Ένα νέο φυσικό αντιοξειδωτικό βιοϋλικό από Cinnamomum Osmophloeum Kanehira Leaves καταστέλλει τη μελανογένεση και προστατεύει από τη φθορά του DNA

Επικοινωνία: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* και Chi-Yue Chang 2

Αφηρημένη:Το Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) είναι ένα γηγενές είδος δέντρου στην Ταϊβάν. Χημικές συνθέσεις,αντιοξειδωτικόδραστηριότητα, μανιτάριτυροσινάσηΕξετάστηκαν η αναστολή, η καταστολή της σύνθεσης μελανίνης και η προστασία έναντι της βλάβης του DNA του υδρολύματος από τα φύλλα COK με απόσταξη με ατμό. Πραγματοποιήσαμε 1,1-διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλική δέσμευση ριζών, χηλικοποίηση μεταλλικών ιόντων, αναγωγική ισχύ και αντιοξειδωτική ικανότητα ισοδύναμης Trolox (TEAC) και προσδιορίσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ των συνολικών περιεχομένων σε φαινολικά και των αντιοξειδωτικών δραστηριοτήτων. Τα ευρήματα έδειξαν ότι οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του υδρολύματος COK συσχετίζονται στενά με τα περιεχόμενά τους σε φαινόλη. Επιπλέον, τα κύρια συστατικά του υδρολύματος, π.χ. η κινναμαλδεΰδη και η βενζαλδεΰδη, είχαν δοσοεξαρτώμενα αποτελέσματα αντι-τυροσινάσης έναντι της δραστηριότητας τόσο της μονοφαινολάσης όσο και της διφαινολάσης. Η ανάλυση GC-MS αποκάλυψε ότι τα κύρια βιοδραστικά συστατικά του υδρολύματος ήταν η trans-cinnamaldehyde (87,7%). βενζαλδεΰδη (7,0 τοις εκατό) και οξική κινναμυλεστέρα (5,3 τοις εκατό). Επιπλέον, βρήκαμε ότι το υδρόλυμα με την παρουσία βενζαλδεΰδης είναι πιο ισχυρό από την καθαρή κινναμαλδεΰδη και ενισχύει τηντυροσινάσηανασταλτική δράση του υδρολύματος. Σε κινητικές αναλύσεις, οι Lineweaver-Burk σχεδιάζουν γραφικά και replots έδειξαν ότι το COK hydrosol είναι ένας μικτού τύπου αναστολέας. Επιπρόσθετα, διαπιστώσαμε ότι πολύ χαμηλές δόσεις υδρολύματος COK κατέστειλαν την επαγόμενη από μελανοκύτταρα ορμόνη σύνθεση του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία, οδηγώντας σε μειωμένη σύνθεση μελανίνης στα κύτταρα μελανώματος B16-F10. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή υδρολύματος από φύλλα COK με απόσταξη ατμού μπορεί να παρέχει μια ασφαλή και αποτελεσματική πηγήδέρμα-λεύκανσηπαράγοντες για καλλυντικές και φαρμακευτικές εφαρμογές, μεαντιοξειδωτικό, αντι-τυροσινάση, αντι-μελανογένεση και προστατευτικές δράσεις DNA.

Λέξεις-κλειδιά: αντιοξειδωτικόδραστηριότητα; Cinnamomoum ​​osmophloeum; υδρόλυμα;τυροσινάσηανασταλτική δραστηριότητα;λεύκανση; Προστατευτικά αποτελέσματα καταστροφής του DNA

Κάντε κλικ στοCistancheστέλεχος και προϊόν για λεύκανση δέρματος

1. Εισαγωγή

Οι διαταραχές του ανθρώπινου δέρματος όπως η φακή, οι κηλίδες ηλικίας, το μέλασμα και τα κακοήθη μελανώματα έχουν συνδεθεί με το σχηματισμό και τη συσσώρευση μελανίνης [1]. Η αναστολή των τυροσινασών και η μελανογένεση βελτιώνει τις δερματολογικές διαταραχές και το σύνδρομο υπερμελάγχρωσης. Επιπλέον, η παγκόσμια αγορά παραγόντων λεύκανσης δέρματος και καλλυντικών προϊόντων έχει επεκταθεί πρόσφατα επειδή το ανοιχτόχρωμο δέρμα προτιμάται από πολλά άτομα με πιο σκούρο δέρμα [2]. Επομένως, αποτελεσματικό και ασφαλέςτυροσινάσηκαι οι αναστολείς σύνθεσης μελανίνης θεωρούνται σημαντικοί για την πρόληψη της μελάγχρωσης και άλλων θεμάτων ανθρώπινης υγείας που σχετίζονται με τη μελανίνη [3,4]. Επιπλέον, οι περιβαλλοντικές τοξικές ουσίες προκαλούν διάφορα οξειδωτικά στρες στους ανθρώπους και μπορούν να παράγουν δραστικά είδη αζώτου ή αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [5]. Οι υπερβολικές ελεύθερες ρίζες και τα ROS σχετίζονται με φλεγμονώδεις οδούς σηματοδότησης, οι οποίες τελικά οδηγούν σε κυτταρική βλάβη, γήρανση, νευρικές διαταραχές, διαβήτη, αθηροσκλήρωση, φλεγμονώδεις, καρδιαγγειακές παθήσεις, καρκίνο και μελανογένεση [6,7]. Αρκετές μελέτες το προτείνουναντιοξειδωτικάμπορεί να αναστείλει τις βλάβες της οξειδωτικής πίεσης δρώντας ως σαρωτές ελεύθερων ριζών ή σαρωτές ROS [7,8]. Επιπλέον, τόσο οι αναστολείς της παραγωγής ROS όσο και οι σαρωτές ROS μπορεί να μειώσουν την παραγωγή μελανίνης [9]. ΕΙΔΙΚΑ,τυροσινάσηείναι ένα βασικό ένζυμο που καταλύει ένα βήμα περιορισμού του ρυθμού στα δύο πρώτα στάδια κατά τη διάρκεια των διαδικασιών σύνθεσης μελανίνης [10] και η προς τα κάτω ρύθμιση της τυροσινάσης είναι ένας κρίσιμος στόχος για την πρόληψη δερματικών παθήσεων και την παραγωγήλεύκανση δέρματοςπαράγοντες [11]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη φυσικών αντιοξειδωτικών που αναστέλλουν αποτελεσματικά τις τυροσινάσες για την πρόληψη ή τη θεραπεία της ανεπιθύμητης υπερμελάγχρωσης του δέρματος και την προστασία από τη βλάβη του DNA είναι απαραίτητη.

Το Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) είναι ένα γηγενές είδος κανέλας της Ταϊβάν με πολλές χρήσεις ως κινέζικο φυτικό φάρμακο. Οι δραστικές ενώσεις των αιθέριων ελαίων COK παρουσιάζουν εξαιρετικό δυναμικό ως φαρμακολογικά αντιβακτηριακά [12]. Αν και προηγούμενες μελέτες αλκοολούχων εκχυλισμάτων φύλλων COK έδειξαν δράση κατά της τυροσινάσης, σχεδόν όλες αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν σε αιθανολεξικά εκχυλίσματα ή αιθέρια έλαια από το COK. Επιπλέον, δεν έχουν αναφερθεί ποσοτικές και συστηματικές μελέτεςαντιοξειδωτικόιδιότητες,τυροσινάσηανασταλτικές δραστηριότητες και καταστολή της σύνθεσης μελανίνης από υδατικά εκχυλίσματα (hydrosol) των φύλλων COK. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη διεξήχθη για τη διερεύνηση των επιδράσεων του υδρολύματος COK στο οξειδωτικό στρες και τη μελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος B16F10 και την προστασία από τη βλάβη του DNA. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη λεπτομερής αναφορά της χημικής σύνθεσης καιαντιοξειδωτικό, αναστολή τυροσινάσης, κατασταλτική μελανογένεση και προστατευτικές δράσεις βλάβης του DNA του υδρολύματος από φύλλα COK.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Χημικά και Αντισώματα

Μανιτάριτυροσινάση, βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (BHT), -τοκοφερόλη, 6-υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλοκρομαν-2-καρβοξυλικό οξύ (Trolox), τριχλωροξικό οξύ (TCA), γαλλικό οξύ, σιδηροκυανιούχο κάλιο, χλωριούχο σίδηρο, χλωριούχο σίδηρο, φερροζίνη, 1,1-διφαινυλ-2-πικρυυλυδραζυλ (DPPH), 2,20-αζινο-δις-3-αιθυλβενζοθειαζολίνη{{14} } σουλφονικό οξύ (ABTS), αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu, L-τυροσίνη και L-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA) ελήφθησαν από τη Merck Co. (Darmstadt, Γερμανία). Όλες οι χημικές ουσίες και οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας ή υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Αντισώματα κατά του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) και της -ακτίνης ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) και τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), αντίστοιχα.

2.2. Προετοιμασία Hydrosol: Εκχύλιση από φύλλα COK με απόσταξη με ατμό

Τα φύλλα ενός δέντρου COK 13- ετών στην Ταϊβάν (No.186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Ταϊβάν) ξηράνθηκαν στον αέρα. Χρησιμοποιώντας έναν μύλο από ανοξείδωτο χάλυβα, τα φύλλα στη συνέχεια αλέστηκαν σε λεπτή σκόνη (λιγότερο από < 10="" mesh)="" και="" στη="" συνέχεια="" αποθηκεύτηκαν="" σε="" θερμοκρασία="" δωματίου.="" στη="" συνέχεια,="" 3,5="" kg="" ξηρής="" σκόνης="" φύλλων="" cok="" εκχυλίστηκαν="" χρησιμοποιώντας="" απόσταξη="" με="" ατμό="" για="" 4="" ώρες.="" αυτή="" η="" διαδικασία="" επαναλήφθηκε="" τέσσερις="" φορές.="" χρησιμοποιώντας="" ένα="" κενό,="" το="" εκχύλισμα="" διηθήθηκε="" και="" στη="" συνέχεια,="" χρησιμοποιώντας="" έναν="" περιστροφικό="" εξατμιστή,="" ελήφθη="" το="" ξηρό="" εκχύλισμα="" (εικόνα="" 1).="" το="" εκχύλισμα="" τελικά="" εξατμίστηκε="" για="" να="" ληφθεί="" ένα="" τελικό="">

2.3. Αέρια Χρωματογραφία/Φασματομετρία Μάζας (GC/MS) Ανάλυση υδρολύματος

Ένα όργανο Thermo-GC/MS με διασταυρούμενη τριχοειδή στήλη THERMO WaxMS 5 τοις εκατό φαινυλ- 95 τοις εκατό μεθυλοπολυσιλοξάνη (60 m × 0).25 mm id, πάχος φιλμ {{1 0}}.25 μm) χρησιμοποιήθηκε με θήλιο ως φέρον αέριο με σταθερό ρυθμό ροής 1,0 mL/min. Η στήλη διατηρήθηκε στους 200 ◦C για 5 λεπτά μετά την ένεση και στη συνέχεια θερμάνθηκε στους 5 ◦C/min στους 260 ◦C. Καθαρό αιθέριο έλαιο (1,0 mL) εγχύθηκε με αναλογία διαχωρισμού 1:100. Οι θερμοκρασίες του εγχυτήρα, της γραμμής μεταφοράς και της πηγής ιόντων ήταν 250 ◦C, 250 ◦C και 200 ​​◦C, αντίστοιχα. Η ανίχνευση MS πραγματοποιήθηκε στη λειτουργία κρούσης ηλεκτρονίων σε ενέργεια 70 eVionisation και ρεύμα ιονισμού 60 μA. το όργανο λειτουργούσε σε λειτουργία λήψης πλήρους σάρωσης στην περιοχή 50–350 amu. Οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν συγκρίνοντας τους χρόνους κατακράτησης και τους δείκτες των χρωματογραφικών κορυφών με εκείνες των αυθεντικών προτύπων αναφοράς, που εγχύθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες. Τα πρότυπα κατακερματισμού του MS συγκρίθηκαν με αυτά των καθαρών ενώσεων και η βάση δεδομένων φάσματος μάζας αναζητήθηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων MSspectral του Εθνικού Ινστιτούτου Προτύπων και Τεχνολογίας (NIST) [13].

2.4.Ολικά Φαινολικά Περιεχόμενα

Τα συνολικά φαινολικά περιεχόμενα (TPC) των εκχυλισμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες Folin-Ciocalteu που περιγράφηκαν προηγουμένως [14]. Εν συντομία, δείγματα υδρολύματος (100 μL) αναμίχθηκαν με δείγματα 100 μL αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (10-πλάσια αραίωση) και δείγματα 10 μL ανθρακικού νατρίου (10 τοις εκατό, w/v). Μετά από αποθήκευση για 30 λεπτά, το Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 735 nm. Τα TPC εκφράζονται ως ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) σε mg ανά 100 g φρέσκου υλικού.

2.5. Δοκιμασίες σάρωσης ελεύθερων ριζών DPPH

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τη χρήση της ανάλυσης DPPH, προσδιορίστηκαν οι δραστικότητες δέσμευσης ριζών του υδρολύματος [15], με τροποποιήσεις. Εν συντομία, ποικίλες αραιώσεις δειγμάτων υδρολύματος (75 μL εις τριπλούν) προστέθηκαν σε κλάσματα 150 μL DPPH (0,02 g/100 mL) και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 517 nm μετά από 30 λεπτά. Το ΒΗΤ χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (0,5 mg/mL αιθανόλης). Οι δραστηριότητες δέσμευσης ριζών εκφράστηκαν ως αναλογίες αναστολής (%) χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

Ο λόγος αναστολής ( τοις εκατό )=[1 − (A/B)] × 100 τοις εκατό

όπου Α είναι η απορρόφηση του δείγματος υδρολύματος και Β είναι η απορρόφηση του τυφλού.

2.6. Κλασματικές Ανασταλτικές Συγκεντρώσεις

Οι δοκιμασίες κλασματικών ανασταλτικών συγκεντρώσεων (FIC) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], με τροποποιήσεις. Εν συντομία, FeS04 (20 μL, 2 mM) αναμίχθηκε με διαφορετικές αραιώσεις δειγμάτων υδρολύματος (200 μL). Μετά την προσθήκη φερροζίνης (40 μL, 5 mM), οι αντιδράσεις αφέθηκαν να προχωρήσουν για 10 λεπτά και στη συνέχεια μετρήθηκε η απορρόφηση στα 562 nm. Επιπλέον, ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε 0,5 mg/mL αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA). Η ποσοστιαία αναστολή του σχηματισμού συμπλόκου φερροζίνης-Fe2 συν υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

Χηλική επίδραση μετάλλων ( τοις εκατό )=[1 − (A/B)] × 100 τοις εκατό

όπου Α είναι η απορρόφηση του δείγματος υδρολύματος και Β είναι η απορρόφηση του τυφλού.

2.7. Μείωση των δοκιμών ισχύος

Η αναγωγική ισχύς του υδρολύματος COK προσδιορίστηκε παρακολουθώντας τη μείωση του Fe3 συν σε Fe2 plus όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], με τροποποιήσεις. Εν συντομία, σε 50 μL αραιώσεις υδρολύματος, ήταν 50-μΛαλικά ποσά ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (pH 6,6, 200 mM) και 50-μL κλάσματα σιδηροκυανιούχου καλίου (1 τοις εκατό, w/v) προστέθηκε. Μετά από επώαση στους 50◦C για 20 λεπτά, προστέθηκαν 50 μL TCA (10 τοις εκατό, w/v). και το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 9,000 rpm για 3 λεπτά. Τέλος, 50 μL υπερκειμένου αναμίχθηκαν με 50 μL απεσταγμένου νερού και 50 μL χλωριούχου σιδήρου σε νερό (0,1 τοις εκατό, w/v) και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 700 nm έναντι του τυφλού μετά από 10 λεπτά χρόνου αντίδρασης. Οι θετικοί έλεγχοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ) και -τοκοφερόλη.

2.8. Δοκιμασία ισοδύναμης αντιοξειδωτικής ικανότητας Trolox (TEAC).

ΑντιοξειδωτικόΟι δραστηριότητες του υδρολύματος COK αξιολογήθηκαν σύμφωνα με μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [15,18], με τροποποιήσεις. Εν συντομία, το συμπυκνωμένο διάλυμα κατιόντων ρίζας ABTS (ABTS• συν) αραιώθηκε σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (pH 7,4) σε τελική απορρόφηση 0,80 ± 0,05 στα 734 nm. Μετά την ανάμιξη (0,02 mL) δείγματος με 1 mL ABTS συν διαλύματος, υπήρξαν μειώσεις στην απορρόφηση στα 734 nm μετά από 5 λεπτά. Το Trolox χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο και οι δραστηριότητες υδρολύματος εκφράστηκαν ως TEAC σχεδιάζοντας καμπύλες βαθμονόμησης Trolox. Οι μοριακές τιμές TEAC των δειγμάτων υδρολύματος υπολογίστηκαν σύμφωνα με τις μειώσεις στην απορρόφηση του διαλύματος Trolox. ΒΗΤ και -τοκοφερόλη χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες.

2.9. Επιδράσεις του Hydrosol στην Αναστολή της Τυροσινάσης Μανιταριών

ΜανιτάριτυροσινάσηΗ δραστηριότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρική ανάλυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με τροποποιήσεις [19]. Εν συντομία, 20 μL L-τυροσίνης ή 20 μL L-DOPA σε PBS (pH 6,8, 80 μL) και 80 μL PBS με ή χωρίς δοκιμαστικό υδρόλυμα προστέθηκαν σε μικροπλάκες {{9}φρεατίων και στη συνέχεια 20 μL μανιταροσινάσης (100 U/ mL) προστέθηκε. Μετά από ανάμιξη και επώαση στους 37 ◦C για 20 λεπτά, η παραγωγή (ή η κατανάλωση) ντοπαχρωμίας στο μίγμα της αντίδρασης προσδιορίστηκε σε απορρόφηση 475 nm. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το Kojic acid, το οποίο αναστέλλει την τυροσινάση. Το ποσοστό αναστολής της τυροσινάσης υπολογίστηκε ως εξής:

Αναστολή ( ποσοστό ) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 τοις εκατό

όπου το Α υποδηλώνει απορρόφηση με ένζυμο απουσία δείγματος υδρολύματος, το Β δείχνει απορρόφηση χωρίς δείγμα ένζυμου ή υδρολύματος, το C υποδηλώνει απορρόφηση με ένζυμο και απορρόφηση υδρολύματος και Dindicate χωρίς το ένζυμο αλλά με υδρόλυμα. Υπολογίσαμε και το 50 τοις εκατότυροσινάσηανασταλτικές συγκεντρώσεις (IC50) των δειγμάτων ως εκείνων που αναστέλλουν τη δραστηριότητα της τυροσινάσης κατά 50 τοις εκατό .

2.10. Kinetic Analysis of Mushroom Tyrosinase Inhibition

Τα μείγματα αντίδρασης περιείχαν 20 μL L-τυροσίνης ή L-DOPA (0,25 mg/mL) ως υποστρώματα, 100 μLof τυροσινάση μανιταριού (20 μονάδες/mL) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0,2 Μ ( pH 6,8) και 80 µL κάθε δείγματος υδρολύματος σε συνολικό όγκο 200 μL. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στους 25 ◦C και η ανασταλτική κινητική κάθε δείγματος υδρολύματος μετυροσινάσηαναλύθηκε χρησιμοποιώντας διαγράμματα Lineweaver-Burk. Η αμοιβαία επανάληψη χρησιμοποιήθηκε για ταχεία ισορροπία από τη μη ανταγωνιστική αναστολή μικτού τύπου, όπως εκφράζεται στην Εξίσωση (1) [20]. Οι τιμές Ki για δείγματα υδρολύματος υπολογίστηκαν από επαναλήψεις κλίσης (Εξίσωση (2)).

όπου Vmax είναι η μέγιστη ταχύτητα τουτυροσινάσηδραστηριότητα, Ksis η σταθερά διάστασης του υποστρώματος (S) από το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος (ES), Kiis η σταθερά διάστασης του αναστολέα[I] από το σύμπλεγμα ενζύμου-αναστολέα και Kiis η σταθερά διάστασης του αναστολέα από το ένζυμο-υπόστρωμα -σύμπλεγμα αναστολέα (ESI).

2.11. Αναλύσεις κυτταρικής καλλιέργειας και βιωσιμότητας κυττάρων

Β16-Κύτταρα μελανώματος F10 (BCRC60031) ελήφθησαν από το Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Ταϊβάν. Τα κύτταρα Β16-F10 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (Gibco, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) που περιείχε 10 τοις εκατό FBS στους 37 °C σε 5 τοις εκατό CO2. Με θρυψινοποίηση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν. Η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση ανάλυσης 3-(4,{5-διμεθυλ-θειαζολ-2-υλ)-2,5-διφαινυλτετραζολιούμιδίου (MTT) όπως περιγράφεται από τον Lee [15 ].

2.12. Περιεκτικότητα σε κυτταρική μελανίνη

Η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Lee. [15]. Εν συντομία, τα κύτταρα Β16-F10 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6-πηγαδιών σε πυκνότητα 0.8 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100-nM -μελανοκυτταροτρόπο ορμόνη (-MSH), κοτζικό οξύ (θετικός έλεγχος) και υδρόλυμα σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Μετά από δύο φορές πλύση με PBS, τα κύτταρα λυσοποιήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 100 mM φωσφορικό νάτριο (pH 6,8), 1 τοις εκατό Triton X-100 και 0,1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για 30 λεπτά. Μετά τη συλλογή των κυττάρων, το σφαιρίδιο κυττάρων διαλύθηκε σε 1Ν NaOH που περιείχε 10 τοις εκατό DMSO στους 65°C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm.

2.13. Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν όπως περιγράφεται στην Ενότητα 2.11 και υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για πρωτεΐνη MITF που χρησιμοποιεί ένα αντίσωμα Anti-MITF.

2.14. Δοκιμασίες Προστασίας DNA

Η οξειδωτική βλάβη του DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μετατροπή του κυκλικού υπερτυλιγμένου pCI νεοπλασμιδικού DNA σε χαραγμένες κυκλικές ή περαιτέρω αποικοδομημένες μορφές χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [21,22] με ελαφρές τροποποιήσεις. Μείγματα αντίδρασης 20 µL περιείχαν 2,5 µL supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µL διαλύµατος αντίδρασης Fenton που περιείχε 30 mM υπεροξείδιο του υδρογόνου, 100-µM χλωριούχο σίδηρο και 100 μΜ ασκορβικό οξύ σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 20 mM (ρΗ 7,6) και 5 μL υδρολύματος (0,3325–5,32 mg/mL) ή κερκετίνης (θετικός έλεγχος, 250 μg/mL). Τα μείγματα αντίδρασης επωάστηκαν στους 37°C για 30 λεπτά και οι μορφές πλασμιδικού DNA διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 0,7 τοις εκατό και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Καναδάς).

Για ημιποσοτικοποίησηαντιοξειδωτικόΟι δραστηριότητες των εκχυλισμάτων, οι ποσότητες των υπερτυλιγμένων και χαραγμένων μορφών του pCI neo ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο AlphaImager Mini (proteinsimple) και οι εντάσεις ζώνης σε γέλες αγαρόζης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Gelpro. Ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, το νεοπλασμίδιο pCI επωάστηκε μόνο του και με το μίγμα αντιδραστηρίου Fenton, αντίστοιχα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσότητες υπερτυλιγμένου DNA σε σχέση με αυτό (100 τοις εκατό) στους αρνητικούς μάρτυρες. Οι προστατευτικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων υπολογίστηκαν από τις ποσότητες υπερτυλιγμένου και σπασμένου πλασμιδικού DNA χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις [23]:

Προστασία υπερτυλιγμένου πλασμιδίου (%) =υπερτυλιγμένη μορφή intensitypCI neo DNA ένταση ζώνης × 100

Προστασία χαραγμένου πλασμιδίου (%) =χαρακτηρισμένη μορφή intensitypCI neo DNA ένταση ζώνης × 100

2.15. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Οι διαφορές μεταξύ των θεραπειών εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test ή ANOVA ακολουθούμενο από το test Scheffe. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν p <>

3. Αποτελέσματα και συζήτηση

3.1. Προσδιορισμός Πτητικών Ενώσεων σε Υδροζόλ

Τα περιεχόμενα των υδρολυμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GC/MS. Τα συστατικά ταυτοποιήθηκαν σύμφωνα με τους χρόνους διατήρησης των προτύπων και οι ποσότητες προσδιορίστηκαν από τις περιοχές αιχμής των εκλουστικών (Εικόνα 2). Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2A–D, η τρανς-κινναμαλδεΰδη, η βενζαλδεΰδη και ο οξικός κινναμυλεστέρας ήταν οι κύριες ενώσεις στο υδρόλυμα COK και υπήρχαν στο 87,7 τοις εκατό , 7,0 τοις εκατό και 5,3 τοις εκατό, αντίστοιχα. Η ευγενόλη βρέθηκε προηγουμένως σε αιθέρια έλαια από το C. verum σε ποσοστό 7,29 τοις εκατό [24] αλλά δεν ανιχνεύτηκε στο παρόν υδρόλυμα COK (Εικόνα 2). Οι διαφορές στις διεργασίες εκχύλισης και στις μεθόδους ανάλυσης μπορεί να συμβάλλουν στις διαφορές στις περιεκτικότητες σε κινναμαλδεΰδη των αιθέριων ελαίων C. cassia [25].

3.2. Αντιοξειδωτικές ιδιότητες Hydrosol από φύλλα COK

3.2.1. Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών DPPH

Στο Σχήμα 3Α, οι δραστηριότητες σάρωσης ριζών DPPH των υδρολυμάτων από 1.06×10−2 έως 5,32×10−1 mg/mL ήταν μεταξύ 5.04. τοις εκατό ± 0,96 τοις εκατό και 41,76 τοις εκατό ± 2,50 τοις εκατό, αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν δοσοεξαρτώμενη δέσμευση ριζών από το υδρόλυμα COK. Συγκριτικά, οι θετικοί μάρτυρες BHT και -τοκοφερόλες εξάλειψαν το 94,32 τοις εκατό ± 0,08 τοις εκατό και το 93,82 τοις εκατό ± 0,13 τοις εκατό των αντιδραστικών ριζών DPPH, αντίστοιχα, σε 0,5 mg/mL. ).Πολλές μελέτες δείχνουν ότι τα φαινολικά και τα φλαβονοειδή εμποδίζουν τον σχηματισμό ριζών DPPH δίνοντας άτομα υδρογόνου. Ως εκ τούτου, οι δραστηριότητες σάρωσης ριζών DPPH των ειδών Cinnamomum μπορεί επίσης να αντικατοπτρίζουν δράσεις ως δότης υδρογόνου [26,27].

3.2.2. Χηλίωση ιόντων μετάλλων

Αξιολογήσαμε την ικανότητα δέσμευσης Fe2 συν των υδρολυμάτων σε 1,06 × 10−3 και 5,32 × 10−1 mg/mL, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Η χηλικοποίηση μετάλλων από συστατικά υδρολύματος αυξήθηκε οριακά με τη συγκέντρωση, αλλά στα 6 mg/mL, είχε μόνο το 37,3 τοις εκατό της χηλικοποιητικής δράσης του EDTA (Εικόνα 3Α).

3.2.3. Μείωση ισχύος

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η αναγωγική ισχύς των συστατικών του υδρολύματος ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση και ήταν υψηλότερη από εκείνη του ΒΗΤ και της τοκοφερόλης (0.22 ± 0.01 και {{9} }}.33 ± 0.15, αντίστοιχα) σε 0,5 mg/mL. Σε προηγούμενες μελέτες, η αναγωγική ισχύς των ακατέργαστων εκχυλισμάτων από κλαδιά C. osmophloeum σε κλάσματα BuOH ήταν η υψηλότερη μεταξύ όλων των κλασμάτων και αυξήθηκε γραμμικά με τη συγκέντρωση [28].αντιοξειδωτικόΤα δυναμικά διαφέρουν μεταξύ των ενώσεων στα εκχυλίσματα, η συνολική αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον διαλύτη εκχύλισης. Ωστόσο, η αναγωγική ισχύς (τιμή OD {{0}}.7) των υδάτινων εκχυλισμάτων από κλαδιά C. osmophloeum ήταν παρόμοια (τιμή OD=0.66 ± 0.01) με αυτή του παρόντος C. υδρολύματα οσμοφλοίου (Εικόνα 3Α), τα οποία παρήχθησαν με απόσταξη με ατμό. Η αναγωγική ισχύς σχετίζεται γενικά με την παρουσία αναγωγικών παραγόντων και αντιοξειδωτική δράση, αντανακλώντας τη διακοπή των αλυσιδωτών αντιδράσεων ελεύθερων ριζών με την παροχή αναγωγικών ατόμων υδρογόνου. Η αναγωγική ισχύς του C. osmophloeum πιθανότατα οφείλεται στην παρουσία των υδροξυλομάδων σε φαινολικές ενώσεις (Εικόνα 2), οι οποίες μπορεί να λειτουργήσουν ως δότες ηλεκτρονίων.

3.2.4. Δοκιμασίες TEAC

Οι τιμές TEAC του παρόντος υδρολύματος αυξήθηκαν σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 5,32 × 10-3 mg/mLand ήταν μεγαλύτερες από εκείνες των ενώσεων αναφοράς -τοκοφερόλη και BHT, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Η στερική προσβασιμότητα στη θέση ρίζας του ABTS plus είναι η Το κύριο κριτήριο για τη δράση στις δοκιμές TEAC. Κατά συνέπεια, οι φαινυλομάδες των παρόντων συστατικών υδρολύματος είναι ελαφρώς λιγότερο παρεμποδισμένες από αυτήν του Trolox.

3.2.5. Συσχετίσεις μεταξύ TPC και Αντιοξειδωτικών Δραστηριοτήτων

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, υπήρχε μια εξαιρετικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των TPCs και της δραστηριότητας σάρωσης ελεύθερων ριζών DPPH στο GAE από 1,75 ± 0,438 έως 100,41 ± 1,581 mg/g . Οι συντελεστές συσχέτισης του TPC με τη δραστηριότητα σάρωσης ελεύθερων ριζών DPPH, τη δραστηριότητα FIC, τη μειωτική ισχύ και το TEAC ήταν0,980, 0,925, 0,967 και 0,902, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι τοαντιοξειδωτικόΟι δραστηριότητες των υδρολυμάτων COK συσχετίζονται στενά με την περιεκτικότητα σε φαινόλη.

3.3. Επίδραση της συγκέντρωσης υδρολύματος COK στη δραστηριότητα της τυροσινάσης

Προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της συγκέντρωσης υδρολύματος COK στην οξείδωση της L-τυροσίνης και της L-DOPA από το μανιτάριτυροσινάσηκαι έκανε συγκρίσεις με τη δράση του κοζικού οξέος, το οποίο είναι πολύ γνωστός αναστολέας τυροσινάσης (Εικόνα 3C,D). Το παρόν υδρόλυμα ανέστειλε δυναμικά και δοσοεξαρτώμενα τις δραστηριότητες L-τυροσίνης και L-DOPA οξειδάσης της τυροσινάσης μανιταριού (Εικόνα 3C), αλλά είχε υψηλότερη ανασταλτική δράση τυροσινάσης παρουσία υποστρώματος L-τυροζίνης (δραστηριότητα μονοφαινολάσης) από το L-DOPA (δραστηριότητα διφαινολάσης). Οι τιμές IC5{{1{0}} του κοζικού οξέος έναντι της δράσης μονοφαινολάσης και διφαινολασών ήταν 4.0 × 10-5 και 7,8 × 10-3 mg/mL (Εικόνα 3C), αντίστοιχα, σημαντικά περισσότερα από αυτά του παρόντος υδρολύματος (7,96 × 10−4 mg/mL και 0,35 mg/mL, αντίστοιχα· Εικόνα 3D). Ως εκ τούτου, για να επιτευχθεί 90 τοις εκατό ανασταλτική δραστηριότητα της τυροσινάσης (δραστηριότητα μονοφαινολάσης), το υδρόλυμα και το κοτζικό οξύ απαιτούνταν σε 0,52 mg/mL και 4,0 × 10−3 mg/mL, αντίστοιχα, όταν χρησιμοποιήθηκε L-τυροσίνη ως υπόστρωμα (Εικόνα 3C, D ). Αν και οι ανασταλτικές επιδράσεις της τυροσινάσης απαιτούν υψηλότερες συγκεντρώσεις υδρολύματος COK σε κοτζικό οξύ, η ισχυρή ανασταλτική δράση της τυροσινάσης ήταν εμφανής σε αυτά τα πειράματα.

ΔιάφοροςτυροσινάσηΤα παρασκευάσματα, οι μέθοδοι προσδιορισμού δραστηριότητας και οι καθαρότητες και τα συστατικά αναστολέων θα μπορούσαν να έχουν συμβάλει στις διαφορές στην ανασταλτική κινητική των ενζύμων [29]. Ωστόσο, οι βιολογικές δραστηριότητες των φυτικών εκχυλισμάτων συνεισφέρονται από τα βιοενεργά συστατικά τους, τα οποία μπορεί να επηρεαστούν από το φυτικό είδος, τον χρόνο συγκομιδής, την εποχή, τη γεωγραφική προέλευση, τις αγρονομικές πρακτικές και τις μεθόδους εκχύλισης. Οι αναστολείς έχουν εντοπιστεί και χαρακτηριστεί από φυσικές πηγές σε πολλές πρόσφατες μελέτες και οι σχέσεις μεταξύ ανασταλτικών δράσεων και φυσικών συστατικών είναι καλά εδραιωμένες (Πίνακας 1). Ειδικότερα, πολλές αλδεΰδες και άλλες ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί ως αναστολείς τυροσινάσης. Αυτά περιλαμβάνουν κινναμαλδεΰδη, 2-υδροξυ-4-μεθοξυ βενζαλδεΰδη, ανισαλδεΰδη, κουμιναλδεΰδη, κουμικό οξύ, φλαβονόλες, φλαβόνες και ισοφλαβάνες [4,19,30-37]. Το παρόν υδρόλυμα περιείχε 87,7 τοις εκατό κινναμαλδεΰδη και 7,0 τοις εκατό βενζαλδεΰδη, υποδηλώνοντας ότι η κινναμαλδεΰδη, ακολουθούμενη από τη βενζαλδεΰδη, είναι η κύρια ουσία που είναι υπεύθυνη για την ανασταλτική δράση της τυροσινάσης του υδρολύματος. από καθαρή κινναμαλδεΰδη, και ενισχύει τηντυροσινάσηανασταλτική δράση του υδρολύματος. Επιβεβαιώθηκε επίσης ότι οι βενζαλδεΰδες αναστέλλουν τόσο τη δραστηριότητα διφαινολάσης όσο και τη δραστηριότητα μονοφαινολάσης της μανιτυροσινάσης [38]. Ο ανασταλτικός μηχανισμός της τυροσινάσης των αναστολέων τύπου βενζαλδεΰδης προέρχεται πιθανώς από την ικανότητά τους να σχηματίζουν μια βάση Schiff με μια πρωτογενή αμινομάδα στο ένζυμο [33,39]. πιθανώς σταθεροποιώντας τη βάση του Σιφ.

3.4. Kinetic Modes of Mushroom Tyrosinase Inhibition από την COK Hydrosol

Μελετήθηκαν οι κινητικές συμπεριφορές του υδρολύματος στη μονοφαινολάση και τη δράση της διφαινολάσης της τυροσινάσης χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα L-τυροσίνη και L-DOPA, αντίστοιχα. οτυροσινάσηΗ ανασταλτική κινητική του υδρολύματος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας διπλά αμοιβαία διαγράμματα Lineweaver-Burk, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Στο Σχήμα 4Α, Β, οι τέσσερις γραμμές αντιπροσωπεύουν μη ανασταλμένο ένζυμο (Γραμμή 1) και αναστολή από τρεις συγκεντρώσεις (Γραμμή 2 – Γραμμή 4) υδρολύματος, και αυτές οι γραμμές τέμνονται στα αριστερά του άξονα 1/v πάνω από τον άξονα 1/S. Κάτω από τις μη ανασταλμένες πειραματικές συνθήκες, η μέγιστη ταχύτητα (Vmax) της αντίδρασης οξείδωσης L-τυροσίνης και L-DOPA που καταλύθηκε από την τυροσινάση ήταν {{10}}.055 ΔOD475/λεπτό και 0,096 ΔOD475/λεπτό χωρίς να περιέχει υδρόλυμα (Γραμμή 1 στο Σχήμα 4Α, Β), αντίστοιχα. Οι κινητικές παράμετροι Km (σταθερά Μιχαήλ) για το μανιτάριτυροσινάσηπου ελήφθη από ένα Lineweaver–Burk που χρησιμοποιεί L-τυροσίνη και L-DOPA ως υποστρώματα, αντίστοιχα, δείχνει ότι το Km ήταν 0,534 mg/mL και0,511 mg/mL χωρίς να περιέχει υδρόλυμα (Γραμμή 1 στο Σχήμα 4Α, Β).

Οι τέσσερις γραμμές, που ελήφθησαν από το μη ανασταλμένο ένζυμο και από τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις υδροσόλης, τέμνονται στα αριστερά του άξονα 1/v πάνω από τον άξονα 1/S. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις υδρολύματος είχαν ως αποτέλεσμα μειωμένο Vmax και αυξημένο Km. Συγκεκριμένα, όταν η L-τυροσίνη χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα, οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις υδρολύματος οδήγησαν σε πολλαπλές γραμμές με διάφορες κλίσεις και τομές, αλλά αυτές τέμνονται μεταξύ τους στο δεύτερο τεταρτημόριο (Γραμμή 1-4 στο Σχήμα 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα επιτεύχθηκαν όταν το L-DOPA χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα (Γραμμή 1-4 στο Σχήμα 4Β), υποστηρίζοντας τον ισχυρισμό ότι το υδρόλυμα φέρει αναστολείς τυροσινάσης μικτού τύπου. Σύμφωνα με την αναστολή μικτού τύπου, τα συστατικά υδρολύματος πιθανότατα δεσμεύουν το ελεύθερο ένζυμο και το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος. Οι αναστολές μικτού τύπου μπορούν να προκύψουν με πολλούς τρόπους: η αναστολή του υδρολύματος θα μπορούσε να προκύψει επειδή αλληλεπιδρούν με ένα μετέπειτα ενδιάμεσο στο πρότυπο αντίδρασης αλλά όχι με ένα αρχικό σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος [40]. Έτσι, προσδιορίσαμε τις σταθερές διάστασης (Ki και Ki, αντίστοιχα) για τον αναστολέα που δεσμεύεται με το ελεύθερο ένζυμο (Ε) και το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος χρησιμοποιώντας διπλά αμοιβαία διαγράμματα και διαγράμματα κλίσης και κατακόρυφης τομής έναντι των συγκεντρώσεων υδρολύματος παρουσία L-τυροσίνης (Εικόνα 4C, D) ή L- DOPA ως υποστρώματα (Εικόνα 4Ε, ΣΤ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, Β, η τιμή Ki όταν χρησιμοποιήθηκε η L-τυροσίνη ως υπόστρωμα ήταν περίπου 1,28 φορές χαμηλότερη από αυτή παρουσία L-DOPA, υποδεικνύοντας πιο αποτελεσματική ανασταλτική δέσμευση ενζύμου με L-τυροσίνη παρά με L-DOPA. Επιπλέον, η τιμή του Ki ήταν 1,71 φορές μεγαλύτερη από την τιμή Ki για την οξείδωση του L-DOPA, υποδεικνύοντας ότι η συγγένεια των συστατικών υδρολύματος για το ελεύθερο ένζυμο είναι ισχυρότερη από εκείνη για το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το υδρόλυμα επηρεάζει τη συγγένεια του το ένζυμο για το L-DOPA αλλά δεν δεσμεύει την ενεργό θέση. Επιπλέον, η τιμή του Ki ήταν σχεδόν ίδια με το Ki για την οξείδωση της L-τυροσίνης, υποδεικνύοντας ότι οι μικτοί αναστολείς είναι οι μη ανταγωνιστικοί αναστολείς, οι οποίοι συνδέονται με ένα ελεύθερο ένζυμο και ένα σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος με την ίδια σταθερά ισορροπίας χρησιμοποιώντας L- τυροσίνη ως υπόστρωμα (Εικόνα 4Α). Ωστόσο, οι σταθερές δέσμευσης ισορροπίας για το ελεύθερο ένζυμο και το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος, αντίστοιχα, είναι διαφορετικές χρησιμοποιώντας το L-DOPA ως υπόστρωμα (Εικόνα 4Β), υποδεικνύοντας ότι ο αναστολέας μικτού τύπου (ανταγωνιστικός και μη ανταγωνιστικός μεικτός) μπορεί να συνδεθεί όχι μόνο με ένα ελεύθερο ένζυμο αλλά επίσης με το σύμπλεγμα ενζύμου-υποστρώματος χρησιμοποιώντας L-DOPA ως υπόστρωμα. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν επίσης ότι το αιθέριο έλαιο C. cassia και η κινναμαλδεΰδη είναι αναστολείς μικτού τύπου [19]. Αντίθετα, η τρανς-κινναμαλδεΰδη που απομονώθηκε από το φλοιό του C. cassia έδειξε ανταγωνιστική αναστολή για την οξείδωση του L-DOPA από το μανιτάριτυροσινάση[32], ενώ η κινναμαλδεΰδη απομονώθηκε από τη ρίζα του P. Το cernua ήταν μια μη ανταγωνιστική αναστολή [35].

3.5. Επιδράσεις εξαρτώμενες από τη συγκέντρωση των συγκεντρώσεων υδρολύματος στη μελανογένεση

Για τον προσδιορισμό των επιδράσεων του υδρολύματος στη βιωσιμότητα και τη μελανογένεση των κυττάρων σε ποικίλες συγκεντρώσεις ({0}}.0035–10,64 mg/mL), προκλήθηκε μελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος B16-F10 χρησιμοποιώντας -MSH και συγκρίθηκε τις επιδράσεις χρησιμοποιώντας το κοτζικό οξύ ως θετικό μάρτυρα (Εικόνα 5). Το αποτέλεσμα αυτής της δοκιμασίας βιωσιμότητας κυττάρων έδειξε ότι το υδρόλυμα δεν είχε κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις 0,0035-1,064 mg/mL σε κύτταρα μελανώματος B16F10 (Εικόνα 5α). Καθώς αναπτύσσονται αναστολείς μελανογένεσης, η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα θα πρέπει να είναι το πιο σημαντικό στοιχείο για πολλές εφαρμογές. Ωστόσο, η θεραπεία των κυττάρων μελανώματος B16F10 με υδρόλυμα οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε συγκεντρώσεις 5,32–10,64 mg/mL. Σύμφωνα με αποτελέσματα από μελέτες διαλογής ασφάλειας και αποτελεσματικότητας τουλεύκανση δέρματοςπροϊόντα σε κυτταροκαλλιέργειες B16F10, 1,064 mg/mL είναι μια συγκέντρωση κατωφλίου για τον πρωτογενή έλεγχο με βάση τα κύτταρα. Ως εκ τούτου, συγκεντρώσεις 0,1064–1,064 mg/mL χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστούν οι μηχανισμοί της αντι-τυροσινάσης σε κύτταρα μελανώματος B16F10 από υδρόλυμα.

Η καταστολή της μελανογένεσης με επεξεργασίες με υδροζόλ σε διάφορες συγκεντρώσεις προσδιορίστηκε ως ποσοστά των περιεχομένων μελανίνης στα κύτταρα (Εικόνα 5β). Αναλύσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης MITF χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Εικόνα 5γ). Σε αυτά τα πειράματα, τα περιεχόμενα μελανίνης και τα επίπεδα έκφρασης MITF καταστέλλονταν εξαρτώμενα από τη δόση από το COK hydrosol, υποδηλώνοντας ότι το COK hydrosol μειώνει την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα καταστέλλοντας τη σύνθεση MITF.

3.6. Δοκιμασίες Προστασίας DNA

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου είναι γνωστό ότι βλάπτουν το DNA και προκαλούν γήρανση των κυττάρων και καρκίνο. Οι δοκιμασίες DNAnicking προσφέρουν ένα βολικό σύστημα μοντέλου χωρίς κύτταρα για τον ευαίσθητο προσδιορισμό της παραγωγής ριζών που βλάπτουν το DNA [41]. Σε αυτά τα πειράματα, οι αντιδράσεις Fenton παρήγαγαν ρίζες υδροξυλίου που διασπούν το υπερτυλιγμένο πλασμιδιακό DNA και το μετατρέπουν στη χαραγμένη μορφή του DNA, η οποία έχει μειωμένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα. [42,43]. Έτσι, για να αξιολογήσουμε τις προστατευτικές δράσεις του DNA του υδρολύματος, επωάσαμε το pCI neo DNA με τα αντιδραστήρια Fenton [44]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, οι μορφές πλασμιδίου με υπερτυλιγμένες και εγκοπές διακρίνονται σαφώς από τους σχετικούς ρυθμούς ηλεκτροφορητικής κινητικότητάς τους σε γέλη αγαρόζης. Το supercoiledDNA κινούνταν με τον ταχύτερο ρυθμό και το χαραγμένο DNA με την πιο αργή κίνηση, αντίστοιχα. Μετά από θεραπείες με υδρόλυμα, η βλάβη του DNA μειώθηκε ελαφρώς σε συγκεντρώσεις υδρολύματος 1,33–5,32 mg/mL, με 28–58 τοις εκατό προστασία της υπερτυλιγμένης μορφής, αντίστοιχα (λωρίδες 6–8). Σε συγκεντρώσεις υδρολύματος 0,3325–0,665 mg/mL, δεν παρατηρήθηκε προστασία σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα (λωρίδες 4 και 5). Αντίθετα, η κερσετίνη προστάτευσε αποτελεσματικά το πλασμιδικό DNA από τις ρίζες υδροξυλίου διαμεσολαβούμενος κατακερματισμός, όπως φαίνεται προηγουμένως [45]. Αυτά είναι τα πρώτα δεδομένα που δείχνουν τις προστατευτικές επιδράσεις των εκχυλισμάτων υδρολύματος από το C. Το οσμόφλοιο Kanehira αφήνει βλάβη στο DNA από τις αντιδράσεις Fenton. Αυτά τα αποτελέσματα είναι πιθανό να οφείλονται στην παρουσία ενώσεων πολυφαινόλης.

4. Συμπεράσματα

Το COK χρησιμοποιείται από καιρό ως φαρμακευτικό φυτό στην Ταϊβάν. Ωστόσο, από ό,τι γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που καταδεικνύει ότι τα υδροσόλια που παρασκευάζονται με απόσταξη ατμού από φύλλα COK έχουν αντιοξειδωτική δράση, όπως παρατηρείται σε προσδιορισμούςαντιοξειδωτικόδραστηριότητα και βλάβη του DNA. Δείξαμε επίσης ότι αυτό το υδρόλυμα καταστέλλει τη μελανογένεση. Σε αναλύσεις GC/MS, οι κύριες ενώσεις στο υδρόλυμα COK βρέθηκαν να είναι η κινναμαλδεΰδη και η βενζαλδεΰδη, και αυτοί οι παράγοντες ήταν ισχυρά ανασταλτικοί έναντι της δράσης μονοφαινολάσης και διφαινολάσης της τυροσινάσης. Στις αξιολογήσεις μας για την κινητική αναστολής της τυροσινάσης, το υδρόλυμα COK εμφάνισε μια μικτού τύπου δοσοεξαρτώμενη αναστολή τόσο της L-τυροσίνης όσο και της L-DOPA οξειδάσηςτυροσινάση. Οι παρούσες ενώσεις υδρολύματος κατέστειλαν επίσης την έκφραση πρωτεΐνης MITF, οδηγώντας σε μειωμένη επαγόμενη από -MSH σύνθεση μελανίνης.

Τέλος, η ασφάλεια είναι ένα σημαντικό ζήτημα για τους αναστολείς τυροσινάσης, ειδικά για εκείνους που χρησιμοποιούνται καλλυντικά και προϊόντα διατροφής, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ελεγχόμενες ποσότητες. Το COK είναι ήδη ένα βρώσιμο και ευρέως χρησιμοποιούμενο φυσικό πρόσθετο για τρόφιμα και καλλυντικά. Επιπλέον, η κινναμαλδεΰδη είναι γενικά αναγνωρισμένη ως ασφαλής για ανθρώπινη κατανάλωση. Το COK hydrosol είναι ένα εξαιρετικό φυσικό βιοϋλικό με αποτελεσματικό και ασφαλέςτυροσινάσηκαι την ανασταλτική δραστηριότητα της σύνθεσης μελανίνης και τη δυνατότητα προστασίας έναντι της βλάβης του DNA. Επομένως, πιστεύουμε ότι το COK hydrosol θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ασφαλής και αποτελεσματικός παράγοντας αποχρωματισμού για πολλές εφαρμογές.