεία του PDAC.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers