Τα νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου προάγουν τη διαδικασία γήρανσης με τρόπο που εξαρτάται από το μέγεθος

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη

Τα νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO) (NPs) χρησιμοποιούνται γενικά σε καλλυντικά προϊόντα, υπόστεγα, βιοαισθητήρες και διανομή φαρμάκων. Όπως τα ιδανικά συστήματα in vitro, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSC) χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της οξείας τοξικότητας. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήθηκαν οι εξαρτώμενες από το μέγεθος επιδράσεις κυτταροτοξικότητας των ZnO NPs στα MSCs. Τα MSC του μυελού των οστών και του λιπώδους ιστού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZnO NPs με μέσα μεγέθη 10-30 και 35-45 nm. Οι συγκεντρώσεις 5 και 10 ug/ml ZnO NP βρέθηκαν να είναι οι ασφαλείς συγκεντρώσεις για τα μεγέθη NP των 10-30 και 35-45 nm, αντίστοιχα.οφέλη από το cistancheΗ ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι το μικρό μέγεθος των NPs ZnO έχει περισσότερες αρνητικές επιπτώσεις στη διαδικασία εισόδου των κυττάρων στη σύνθεση DNA σε σύγκριση με το μεγαλύτερο μέγεθος. Τα αποτελέσματα της δοκιμής -γαλακτοσιδάσης έδειξαν την προώθηση της γήρανσης Forocess στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με το μικρότερο μέγεθος ZnO NPs. Και τα δύο μεγέθη του NP βρέθηκαν να ρυθμίζουν προς τα πάνω τα γονίδια NF-kB και p53 που σχετίζονται με τη γήρανση και να μειώνουν το γονίδιο αντιγήρανσης Nanog. Συνοψίζοντας, το μικρότερο μέγεθος των NP ZnO μπορεί να ενισχύσει τη διαδικασία γήρανσης στα κύτταρα.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Την τελευταία δεκαετία, η βιομηχανία νανοτεχνολογίας πρέπει να αναπτυχθεί γρήγορα σε όλο τον κόσμο. Τα νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO) χρησιμοποιούνται γενικά σε προϊόντα περιποίησης ομορφιάς, υπόστεγα, βιοαισθητήρες, χορήγηση φαρμάκων, βιοαπεικόνιση και ως αντιμυκητιακούς και αντιβακτηριακούς παράγοντες [1-5]. Οι νανοδομές ZnO έχουν μερικές εξαιρετικές ιδιότητες καθώς και σταθερότητα σύνθετης λίπανσης, μεγάλο εύρος ειδικής επιφάνειας, υψηλές επισημάνσεις αντιστοιχίας ηλεκτρονίων και δραστηριότητα ηλεκτροσύνθεσης [6]. Τα NP ZnO χρησιμοποιούνται ως επί το πλείστον ως προστιθέμενη ουσία που διαχέει την υπεριώδη ακτινοβολία σε καλλυντικά προϊόντα, όπως αντηλιακά, οδοντόκρεμες και προϊόντα magnificence [7, 8]. Με την ευρεία εφαρμογή νανοδομημένων ουσιών για εμπορικά είδη, η βιοασφάλεια αυτών των υλικών έχει θεωρηθεί για τη διερεύνηση των φυσικών και τοξικολογικών επιπτώσεων της ανώμαλης και άμεσης εκδήλωσης αυτών των ουσιών [9]. Λόγω των δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και των αδιάλυτων μεταλλικών ιόντων τους, τα νανοϋλικά όπως το ZnO έχουν τοξικές επιπτώσεις στα κύτταρα [10,11].cistanche χοληστερόληΚαθώς η τοξικότητα των NPs ZnO είναι υψηλότερη στο υπερκαθαρό νερό από ότι στο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) σε διάφορα υδατικά μέσα, η τοξικότητα των NPs ZnO είναι ως επί το πλείστον σύμφωνη με τα ελεύθερα ιόντα ψευδαργύρου [12]. Ενώ το σύμπλεγμα ψευδαργύρου NP με μέσα προκαλεί χαμηλότερη τοξικότητα, η συγκέντρωση των ιόντων Zn2 συν μειώνεται σημαντικά. Τα παραγόμενα Zn2 συν αδιάλυτα ZnO NPs προκαλούν νέκρωση και φλεγμονή [13]. Το μεσοκυττάριο ROS, το οποίο προκαλείται από ZnO NPs, προκαλεί κυτταρικό θάνατο και δυσλειτουργία της μιτοχονδριακής οξειδωτικής φωσφορυλίωσης [10].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Αρκετά in vivo πειράματα έχουν δείξει τις επιβλαβείς επιδράσεις των NPs Zn σε διάφορες μορφές ζωής όπως η δροσόφιλα [14], τα ψάρια [15], τα αμφιπόδια [16], τα ποντίκια [17], οι αρουραίοι [18] και τα βακτήρια [19]. Τα NP Zn έχουν επίσης αναφερθεί ότι παρουσιάζουν in vitro τοξικότητα [20-22]. Παρά τις πολλές κρυφές τοξικότητες που σχετίζονται με τα NP ZnO, χρησιμοποιούνται ευρέως για διάφορες βιοϊατρικές εφαρμογές και φαρμακευτικούς σκοπούς [23]. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την αξιολόγηση της τοξικής επίδρασης αυτής της ένωσης στα κύτταρα. Στην τοξικολογική έρευνα, τα MSC χρησιμοποιούνται ως ιδανική μοντελοποίηση in vivo [24]. Η απομόνωση και η επέκταση των MSC στην καλλιέργεια είναι εύκολη και η διαφοροποίησή τους γίνεται μέσω κατάλληλης διέγερσης. Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών (BMSCs) δείχνουν ευαισθησία σε τεστ κυτταροτοξικότητας των αντικαρκινικών φαρμάκων και ορισμένων άλλων κυτταροτοξικών φαρμάκων [25]. Επιπλέον, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που προέρχονται από λιπώδη ιστό (AMSCs) χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της ασφάλειας των φαρμάκων και για την ανακάλυψη φαρμάκων [26]. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι τα AMSC και τα BMSC που στοχεύουν τα NP ZnO μπορεί να είναι κατάλληλα για την εξέταση των πιθανών κινδύνων στην ανάπτυξη της γήρανσης. Για την αξιολόγηση της κυτταρικής τοξικότητας, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, ένας παράγοντας που παίζει ρόλο στις πρώιμες τοξικές διεργασίες, είναι εξαιρετικά σημαντική [26]. Έτσι, ως ειδικός δείκτης βλαστοκυττάρων, το γονίδιο Nanog χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα έρευνα για την πρόβλεψη της τοξικότητας. Το Nanog έχει δύο λειτουργίες στη διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων και στην αυτοανανέωση [27]. Επιπλέον, το γονίδιο Nanog διεγείρει την καταστολή της γήρανσης μειώνοντας την έκφραση του γονιδίου p27KIPI [28].παρενέργειες cistanche deserticolaΣε κλασική απόκριση στη γονοτοξικότητα, για τον περιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η ρ53 στα κατεστραμμένα γονιδιώματα προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο. Πολυάριθμες έρευνες έχουν επισημάνει τον ρόλο του πλαισίου NF-kB στην ενεργοποίηση των διεγερτικών αλλαγών στους ιστούς κατά τη γήρανση [29]. Επομένως, στην παρούσα μελέτη, ελήφθησαν υπόψη η δοκιμασία κυτταρικού κύκλου, η δοκιμασία γαλακτοσιδάσης in situ και τα επίπεδα mRNA των γονιδίων NF-kB, p53 και Nanog.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1 Ιδιότητες και χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων

Αγοράστηκαν δύο διαφορετικά μεγέθη NP ZnO (Sigma Aldrich, ΗΠΑ) με τις ακόλουθες πληροφορίες: ένα με μέσο μέγεθος 10-30nm, συν 99 τοις εκατό καθαρότητα, 5,606 g/cm³ πυκνότητα και περίπου 20-60m2/ g επιφάνειας και το άλλο με 35-45 nm μέσο μέγεθος, -99 τοις εκατό καθαρότητα, 5,606 g/cm³ πυκνότητα και περίπου 65 m-/g επιφάνειας (Εικ. 1). Στη συνέχεια, παρασκευάστηκε ένα απόθεμα 100 μg/ml εναιωρήματος ZnO NPs σε 1 ml PBS με υπερήχους για 3 λεπτά.

2.2 Απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων

Τα BMSC επιλέχθηκαν από αρσενικούς αρουραίους {{{0}}εβδομάδων (200-250 g). Οι επιφύσεις αφαιρέθηκαν, έγινε πρόσβαση στις κοιλότητες του μυελού και τα βύσματα ολικού μυελού των οστών (BM) κοκκινίστηκαν από τα οστά της κνήμης και του μηριαίου οστού με μια σύριγγα 10 ml που περιείχε το Dulbecco's τροποποιημένο μέσο αετού (DMEM) (Laboratories Inc., MA, USA) συν 10 ποσοστό εμβρυϊκού ορού βοοειδών (FBS). Δείγματα BM συλλέχθηκαν και αναστατώθηκαν με ακρίβεια από διαδοχικές βελόνες επιθυμίας 18 και 20 gauge που προσαρτήθηκαν σε παρόμοια σύριγγα των 10 ml. Στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1000 rpm. Μετά την σφαιροποίηση των κυττάρων, αυτά επαναιωρήθηκαν στο μέσο με 10 τοις εκατό FBS. Για να παίξει έναν μετρητή καταμέτρησης κυττάρων, 4 τοις εκατό οξικό οξύ αναμίχθηκε με μια χαμηλή ποσότητα του εναιωρήματος για να λυθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Η μέτρηση των κυττάρων έγινε με αιμοκυτταρόμετρο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα 5×10' επιστρώθηκαν σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 100 mm, διατηρήθηκαν σε 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς και άλλαζαν με ένα νέο μέσο κάθε 3-4 ημέρες [30]. Χρησιμοποιώντας κολλαγενάση τύπου Ι (0,15 τοις εκατό βάρος προς όγκο) για 1 ώρα στους 37 βαθμούς, ο λιπώδης ιστός στη συνέχεια διαχωρίστηκε ενζυματικά. Για την αφαίρεση αδιάσπαστων σωματιδίων, το εναιώρημα διηθήθηκε με ένα φίλτρο 70-um. Στη συνέχεια, προστέθηκε DMEM με 10 τοις εκατό (ο/ο) FBS και φυγοκεντρήθηκε στα 700xg για 5 λεπτά. Τέλος, το ίζημα του κυττάρου επαναιωρήθηκε σε DMEM με 1 τοις εκατό (v/v) πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και 10 τοις εκατό (v/v) FBS [31].

2.3 Κυτταρική καλλιέργεια

Τα AMSC και τα BMSCs καλλιεργήθηκαν σε DMEM (Laboratories Inc., MA, USA) με 1 τοις εκατό αντιβιοτικά και 10 τοις εκατό FBS στις τυπικές συνθήκες καλλιέργειας (στους 37 βαθμούς, σε 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό υγρασία)[32].

2.4 Χαρακτηρισμός επιφανειακών δεικτών BMSC και AMSCS

Τα BMSC και τα AMSC συλλέχθηκαν για 5 λεπτά στους 37 βαθμούς, επιστρώθηκαν με φυγοκέντρηση 200xg για 5 λεπτά και ξεπλύθηκαν με ψυχρό PBS. Στη συνέχεια, 5 ul αντισωμάτων συζευγμένων με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συμπεριλαμβανομένων CD34-PE, CD90-FITC, CD45-FITC και CD73-FITC (Thermo Fisher Scientific, Germany), προστέθηκε στα BMSC και AMSC και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και σε σκοτεινό μέρος για 20 λεπτά. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής (BD FACS Caliber; San Jose, CA, USA)[33, 34].

2.5 Κυτταροτοξικότητα in vitro

Για τη δοκιμή κυτταροτοξικότητας του NPS, τα BMSCs και τα AMSC καλλιεργήθηκαν σε πλάκες {{0}}πηγαδιών σε συρροή 70-80 τοις εκατό, όλα τα σωματίδια εναιωρήθηκαν σε πλήρες DMEM (10 τοις εκατό αραιωμένα NPs με 90 τοις εκατό DMEM που περιέχει PBS)[35]. Η υπερήχηση στο μπάνιο έγινε δύο φορές, κάθε φορά για 5 λεπτά, για να αναμειχθούν λεπτά οι τελικές συγκεντρώσεις ZnO NPs. Επομένως, τα BMSC και τα AMSC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,3,5,10,25 και 50 μg/ml) ZnO NPs για 24, 48 και 72 ώρες. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε μια δοκιμασία ΜΤΤ για να ελεγχθεί η βιωσιμότητα των επεξεργασμένων κυττάρων.cistanche δοσολογία redditΗ παρασκευή του μητρικού διαλύματος ΜΤΤ ((3-(4,5-diminish αιθυλοθειαζόλη-2-υλ)- 2,5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο) έγινε με προσθήκη 1 ml PBS σε 5 mg MTT (Sigma, Η.Π.Α.) σε σκοτεινό μέρος Στη συνέχεια, 20 λίτρα του αποθεματικού διαλύματος αναμίχθηκαν με όλα τα πειραματικά φρεάτια (κύτταρα ελέγχου και ZnO NPs κατεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις), δονήθηκαν για 10 λεπτά και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 3 ώρες Τέλος, τα δείγματα απομακρύνθηκαν από τον επωαστήρα και αναμίχθηκαν με DMSO, με ένα πορφυρό χρώμα αισθητό σε αυτό το στάδιο.Αναπτύχθηκαν με πιπέτα και διαβάστηκαν αμέσως παρουσία UV στα 570nm.

2.6 Δοκιμασία κυτταρικού κύκλου

Τα BMSC και τα AMSC σπάρθηκαν σε διαφορετικές 6-πλάκες φρεατίων. Ενώ παρατηρήθηκε η κυτταρική συρροή 70%, ασφαλείς συγκεντρώσεις ZnO NPs (5 και 10ug/ml σε μικρότερα και μεγαλύτερα μεγέθη ZnO NPs, αντίστοιχα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στα κύτταρα για ανάλυση MTT και επωάστηκαν για 72 ώρες στους 37 βαθμούς (5 τοις εκατό CO2). Τα μέσα αφαιρέθηκαν από τον ομοεστιακό δίσκο μετά από 72 ώρες και πλύθηκαν με PBS δύο φορές και φυγοκεντρήθηκαν. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αιθανόλη (70 τοις εκατό) στους 4 βαθμούς για 2 ημέρες. Στη συνέχεια, τα επωασμένα κύτταρα ξεπλύθηκαν και πάλι με PBS και ανακινήθηκαν ελαφρά, και στη συνέχεια τα μέσα αφαιρέθηκαν πλήρως από τον ομοεστιακό δίσκο. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 10 μΐ RNase και επωάστηκαν για 45 λεπτά. Για χρώση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν με 10 μΐ διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου (Sigma, ΗΠΑ). Ένα κυτταρόμετρο ροής υποβλήθηκε για την αξιολόγηση του DNA των κυττάρων [36].

2.7 Δοκιμασία γαλακτοσιδάσης in situ για κυτταρική γήρανση

Η δραστηριότητα της γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με τη γήρανση (SA-gal), ως κοινού βιοδείκτη για τη δοκιμασία γήρανσης στα κύτταρα, αξιολογήθηκε με κιτ χρώσης SA{3}gal (Thermo Fisher Scientific, Γερμανία) όπως και σε προηγούμενες μελέτες [37]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο διαφορετικά μεγέθη ZnO NPs με ασφαλείς συγκεντρώσεις. Στη συνέχεια, πλύθηκαν σε PBS, σταθεροποιήθηκαν σε σταθεροποιητικό μίγμα G/F (20 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη ＋ 37 τοις εκατό φορμαλδίδη) και επωάστηκαν σε RT για 3-5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν σε ένα φρέσκο ​​διάλυμα χρώσης (10 ml κιτρικό Na συν 250 μλ σιδηροκυανιούχο κάλιο ＋250 μλ σιδηροκυανιούχο κάλιο＋100 μλ MgCl＋250 μλ NaCl＋200 μλ NaCl＋200 μλ. πράσινο χρώμα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ανεστραμμένου φωτός.

2.8 PCR σε πραγματικό χρόνο

Τα BMSC και τα AMSC με δύο διαφορετικά μεγέθη ZnO NP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε βέλτιστες συγκεντρώσεις 5 και 10 ug/ml, αντίστοιχα. Συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες και χρησιμοποιήθηκε κιτ εκχύλισης RNA (Bio Basic INC) για την εξαγωγή του συνολικού RNA. Ο πρώτος κλώνος του cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green qPCR MasterMix 2X, βαθμός SYBR Premix Ex TaqIM (TaKaRa, Ιαπωνία). Στη συνέχεια, η ποιότητα και η ποσότητα του συντιθέμενου cDNA αξιολογήθηκαν με φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Γερμανία).οφέλη από το εκχύλισμα κιστάνςΣτη συνέχεια, 2 μΐ του cDNA χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση γονιδίου στόχου. Ειδικοί εκκινητές σχεδιάστηκαν από το λογισμικό Primer 3 και χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση της έκφρασης των γονιδίων p53, NF-kB και Nanog (General Biotech, Κορέα). Η αλληλουχία των εκκινητών παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.

Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου GAPDH ως γονίδιο οικιακής φροντίδας. Για να πραγματοποιηθεί PCR σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιήθηκε ο πρώτος κύκλος στους 95 βαθμούς για 3 λεπτά και 40 κύκλοι στους 95 βαθμούς για τη δεκαετία του '20, στους 60 βαθμούς για τα 20 δευτερόλεπτα και στους 72 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα.

2.9 Στατιστική ανάλυση

Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα εμφανίστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Τα δεδομένα τροφοδοτήθηκαν σε λογισμικό SPSS (IBM Corp. NY, USA) και αναλύθηκαν με αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA).

3 Αποτελέσματα

3.1 Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων

Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα αρουραίου διαχωρίστηκαν από δύο προελεύσεις, συμπεριλαμβανομένου του λιπώδους ιστού και του ΒΜ. Οι επιφανειακοί δείκτες CD των MSCs ελέγχθηκαν και η πλειονότητα των AMSCs ή BMSCs (98,18 και 99,62 τοις εκατό ) βρέθηκαν για CD90 ως θετικός δείκτης επιφάνειας στα MSC (Εικ.2Α, Β). Επιπλέον, το 94,80 και το 99,76 τοις εκατό του CD73 σε AMSC ή BMSC ήταν σίγουρα χρωματισμένα, αντίστοιχα (Εικ. 2Α, Β). Επιπλέον, ένα ασήμαντο ποσοστό BMSC ή AMSC έδειξε την έκφραση των CD45 (0.18 ή 0,56 τοις εκατό ) και CD34 (0,71 ή 12,65 τοις εκατό ) σε AMSC ή BMSCs, αντίστοιχα, που είναι οι δείκτες των αιμοποιητικών σειρών (Εικ. .2Α, Β). Αυτά τα μοριακά προφίλ επιδεικνύουν τις εξαιρετικές ιδιότητες των BMSC και AMSC. Επιπλέον, εγκρίνουν την ποιοτική αφαίρεση αιμοποιητικών κυττάρων και την απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από λιπώδη ιστό και ΒΜ κατά την απομόνωση των στρωματικών κυττάρων.

3.2 Κυτταροτοξικότητα in vitro

Η χρωματομετρική δοκιμή κυτταροτοξικότητας με βάση το ΜΤΤ εφαρμόστηκε για τη διερεύνηση της βιωσιμότητας των BMSC ή των AMSC μετά τις θεραπείες τους με 10-30 και 35-45 nm ZnO NPs για 1,2 και 3 ημέρες (Εικ. 3). Σύμφωνα με τα δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα 2, τα αποτελέσματα δύο διαφορετικών μεγεθών ZnO NPs στα BMSC ή τα AMSC εξαρτώνται από τη δόση και τον χρόνο. Στη δόση 5 και 10 ug/ml, τα NP ZnO 10-30 και 35-45 nm έδειξαν καλή βιωσιμότητα για τα AMSC και τα BMSCs, αντίστοιχα (Εικ. 3). Επιπλέον, η βιωσιμότητα των AMSC και των BMSC με 35-45 nm ZnO NPs μειώθηκε με τρόπο δοσοεξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο στις ίδιες συγκεντρώσεις (Εικ. 3).

3.3 Δοκιμασία κυτταρικού κύκλου

Οι επιδράσεις των NPs ZnO στις κατανομές του κυτταρικού κύκλου των BMSCs και AMSCs μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, τα AMSC και τα BMSC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10-30nm ZnO NP

έδειξε ότι η αναλογία των κυττάρων που εισέρχονται στη φάση GO/Gl αυξήθηκε (82,2 και 82,{8}}1 τοις εκατό ) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (81,92 και 78,76 τοις εκατό, αντίστοιχα). Όταν τα σήματα που οδηγούν τον πολλαπλασιασμό εμφανίζουν απόπτωση ή λείπουν, τα κύτταρα έχουν την τάση να αυξάνονται στο G0/G1 [38].

Επιπλέον, στα AMSC και τα BMSC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10-30nm ZnO NPs, η φάση G2/M μειώθηκε (7,38 και 9,98 τοις εκατό δεκτικά) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (10,04 και 13,47 τοις εκατό ), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα διακόπηκαν σε Ο κυτταρικός κύκλος S και οι φάσεις G2/M και δεν πολλαπλασιάζονταν ενεργά (Εικ.4). Ωστόσο, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των 35-45 nm ZnO NPs έδειξε αυξημένη συσσώρευση κυττάρων φάσης G2/M σε AMSCs και BMSCs (14,19 και 16,18 τοις εκατό, δεκτικά) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου G2/M (10,04 και 13,47 τοις εκατό), υποδηλώνοντας την καθυστέρηση της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου (Εικ. 4). Όταν το DNA βλάπτεται, το σημείο ελέγχου G2 αναστέλλει τη μίτωση των κυττάρων και διασφαλίζει τον πολλαπλασιασμό των διπλών γονιδιωμάτων χωρίς σφάλματα σε κάθε θυγατρικό κύτταρο.

3.4 Δοκιμασία γαλακτοσιδάσης in situ

Η δραστηριότητα του ενζύμου βήτα-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν την εργασία για να ελεγχθεί η επίδραση των 10-30 και 35-45 nm ZnO NPs στη γήρανση των BMSC και των AMSCs. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι κυτταρικές περιοχές με θετική πράσινη χρώση παρατηρήθηκαν πιο συχνά στην ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με ZnO NP και στους δύο τύπους βλαστικών κυττάρων αρουραίου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 5Α, Β).

Στα φυσιολογικά κύτταρα, όξινες λυσοσωμικές-γαλακτοσιδάσες παρήχθησαν και συλλέχθηκαν στο λυσόσωμα, όπως παρατηρήθηκε στις ομάδες ελέγχου. Αλλά στα γηρασμένα κύτταρα, το λυσόσωμα αυξήθηκε και παρήγαγε ένα ανώτερο επίπεδο -γαλακτοσιδάσης, που ονομάζεται σχετιζόμενη με τη γήρανση -γαλακτοσιδάση (SA{4}}gal), όπως ανιχνεύθηκε στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZnO NPs (Εικ. 5). Τα θετικά κύτταρα του SA-gal χρωματίστηκαν μπλε-πράσινο κάτω από μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. Και τα δύο κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή ήταν θετικά σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Το υψηλότερο μπλε-πράσινο χρώμα ελήφθη σε AMSC με 10-30nm ZnO NPs (Εικ. 5Α).

3.5 PCR σε πραγματικό χρόνο

Η σχετική έκφραση των γονιδίων NF-kB, P53 και Nanog αξιολογήθηκε σε σχέση με το GAPDH ως ένα γονίδιο που βοηθάει στο σπίτι τόσο στα BMSC όσο και στα AMSC, τα οποία εκτέθηκαν σε 5 και 10 ug/ml ZnO NPs σε 10-30 και 35-45 μεγέθη nm, αντίστοιχα, μετά από 48 ώρες. Τα αποτελέσματα της έκφρασης των γονιδίων Nanog στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10-30 και 35-45 nm ZnO NPs έδειξαν σημαντικά (Ρ<0.01)lower regulation="" in="" the="" amscs="" (fig.6a)="" and="" bmscs="" in="" comparison="" with="" the="" control="" group="" (fig.="">

Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10-30nm ZnO NPs παρουσίασαν χαμηλότερη έκφραση του γονιδίου Nanog σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

4. Συζήτηση

Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τις τοξικές επιδράσεις δύο μεγεθών ZnO NPs σε BMSCs και AMSCs·10-30nm ως μικρότερο μέγεθος και 35-45nm ως μεγαλύτερο μέγεθος. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το μικρότερο μέγεθος των NP ZnO είχε πιο τοξική επίδραση από το μεγαλύτερο μέγεθός του. Η επιφανειακή ζώνη και το μέγεθος των σωματιδίων των NPs είναι σημαντικές ιδιότητες υλικού από τοξικολογική άποψη. Καθώς το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται, η περιοχή της επιφάνειάς του ανυψώνεται και επιτρέπει σε μεγαλύτερη έκταση των σωματιδίων ή των ατόμων του να εμφανίζονται επιφανειακά σε αντίθεση με την εσωτερική πλευρά του υλικού [39].

Τα νανοϋλικά μικρότερα από 50 nm εμφανίζουν μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες λόγω του μικρού μεγέθους, της υψηλής περιοχής επιφάνειας, του χαμηλού κόστους, της βελτιωμένης αντιδραστικότητας και της εύκολης εισόδου στους κυτταρικούς διαχωριστές [40-42]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας MTT, οι βέλτιστες και ασφαλείς συγκεντρώσεις των μελετώμενων μικρότερων και μεγαλύτερων μεγεθών ZnO NPs ήταν 5 και 10 ug/ml, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Η ανάλυσή μας στον κυτταρικό κύκλο έδειξε ότι ασφαλείς συγκεντρώσεις ZnO NP μεγέθους 10-30 nm έχουν τοξικές επιδράσεις στα AMSCs μειώνοντας τον αριθμό των κυττάρων στις φάσεις S και GO/G1, υποδεικνύοντας τη διακοπή της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου και την απώλεια των σημάτων πολλαπλασιασμού κίνησης. Τα NP ZnO σε μέγεθος 35-45 nm μείωσαν τα κύτταρα στις φάσεις G2/M και S, με αποτέλεσμα την επιβράδυνση της διαδικασίας του κυτταρικού κύκλου.

Τα αποτελέσματα της μελέτης μας συμφωνούν με εκείνα άλλων μελετών που έχουν δείξει ότι τα NPs μπορεί να οδηγήσουν στο θάνατο του κυττάρου μέσω της βλάβης του DNA ή των οργανιδίων [43, 44]. Αν και υπάρχουν περιορισμένες τοξικολογικές αναφορές για την επίδραση των ZnO NPs, υπάρχουν μερικές αναφορές για τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του ZnO NP in vitro [45-47]. Μια μελέτη έδειξε ότι το οξειδωτικό στρες ενεργοποιήθηκε σε κύτταρα TR146 με συγκέντρωση 10 ug/ml ZnO NPs [48] και σε κύτταρα SH-SY5Y με συγκέντρωση 15 ug/ml [49]. Μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη που απελευθερώνεται σε κύτταρα THP-1 με 17,69 ug/ml ZnO NPs 【20】. Η βλάβη του DNA έγινε επίσης σε συγκέντρωση 6,4 ug/ml των NPs ZnO σε κύτταρα καρκινώματος του παχέος εντέρου ανθρώπου [50] και σε συγκέντρωση 12,5 ug/ml σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρών αρουραίου [51]. Η επαφή με τα νανοϋλικά είναι αναπόφευκτη γιατί γίνονται μέρος της καθημερινότητάς μας. Συνεπώς, λαμβάνεται υπόψη η τοξικότητα της έρευνας για νανοϋλικά [52]. Το Σχήμα 9 απεικονίζει την αλληλεπίδραση των NPs ZnO στο κύτταρο θηλαστικού. Ο προσδιορισμός των γηρασμένων κυττάρων έδειξε αυξημένο επίπεδο δραστηριότητας λυσοσωμικής γαλακτοσιδάσης [53]. Τα αποτελέσματα της δοκιμής μας SA- -gal έδειξαν ότι τα NP ZnO σε μικρότερα και μεγαλύτερα μεγέθη (10-30 και 35-45 nm) διέγειραν τα κύτταρα να παράγουν το λυσόσωμα. Ωστόσο, ένα υψηλό μπλε-πράσινο χρώμα προκλήθηκε από υψηλά λυσοσωμικά επίπεδα στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε 10-30 nm NP ZnO σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

Το P53 λειτουργεί ως ποιότητα αριστείας διάρκειας ζωής λόγω της ισχυρής του σιγαστήρας όγκων και ως ελεγκτής γήρανσης [54]. Το p53 μπορεί να μειώσει και να αυξήσει το οξειδωτικό στρες πιθανώς λόγω της διπλής του επίδρασης στη γήρανση. Τα αποτελέσματά μας PCR σε πραγματικό χρόνο έδειξαν μια σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση των γονιδίων p53 και NF-kB στα κύτταρα που εκτέθηκαν και στα δύο μεγέθη ZnO NPs. Ωστόσο, η υψηλότερη υπερέκφραση αυτών των γονιδίων ανιχνεύθηκε στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μικρότερο μέγεθος (10-30nm) NPs. Επιπλέον, το επίπεδο mRNA του γονιδίου Nanog θεωρήθηκε γονίδιο αντιγήρανσης. Για το γονίδιο Nanog, τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν σημαντική μείωση της ρύθμισης και των δύο μελετηθέντων μεγεθών των NPs ZnO και στα δύο υπό θεραπεία κύτταρα. Ωστόσο, η χαμηλότερη μείωση στο μέγεθος 10-30nm έδειξε ότι τα NP ZnO μπορεί να είναι πιο τοξικά στο μικρότερο μέγεθος από ότι στο μεγαλύτερο μέγεθος (35-45 nm).

5. Συμπέρασμα

Τα NP ZnO (10-30 και 35-45 nm) προτρέπουν τα κύτταρα στη διαδικασία γήρανσης. Το μικρότερο μέγεθος των NP ZnO έχει περισσότερες τοξικές επιδράσεις στη σύνθεση του DNA από το μεγαλύτερο μέγεθος. Η υψηλότερη χρώση -γαλακτοσιδάσης παρατηρήθηκε στο μικρότερο μέγεθος από το μεγαλύτερο μέγεθος των ZnO NPs. Επιπλέον, μια σημαντική υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη γήρανση (NF-kB και p53) αποκτήθηκε σε κύτταρα ZnO NPs που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και με τα δύο μεγέθη. Επιπλέον, μια σημαντική μείωση της ρύθμισης του γονιδίου που σχετίζεται με την αντιγήρανση (Nanog) αποκτήθηκε στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ZnO NPs.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Journal of Materials Science: Materials in Medicine (2021) 32:128https://doi.org/10.1007/s10856-021-06602-x