Ενίσχυση Top-Down Proteomics του εγκεφαλικού ιστού με FAIMS Μέρος 2

Ανάλυση Δεδομένων

Η αναγνώριση πρωτεομορφών πραγματοποιήθηκε με TopPIC έκδοση 1.3.53 Ρυθμίσεις για το TopPIC περιελάμβανε ένα παράθυρο πρόδρομου 3 m/z (για να ληφθεί υπόψη ο ισοτοπικός φάκελος), μια ανοχή λάθους μάζας 15 ppm, μια μέγιστη/λεπτό άγνωστη μετατόπιση μάζας 500 Da και μια μέγιστη αριθμός επιτρεπόμενων άγνωστων τροποποιήσεων 1.

Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ της μορφολογίας των πρωτεϊνών και της μνήμης. Οι πρωτεΐνες είναι τα πιο βασικά μόρια στις δραστηριότητες της ζωής. Μπορούν να ελέγξουν τις ζωτικές δραστηριότητες των κυττάρων και να διατηρήσουν την κανονική λειτουργία του ανθρώπινου σώματος. Μελέτες έχουν βρει ότι η μορφολογία των πρωτεϊνών όχι μόνο παίζει σημαντικό ρόλο στις δραστηριότητες της κυτταρικής ζωής, αλλά έχει επίσης μια άρρηκτη σχέση με τη λειτουργία μνήμης στον εγκέφαλο. Μόλις αλλάξει η μορφολογία των πρωτεϊνών, θα επηρεάσει τη σύνδεση μεταξύ των νευρώνων, επηρεάζοντας έτσι την ικανότητα μνήμης των ανθρώπων.

Στα πρώτα στάδια της ζωής, οι αλλαγές στη μορφολογία των πρωτεϊνών παίζουν ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη λειτουργία του εγκεφάλου. Εάν η μορφολογία των πρωτεϊνών δεν είναι όπως θα έπρεπε, θα προκαλέσει μια σειρά από νευρολογικά προβλήματα, οδηγώντας τελικά σε απώλεια μνήμης, γνωστική εξασθένηση κ.λπ.

Ωστόσο, δεν υπάρχει λόγος ανησυχίας. Η σύγχρονη ιατρική τεχνολογία έχει επιτρέψει στους ανθρώπους να προσαρμόσουν τη μορφολογία των πρωτεϊνών μέσω της διατροφής για να βελτιώσουν τη μνήμη τους. Μια πλούσια και ποικίλη διατροφή είναι πλούσια σε πρωτεΐνες, αλλά όταν επιλέγετε πρωτεΐνη, προσπαθήστε να επιλέγετε τροφές με χαμηλά λιπαρά, χαμηλή σε χοληστερόλη και χαμηλή περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες για να αποφύγετε τις αρνητικές επιπτώσεις της υπερβολικής πρόσληψης στον οργανισμό.

Εν ολίγοις, η μορφολογία των πρωτεϊνών και η μνήμη είναι αχώριστες. Θα πρέπει να προσέχουμε την υγιεινή διατροφή και την ισορροπημένη πρόσληψη πρωτεϊνών για να διατηρήσουμε καλή υγεία διατηρώντας παράλληλα καλή μνήμη. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή έχει αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη μείωση της οξείδωσης και των φλεγμονωδών αντιδράσεων στον εγκέφαλο, προστατεύοντας έτσι την υγεία του νευρικό σύστημα. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη και την επισκευή των νευρικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη συνδεσιμότητα και τη λειτουργία των νευρωνικών δικτύων. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης, της ικανότητας μάθησης και της ταχύτητας σκέψης και μπορούν επίσης να αποτρέψουν την εμφάνιση γνωστικής δυσλειτουργίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Κάντε κλικ στο Γνωρίζω για να βελτιώσετε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη

Τα φάσματα MS2 αναζητήθηκαν σε μια βάση δεδομένων που συνδυάζεται με καταχωρήσεις από Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), Swiss-Prot splicevarianants (22,000) και TrEMBL (54.436), καθώς και κοινές προσμίξεις. Οι αναγνωρισμένες πρωτεομορφές διηθήθηκαν σε ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) 1% μέσω TopPIC.

Η μεταγενέστερη ανάλυση δεδομένων διεξήχθη στο περιβάλλον R για στατιστικούς υπολογισμούς και δημιουργία αριθμών.54 Στην ανάλυση κατάντη, πρωτεομορφές από το ίδιο γονίδιο με τα ίδια αμινοξέα έναρξης και λήξης που βρέθηκαν να είναι εντός ±5 Da συνδυάστηκαν ως μεμονωμένη πρωτεόμορφη για να αυξηθεί η αυστηρότητα των αποστολών μας.

Αν και το όριο 5Da είναι αυθαίρετο, αυτή η προσέγγιση αντιστάθμισε τις εσφαλμένα εκχωρημένες μονοϊσοτοπικές κορυφές, την ασάφεια σε άγνωστες μετατοπίσεις μάζας και άλλες τεχνητές αποκλίσεις. Για να προσδιορίσουμε τη σχετική τυπική απόκλιση (RSD) των πρωτεομορφών εντός των αντιγράφων, χρησιμοποιήσαμε την έξοδο "έντασης χαρακτηριστικών" από το TopPIC.

Οι χάρτες κάλυψης ακολουθιών κατακερματισμού και τα σχετικά φάσματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LCMsSpectator.55

Οι συγκεκριμένες ρυθμίσεις για τοLCMsSpectator περιελάμβαναν ανοχή ιόντων πρόδρομου 10 ppm, ανοχή παραγωγής 10 ppm, ελάχιστο όριο S/N 1,5, κατώφλι συσχέτισης Pearson 0,7, προεπιλεγμένη εξομάλυνση 9 βαθμών, και κατώφλι σχετικής έντασης πρόδρομου ισοτόπου 0,1.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η προσθήκη FAIMS Αυξάνει σθεναρά την Κάλυψη Proteome

Το δείγμα ιστού φλοιού από έναν ασθενή με διάγνωση Αλτσχάιμερ υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με τη ροή εργασίας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Αρχικά επιδιώξαμε να αναλύσουμε την απόδοση των FAIMS σε διάφορα βιογραφικά σε σύγκριση με εκείνα χωρίς FAIMS (αναφέρονται ως "No FAIMS").

Αξίζει να θυμηθούμε ότι η διεπαφή FAIMS παράγει μια μέτρια απώλεια μετάδοσης ιόντων, πιθανώς λόγω της μεγαλύτερης διαδρομής ιόντων μέσω της πηγής.56 Επομένως, για την καλύτερη αναπαράσταση τυπικών συνθηκών και τη διασφάλιση δίκαιων συγκρίσεων, τα δεδομένα "No FAIMS" συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο δείγμα χωρίς έχει εγκατασταθεί η μονάδα FAIMS.

Αυτά τα δεδομένα "No FAIMS" συλλέχθηκαν εις τριπλούν και αναλύθηκαν σύμφωνα με τη ροή εργασίας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 με μια κορυφαία ανάλυση DDA MS2. Τα σύνολα δεδομένων "No FAIMS" κατά μέσο όρο εντόπισαν 754 ± 35 πρωτεομορφές (Εικόνα 2Α και Πίνακας S1) και ταυτοποίησαν συλλογικά 1073 μοναδικές (μη περιττές) πρωτεομορφές (Σχήμα 2Β) που προέρχονται από 293 μοναδικά γονίδια (Εικόνα 2C), που καλύπτουν 29.359 αμινοξέα σε όλο το πρωτεόμιο (Εικόνα 2D).

Η μετρική "κάλυψη πρωτεώματος" (Εικόνα 2D) ορίζεται ως μη περιττά αμινοξέα που καλύπτονται από κάθε αλληλουχία πρωτεομορφών. Ουσιαστικά, αυτή η μέτρηση λαμβάνει υπόψη τόσο το μήκος όσο και την ποικιλομορφία των αναγνωρισμένων πρωτεομορφών.

Θεωρούμε ότι αυτό είναι μια πιο ισορροπημένη μέτρηση σε σύγκριση με τον ακατέργαστο αριθμό πρωτεομορφών και γονιδίων, καθώς αποφεύγει τις προκαταλήψεις προς μικρότερες πρωτεομορφές. Αν και οι απλές μετρήσεις πρωτεομορφών ή γονιδίων είναι διαισθητικές, αυτές οι μετρήσεις φαίνεται να επηρεάζονται έντονα από μικρά πρωτεολυτικά θραύσματα. Τα σύνολα δεδομένων FAIMS συλλέχθηκαν από -50 έως -20 CV και σαρώθηκαν σε βήματα των 5 V.

Καθένα από τα 7 βιογραφικά που προέκυψαν συλλέχτηκε εις τριπλούν. Όσον αφορά τις πρωτεομορφές και τα γονίδια, το FAIMS ξεπέρασε τις επιδόσεις "No FAIMS" για όλα τα CV που δοκιμάστηκαν εντός του εύρους −50 έως −30 CV (Εικόνα 2A–C).

Για παράδειγμα, τα τρία σύνολα δεδομένων σε -50 CV εντόπισαν 1833 ± 17 πρωτεομορφές, μια μέση αύξηση ~140% ανά εκτέλεση σε σύγκριση με το "Χωρίς FAIMS". Συλλογικά, αυτά τα τρία σύνολα δεδομένων στο -50 CV εντόπισαν 2564 μοναδικές πρωτεομορφές από 530 μοναδικά γονίδια που καλύπτουν συνολικά 43.437 αμινοξέα, μια αύξηση 95, 69 και 69% σε σχέση με τα τρία σύνολα δεδομένων "NoFAIMS", αντίστοιχα (Εικόνα 2B–D και Πίνακας S1).

Επίσης, παρόλο που το FAIMS στα −25V παρατηρεί λιγότερα μοναδικά πρωτεόμορφα και γονίδια σε σύγκριση με το "No FAIMS", τα ίδια τα πρωτεόμορφα είναι πολύ μεγαλύτερα κατά μέσο όρο. Έτσι, όταν εξετάζουμε το μήκος πρωτεομορφών, (Εικόνα 2D), τα σύνολα δεδομένων −25 V καλύπτουν σχεδόν τόσα αμινοξέα από το πρωτεόσωματο (28.398) σε σχέση με το "No FAIMS" (29.359), κάνοντάς το μόνο με τις μισές πρωτεομορφές (Εικόνα 2Β ).

Ερευνήσαμε επίσης εάν το FAIMS θα μπορούσε να παρέχει τόσο στιβαρή και αναπαραγώγιμη ανάλυση σε σύγκριση με χωρίς FAIMS. Αξιολογήσαμε την αναπαραγωγιμότητα της ποσοτικοποίησης υπολογίζοντας το RSD (ισοδύναμο με τον συντελεστή διακύμανσης) της έντασης χαρακτηριστικών κάθε πρωτεομορφής, υπό τον όρο ότι η πρωτεομορφή πληρούσε το κριτήριο της παρατήρησης και στα τρία αντίγραφα σύνολα δεδομένων για κάθε ρύθμιση CV.

Επειδή τα σύνολα δεδομένων FAIMS και "No FAIMS" συλλέχθηκαν όλα από μεμονωμένο βιολογικό δείγμα, η διακύμανση μεταξύ των αντιγράφων θα πρέπει να αποδοθεί αποκλειστικά σε οργανικούς παράγοντες.

Το διάγραμμα πλαισίου στο Σχήμα 3 (καθώς και μεμονωμένα ιστογράμματα στο Σχήμα S1) δείχνει πώς συγκρίνονται οι κατανομές των RSD μεταξύ των συνόλων δεδομένων FAIMS και "No FAIMS".

Με βάση τη μέση τιμή RSD, η προσθήκη FAIMS είχε ως αποτέλεσμα παρόμοια ή ελαφρώς βελτιωμένη ποιότητα ποσοτικοποίησης σε σχέση με το "No FAIMS". Η βελτίωση των RSD μεταξύ των χαμηλότερων τάσεων (−20 έως −30 CV) μπορεί να σχετίζεται με την παρατήρηση ότι λιγότερες πρωτεομορφές μεταδίδονται εντός αυτού του εύρους, παρέχοντας υψηλότερης ποιότητας φάσματα MS1 και επομένως καλύτερες εκτιμήσεις της έντασης των χαρακτηριστικών.

Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι τα RSD που προσδιορίστηκαν από αυτά τα αντίγραφα είναι παρόμοια με τα προηγούμενα πειράματα από πάνω προς τα κάτω55 και από κάτω προς τα πάνω57,58 που εκτελέστηκαν με παρόμοια όργανα.

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η προσθήκη του FAIMS στο TDP αυξάνει σθεναρά τις ταυτοποιήσεις πρωτεομορφών, χωρίς καμία θυσία στην ποιότητα της ποσοτικοποίησης.

Στη συνέχεια διερευνήσαμε την επικάλυψη των ταυτοποιήσεων μεταξύ των βιογραφικών σημειωμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να παρέχουν το μεγαλύτερο μη περιττό σύνολο παρατηρήσεων.

Χρησιμοποιώντας συντελεστές επικάλυψης, που ορίζονται ως τομή μεταξύ δύο συνόλων διαιρούμενο με το μικρότερο από τα δύο σύνολα, προσδιορίσαμε την ομοιότητα μεταξύ κάθε συνόλου δεδομένων. Ο συνολικός μέσος συντελεστής επικάλυψης και για τις ταυτοποιήσεις πρωτεομορφών και γονιδίων σε κάθε CV FAIMS ήταν 0.76.

Αυτός είναι συγκρίσιμος με τον συντελεστή επικάλυψης από σύνολα δεδομένων "Χωρίς FAIMS" (0.77), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα τεχνικά αντίγραφα εμφανίζουν παρόμοια αναπαραγωγιμότητα. Ένας χάρτης θερμότητας που εμφανίζει τους συντελεστές επικάλυψης FAIMS των πρωτεομορφών και των γονιδίων φαίνεται στα Σχήματα 4 και S2, αντίστοιχα.

Σημειωτέον, η επικάλυψη των ταυτοποιήσεων γονιδίων στον χώρο του CV είναι πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με τις πρωτεομορφές, αν και είναι ιδιαίτερα αισθητή όταν συγκρίνονται οι μεγαλύτερες αποστάσεις CV.

Για παράδειγμα, η επικάλυψη μεταξύ −50 και −20 CV είναι 0,64 σε επίπεδο γονιδίου και 0,06 σε επίπεδο πρωτεομορφής. Αυτό ήταν αναμενόμενο καθώς κάθε γονίδιο μπορεί δυνητικά να αντιπροσωπεύεται από πολλαπλές πρωτεομορφές.

Το Σχήμα 4 δείχνει ότι ενώ μια διαφορά 5−1{3}} V στο CV παράγει συντελεστές επικάλυψης ως επί το πλείστον πάνω από 0,5, αποστάσεις μεγαλύτερες από 15 V παράγουν μεγαλύτερους βαθμούς ανομοιότητας και επομένως είναι καλύτερα τοποθετημένες για τη σύλληψη αρκετά διαφορετικών συνόλων πρωτεομορφών.

Με αυτά τα σύνολα δεδομένων, στη συνέχεια επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε ποιοι συνδυασμοί CV είναι οι βέλτιστοι για την επίτευξη μέγιστων ταυτοποιήσεων γονιδίων, ταυτοποιήσεων πρωτεομορφών και κάλυψης αλληλουχίας με περιορισμούς στον αριθμό των CV για κάθε συνδυασμό.

Πρώτον, καθιέρωσε τους βέλτιστους συνδυασμούς για οποιονδήποτε αριθμό CV από 1 έως 7 χρησιμοποιώντας τις μετρήσεις των μοναδικών πρωτεομορφών, γονιδίων και κάλυψης αλληλουχίας πρωτεώματος (Εικόνα 5).

Χρησιμοποιώντας συνδυασμούς περιορισμένους σε τρία CV ως παράδειγμα, το Σχήμα 5Α, Β περιγράφει πώς τα −35, −40 και −50 V είναι ιδανικά εάν κάποιος επιθυμεί να μεγιστοποιήσει τον αριθμό των πρωτεομορφών ή των γονιδίων.

Οι πρωτεομορφές και τα γονίδια που προσδιορίζονται σε αυτά τα τρία CV (εννέα σύνολα δεδομένων) καλύπτουν το 84% των συνολικών μοναδικών πρωτεομορφών και το 92% των συνολικών γονιδίων σε ολόκληρο το σύνολο των 21 συνόλων δεδομένων.

Όταν ζυγίζεται το μήκος μιας πρωτεομορφής με την κάλυψη αλληλουχίας ως μετρική, ο ιδανικός συνδυασμός είναι −30, −40 και −50 CV, που καλύπτει το 88% των μοναδικών αμινοξέων και από τα 21 σύνολα δεδομένων FAIMS με μέτρια μόνο απώλεια αναγνώρισης πρωτεομορφών και γονιδίων. 4221 πρωτεομορφές και 723 γονίδια, Εικόνα 5C). Ωστόσο, αυτοί οι συνδυασμοί περιλαμβάνουν όλα τα αντίγραφα και αντιπροσωπεύουν τις μέγιστες ταυτοποιήσεις που θα μπορούσαν να επιτευχθούν για έναν δεδομένο συνδυασμό βιογραφικών σημειωμάτων. Ως εκ τούτου, για να δείξουμε το πλεονέκτημα του εξωτερικού βήματος βιογραφικού, αποφασίσαμε να διερευνήσουμε ποιοι αριθμοί θα μπορούσαν εύλογα να επιτευχθούν κατά μέσο όρο με μόλις τρεις διαδρομές, όπου κάθε διαδρομή είναι διαφορετικό βιογραφικό.

Χρησιμοποιώντας τα σύνολα δεδομένων −50, −40 και −30 V ως παράδειγμα, προσδιορίσαμε τις κατά μέσο όρο μοναδικές πρωτεομορφές, μοναδικά γονίδια και καλύψεις αλληλουχίας πρωτεώματος με βάση τους 27 μοναδικούς συνδυασμούς από τα τρία διαφορετικά αντίγραφα σε κάθε CV.

Με βάση αυτή την ανάλυση, θα μπορούσαμε να επιτύχουμε 2986 (±46) μοναδικές πρωτεομορφές και 618 (±12) μοναδικά γονίδια που καλύπτουν 64.534 (±1089) αμινοξέα κατά μέσο όρο. Σε σύγκριση με τα σύνολα δεδομένων τριπλών "No FAIMS", τα οποία εντόπισαν 1073 μοναδικές πρωτεομορφές και 293 μοναδικά γονίδια που καλύπτουν 29.359 αμινοξέα, το εξωτερικό CV στα -50, -40 και -30 V θα μπορούσε να υπερδιπλασιαστεί κάθε μέτρηση.

Ωστόσο, ο βέλτιστος συνδυασμός βιογραφικών θα εξαρτηθεί επίσης πιθανότατα από τον οργανισμό και τον ιστό από τον οποίο προέρχεται το δείγμα, τα βήματα προετοιμασίας του δείγματος που εφαρμόζονται, καθώς και οποιαδήποτε πρόσθετη κλασμάτωση εκτός σύνδεσης που εφαρμόζεται πριν από την ανάλυση LC-MS.

Συνολικά, όταν λαμβάνεται μαζί με την ανάλυση επικάλυψης (Εικόνα 4), προτείνουμε ότι οι αποστάσεις 15 V ή μεγαλύτερες μεταξύ των CV παρέχουν τη μικρότερη ποσότητα επικάλυψης μεταξύ των πρωτεομορφών, ενώ ο διαχωρισμός 5−10 V εντός του −50 έως −30 CV μεγιστοποιεί τα γονίδια, τις πρωτεομορφές και το πρωτεόσωμα. κάλυψη ακολουθίας.

Για να προσδιορίσουμε περαιτέρω τον αντίκτυπο του FAIMS στο βάθος της κάλυψης των πρωτεϊνών, συγκρίναμε τα γονίδια που προσδιορίστηκαν από τα σύνολα δεδομένων από πάνω προς τα κάτω με μια τυπική ανάλυση από κάτω προς τα πάνω του ανθρώπινου εγκεφάλου.

Ολοκληρωμένα σύνολα δεδομένων ανθρώπινου εγκεφάλου από κάτω προς τα πάνω μας επέτρεψαν να εκτιμήσουμε την αφθονία για 8528 πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας σταθμισμένη φασματική μέτρηση. Οι πρωτεΐνες 59-61 συνδυάστηκαν σε 10 διαφορετικά εκατοστημόρια αφθονίας με βάση φασματικές μετρήσεις που συγκεντρώθηκαν από διάφορα σύνολα δεδομένων από κάτω προς τα πάνω του ανθρώπινου εγκεφάλου.

Με τη διασταύρωση με τα σύνολα δεδομένων από πάνω προς τα κάτω, μπορέσαμε να προσδιορίσουμε από πού προέρχονται τα γονίδια και οι πρωτεομορφές και κατατάσσονται ως προς την εκτιμώμενη αφθονία πρωτεϊνών (χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες φασματικές μετρήσεις από σύνολο δεδομένων) στον ανθρώπινο εγκέφαλο (Εικόνα 6).

Τα γονίδια που βρέθηκαν στην ανάλυσή μας από πάνω προς τα κάτω, αλλά όχι στο σύνολο αναφοράς από κάτω προς τα πάνω, καταχωρήθηκαν ως "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com