Αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος για τη διάγνωση των διαταραχών νευρολογικής επανάληψης επέκτασης στο Ηνωμένο Βασίλειο: Μια αναδρομική διαγνωστική ακρίβεια και προοπτική κλινική μελέτη επικύρωσης

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Περίληψη

Ιστορικό

Οι διαταραχές επαναλαμβανόμενης επέκτασης επηρεάζουν περίπου 1 στα 3000 άτομα και είναι κλινικά ετερογενείς ασθένειες που προκαλούνται από επεκτάσεις σύντομων διαδοχικών επαναλήψεων DNA. Ο γενετικός έλεγχος είναι συχνά ειδικός για τον τόπο, με αποτέλεσμα την υποδιάγνωση ατόμων που έχουν άτυπες κλινικές εκδηλώσεις, ειδικά σε παιδιατρικούς ασθενείς χωρίς προηγούμενο θετικό οικογενειακό ιστορικό. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο ως τεστ πρώτης γραμμής για άλλες σπάνιες γενετικές διαταραχές και στοχεύαμε να αξιολογήσουμε την απόδοσή της στη διάγνωση ασθενών μενευρολογικόςεπαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης.

Μέθοδοι

Αξιολογήσαμε αναδρομικά τη διαγνωστική ακρίβεια της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για να ανιχνεύσουμε τους πιο συνηθισμένους επαναλαμβανόμενους τόπους επέκτασης που σχετίζονται μενευρολογικόςαποτελέσματα (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT και TBP) με τη χρήση δειγμάτων που ελήφθησαν από την Εθνική Υπηρεσία Υγείας στην Αγγλία από ασθενείς που ήταν ύποπτοι ότι είχαννευρολογικόςδιαταραχές? Τα προηγούμενα αποτελέσματα δοκιμών PCR χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο αναφοράς. Η κλινική ακρίβεια της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων εξετάστηκε προοπτικά σε προηγουμένως γενετικά ελεγμένους και αδιάγνωστους ασθενείς που στρατολογήθηκαν το 2013–17 στο 100 000 Genomes Project στο Ηνωμένο Βασίλειο, οι οποίοι ήταν ύποπτοι για γενετικήνευρολογικόςδιαταραχή (οικογενείς ή πρώιμης έναρξης μορφές αταξίας, νευροπάθειας, σπαστική παραπληγία, άνοια, νόσος του κινητικού νευρώνα,παρκινσονικόςκίνησηδιαταραχές, διανοητική αναπηρία ή νευρομυϊκές διαταραχές). Εάν πραγματοποιήθηκε μια επαναλαμβανόμενη κλήση επέκτασης χρησιμοποιώντας αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος, χρησιμοποιήθηκε PCR για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα.

Ευρήματα

Η διαγνωστική ακρίβεια της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων αξιολογήθηκε έναντι 793 δοκιμών PCR που πραγματοποιήθηκαν προηγουμένως εντός του NHS από 404 ασθενείς. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ταξινόμησε σωστά 215 από 221 διευρυμένα αλληλόμορφα και 1316 από 1321 μη διογκωμένα αλληλόμορφα, δείχνοντας ευαισθησία 97,3 τοις εκατό (95 τοις εκατό CI 94,2-99,0) και 99,6 τοις εκατό ειδικότητα (99,1-99 ·9) στους 13 τόπους που σχετίζονται με τη νόσο σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της δοκιμής PCR. Σε δείγματα από 11 631 ασθενείς στο 100 000 Genomes Project, η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος εντόπισε 81 επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις, οι οποίες δοκιμάστηκαν επίσης με PCR: 68 επιβεβαιώθηκαν ως επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις στο πλήρες παθογόνο εύρος, 11 ήταν μη - παθογόνες ενδιάμεσες επεκτάσεις ή μεταθέσεις, και δύο ήταν μη εκτεταμένες επαναλήψεις (16 τοις εκατό ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης).

Ερμηνεία

Στη μελέτη μας, η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων έδειξε υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και οδήγησε στον εντοπισμόνευρολογικόςεπαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης σε ασθενείς που δεν είχαν διαγνωσθεί προηγουμένως. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την εφαρμογή της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος σε κλινικά εργαστήρια για τη διάγνωση ασθενών που έχουν ανευρολογικόςπαρουσίαση σύμφωνη με μια διαταραχή επανάληψης επέκτασης.

Χρηματοδότηση

Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας, Τμήμα Υγείας και Κοινωνικής Φροντίδας, Εθνική Υπηρεσία Υγείας Αγγλίας, Εθνικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας και Illumina.

Εισαγωγή

Παρά την πρόσφατη πρόοδο στην κατανόησή μας για τη γενετική βάση των σπάνιωννευρολογικόςδιαταραχές, έως και το 70 τοις εκατό των ασθενών με τέτοιες διαταραχές παραμένουν γενετικά αδιάγνωστοι. Τέτοιες επεκτάσεις εκτιμάται ότι επηρεάζουν περίπου 1 στους 3000 ανθρώπους (παράρτημα σελ 1) και αποτελούν την κύρια αιτία περισσότερων από 40 νευρογενετικών διαταραχών,4 συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Huntington και του συνδρόμου του εύθραυστου Χ. Οι διαταραχές επαναλαμβανόμενης επέκτασης είναι κλινικά και γενετικά ετερογενείς και η επαναλαμβανόμενη επέκταση μπορεί να σχετίζεται με διάφορες ασθένειες. Για παράδειγμα, οι επεκτάσεις στο C9orf72 μπορεί να παρουσιαστούν είτε ως αμυοτροφική πλάγια σκλήρυνση είτε ως μετωποκροταφική άνοια.5 Οι επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις σε διαφορετικούς τόπους μπορούν επίσης να αποδώσουν παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, καθιστώντας δύσκολη την κλινική διάκρισή τους: επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις σε τουλάχιστον δέκα γονίδια σπονδυλοπαρεγκεφαλιδικής αταξίας που εμφανίζονται συχνά ως ενήλικες -έναρξη αταξίας,6 και εκείνων σε C9orf72 και AR μπορούν και οι δύο να προκαλέσουν νόσο του κινητικού νευρώνα.7,8

Οι διαταραχές επαναλαμβανόμενης επέκτασης προκαλούνται από την αύξηση του αριθμού των επαναλαμβανόμενων σύντομων διαδοχικών αλληλουχιών DNA και τα κατώφλια παθογένειας για κάθε διαταραχή είναι ειδικά για τον τόπο. Το μέγεθος της επέκτασης ποικίλλει από λιγότερες από 30 επαναλήψεις (π.χ. στο CACNA1A) έως αρκετές χιλιάδες επαναλαμβανόμενες μονάδες (π.χ. σε FMR1, DMPK, C9orf72 και FXN, που μπορούν να επεκταθούν έως και 5 kb σε μέγεθος). Οι επαναλαμβανόμενες διαστολές εμφανίζουν μοριακή αστάθεια, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στο μέγεθος της επανάληψης (γενικά αυξάνεται σε μήκος) μεταξύ των γενεών και των ιστών.4 Σε αυτές τις συνθήκες, η αύξηση του αριθμού των επαναλήψεων οδηγεί συχνά σε πρώιμη έναρξη και πιο σοβαρή ασθένεια διαδοχικά γενιές.4 Η παιδιατρική έναρξη επαναλαμβανόμενων διαταραχών επέκτασης μπορεί να παρουσιαστεί ως πολυσυστημικά σύνδρομα χωρίς συγκεκριμένες φαινοτυπικές υπογραφές,9 και τα παιδιά με αυτές τις διαταραχές είναι επομένως πιο πιθανό να υποδιαγνωσθούν όταν απουσιάζει ένα οικογενειακό ιστορικό επαναλαμβανόμενης διαταραχής επέκτασης παρά όταν υπάρχει.10– 12

Η εργαστηριακή αξιολόγηση των επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων τυπικά περιορίζεται στη στοχευμένη μοριακή αξιολόγηση ενός μεμονωμένου τόπου που καθοδηγείται από την ύποπτη κλινική διάγνωση χρησιμοποιώντας μεθόδους που βασίζονται σε PCR ή στυπώματα Southern,13 που μπορεί να είναι δαπανηρές και χρονοβόρες. Επιπλέον, λόγω των ποικίλων και αλληλεπικαλυπτόμενων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών αυτών των διαταραχών, οι επαναλαμβανόμενοι τόποι επέκτασης που σχετίζονται με τη νόσο μπορούν να παραμείνουν μη δοκιμασμένοι.14

Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος αναδύεται ως διαγνωστικό εργαλείο πρώτης γραμμής σε ασθενείς με σπάνια νόσο15 αλλά, μέχρι πρόσφατα, πιστευόταν ότι είχε περιορισμένη ικανότητα αξιολόγησης των τόπων που περιέχουν επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις.16 Ωστόσο, οι πρόοδοι στη βιοπληροφορική κατέστησαν εφικτή την ανίχνευση της νόσου -προκαλώντας επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις από δεδομένα αλληλουχίας επόμενης γενιάς.17–22 Εδώ, αναφέρουμε τη διαγνωστική αξιολόγηση μιας προσέγγισης αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων χρησιμοποιώντας αναδρομικά δεδομένα PCR και την κλινική επικύρωσή της σε ασθενείς στο 100000 Genomes Project που είχε υποψία νευρολογικής διαταραχής, αδιάγνωστη με προηγούμενο γενετικό έλεγχο.

Μέθοδοι

Σχεδιασμός μελέτης και συμμετέχοντες

Αυτή η αξιολόγηση της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων περιελάμβανε αξιολογήσεις τόσο διαγνωστικής όσο και κλινικής ακρίβειας. Η διαγνωστική ακρίβεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα από ασθενείς που είχαν προηγουμένως ελεγχθεί με PCR για επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που είναι γνωστό ότι προκαλούν νευρολογική νόσο. Cambridge, UK). Και για τα δύο σύνολα ασθενών, οι δοκιμές PCR είχαν πραγματοποιηθεί σε δείγματα ασθενών από εργαστήρια της Εθνικής Υπηρεσίας Υγείας (NHS) ως μέρος της κλινικής αξιολόγησης ρουτίνας: για τα δείγματα στο 100000 Genomes Project, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές PCR πριν από την πρόσληψη στο έργο από το University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (Λονδίνο, UK); Δείγματα με επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις επιβεβαιωμένες με PCR ελήφθησαν από ασθενείς που εξετάστηκαν από το Εργαστήριο Γονιδιώματος που εδρεύει στο Cambridge. Ασθενείς με PCR-θετικά και PCR-αρνητικά αποτελέσματα δοκιμών για επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης ταυτοποιήθηκαν για συμπερίληψη στη μελέτη μας μέσω εργαστηριακών συστημάτων καταγραφής. Όλοι οι ασθενείς είχαν δώσει γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση για χρήση του δείγματός τους για σκοπούς διασφάλισης ποιότητας και έρευνας και εκπαίδευσης, ως μέρος της βελτιστοποίησης και επικύρωσης της κλινικής υπηρεσίας.

Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος κάθε δείγματος έγινε σε ένα από τα δύο εργαστήρια: Genomics England (Hinxton, UK) για τα δείγματα του 100000 Genomes Project (n=254) και το Εργαστήριο Κλινικών Υπηρεσιών Illumina (ICSL, San Diego, CA, ΗΠΑ) για δείγματα που ελήφθησαν από το Εργαστήριο Γονιδιώματος που εδρεύει στο Κέιμπριτζ (n=150). Συνολικά, αυτό το σύνολο δεδομένων χρησιμοποιήθηκε για το μέρος της διαγνωστικής ακρίβειας της μελέτης και αποτελούνταν από PCR και δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος από 404 ασθενείς, που κάλυπταν 13 τόπους που αντιπροσωπεύουν τις πιο συχνές νευρολογικές επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης: 11 τόποι που σχετίζονται με αταξία και καθυστερημένη έναρξη νευροεκφυλιστικών διαταραχών (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 και FXN), ένας τόπος που σχετίζεται με διανοητική αναπηρία (FMR1) και ένας τόπος που σχετίζεται με μυοτονική δυστροφία (DMPK). Για κάθε τόπο, τα δεδομένα δοκιμής PCR ήταν διαθέσιμα για τουλάχιστον ένα διευρυμένο αλληλόμορφο (παράρτημα σελ 24).

Η κλινική ακρίβεια αξιολογήθηκε με εξέταση της συμφωνίας επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων, όπως ανιχνεύθηκε με την αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος, με υποψία κλινικής διάγνωσης μετά από επιβεβαίωση PCR σε ασθενείς με υποψίες γενετικών νευρολογικών διαταραχών (οικογενείς ή πρώιμης έναρξης μορφές αταξίας, νευροπάθειας, σπαστική παραπληγία, άνοια , νόσος του κινητικού νευρώνα,παρκινσονικόςκινητικές διαταραχές, διανοητική αναπηρία ή νευρομυϊκές διαταραχές) που προσλήφθηκαν στο 100000 Genomes Project το 2013–17. Το 100000 Genomes Project είναι ένα πρόγραμμα του Ηνωμένου Βασιλείου για την αξιολόγηση της αξίας της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος σε ασθενείς με ανεκπλήρωτες διαγνωστικές ανάγκες σε σπάνιες ασθένειες και καρκίνο. Μετά την ηθική έγκριση για το έργο 100000 Genomes από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ανατολικής Αγγλίας του Cambridge South Research (αναφορά 14/EE/1112), συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης δεδομένων και της επιστροφής των διαγνωστικών ευρημάτων στους ασθενείς, αυτοί οι ασθενείς στρατολογήθηκαν από επαγγελματίες υγείας και ερευνητές από 13 Κέντρα Γονιδιωματικής Ιατρικής στην Αγγλία και εγγράφηκαν στο έργο εάν αυτοί ή ο κηδεμόνας τους παρείχαν γραπτή συγκατάθεση για τα δείγματα και τα δεδομένα τους να χρησιμοποιηθούν στην έρευνα, συμπεριλαμβανομένης αυτής της μελέτης. Οι πρόγονοι και, εάν ήταν εφικτό, άλλα μέλη της οικογένειας, εγγράφηκαν σύμφωνα με κριτήρια καταλληλότητας που ορίστηκαν για συγκεκριμένες καταστάσεις σπάνιων ασθενειών (παράρτημα σελ. 5–11). Οι ασθενείς στρατολογήθηκαν στο 100000 Genomes Project μετά από τυπικό γενετικό έλεγχο στο NHS, όπως υποδεικνύεται στα κριτήρια επιλεξιμότητας. Τα τυποποιημένα βασικά κλινικά δεδομένα καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Οντολογία Ανθρώπινου Φαινοτύπου (HPO)23 έναντι μοντέλων δεδομένων ειδικά για την ασθένεια.24 Συλλέχτηκε επίσης η κατάσταση της νόσου των μελών της οικογένειας, σε σχέση με την κλινική ένδειξη του proband για δοκιμή.

Για τον εντοπισμό αιτιολογικών επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων σε ασθενείς με γενετικά αδιάγνωστη νόσο, δοκιμάσαμε ασθενείς με υποψία γενετικών διαταραχών που συνάδουν με μια επαναλαμβανόμενη νόσο επέκτασης. Οι ασθενείς επιλέχθηκαν με βάση τη συμφωνία της νόσου τους και τους όρους HPO με επαναλαμβανόμενες διαταραχές που σχετίζονται με την επέκταση. Τα δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος ασθενών ανακρίθηκαν για την αναζήτηση επεκτάσεων σε συγκεκριμένα σύνολα επαναλήψεων χρησιμοποιώντας τέσσερα διαφορετικά πάνελ επέκτασης επαναλήψεων σύμφωνα με τα κλινικά χαρακτηριστικά τους (παράρτημα σελ 5). Οι επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που επιλέχθηκαν για συμπερίληψη σε αυτά τα πάνελ είναι οι πιο συχνοί τόποι επανάληψης επέκτασης που προκαλούν νευρολογική νόσο. Ασθενείς με κλινικά χαρακτηριστικά δυνητικά συμβατά με περισσότερες από μία επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης εξετάστηκαν σε πολλαπλούς πίνακες. Εάν πραγματοποιήθηκε επαναλαμβανόμενη κλήση επέκτασης με χρήση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος, πραγματοποιήθηκε επιβεβαιωτική δοκιμή με PCR.

Για κάθε ασθενή με επιβεβαιωμένη επαναλαμβανόμενη επέκταση, ο τοπικός κλινικός ιατρός ενημερώθηκε για το πιθανό διαγνωστικό αποτέλεσμα και αξιολογήθηκε η συμβολή της επαναλαμβανόμενης επέκτασης στα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς. Για επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που εξηγούσαν πλήρως ή εν μέρει τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς, εκδόθηκε μια διαγνωστική αναφορά σύμφωνα με τις τοπικές τυπικές διαδικασίες.

Διαδικασίες

Για τα ιστορικά δείγματα του NHS που χρησιμοποιήθηκαν στο μέρος της διαγνωστικής ακρίβειας της μελέτης μας, επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις είχαν δοκιμαστεί προηγουμένως χρησιμοποιώντας ενίσχυση PCR και ανάλυση θραυσμάτων. Διεξήχθη στύπωμα Southern για μεγάλες επεκτάσεις C9orf72. Στο τμήμα κλινικής ακρίβειας της μελέτης μας, επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που ανιχνεύθηκαν με αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος σε ασθενείς από το 100 000 Genomes Project δοκιμάστηκαν με PCR σε δείγματα που ήταν αποθηκευμένα σε γενετικά εργαστήρια του NHS. Πρόσθετες λεπτομέρειες, συμπεριλαμβανομένων των αλληλουχιών εκκινητών, παρέχονται στο παράρτημα (σελ. 2–3, 25–26).

Το DNA προετοιμάστηκε για αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος χρησιμοποιώντας προετοιμασία βιβλιοθήκης χωρίς PCR-Free DNA TruSeq και η αλληλουχία ζευγαριού άκρου 150 bp ή 125 bp εκτελέστηκε σε πλατφόρμες HiSeq 2000 ή HiSeq X στις εγκαταστάσεις γονιδιωμάτων υψηλής απόδοσης για Genomics England και στο ICSL . Τα γονιδιώματα αλληλουχήθηκαν σε μέσο βάθος 35× (31× έως 37×· προσάρτημα σελ 27). Ο γονότυπος βραχείας σειράς επανάληψης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού ExpansionHunter έκδοση 3.1.2.25,26 Εν συντομία, το ExpansionHunter ευθυγραμμίζει εκ νέου τις αναγνώσεις αλληλουχίας σε ένα προκαθορισμένο σύνολο σύντομων διαδοχικών επαναλήψεων για να εκτιμήσει το μέγεθος και των δύο αλληλόμορφων από ένα άτομο (παράρτημα σελ 3).

Η έξοδος του ExpansionHunter περιλαμβάνει μια εκτίμηση του αριθμού των επαναλαμβανόμενων στοιχείων, του συνολικού μεγέθους και του ορίου εμπιστοσύνης για κάθε γεωμετρικό τόπο που αξιολογήθηκε. Οι κατευθυντήριες γραμμές από την Ένωση Ιατρικής Παθολογίας και το Κολλέγιο Αμερικανών Παθολόγων συνιστούν την οπτική επιθεώρηση των κλήσεων παραλλαγής κατά τη διάρκεια της τακτικής αξιολόγησης παραλλαγών αλληλουχίας υψηλής απόδοσης.27

Ωστόσο, οι παραλλαγές σύντομης διπλής επανάληψης δεν μπορούν να οπτικοποιηθούν επαρκώς από κοινά εργαλεία οπτικοποίησης όπως το Integrative Genomics Viewer.28 Για να εξεταστούν τα δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος που βρίσκονται κάτω από κάθε κλήση γονότυπου, χρησιμοποιήθηκε ένα εργαλείο οπτικοποίησης γραφήματος, το οποίο επιτρέπει την άμεση οπτικοποίηση των απλοτύπων και την αντίστοιχη συσσώρευση ανάγνωσης των γονότυπων ExpansionHunter (παράρτημα σελ. 3, 15). Πραγματοποιήθηκε οπτική επιθεώρηση του γραφήματος συσσώρευσης σε όλες τις σύντομες διαδοχικές επαναλαμβανόμενες κλήσεις αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για να επιβεβαιωθεί ότι η πρόβλεψη του ExpansionHunter για αλληλόμορφα περιλαμβανόταν εξ ολοκλήρου σε κάθε ανάγνωση (δηλαδή, η αλληλουχία επανάληψης ήταν μικρότερη από το μήκος ανάγνωσης αλληλουχίας). για επιβεβαίωση της παρουσίας μονοαλληλικής ή διαλληλικής διαστολής. για τον εντοπισμό πιθανών ψευδώς θετικών κλήσεων. και για την ανίχνευση ψευδώς αρνητικών αλληλόμορφων σε διαλληλικές επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις, όπως το FXN (παράρτημα σελ. 4, 16).

Το ExpansionHunter υπολογίζει το μέγεθος της επανάληψης από δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος αναλύοντας αναγνώσεις αλληλουχίας που περιέχουν πλήρως ή εν μέρει μια σύντομη διαδοχική επανάληψη. Εάν ένα σύντομο διαδοχικό αλλήλιο επανάληψης είναι μικρότερο από το μήκος ανάγνωσης, το ExpansionHunter προβλέπει το ακριβές μέγεθος. εάν ένα σύντομο διαδοχικό αλληλόμορφο είναι μεγαλύτερο από το μήκος ανάγνωσης, το ExpansionHunter υπολογίζει το μέγεθος επανάληψης εντός ενός CI, ανάλογα με τη σύνθεση της αλληλουχίας του τόπου, το βάθος της αλληλουχίας και την ποιότητα της αλληλουχίας.

Στατιστική ανάλυση

Ταξινομήσαμε τις επαναλήψεις ως διευρυμένες με αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος, εάν το μέγεθος που προβλεπόταν από το ExpansionHunter ήταν πάνω από το όριο της προμετάλλαξης ή ως μη διευρυμένο εάν το προβλεπόμενο μέγεθος ήταν κάτω από το σημείο αποκοπής (παράρτημα σελ 28).

Η ευαισθησία και τα CI για την επαναλαμβανόμενη ανίχνευση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος υπολογίστηκαν ως η αναλογία των αλληλόμορφων με διευρυμένες επαναλήψεις μεταξύ των προηγουμένως επιβεβαιωμένων με PCR αλληλόμορφων με διευρυμένες επαναλήψεις. Η ειδικότητα υπολογίστηκε ως η αναλογία των μη διογκωμένων αλληλόμορφων μεταξύ των προηγουμένως ελεγμένων μη διογκωμένων επαναλήψεων με PCR. Μια πλήρης περιγραφή των στατιστικών τύπων παρέχεται στο παράρτημα (σελ. 1).

Για να συγκριθούν μεγέθη επαναλήψεων με PCR με εκτιμήσεις επαναλαμβανόμενου μεγέθους με αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος, τα ποσοτικοποιημένα με PCR αλληλόμορφα συγκρίθηκαν με μεγέθη επαναλήψεων που προβλέφθηκαν από το ExpansionHunter για αλληλόμορφα μικρότερα από το μήκος ανάγνωσης και στους 13 βραχείς διαδοχικούς επαναλαμβανόμενους τόπους. Η συμφωνία υπολογίστηκε από το ποσοστό των μεγεθών επαναλήψεων που προβλέφθηκαν από το ExpansionHunter που συμφωνούσαν με το μέγεθος που προσδιορίστηκε με PCR, λαμβάνοντας υπόψη το σφάλμα PCR συν ή πλην μία επανάληψη. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το στατιστικό λογισμικό R έκδοση 3.6.3.

Ο ρόλος της πηγής χρηματοδότησης

Ο σχεδιασμός της μελέτης, η εγγραφή ασθενών, η συλλογή δεδομένων και η αλληλουχία έγιναν από υπαλλήλους της Genomics England και ακαδημαϊκούς ερευνητές. Οι υπάλληλοι της Illumina πραγματοποίησαν τον προσδιορισμό της αλληλουχίας 150 δειγμάτων ασθενών ως προγραμματισμένο συστατικό της μελέτης διαγνωστικής ακρίβειας της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος και ανέπτυξαν το ExpansionHunter. Εργαζόμενοι της Genomics England, ακαδημαϊκοί ερευνητές και οι συγγραφείς RTH, ED και MAE πραγματοποίησαν την ανάλυση και την ερμηνεία των επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων σε ασθενείς που στρατολογήθηκαν στο 100 000 Genomes Project. Οι πηγές χρηματοδότησης δεν είχαν κανένα ρόλο στην ερμηνεία ή τη σύνταξη των δεδομένων της έκθεσης.

Αποτελέσματα

Η διαγνωστική ακρίβεια της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων αξιολογήθηκε έναντι 793 δοκιμών PCR που είχαν πραγματοποιηθεί προηγουμένως εντός του NHS από 404 ασθενείς (64 ασθενείς εξετάστηκαν για περισσότερες από μία επαναλήψεις· εικόνα 1). Από αυτές τις δοκιμές, 183 ταξινομήθηκαν ως με εκτεταμένη επανάληψη και 610 ως μη επαναλαμβανόμενες με PCR, αποδίδοντας συνολικά 221 διευρυμένα και 1321 μη διογκωμένα μεμονωμένα αλληλόμορφα σε 13 τόπους ασθένειας (παράρτημα σελ. 24, 28). Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ταξινόμησε σωστά 215 από 221 διευρυμένα αλληλόμορφα και 1316 από 1321 μη διογκωμένα αλληλόμορφα σε σύγκριση με τα αποτελέσματα δοκιμής PCR (παράρτημα σελ. 27, 29), δείχνοντας αρχική ευαισθησία 97,3 τοις εκατό (95 τοις εκατό CI 94,2-99 ·0) και ειδικότητα 99,6 τοις εκατό (99·1–99,9, πίνακας 1). Μετά την οπτική διόρθωση όλων των κλήσεων με βάση την ποιότητα των αναγνώσεων, η ευαισθησία αυξήθηκε στο 99,1 τοις εκατό (96,8–99,9) και η ειδικότητα στο 100 τοις εκατό (99,7–100· εικόνα 2Α, πίνακας 1). Η οπτικοποίηση των διευρυμένων αλληλίων επέτρεψε την ανίχνευση ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων και την επαναταξινόμηση όλων των ψευδώς αρνητικών αλληλόμορφων στο FXN, από τα οποία μόνο ένα αλληλόμορφο ταξινομήθηκε σωστά ως διευρυμένο σε δείγματα με διαλληλικές διαστολές (παράρτημα σελ. 17, 18).

Το μήκος της επανάληψης ποσοτικοποιήθηκε με PCR σε 509 δοκιμές PCR που εξέτασαν 945 αλληλόμορφα σε 13 επαναλαμβανόμενους τόπους επέκτασης. Οι συσχετίσεις μεταξύ του ExpansionHunter και της PCR για μεγέθη επανάληψης μικρότερα και μεγαλύτερα από το μήκος ανάγνωσης της αλληλουχίας (δηλ. 150 bp) εμφανίζονται στο παράρτημα (παράρτημα σελ 19). Παρατηρήθηκε υψηλή συμφωνία για επαναλήψεις μικρότερες από το μήκος ανάγνωσης, με 92,7 τοις εκατό (836 από 902) συμφωνία μεταξύ PCR και ExpansionHunter. Παρατηρήθηκε μεταβλητότητα του τόπου, με υψηλή συμφωνία μεταξύ ExpansionHunter και PCR για τα ATXN2, ATXN7, CACNA1A και HTT, και χαμηλή συμφωνία για DMPK ή TBP (παράρτημα σελ 30). Τα μήκη των αλληλόμορφων μεγαλύτερων από το μήκος ανάγνωσης υποεκτιμήθηκαν από το ExpansionHunter, το οποίο επηρέασε την ακρίβεια της κλήσης σε DMPK, FMR1 και FXN (εικόνα 2Β, παράρτημα σελ. 19, 31).

Αν και το ExpansionHunter μπόρεσε να αναγνωρίσει σωστά τα μεγάλα διεσταλμένα αλληλόμορφα σε FMR1, DMPK, C9orf72 και FXN (παράρτημα σελ 29), οι εκτιμήσεις του προβλεπόμενου μεγέθους έτειναν να είναι χαμηλότερες από αυτές που ελήφθησαν με την PCR καθώς το μέγεθος της επανάληψης αυξήθηκε εντός του παθογόνου εύρους, το οποίο επηρέασε την ικανότητα διάκρισης μεταξύ μεγάλων και μικρών επεκτάσεων σε DMPK, C9orf72 και FXN ή μεταξύ πλήρους επεκτάσεων και μεταθέσεων στο FMR1 (παράρτημα σελ 31). Για παράδειγμα, οι τόποι με μήκος επανάληψης που αξιολογήθηκε με PCR μεγαλύτερο από 200 επαναλήψεις στο FMR1 και ταξινομήθηκαν ως πλήρης μετάλλαξη είχαν μέσο μέγεθος επανάληψης που εκτιμήθηκε από το ExpansionHunter 92,6 (SD 17,8, παράρτημα σελ 31).

Για να ελέγξουμε την ικανότητα επαναλαμβανόμενης ανίχνευσης επέκτασης με αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος για την επίλυση της διάγνωσης προηγουμένως ελεγμένων και γενετικά μη διαγνωσμένων ασθενών, δοκιμάσαμε 11 631 ασθενείς με υποψία γενετικής νευρολογικής διαταραχής που προσλήφθηκαν στο 100000 Genomes Project (εικόνα 1). Τα δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τέσσερα διαφορετικά πάνελ επέκτασης επαναλαμβανόμενων σύμφωνα με τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς. Οι αριθμοί των ασθενών που δοκιμάστηκαν με καθένα από τα τέσσερα πάνελ παρουσιάζονται στον πίνακα 2.

Συνολικά, εντοπίσαμε και επιβεβαιώσαμε οπτικά επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις σε δείγματα από 105 ασθενείς (πίνακας 2, παράρτημα σελ. 20, 33). Από αυτά, 81 δείγματα ήταν διαθέσιμα για επιβεβαιωτική δοκιμή με PCR και 68 επιβεβαιώθηκε ότι είχαν επαναλαμβανόμενη επέκταση (0·6 τοις εκατό απόδοση): 45 (1,2 τοις εκατό ) από 3692 στο πλαίσιο Α, οκτώ ({ {18}}·3 τοις εκατό ) από 2743 στο πλαίσιο Β, πέντε (0,6 τοις εκατό ) από 860 στο πλαίσιο Γ και δέκα (0,1 τοις εκατό ) από 6731 στο πλαίσιο Δ. Δεκατρείς από 81 κλήσεις επέκτασης δεν επιβεβαιώθηκαν ως παθογόνες επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις (16 τοις εκατό ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης). Από αυτά, δύο ήταν μη διογκωμένα αλληλόμορφα σε ATXN1 και ATXN2, τέσσερα ήταν κλήσεις ενδιάμεσου μεγέθους FMR1 (παράρτημα σελ 21) και επτά ήταν μεταθέσεις FMR1.

Κλινικές λεπτομέρειες των 68 ασθενών με επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που επιβεβαιώθηκαν με PCR, συμπεριλαμβανομένων των κλινικών τους παρουσιάσεων, της επαναλαμβανόμενης επέκτασης που εντοπίστηκε και της συμβολής της επαναλαμβανόμενης επέκτασης στα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς παρέχονται στον πίνακα 3. οι όροι HPO, το μέγεθος επανάληψης που εκτιμάται από το ExpansionHunter και εάν έχει εκδοθεί μια διαγνωστική αναφορά παρατίθενται στο παράρτημα (σελ. 33).

Παρατηρήθηκαν επεκτάσεις σε ασθενείς που παρουσίαζαν μεγάλη ποικιλία επικαλυπτόμενων κλινικών παρουσιάσεων που δοκιμάστηκαν με το πάνελ Α (πίνακας 3, παράρτημα σελ 22), συμπεριλαμβανομένης επαναλαμβανόμενης επέκτασης ATXN2 σε ασθενή με πρώιμη έναρξη της νόσου του Πάρκινσον που ανταποκρίνεται στη λεβοντόπα και ιστορικό προοδευτικής παρεγκεφαλιδικής αταξίας , και επεκτάσεις AR σε τέσσερις ασθενείς με κλινική διάγνωση νόσου Charcot-Marie-Tooth, συμπεριλαμβανομένου ενός με γενετικά επιβεβαιωμένη απομυελινωτική νευροπάθεια (δηλ. νόσος Charcot-Marie-Tooth τύπου 1, ασθενής 42, παράρτημα σελ 33). Ένα ευρύ φάσμα προηγούμενων κλινικών διαγνώσεων παρατηρήθηκε σε ασθενείς με παθογόνες επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις.

Για παράδειγμα, σε επτά ασθενείς με αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση ή άλλη νόσο του κινητικού νευρώνα, εντοπίστηκαν επεκτάσεις σε AR (n=4) και C9orf72 (n=3). Σε ασθενείς με υποψία κληρονομικής αταξίας, εντοπίσαμε επεκτάσεις στους τόπους που δεν είχαν αξιολογηθεί ως μέρος της διαγνωστικής εργασίας ρουτίνας στο NHS τη στιγμή της στρατολόγησης, συμπεριλαμβανομένων των ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP και HTT ( πίνακας 3). Εντοπίσαμε επίσης επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις σε ασθενείς με κλινικά χαρακτηριστικά που συνάδουν με εναλλακτικές επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης, συμπεριλαμβανομένης της επέκτασης C9orf72 στην πρώιμη έναρξη και της οικογενούς νόσου του Πάρκινσον (ασθενής 24, Πίνακας 3) και επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις στο εύρος μειωμένης διείσδυσης στο HTT (38 επαναλήψεις) σε δύο αδελφές με κινητική διαταραχή, άνοια, κατάθλιψη και δυσκολίες ομιλίας (ασθενείς 44 και 45), υπογραμμίζοντας τη διαγνωστική πρόκληση που παρουσιάζουν αυτές οι επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης.

Οκτώ παιδιά που δοκιμάστηκαν με το πάνελ Β βρέθηκαν να είχαν μεγάλες επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις CAG (εικόνα 3), επτά από τις οποίες εξήγησαν πλήρως τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς. Έξι ασθενείς δεν είχαν ενημερωτικό οικογενειακό ιστορικό και δεν τους προσφέρθηκε επαναλαμβανόμενος έλεγχος επέκτασης ως μέρος της κλινικής τους αξιολόγησης κατά τη στιγμή της πρόσληψης (ασθενείς 48–53, πίνακας 3, παράρτημα σελ. 33). Δύο από αυτά τα παιδιά έφεραν μεγάλες επεκτάσεις HTT (90-100 επαναλήψεις CAG). Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα παιδί είχε κληρονομήσει την επανάληψη από έναν μη επηρεασμένο γονέα χωρίς οικογενειακό ιστορικό της νόσου του Huntington. Οι οικογενειακές δοκιμές βρίσκονται σε εξέλιξη, αλλά ένα αλληλόμορφο μειωμένης διείσδυσης έχει εντοπιστεί στην εκτεταμένη οικογένεια, υποδεικνύοντας ότι η επανάληψη είχε επεκταθεί κατά περισσότερες από 60 επαναλαμβανόμενες μονάδες σε μία μόνο γενιά (ασθενής 52). Τη στιγμή της σύνταξης του κειμένου, κανείς στην οικογένεια δεν έδειξε σημάδια της νόσου του Χάντινγκτον και η γενετική συμβουλευτική και ο έλεγχος συνεχίζονται για τους γονείς. Δύο παιδιά κάτω των 5 ετών έφεραν μεγάλες επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις στο ATXN7 και παρουσίασαν πολύπλοκη πολυσυστηματική νόσο. Για ένα από αυτά τα παιδιά (ασθενής 50), ο γονέας του παρουσίασε προβλήματα βάδισης 2 χρόνια μετά την εγγραφή του στο 100000 Genomes Project. Ομοίως, ένα κορίτσι ηλικίας 10 ετών με διανοητική αναπηρία βρέθηκε να έχει 99-επαναλαμβανόμενη επέκταση στο ATXN2, παρά το γεγονός ότι και οι δύο γονείς χαρακτηρίστηκαν ως ανεπηρέαστοι και ένα κορίτσι ηλικίας 18 ετών με άνοια βρέθηκε να φέρει {19}}επαναλάβετε την επέκταση στο ATN1 (παράρτημα σελ 33).

Ανιχνεύθηκαν πέντε επεκτάσεις του DMPK (πίνακας C), μεταξύ των οποίων ένα παιδί και μια μητέρα με κλινική διάγνωση μυϊκής δυστροφίας, σε δύο αδέλφια με υποψία περιφερικής μυοπάθειας και σε έναν έφηβο με συγγενή μυοπάθεια (ασθενείς 54-58). Οι επεκτάσεις FMR1 (πίνακας D) ανιχνεύθηκαν σε εννέα αγόρια και ένα κορίτσι και η διάγνωση του συνδρόμου Εύθραυστου Χ εξήγησε πλήρως ή εν μέρει τα παρουσιαζόμενα κλινικά χαρακτηριστικά (ασθενείς 59-68).

Συζήτηση

Η διάγνωση επαναλαμβανόμενων διαταραχών επέκτασης αποτελεί πρόκληση στην υγειονομική περίθαλψη λόγω των ετερογενών και αλληλοεπικαλυπτόμενων κλινικών χαρακτηριστικών και των μη ειδικών κλινικών ευρημάτων, τα οποία μπορεί να αυξάνονται σε σοβαρότητα με την ηλικία και σε κάθε επόμενη γενιά. Οι διαταραχές επαναλαμβανόμενης επέκτασης είναι από τις πιο κοινές αιτίες κληρονομικών νευρολογικών παθήσεων.4 Ωστόσο, οι ασθενείς ενδέχεται να υποδιαγνωσθούν, είτε επειδή δεν έχουν διεξαχθεί επαρκής γενετικοί έλεγχοι είτε επειδή δεν έχουν ακόμη ανακαλυφθεί οι αιτιολογικές γενετικές παραλλαγές. Οι προσεγγίσεις δοκιμών είναι επί του παρόντος κατακερματισμένες και οι ασθενείς μπορεί να έχουν εσφαλμένη επαναλαμβανόμενη διόγκωση29 ή να λάβουν μοριακό τεστ για διαφορετική κατηγορία παραλλαγής λόγω επικάλυψης των κλινικών χαρακτηριστικών με άλλες νευρολογικές γενετικές διαταραχές.30

Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλαπλές ρυθμίσεις ως διαγνωστικό τεστ πρώτης γραμμής για σπάνιες νευρολογικές διαταραχές, αλλά παλαιότερα είχε θεωρηθεί ότι έχει χαμηλή ικανότητα ανίχνευσης επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων.16 Έχουν αναπτυχθεί αρκετά εργαλεία για τον εντοπισμό επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων από ολόκληρο το γονιδίωμα προσδιορισμός αλληλουχίας στο ερευνητικό περιβάλλον,31 αλλά καμία από αυτές τις προσεγγίσεις δεν έχει εφαρμοστεί σε δεδομένα αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος που συλλέχθηκαν από μεγάλο αριθμό ασθενών σε μεμονωμένη υπηρεσία υγειονομικής περίθαλψης. Παρουσιάζουμε στοιχεία ότι ένας αλγόριθμος που έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων από την αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος μπορεί να αξιολογήσει αξιόπιστα τις πιο κοινές επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις που προκαλούν νόσο και να επιλύσει προηγουμένως γενετικά αδιάγνωστες περιπτώσεις σε μια μεγάλη ομάδα ασθενών με νευρολογικές διαταραχές. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος μπορεί να διακρίνει μεταξύ μη διογκωμένων και διευρυμένων αλληλόμορφων με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα σε 13 επαναλαμβανόμενους τόπους επέκτασης (που μπορούν να βελτιωθούν περαιτέρω με οπτική επιθεώρηση), μπορεί να υπολογίσει με ακρίβεια το μέγεθος των αλληλόμορφων μικρότερων από το μήκος ανάγνωσης και μπορεί να υποτιμήσει το μέγεθος των μεγάλων επεκτάσεων στα FMR1, DMPK, FXN και C9orf72.

Όταν η ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων με αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος αξιολογήθηκε έναντι θετικών και αρνητικών αποτελεσμάτων που είχαν προηγουμένως ληφθεί σε κλινικά διαγνωστικά γονιδιωματικά εργαστήρια χρησιμοποιώντας μεθόδους χρυσού προτύπου, βρήκαμε τουλάχιστον 97,3 τοις εκατό ευαισθησία και 99,6 τοις εκατό ειδικότητα. Επιπλέον, δείξαμε ότι τόσο η ειδικότητα όσο και η ευαισθησία μπορούν να βελτιωθούν με τη χειροκίνητη επεξεργασία της στοίβας ανάγνωσης, επιτρέποντας την ανίχνευση ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων και την επαναταξινόμηση των ψευδώς αρνητικών αλληλόμορφων σε δείγματα με διαλληλικές διαστολές. Από τους 6731 ασθενείς που εξετάστηκαν για FMR1 (πίνακας D), προβλέφθηκε να επεκταθούν 124 κλήσεις. Καταφέραμε να αποκλείσουμε το 97 μέσω οπτικής επιθεώρησης ως πιθανά ψευδώς θετικά. Αυτό υποδεικνύει ότι 1 στις 54 δοκιμές αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος θα έχει μια κλήση FMR1 που θα πρέπει να επιθεωρηθεί οπτικά για να απορριφθεί μια πιθανή ψευδώς θετική κλήση. Οι εργασίες συνεχίζονται για τη βελτίωση της μεθόδου γονότυπου ExpansionHunter για τη μείωση του αριθμού των ψευδώς θετικών κλήσεων για FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 επαναλήψεις) προκαλούν πιο σοβαρή νόσο και η νωτιαία παρεγκεφαλιδική αταξία τύπου 36 (NOP56), για την οποία επεκτάσεις μεγαλύτερες από 650 επαναλήψεις θεωρούνται παθογόνες και μεγέθη επαναλήψεων 15-650 θεωρούνται ενδιάμεσες και παραλλαγές αβέβαιης σημασίας.

Έχουν εντοπιστεί περισσότεροι από 40 επαναλαμβανόμενοι τόποι επέκτασης. Πολλοί από αυτούς τους τόπους έχουν εντοπιστεί μόλις πρόσφατα και τώρα συνδέονται με προηγουμένως ανεξήγητες καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένης της παρεγκεφαλιδικής αταξίας με νευροπάθεια και του συνδρόμου αιθουσαίας αρεφλεξίας (RFC1) 32 και της μυοκλονικής επιληψίας (SAMD12). επιλεγμένα για τη μελέτη μας με βάση τη διαθεσιμότητα θετικών και αρνητικών δειγμάτων ελέγχου.

Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν ότι το ExpansionHunter θα πρέπει να είναι σε θέση να ταξινομεί τα μη διογκωμένα και διογκωμένα αλληλόμορφα με ακρίβεια σε οποιονδήποτε επαναλαμβανόμενο τόπο επέκτασης εάν τα μη διογκωμένα αλληλόμορφα είναι μικρότερα από το μήκος ανάγνωσης (δηλαδή, 150 bp). Αν και οι περισσότεροι επαναλαμβανόμενοι τόποι επέκτασης έχουν αλληλόμορφα μικρότερα από 150 bp όταν δεν διαστέλλονται, ορισμένοι τόποι για τους οποίους το μέγεθος του μη διογκωμένου αλληλόμορφου είναι κοντά στα 150 bp (π.χ. NOTCH2NLC)34 μπορεί να είναι πιο δύσκολο να προσδιοριστεί ο γονότυπος χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση. Για τόπους όπου η διευρυμένη επανάληψη είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το μήκος ανάγνωσης, η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος μπορεί να ανιχνεύσει παθογόνες επεκτάσεις (π.χ. NOP56,35 RFC120,32). Οι αναδυόμενες τεχνολογίες αλληλουχίας μακράς ανάγνωσης ενδέχεται να προσφέρουν συμπληρωματικές προσεγγίσεις κατά τον γονότυπο των μεγάλων επεκτάσεων.36

Η αξιολόγηση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων με χρήση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος σε 11 631 μη διαγνωσμένους ασθενείς που στρατολογήθηκαν στο 100 000 Genomes Project έδωσε 68 ασθενείς με επεξηγηματικά ευρήματα. Οι ασθενείς στρατολογήθηκαν στο 100 000 Genomes Project μετά από τυπικό γενετικό έλεγχο. Ως εκ τούτου, το ποσοστό των επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων που προσδιορίζονται σε αυτήν την κοόρτη αντιπροσωπεύει μια αύξηση της διαγνωστικής απόδοσης από την τυπική δοκιμή NHS, η οποία περιλαμβάνει δοκιμές ειδικής θέσης για επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης όπως FXN ή DMPK. Αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένες διαγνώσεις δεν ήταν ύποπτες με βάση τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς, συμπεριλαμβανομένων έξι παιδιατρικών ασθενών που δεν είχαν γνωστό οικογενειακό ιστορικό διαταραχής επαναλαμβανόμενης επέκτασης. Τα μέσα επαναλαμβανόμενα μεγέθη επέκτασης που προβλέπονται από την αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος σε παιδιατρικούς ασθενείς που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη είναι σημαντικά μεγαλύτερα από τον μέσο όρο στους ενήλικες, σύμφωνα με την προσδοκία ότι οι μεγαλύτερες επεκτάσεις σχετίζονται με πρώιμη και πιο σοβαρή έναρξη, ακόμη και στα παιδιά. Απαιτείται περαιτέρω εργασία, αλλά αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι μια εξαρτώμενη από την ηλικία και επαναλαμβανόμενη αξιολόγηση της παθογένειας μπορεί να υποστηρίξει μια παιδιατρική διάγνωση μειώνοντας τον πιθανό κίνδυνο εντοπισμού αλληλόμορφων κινδύνου από ενήλικες, οδηγώντας σε αυτόκλητες προγνωστικές δοκιμές σε παιδιά.

Τα ευρήματά μας επιτρέπουν τη δημιουργία μιας κλινικής διαγνωστικής ροής εργασιών για την αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος (παράρτημα σελ 23). Προτείνουμε να γίνεται οπτική επιθεώρηση για όλες τις κλήσεις που ταξινομούνται ως διευρυμένες για την ανίχνευση ψευδώς θετικών και για διαλληλικές επεκτάσεις για τις οποίες έχει ανιχνευθεί μόνο ένα διευρυμένο αλληλόμορφο (π.χ. FXN). Συνιστούμε στα εργαστήρια να χρησιμοποιούν το ExpansionHunter για να αξιολογήσουν την παρουσία επέκτασης χωρίς να τηρούν την εκτίμηση μεγέθους και να εκτελούν επιβεβαιωτική δοκιμή PCR ως τυπικό στοιχείο της ροής εργασιών δοκιμών.

Οι σπάνιες κληρονομικές ασθένειες περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα κλινικών χαρακτηριστικών, καθιστώντας τις γονιδιωματικές δοκιμές ειδικά για τη γεωγραφική θέση αναποτελεσματικές, επίπονες και δαπανηρές. Παρουσιάζουμε στοιχεία ότι η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος κλινικού βαθμού με τη δυνατότητα διάγνωσης μιας σειράς σπάνιων νευρολογικών ασθενειών που συνήθως παρουσιάζονται με μία μόνο βάση, indel ή παραλλαγές αριθμού αντιγράφων θα μπορούσε τώρα να επεκταθεί σε επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις. Επειδή η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος παρέχει μια ενιαία δοκιμή που μπορεί να εντοπίσει τις πιο κοινές επαναλαμβανόμενες επεκτάσεις, καθώς και τη δυνατότητα δοκιμής σημειακών μεταλλάξεων και παραλλαγών αριθμού αντιγράφων σε γονίδια που σχετίζονται με αυτές τις καταστάσεις ταυτόχρονα, προσφέρει την ευκαιρία να εντοπιστούν οι περισσότεροι ασθενείς με αυτές τις ετερογενείς διαταραχές που δεν έχουν διαγνωστεί με τη χρήση εξειδικευμένων δοκιμών για τον τόπο. Στην εποχή των αναδυόμενων θεραπειών για αυτές τις διαταραχές, η έγκαιρη ανίχνευση μπορεί να γίνει κρίσιμη.37 Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την εφαρμογή της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος για την ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων σε κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια, μια προσέγγιση που έχει ήδη συμπεριληφθεί στο NHS England National Genomic Κατάλογος Δοκιμών,38 για διερεύνηση αδιάγνωστης σπάνιας νευρολογικής νόσου.

βιβλιογραφικές αναφορές

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Ένα διαγνωστικό ανώτατο όριο για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των εξωμών σε παρεγκεφαλιδική αταξία και σχετικές νευρολογικές διαταραχές. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Κληρονομική σπαστική παραπληγία στην Ελλάδα: χαρακτηρισμός ανεξερεύνητου πληθυσμού με χρήση αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Διαγνωστική απόδοση ενός στοχευμένου γονιδιακού πίνακα αλληλουχίας επόμενης γενιάς για παιδιατρικές κινητικές διαταραχές: μια 3-ετής μελέτη κοόρτης. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Επαναλαμβανόμενες ασθένειες επέκτασης. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 μετωποκροταφική άνοια και/ή αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση. Seattle, WA: Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Σκαντινοπαρεγκεφαλιδική αταξία. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Κλινική νευρογενετική: αυτοσωμική επικρατούσα νωτιαία παρεγκεφαλιδική αταξία. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Μυϊκή ατροφία σπονδυλικής στήλης και βολβού. Στο: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Θανατηφόρα μορφή νωτιαίας παρεγκεφαλιδικής αταξίας τύπου 7 με πρώιμη έναρξη στην παιδική ηλικία. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Συσσώρευση αταξίνης-7 και ουβικουϊτινοποίηση σε βρεφική SCA7 με 180 επαναλήψεις CAG. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Η νωτιαία παρεγκεφαλιδική αταξία τύπου 2 παρουσιάζεται με γνωστική παλινδρόμηση στην παιδική ηλικία. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Παιδική νωτιαία παρεγκεφαλιδική αταξία 3: γλωσσική δυστονία ως πρώιμη εκδήλωση. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; δημοσιεύτηκε διαδικτυακά στις 13 Σεπτεμβρίου.

13 Bird TD. Myotonic dystrophy type 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Σιάτλ, Ουάσιγκτον: Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Συχνότητα SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS και C9orf72 επαναλαμβάνονται οι επεκτάσεις σε ασθενείς με SCA αρνητικές για τους πιο κοινούς υποτύπους SCA. BMC Neurol 2018; 18: 3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ασθενών με σπάνιες ασθένειες σε ένα εθνικό σύστημα υγείας. Φύση 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Προς την ιατρική ακριβείας. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Διαγνωστική και κλινική χρησιμότητα της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος σε μια ομάδα αδιάγνωστων κινεζικών οικογενειών με σπάνιες ασθένειες. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genome-wide landscape of tandem repeat επεκτάσεων. Nucleic Acids Res 2019; 47: ε90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Ανίχνευση επεκτάσεων διαδοχικών επαναλήψεων σε κοόρτες αλληλουχίας με δεδομένα αλληλουχίας σύντομης ανάγνωσης. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Αναγνώριση διευρυμένων επαναλήψεων με βάση τη βιοπληροφορική: μια μη αναφορά ιντρονική επέκταση πενταμερούς στο RFC1 προκαλεί CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Παραλλαγές αριθμού αντιγράφων στην αλληλουχία κλινικού γονιδιώματος: ανάπτυξη και ερμηνεία για σπάνια και αδιάγνωστη ασθένεια. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Ανίχνευση σε όλο το γονιδίωμα διαδοχικών επαναλήψεων DNA που επεκτείνονται στον αυτισμό. Φύση 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: a tool for annotating and analyzing human heritary disease. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics England. Μοντέλα κλινικών δεδομένων καταστάσεων σπάνιων ασθενειών. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (πρόσβαση στις 4 Αυγούστου 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Ανίχνευση μακρών επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων από δεδομένα αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος χωρίς PCR. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: ένα εργαλείο που βασίζεται σε γραφήματα ακολουθίας για την ανάλυση της διακύμανσης σε μικρές διαδοχικές περιοχές επανάληψης. Βιοπληροφορική 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Πρότυπα και οδηγίες για την επικύρωση αγωγών βιοπληροφορικής αλληλουχίας επόμενης γενιάς: μια κοινή σύσταση της Ένωσης Μοριακής Παθολογίας και του Κολλεγίου Αμερικανών Παθολόγων. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Ενσωματωμένο πρόγραμμα προβολής γονιδιωματικών. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Φαινοτυπική ομοιογένεια της παρουσίας που μοιάζει με τη νόσο Huntington σε μια οικογένεια SCA17. Neurology 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntington's νόσος, νόσος Huntington που μοιάζει και καλοήθης κληρονομική χορεία: τι νέο υπάρχει; Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Πρόσφατες εξελίξεις στην ανίχνευση επαναλαμβανόμενων επεκτάσεων με σύντομη ανάγνωση αλληλουχίας επόμενης γενιάς. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Η διαλληλική επέκταση μιας ιντρονικής επανάληψης στο RFC1 είναι μια κοινή αιτία αταξίας όψιμης έναρξης. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura Η, Doi K, Mitsui J, et al. Επεκτάσεις ιντρονικών επαναλήψεων TTTCA και TTTTA στην καλοήθη οικογενή μυοκλονική επιληψία ενηλίκων. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura Η, Shibata S, Yoshimura J, et αϊ. Οι μη κωδικοποιητικές επεκτάσεις CGG επαναλαμβάνονται στη νόσο ενδοπυρηνικής εγκλεισμού των νευρώνων, στην οφθαλμοφαρυγγοαπωτερική μυοπάθεια και σε μια επικαλυπτόμενη ασθένεια. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Ταχεία διάγνωση της νωτιαίας παρεγκεφαλιδικής αταξίας 36 σε μια οικογένεια τριών γενεών με χρήση βραχυπρόθεσμης ανάγνωσης δεδομένων αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-read sequencing emerging in medical genetics. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Επαναλαμβανόμενες διαταραχές επέκτασης: μηχανισμοί και θεραπείες. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Εθνικό Σύστημα Υγείας. Εθνικός κατάλογος γονιδιωματικών δοκιμών: κριτήρια δοκιμών για σπάνιες και κληρονομικές ασθένειες. Οκτώβριος, 2021.