Το Tubuloside B από το Cistanche Salsa σώζει τα νευρωνικά κύτταρα PC12 από την απόπτωση και το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από 1-μεθυλ-4-φαινυλοπυριδίνιο

Εισαγωγή

Παθολογικά, η σποραδική νόσος του Πάρκινσον (PD) χαρακτηρίζεται τυπικά από απώλεια κατεχολαμινεργικών νευρώνων, ιδιαίτερα ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς ουσίας μέλαινας ουσίας (SNc) και από την παρουσία χαρακτηριστικού ενδονευρώνα| εγκλείσματα που ονομάζονται σώματα Lewy στις πληγείσες περιοχές του εγκεφάλου. Παρά την παθογένεση της PD, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη της PD παραμένουν αβέβαιοι. σε νευρωνικό θάνατο ή απόπτωση από την υπερβολική παραγωγή ελεύθερων ριζών. Το γεγονός ότι το nigral ντοπαμινεργικό σύστημα μπορεί να παράγει υψηλά επίπεδα ελεύθερων ριζών και έχει σχετικά χαμηλά επίπεδα οξειδωτικού αμυντικού συστήματος υποστηρίζει περαιτέρω αυτή την υπόθεση. Τόσο in vivo όσο και in vitro μελέτες έδειξαν νευροτοξικότητα που προκαλείται από οξειδωτικό στρες του MPP ＋, ενός ενεργού μεταβολίτη της l-μεθυλ-4-φαινυλ-l,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνης (MPTP) σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Η συμμετοχή ελεύθερων ριζών που παράγονται υπερβολικά από το οξειδωτικό στρες ως η κοντινή αιτία νευροεκφυλιστικών διαταραχών όπως η PD υποδηλώνει έναν κεντρικό ρόλο για τα αντιοξειδωτικά. Το Tubuloside B (Σχήμα 1) ήταν μία από τις ενώσεις φαινυλαιθα-νοειδούς που απομονώθηκαν από τους μίσχους του Cistanche salsa. Προηγούμενες μελέτες είχαν βρει ότι πολλά φαινυλαιθανοειδή, συμπεριλαμβανομένης της τουμπουλοσίδης Β, έδειξαν ισχυρή δράση σάρωσης ελεύθερων ριζών.

Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα ευρήματα, ερευνήσαμε στην παρούσα μελέτη την επίδραση του tubu]nside B στη νευροτοξικότητα που προκαλείται από MPP+- in vitro, χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά PC12 του φαιοχρωμοκυτώματος συμπαθητικού νεύρου που έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία όλα αυτά τα χρόνια για τη μελέτη της νευρωνικής λειτουργίας.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

Το Tubuloside B από το Cistanche Salsa παρασχέθηκε ευγενικά από τον Dr. Li Lei (Τμήμα Φυσικών Προϊόντων, Σχολή Φαρμακευτικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα). Η καθαρότητα της ένωσης ήταν μεγαλύτερη από 98% με ανάλυση HPLC. Το τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM), ο ορός αλόγου και ο ορός εμβρύου μόσχου αγοράστηκαν από την GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridi ionionion (MPP+ ), poly-L-lysine, 3-(4,{ {8}}διμεθυλθειαζόλη-2 -υλ)-2,5- βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), RNase A, πρωτεϊνάση Κ και 2; Η διοξική 7'-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) αγοράστηκαν από τη Sigma.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα PCI2 διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό αλόγου, 5% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U/ml πενικιλίνη και 100 μg/ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα αεριζόμενο με 95% αέρα και 5% CO2 στους 37 βαθμούς. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν 24-48 ώρες μετά τη σπορά των κυττάρων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν συστηματικά με θρυψινοποίηση 0,25 % όταν τα κύτταρα πλησίασαν το στάδιο της υποσύνδεσης και απλώθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας 25 cm χωρισμένες σε 1:8.

Ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν τροποποιημένο προσδιορισμό ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, τα κύτταρα PC12 σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων σε πυκνότητα I × 104 κύτταρα ανά φρεάτιο. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν για 48 ώρες και στη συνέχεια το μέσο άλλαξε σε αυτό που περιείχε διάφορες συγκεντρώσεις Burside B ή MPP＋. Μετά από επώαση για έως και 48 ώρες και 72 ώρες, διάλυμα MTr (5 mg/ml σε DMEM) προστέθηκε στις πλάκες 96- και τα κύτταρα αφέθηκαν να επωαστούν για 4 ώρες στους 37 βαθμούς. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, οι κρύσταλλοι του κυττάρου και της βαφής τροφοδοτήθηκαν διαλυτά με την προσθήκη 200 μL DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm (540 nm ως αναφορά) με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών μοντέλου 550 (Bio-Rad). Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε επίσης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αποκλεισμού του μπλε τρυπανίου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σφαιροποιήθηκαν ήπια και χρωματίστηκαν με διάλυμα 0,6% κυανού τρυπάνης για 3 βροχές. Το ποσοστό των μη έγχρωμων κυττάρων στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε δέκα τυχαία επιλεγμένα πεδία μικροσκοπίου. Ως θετικό φάρμακο, χρησιμοποιήθηκαν 100 ng／ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ ΚΑΘΑΡΙΣΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ανίχνευση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (PI) [11]. Εν συντομία, περίπου 1 × 106 κύτταρα που επωάστηκαν με υπό δοκιμή ουσίες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70 % αιθανόλη για 24 ώρες σε - 20 βαθμό και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 300 μL PBS που περιείχε 0,5 mg/ml RNaseA και 0,5 mg/ml PI. Μετά από περαιτέρω επώαση για 30 λεπτά στο σκοτάδι, πραγματοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής με FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Γερμανία).

Ανάλυση κατακερματισμού DNA με ηλεκτροφόρηση

Εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο του Moore [12] που απομόνωσε μόνο κατακερματισμένο DNA και τα πειράματα κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ίσο αριθμό καλλιεργειών από κάθε ομάδα δοκιμής. Εν συντομία, 3 × 106 νευρώνες από καθένα από τα επεξεργασμένα δείγματα πλύθηκαν σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank's (1000g για 10 λεπτά) και τα σφαιρίδια που σχηματίστηκαν στο κάτω μέρος του σωλήνα ομογενοποιήθηκαν με 1 ml ρυθμιστικό λύσης (10 mM Tris σε ρΗ 7,4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) για 20 λεπτά σε πάγο. Μετά από φυγοκέντρηση στους 11,000 g για 20 βροχή στους 4 βαθμούς, τα υπερκείμενα που περιείχαν θραυσμένο DNA αφαιρέθηκαν και χωνεύτηκαν με 20 mg/ml RNase A στους 37 βαθμούς για 1 ώρα και 0,1 mg/ml πρωτεϊνάση Κ στους 56 βαθμούς για επιπλέον 1 ώρα. Το τεμαχισμένο DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη και χλωροφόρμιο και φυγοκεντρήθηκε σε 1O,000g για 1 βροχή στους 4 C. Η υδατική φάση μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα Eppendorf, αναμείχτηκε με 2 όγκους παγωμένης αιθανόλης και στη συνέχεια τοποθετείται στους 20 βαθμούς για τουλάχιστον 1 ώρα για να καθιζάνει DNA. Μετά από φυγοκέντρηση στους 15,000g για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς, τα υπερκείμενα αφαιρέθηκαν και τα σφαιρίδια DNA πλύθηκαν με 80% αιθανόλη μία φορά (15.000 g για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς), ξηράνθηκαν στον αέρα και διαλύθηκαν σε 20 μL Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ σε ρΗ 7,6. Ολόκληρο το δείγμα στη συνέχεια ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% για 1 ώρα στα 85 V. Το πήκτωμα εξετάστηκε και φωτογραφήθηκε από ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης Ultra Violet Products (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Μέτρηση του ενδοκυτταρικού σχηματισμού ROS

Ο σχηματισμός ενδοκυτταρικών υπεροξειδίων ανιχνεύθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ χρησιμοποιώντας μια μη φθορίζουσα ένωση, διοξεική 2"7"-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) [13], η οποία αποεστεροποιείται εντός των κυττάρων από ενδογενείς εστεράσες προς το ιονισμένο ελεύθερο οξύ, 2,7"-διχλωροφλουορεσκεΐνη. 2",7-Η διχλωροφλουορεσκεΐνη είναι ικανή να οξειδωθεί σε φθορίζουσα 2"7"-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCF) από υδροαντιοξειδωτικά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μM DCFH-DA για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Οι καλλιέργειες πλύθηκαν δύο φορές με ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank και απεικονίστηκαν στο ίδιο μέσο. Η απεικόνιση έγινε χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ σάρωσης, το DCF διεγέρθηκε στα 488 nm και το φίλτρο εκπομπής ήταν ένα φίλτρο φραγμού 510 nm. Για να παρέχεται έγκυρη σύγκριση, χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες παράμετροι λήψης για όλες τις παρατηρήσεις. Ορίστηκε η βέλτιστη κατακόρυφη θέση στη μέση των κελιών και, στη συνέχεια, το πεδίο σαρώθηκε γρήγορα. Επειδή ο φωτισμός στο μήκος κύματος διέγερσης των 488 nm προκάλεσε αυξημένο φθορισμό λόγω της οξείδωσης αυτής της χρωστικής, κάθε πεδίο εκτέθηκε στο Iight για τον ίδιο χρόνο. Οι τιμές γραμμής βάσης από μη διεγερμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως τιμές ελέγχου για σύγκριση με κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με MPP παρουσία ή απουσίατουμπουλοσίδη Β. Μετά τη σάρωση, η μέση σχετική ένταση φθορισμού σε 15-20 σώματα νευρωνικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου προσδιορίστηκε ποσοτικά σε τέσσερις ξεχωριστές καλλιέργειες ανά συνθήκη θεραπείας.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές που ελήφθησαν εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± SD. Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκε με το Student's t-test. Οι υπολογισμένες τιμές p μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, το MPP+ παρήγαγε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων PCI2. Αντίθετα, ο EGF, ένας πολύ γνωστός νευροτροφικός παράγοντας, παρήγαγε σημαντική προστασία της κυτταρικής βιωσιμότητας στα 100 ng/mL MPP- επαγόμενες από κυτταροτοξικές επιδράσεις εξασθενήθηκαν επίσης παρουσία τουμπουλοσίδης Β (5, 10, 50 ή 100 ug-ml{{12} }), αν και με μικρότερη ισχύ από την αναφορά

φάρμακο (Εικ. 3). Το Tubuloside B σε αυτές τις συγκεντρώσεις εμφάνισε κυτταροπροστατευτικές επιδράσεις με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η ένωση από μόνη της δεν προκάλεσε εμφανή κυτταροτοξικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ηλεκτροφόρηση πηκτής του εκχυλίσματος DNA από κύτταρα PCI 2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 μΜ MPP+ για 48 ώρες έδειξε κλιμάκωση του DNA. ένα κλασικό χαρακτηριστικό της απόπτωσης, τουμπουλοσίδη Β, σε δόσεις 10 και 100μ g·ml-1επαγωγή του σχηματισμού της Κλίμακας DNA (Εικ. 4) . Το Σχήμα 5 δείχνει τυπικά ιστογράμματα της κυτταρομετρικής ανάλυσης ροής του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από MPP＋ σε κύτταρα PC12 παρουσία ή απουσία τουμπουλοσίδης Β. Η ποσοτικοποίηση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου με PI αποκάλυψε τον αριθμό των κυττάρων με υποδιπλοειδή χαρακτηριστικά (περιοχή M1). ενδεικτικό του αποπτωτικού κατακερματισμού του DNA. Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, το αποπτωτικό υποδιπλοειδές κλάσμα ήταν ελάχιστο έως και 5.94% από τα συνολικά 10000 κύτταρα (Εικ. 5 Α). Μετά από 48 ώρες έκθεσης σε MPP＋, το ποσοστό απόπτωσης αυξήθηκε σε 43．02;j;(Εικ.5 B)). Όταν προστίθεται στην κυτταρική καλλιέργεια, ο τουμπουλοσίδης Βανέστειλε την επαγόμενη από MPP+-απόπτωσημε δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Σε συγκέντρωση 10 ug·ml-1η προστασία από το tubuloside B δεν ήταν στατιστικά σημαντική, αλλά στα 50 και 1 00ug·ml-1, 45% και 63% μειώθηκαν αντίστοιχα. παρατηρήθηκε. αύξηση του ποσοστού των κυττάρων επιβίωσης (Εικ. 5D, E)).

Η συσσώρευση ενδοκυττάριων ROS μπορεί να ανιχνευθεί με τη χρήση κυττάρων DCFH-DA (PC12) που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 uM MPP - για 48 ώρες, εμφάνισαν έντονο φθορισμό μέσα στο κύτταρο μετά από χρώση με βαφή DCFH-DA (Εικ. 6). Η ταυτόχρονη θεραπεία με τουμπουλοσίδη Β (σε δόσεις των 10 και 100 ug·ml) ανέστειλε την MPP-προκάλεσε την παραγωγή ROS (το μειωμένο ποσοστό ήταν 24.52% και 55.63%), αντίστοιχα).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Συζήτηση

Η παθογένεση της PD περιλαμβάνει ισχυρό οξειδωτικό στρες, μειωμένα επίπεδα αντιοξειδωτικών και μιτοχονδριακά ελαττώματα. Όλα είναι γνωστά ότι προκαλούν απόπτωση σε πολλά κυτταρικά συστήματα. Συγκεκριμένα, έχει αποδειχθεί ότι οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν ενεργό κυτταρικό θάνατο στους νευρώνες[14]. Το MPTP παράγει ένα μη αναστρέψιμο και σοβαρό παρκινσονικό σύνδρομο που προκαλεί επιλεκτικό εκφυλισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων του μελανοραβδίου στους ανθρώπους. Αυτή η νευροτοξίνη έχει χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία. έφαγε ζωικά μοντέλα PD[15]. Το MPTP μετατρέπεται από τη μονοαμινοξειδάση Β σε Mpp, το οποίο συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια. όπου αναστέλλει το μιτοχονδριακό σύμπλεγμα I και τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. η λειτουργία προκαλεί απόπτωση[16]. Ως εκ τούτου, η επαγόμενη από MPP+ 一 νευροτοξικότητα σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως αιτιολογικό μοντέλο PD για τον έλεγχο νευροπροστατευτικών παραγόντων.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ο κυτταρικός θάνατος που προκαλείται από MPP+- μέσω οξειδωτικού στρες στα κύτταρα PC12 μειώθηκε από την τουμπουλοσίδη Β. Επιπλέον, δείξαμε ότι η τουμπουλοσίδη Β προστατεύει επίσης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο έναντι της MPP{{ 3}}προκάλεσε κλιμάκωση και απόπτωση DNA, όπως μετρήθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης DNA και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Επιπλέον, η ταυτόχρονη θεραπεία με υψηλότερες συγκεντρώσεις τουμπουλοσίδης Β ανέστειλε την προκαλούμενη από MPP παραγωγή ROS. Έτσι, η τουμπουλοσίδη Β έχει δείξει πολυλειτουργικά νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. Διάφοροι μηχανισμοί, χωριστά ή σε συνδυασμό, μπορεί να εμπλέκονται στις δράσεις της τουμπουλοσίδης Β. Η αντιοξειδωτική δράση είναι ένας πιθανός μηχανισμός για τη νευροπροστασία που προκαλείται από την τουμπουλοσίδη Β. Ο Xiong Q βρήκε ότι η τουμπουλοσίδη Β έδειξε ισχυρή δραστηριότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών στη ρίζα 1,1-διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλίου και ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου που παρήχθη από ξανθινο]ξανθινοοξειδάση.

Αρκετά φαινυλαιθανοειδή έχουν πρόσφατα αναφερθεί ότι διαθέτουν ιδιότητες δέσμευσης ελεύθερων ριζών και προστατεύουν τους τοξικούς τραυματισμούς που προκαλούνται από το οξειδωτικό στρες. Τα ROS που παράγονται από MPP+ όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το ανιόν υπεροξειδίου και η ρίζα υδροξυλίου βλάπτουν εύκολα τα βιολογικά μόρια, γεγονός που μπορεί τελικά να οδηγήσει σε αποπτωτικό ή νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Έτσι, η τουμπουλοσίδη Β μπορεί να έχει άμεσες σαρωτικές επιδράσεις έναντι των ROS. Αν και τα δεδομένα μας δεν καθορίζουν την ακριβή θέση στην οποία η τουμπουλοσίδη Β δρα για την καταστολή της συσσώρευσης ROS, υποδηλώνουν ότι ο νευροπροστατευτικός μηχανισμός περιλαμβάνει τη διέγερση των αντιοξειδωτικών οδών. Μια μελέτη της μοριακής δομής του tubuloside B δείχνει επίσης ότι έχει μια ισχυρή ικανότητα γιααπομάκρυνση των ελεύθερων ριζών(προσωπική επικοινωνία).

Άλλοι μηχανισμοί θα μπορούσαν επίσης να είναι σχετικοί. Για παράδειγμα, η τουμπουλοσίδη Β μπορεί να έχει την ικανότητα να εξουδετερώνει την τοξικότητα της MPP, αναστέλλοντας το άνοιγμα των πόρων μετάβασης της μιτοχονδριακής διαπερατότητας και τη δυσλειτουργία. Επιπλέον, θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη εάν η τουμπουλοσίδη Β έχει άμεση δράση προαγωγής της ανάπτυξης στα νευρωνικά κύτταρα. Ο ακριβής μηχανισμός της νευροπροστατευτικής δράσης του tubuloside B παραμένει ασαφής. Απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για να αποσαφηνιστεί η πλήρης εικόνα της νευροπροστατευτικής του δράσης.

Συμπερασματικά, τουμπουλοσίδη Β απόΕκχύλισμα σάλσας Cistancheέχει εμφανή προστατευτικά αποτελέσματα στην απόπτωση που προκαλείται από MPP+-και το οξειδωτικό στρες. Οι νευροπροστατευτικές του επιδράσεις έναντι της τοξικότητας MPP ＋ μπορεί να είναι σημαντικές και να υποδηλώνουν ότι μπορεί να έχει θεραπευτικό δυναμικό στην πρόληψη και τη θεραπεία της PD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ PHGS75% ECH 30% ACT 12%